JP2009300136A - 粒子分析装置 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的は、特定の撮像対象粒子に対する検出感度を高めた測定を行う粒子分析装置を実現することである。
【解決手段】検出手段３０〜３６は、複数の検出出力レベルにおける時間幅を測定し、分析手段３７は、複数の各検出出力レベルごとの時間幅の範囲情報で構成される検出条件を有し、検出手段３０〜３６において検出されたすべてのレベルの時間幅と、検出条件におけるすべてのレベルごとの時間幅の範囲を比較し、この比較結果に応じてフラッシュランプ１を発光させ撮像手段１４、１５により撮像する。
【選択図】図１

Description

本発明は、流れている液体中の粒子を撮像し、液体中の粒子を分析する粒子分析装置であり、特に尿，血液中の細胞や粒子を分析するのに適した粒子分析装置に関する。

従来、尿沈査検査は尿を遠心濃縮しサンプルをスライドガラスに移し、標本を作成し、顕微鏡検査を行うものであった。この方法では、遠心分離の工程において有形成分が破壊されたり、濃縮精度にばらつきが生じたりした。また、検査工程に非常に時間のかかるものであった。

上記のような塗沫標本を作成しない粒子画像解析方法または粒子画像解析装置には、サンプル試料を液体中に懸濁させた状態にてフローセル中に流し、光学的に解析するフローサイトメータ法が知られている。このフローサイトメータによる方法は、サンプル中の各粒子からの蛍光強度や散乱光強度を観測するもので、毎秒数１０００個の処理能力を備えている。しかし、粒子の形態学的特徴を反映する特徴量を観測することはむずかしく、従来、顕微鏡下で行われていた形態学的特徴で粒子を分類することができない。

連続的に流れているサンプル試料中の静止粒子画像を撮像し、それぞれの静止粒子画像から粒子を分類、解析する試みとしては、特許文献１、特許文献２、特許文献３等に記載された技術が知られている。

上記特許文献２に記載の技術では、静止粒子画像撮像系とは別にサンプル流れ中の粒子画像撮影領域より上流に粒子検出系を設けている。これは、予め粒子検出系で粒子通過を知り、その粒子が粒子画像撮像領域に達したとき適当なタイミングでパルス光源であるフラッシュランプを点灯させる方法である。この方法においては、パルス光源の発光を周期的に行わず、粒子の通過を検出した場合だけタイミングを合わせて静止粒子画像を撮像することができるので、効率的に静止粒子画像が集められ、濃度の小さいサンプル試料の場合でも粒子の存在しない無意味な画像を撮像・画像処理することはない。

ここで、サンプルが尿の場合、尿中の粒子の種類が多種にわたり、かつ大きさも異なる。代表的な値は、赤血球，白血球が１０μｍ程度，上皮細胞が数十μｍ，円柱が１００〜２００μｍである。このような場合、同一倍率で細胞を分析することは不可能であり、測定中に倍率を切り換える必要がある。特許文献４では倍率切り換えの機構を持ち、切り換えに伴いサンプル厚み，光源の光量も変化させている。また、特許文献５では検出対象粒子に応じて測定モードを切り替る機能を設けている。
特表昭５７−５００９９５号公報 特開昭６３−９４１５６号公報 特開平４−７２５４４号公報 特開平３−１０５２３５号公報 特開平２００２−７１５４８号公報

上述したように効率的に静止粒子画像が集めるには予め粒子検出系で粒子通過を知り、パルス光源の発光行う必要があるが、この粒子検出系として、通常、フローセル中を流れている測定サンプルにレーザ光束を集光して照射し、このレーザ光束を横切った粒子からの散乱光を検出する方法が用いられている。しかし、粒子検出系において、所定の粒子検出レベル以上を粒子検出の条件としても、前述のように尿中の粒子の種類が多種にわたるため、散乱光の発生状態も多種にわたる。粒子検出による光信号は光検出器により電気信号に変換されるが、光信号の大きさは、粒子の種類、特に粒子の光学的な屈折率、吸収、サイズ、粒子の内部状態などにより影響を受け、この結果、光散乱の大きさが所定の粒子検出レベルに達しない粒子も存在する。十分粒子検出レベルを下げて、全粒子を処理できる対象とすることも可能であるが、画像による粒子解析装置では１〜２μｍ程度の小さい成分は、ごみとの判別など分類精度上の問題から棄却をしている。例えば、尿検査の場合、細菌の中でも小さな球菌や、無晶性の塩類などは画像の大きさでは判断できないため、棄却せざるを得ないのが現状である。また、フローセル内を流れるサンプルには気泡が含まれることもしばしば起こるため、気泡の散乱光を撮像対象粒子と判別してしまうこともしばしば起こることである。また、粒子の形状によっては通過時における角度によって検出できる場合とできない場合が存在する。

このように従来の粒子検出レベルを固定した粒子検出方法では撮像対象に合わせた調整が困難で、撮像対象を撮り逃さないためには一定検出レベルを超えた小さな粒子を検出し、多くの撮像を行うことで効率が悪く、撮像対象粒子の検出感度を下げてしまっていた。

本発明の目的は、特定の撮像対象粒子に対する検出感度を高めた測定を行う粒子分析装置を実現することである。

本発明の粒子分析装置は、液体中に懸濁する粒子サンプルを流すフローセルと、レーザ光源と、前記フローセル中の粒子検出領域を通過する粒子を前記レーザ光源からのレーザ光束により電気信号に変換し計測する検出手段と、前記計測した電気信号を分析する分析手段と、前記分析手段の分析結果に応じて発光するフラッシュランプと、前記フローセル中の撮像領域を通過した検出粒子の静止画像を前記フラッシュランプを光源として撮像する撮像手段とを備え、前記検出手段は、複数の検出出力レベルにおける時間幅を測定し、前記分析手段は、複数の前記検出出力レベルごとの時間幅の範囲情報で構成される検出条件を有し、各検出出力レベルごとに、前記検出手段において検出された時間幅と、前記検出条件における時間幅の範囲を比較し、この比較結果に応じて前記フラッシュランプを発光させることを特徴とする。

さらに、本発明の粒子分析装置は、前記分析手段は、複数の異なる検出条件を有し、検出条件ごとに複数の前記検出出力レベルごとの時間幅の範囲情報を有することを特徴とする。
さらに、本発明の粒子分析装置は、前記分析手段は、一つの検出条件において、すべての検出出力レベルで、前記検出手段において検出された時間幅が当該検出条件における時間幅の範囲内である場合、前記フラッシュランプを発光させることを特徴とする。
さらに、本発明の粒子分析装置は、前記分析手段は、一つの検出条件において、すべての検出出力レベルで、前記検出手段において検出された時間幅が当該検出条件における時間幅の範囲内である場合の粒子の数をカウントし記録することを特徴とする。
さらに、本発明の粒子分析装置は、前記分析手段は、すべての検出出力レベル又はいずれか一つの検出出力レベルにおいて、前記検出手段において検出された時間幅が前記検出条件における時間幅の範囲内である場合、他の検出条件にかかわらず、前記フラッシュランプを発光させない検出条件を有することを特徴とする。
さらに、本発明の粒子分析装置は、前記分析手段に有する検出条件は、接続される端末装置によって変更可能であることを特徴とする。

粒子検出段階で複数の検出レベル基準を持つことで、粒子の種類及び特長に合わせた検出レベルの設定が可能になり、検出対象粒子を絞り込み、撮像効率が上がり、撮像対象粒子の検出感度を向上させることが可能になる。

以下、本発明の一実施形態について添付図面を参照して詳細に説明する。

図１は、本発明に係る粒子分析装置の一実施形態の概略構成図である。顕微鏡光源であるフラッシュランプ１を出た光は顕微鏡光軸５上を進み、フィールドレンズ２で集められ、視野絞り３、開口絞り４を通過後にコンデンサレンズ６を通ってフローセル７内の試料８上に集光される。フローセル７内の試料８を通過した光は顕微鏡対物レンズ１３により粒子画像はＴＶカメラ１４の撮像素子上に像を形成する。ＴＶカメラ１４の画像信号は画像取得部１５、レビュー操作部１７内の画像処理部１６により画像処理、演算された後、形態学的分類を行う解析段階を経て分類結果を表示部１８に分類項目ごとの濃度結果とレビュー対象画像を静止画像として表示する。試料８はシース液９に挟み込まれフローセル７内を流れ、試料カップ１１及びシース液ボトル１２からの吸引、フローセル７への突出、吸引突出時の流速、流量等の制御はフロー系制御部１０により行われる。

一方、フラッシュランプ１の発光タイミングは、粒子検出系の検出信号に従って制御される。連続発振しているレーザ光源２２からの光束２４は、コリメータレンズ２３で平行光束に変換され、シリンドリカルレンズ２５で光束の一方向のみ集束させる。レーザ集束位置はフローセル７内試料８流れの上流であり、反射鏡２６および微小反射鏡２７をへて照射される。測定対象である試料８内の粒子がレーザ光束をよぎると、レーザ光は光散乱され、この散乱光は粒子像撮影につかう顕微鏡対物レンズ１３で集められ、ハーフミラー２８で反射させ絞り２９を通過後に光検出器３０及び光検出回路３１よって電気信号に変換される。電気信号に変換された粒子信号をそれぞれ異なる検出レベル以上に達した場合にデジタル出力するレベル検出回路３２、３３、３４、３５及び時間幅計測部３６によって粒子検出信号の時間幅を計測する。レーザ光源２２は常時点灯しており、常にサンプル中の粒子が検出領域を通過するのを観察している。粒子が通過し散乱光による上記粒子検出信号の計測結果が所定のレベル以上有れば、粒子数分析部３７により粒子数をカウントし、中央制御部１９によりタイミング制御されフラッシュランプ点灯制御回路２０とフラッシュランプ駆動回路２１により粒子の画像が画像取り込み視野の定められた位置に止まるようなタイミングでフラッシュランプ１を発光する。

図２は粒子検出信号例を示す。粒子の光学的な屈折率、吸収、サイズ、粒子の内部状態などにより影響を受け粒子検出信号は標準的な粒子１００に対し、急峻な散乱光特性を示す粒子１０１とブロードな特性を示す粒子１０２とがある。粒子通過の有無を一定の検出レベルで幅計測すると検出レベルが低い場合は画像による粒子解析によって棄却される対象の小さな粒子まで検出することになり粒子検出回路による粒子検出数と画像による粒子解析数とに乖離がでてしまう。この場合は幅の大きな粒子を対象に設定することになるため急峻な散乱光特性を示す粒子１０１は検出粒子対象にはならず撮像されずに流れてしまうこととなる。また、検出レベルが高い場合は上記問題は無いが、ブロードな特性を示す粒子１０２は粒子が大きく画像による粒子解析によって棄却される対象にはならないにも関わらず、波高値が低いため検出粒子対象にはならず撮像されずに流れてしまうこととなる。棄却対象粒子１０３は画像による粒子解析が出来ない小さな粒子を示し、粒子信号を検出してもフラッシュランプ１の発光を行わぬように検出条件設定を行う必要がある。

図３は、粒子検出条件設定の例である。本実施例では上記問題点を解消するために、検出レベルの異なるレベル検出回路を４個設定し、それぞれに時間幅を計測する手段を備えている。図３の例では４つのレベルをそれぞれに異なる検出条件を持つことで粒子１００、粒子１０１、粒子１０２のそれぞれの粒子のみを検出することができるようにしている。ここで図２に示した標準的な粒子１００に対する条件は設定２００となり、条件設定２００には粒子１０１、粒子１０２、粒子１０３いずれも条件に満たない。また、図２に示した急峻な散乱光特性を示す粒子１０１に対する条件は設定２０１となり、条件設定２０１には粒子１００、粒子１０２、粒子１０３いずれも条件に満たない。図２に示したブロードな特性を示す粒子１０２に対する条件は設定２０２となり、条件設定２０２には粒子１００、粒子１０１、粒子１０３いずれも条件に満たない。上記のように検出粒子の特長に合わせた複数の条件を持つことで特定の条件を満たす粒子が通過した場合にのみフラッシュランプ１の発光を行うことで、変形上皮細胞、円柱、白血球など検出対象粒子を絞り込む。条件に上限と下限を持たせることで条件設定２００、２０１、２０２いずれの条件に満たない棄却対象粒子１０３のように、画像による粒子解析が出来ない小さな粒子を検出棄却対象粒子１０３のように画像による判定が行えない小さな粒子や気泡などの大きな粒子が通過した場合にはフラッシュランプ１の発光を行わないことで特定の分類項目の濃度測定精度を上げることが可能になる。

条件設定２００、２０１、２０２は粒子数分析部３７が有する記録部に有しており、これらの情報は、粒子数分析部３７と接続される端末装置によって変更することができる。例えば、試料を流す流速を変化させた場合は、出力が流速が遅い場合と異なるために条件設定２００、２０１、２０２を変えて測定を行う。この場合流速が遅い場合より正確ではないが、例えば、大きい粒子をざっと短い時間で調べることができる。また、撮像対象粒子を特化した測定を行う場合にも条件設定２００、２０１、２０２を変えて測定を行う。

さらに、上記複数の検出条件のいずれかに該当する場合に検出粒子対象とすることで、画像による粒子解析が可能な粒子形状や大きさの異なる数種の粒子を撮り逃がさぬようにすることができる。この場合の検出条件適合判定手順実施例を図４に示す。

レベル検出回路３２、３３、３４、３５及び時間幅計測部３６によって計測された各レベルにおける粒子信号時間幅はあらかじめ設定された条件設定２００、２０１、２０２それぞれと比較し、検出対象粒子の特長条件ごとに撮像可能な対象粒子条件を満たすか判定する。次に各条件のいずれか一つ以上条件を満たした場合にのみ撮像可能な対象粒子を検出したと判定し、フラッシュランプ１の発光を行い撮像する。

また、図４においては、各粒子における各レベルごとの条件をすべて満たしている場合、その粒子における判定条件を満たしていると判断し、そして、複数（図４では３つ）の粒子条件ごとの判定のうちいずれか一つ以上条件を満たしていれば撮像可能な対象粒子を検出したと判定し、フラッシュランプ１の発光を行い撮像するようになっている。しかし、これだけでなく、例えば、ある、一つの粒子条件を除外条件として、当該除外条件のすべてのレベルを満たす場合もしくはいずれか一つのレベルを満たす場合は他の粒子条件を満たす場合でもフラッシュランプ１の発光しないようにすることも可能である。これにより、粒子条件の設定の幅を広げることができる。

この実施例の粒子検出処理フローを図５を用いて説明する。まず、試料８のフローセル７への注入を開始する。粒子が通過したときの散乱光を光検出器３０及び光検出回路３１で検出し、レベル検出回路３２（検出レベル１）のレベル変化を時間幅計測部３６で捕らえ、レベル検出回路３２、３３、３４、３５の時間幅計測を時間幅計測部３６で行う（Ｓ１）。次にレベル検出回路３２、３３、３４、３５の時間幅計測結果が図３に示す条件設定２００に適合するか判定を行う（Ｓ２）。条件設定２００に適合しない場合は次に図３に示す条件設定２０１に適合するか判定を行う（Ｓ３）。条件設定２０１に適合しない場合は次に図３に示す条件設定２０２に適合するか判定を行う（Ｓ４）。このように条件設定２００、２０１、２０２いずれかの条件に適合した場合は粒子数分析部３７で撮像対象粒子としてカウントされる（Ｓ５）。これらの設定条件に適合するかの判定は粒子数分析部３７において行う。画像取り込み視野の定められた位置に粒子が到着するまで時間待ちの実行する（Ｓ６）。フラッシュランプ点灯制御回路２０とフラッシュランプ駆動回路２１によりフラッシュランプ１を発光する（Ｓ７）。あらかじめ定められた測定時間を経過したか判定を行う（Ｓ８）。以上が試料注入開始から試料注入終了までの粒子検出処理フローである。

また、上記の実施形態においては、条件設定２００〜２０２はフラッシュランプ１の発光の条件としたが、単に当該各条件を満たす粒子が各条件ごとにいくつあるかカウントして記録させておくこともできる。こうすることで、例えば、撮像しない小さい粒子の通過情報の事実も知ることができる。また、各粒子のレベルごとの情報を記録することもできる。これは、今後の解析データとなり得る。これらのカウントや記録は、粒子数分析部３７により行うことが可能である。

上記の各粒子におけるレベルは４段階としたが、その粒子を特定するのにふさわしい複数の段階が設定される。ただ、段階を増やす検出精度は増加するが、検出回路の増設や解析負荷の増加となるので４段階を例として上げた。もちろんこれに限定されず、例えば５段階であってもよい。

以上のように、本発明の一実施形態によれば粒子検出段階で複数の検出レベル基準を持つことで、粒子の光学的な屈折率、吸収、サイズ、粒子の内部状態などの特長を捕らえることで粒子の種類及び特長に合わせた検出レベルの設定が可能になり、検出対象粒子を絞り込み、特定の分類項目の濃度測定精度を上げることが可能になる。また、粒子検出レベルに達しないために検出できなかった粒子をなくすことができ、且つ１〜２μｍ程度の小さい成分を正確に棄却可能になるため、撮像効率が上がり、撮像対象粒子の検出感度を向上させることが可能になる。さらに、粒子検出条件が異なる複数の検出条件が結合されることにより、撮像対象粒子を撮りこぼすことなく撮像可能となり且つ、検出段階での粒子数と画像による粒子解析数の結果との一致率が向上する。

本発明に係る粒子分析装置の一実施形態を示す概略構成図である。 粒子ごとの粒子検出信号の例である。 粒子検出条件設定の例である。 粒子の検出条件適合判定の例である。 粒子検出処理フローである。

符号の説明

１ フラッシュランプ
２ フィールドレンズ
３ 視野絞り
４ 開口絞り
５ 顕微鏡光軸
６ コンデンサレンズ
７ フローセル
８ 試料
９ シース液
１０ フロー系制御部
１１ 試料カップ
１２ シース液ボトル
１３ 顕微鏡対物レンズ
１４ ＴＶカメラ
１５ 画像取得部
１６ 画像処理部
１７ レビュー操作部
１８ 表示部
１９ 中央処理部
２０ フラッシュランプ点灯制御回路
２１ フラッシュランプ駆動回路
２２ 半導体レーザ源
２３ コリメータレンズ
２４ 光束
２５ シリンドリカルレンズ
２６ 反射鏡
２７ 微小反射鏡
２８ ハーフミラー
２９ 絞り
３０ 光検出器
３１ 光検出回路
３２ レベル検出回路１（検出レベル１）
３３ レベル検出回路２（検出レベル２）
３４ レベル検出回路３（検出レベル３）
３５ レベル検出回路４（検出レベル４）
３６ 時間幅計測部
３７ 粒子数分析部
１００ 標準的な撮像対象粒子
１０１ 急峻な散乱光特性を示す撮像対象粒子
１０２ ブロードな特性を示す撮像対象粒子
１０３ 棄却対象粒子（非撮像対象粒子）
２００ 条件設定例１
２０１ 条件設定例２
２０２ 条件設定例３

Claims (6)

1. 液体中に懸濁する粒子サンプルを流すフローセルと、レーザ光源と、前記フローセル中の粒子検出領域を通過する粒子を前記レーザ光源からのレーザ光束により電気信号に変換し計測する検出手段と、前記計測した電気信号を分析する分析手段と、前記分析手段の分析結果に応じて発光するフラッシュランプと、前記フローセル中の撮像領域を通過した検出粒子の静止画像を前記フラッシュランプを光源として撮像する撮像手段とを備え、
   前記検出手段は、複数の検出出力レベルにおける時間幅を測定し、
   前記分析手段は、複数の前記検出出力レベルごとの時間幅の範囲情報で構成される検出条件を有し、各検出出力レベルごとに、前記検出手段において検出された時間幅と、前記検出条件における時間幅の範囲を比較し、この比較結果に応じて前記フラッシュランプを発光させることを特徴とする粒子分析装置。
2. 請求項１に記載の粒子分析装置において、
   前記分析手段は、複数の異なる検出条件を有し、検出条件ごとに複数の前記検出出力レベルごとの時間幅の範囲情報を有することを特徴とする粒子分析装置。
3. 請求項１又は請求項２に記載の粒子分析装置において、
   前記分析手段は、一つの検出条件において、すべての検出出力レベルで、前記検出手段において検出された時間幅が当該検出条件における時間幅の範囲内である場合、前記フラッシュランプを発光させることを特徴とする粒子分析装置。
4. 請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の粒子分析装置において、
   前記分析手段は、一つの検出条件において、すべての検出出力レベルで、前記検出手段において検出された時間幅が当該検出条件における時間幅の範囲内である場合の粒子の数をカウントし記録することを特徴とする粒子分析装置。
5. 請求項２に記載の粒子分析装置において、
   前記分析手段は、すべての検出出力レベル又はいずれか一つの検出出力レベルにおいて、前記検出手段において検出された時間幅が前記検出条件における時間幅の範囲内である場合、他の検出条件にかかわらず、前記フラッシュランプを発光させない検出条件を有することを特徴とする粒子分析装置。
6. 請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の粒子分析装置において、
   前記分析手段に有する検出条件は、接続される端末装置によって変更可能であることを特徴とする粒子分析装置。

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