JP2009294200A

JP2009294200A - Differentiation method for tight junction function restoring agent

Info

Publication number: JP2009294200A
Application number: JP2009092329A
Authority: JP
Inventors: Masumi Kurasawa; 真澄倉沢; Shohei Kuroda; 昇平黒田; Takuya Yamamoto; 卓也山本; Hiroyuki Sasaki; 博之佐々木
Original assignee: Pola Chemical Industries Inc
Current assignee: Pola Chemical Industries Inc
Priority date: 2008-05-09
Filing date: 2009-04-06
Publication date: 2009-12-17
Also published as: JP2013100356A

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a differentiation method for visually differentiating how a constituent restores the function of a damaged tight junction, the constituent being used for improving a skin barrier function lowered by incompleteness in a tight junction function. <P>SOLUTION: A tight junction damaged-skin model made by damage-treating a tight junction of a skin or a culture skin three-dimensional model and tight junction function tracers are used to visually differentiate how the function of the tight junction is restored from a change in the distribution of tracers. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、化粧料などの皮膚外用剤の有効成分のスクリーニングに有用なタイトジャンクション機能回復剤の鑑別法に関する。 The present invention relates to a method for identifying a tight junction function recovery agent useful for screening active ingredients of external preparations for skin such as cosmetics.

皮膚におけるバリア機能は、生体にとっての異物の生体内への侵入を防ぐ意味で重要な機能の一つとなっている。かかるバリア機能の不全は肌荒れ、炎症などの原因ともなり、その保全策は化粧料分野においては一大課題となっている。この様な皮膚バリア機能の因子としては、角層細胞の形状や接合状態に起因する表皮・角層のバリア機能、表皮・真皮の含水量などの皮膚保湿性などが挙げられ、単純なものではなく、多くの因子が絡み合っていることが既に知られている。これらの因子で近年特に注目されているのは、表皮顆粒層に存在するタイトジャンクション蛋白であり、かかるタイトジャンクション蛋白を介した細胞接合の不全に皮膚バリア機能の低下が起因すると言う説である。（例えば、特許文献１、特許文献２を参照）このタイトジャンクションの機能に注目した化粧料素材のスクリーニング法も前記の特許文献に開示されている。この方法では、タイトジャンクション機能の不全による皮膚バリア機能の低下を改善する成分を、数値として評価できるが、タイトジャンクションの不全に対してどの様にスクリーニング素材が働いているかを視覚的に捉えることは困難であり、この様な視覚的に皮膚バリア機能改善を捉えられる鑑別法が望まれていた。 The barrier function in the skin is one of the important functions in terms of preventing foreign bodies from entering the living body. Such insufficiency of the barrier function causes rough skin, inflammation, and the like, and its conservation measures are a major issue in the cosmetics field. Such factors of the skin barrier function include the barrier function of the epidermis and stratum corneum due to the shape and joining state of the stratum corneum cells, and the moisture retention of the skin such as the moisture content of the epidermis and dermis. It is already known that many factors are intertwined. In recent years, these factors have attracted particular attention as a tight junction protein present in the epidermal granule layer, and the theory is that a decrease in skin barrier function is caused by the failure of cell junction via the tight junction protein. (See, for example, Patent Document 1 and Patent Document 2) A screening method for a cosmetic material focusing on the function of the tight junction is also disclosed in the patent document. This method can evaluate numerically the components that improve the decrease in skin barrier function due to the failure of tight junction function, but it is not possible to visually grasp how screening materials are working against tight junction failure. It is difficult, and there has been a demand for such a differentiation method that can visually grasp the improvement of the skin barrier function.

一方、アビジンとビオチンとが特異的に結合することを利用して、細胞などを染色するマーカーとして使用することは既に知られている（例えば、特許文献３を参照）。また動物の皮膚にビオチンを注射しタイトジャンクションの結合機能をトレースすることにより、視覚的に皮膚バリア機能改善を捉えられる鑑別法も知られている（例えば、特許文献２を参照）。しかしながら、動物の皮膚においては個体差などにより皮膚の厚さが均一でなく、また注射を行うという煩雑な人為的作業によりトレーサーの投与位置、量などにばらつきが認められていた。これに対して、三次元培養皮膚モデルを用いて、タイトジャンクションの結合機能をトレースすることは全く知られていなかった。また、この様なトレーサーを用いることにより、他の皮膚生理化学的因子に関する染色法とともに二重染色しそれぞれの因子の影響度合いを視覚的に検討する試みも為されていなかった。 On the other hand, it is already known to use as a marker for staining cells and the like by utilizing the specific binding between avidin and biotin (see, for example, Patent Document 3). In addition, a differentiation method is also known in which biotin is injected into the skin of an animal and the binding function of a tight junction is traced so that the improvement of the skin barrier function can be visually grasped (see, for example, Patent Document 2). However, in the skin of animals, the thickness of the skin is not uniform due to individual differences or the like, and variation in the administration position and amount of the tracer has been recognized due to complicated manual work of injection. On the other hand, it has never been known to trace the binding function of tight junctions using a three-dimensional cultured skin model. Further, by using such a tracer, no attempt has been made to visually examine the degree of influence of each factor by double staining together with staining methods relating to other skin physiochemical factors.

タイトジャンクションの障害因子として、紫外線が知られている（例えば、特許文献４を参照）。またタイトジャンクションを傷害する可能性のある物質としては、カプリン酸などが存することは既に知られている（例えば、非特許文献１を参照）が、これを用いて、培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害し、スクリーニング用の素材とすることは全く知られていなかった。 Ultraviolet rays are known as an obstacle factor for tight junction (see, for example, Patent Document 4). Moreover, it is already known that capric acid or the like exists as a substance that may damage the tight junction (see, for example, Non-Patent Document 1). It was not known at all to damage junctions and use them as screening materials.

特開２００８−２６０９２号公報JP 2008-26092 A 特開２００６−２５０７８６号公報JP 2006-250786 A 特表２００２−５３４２１９号公報Special Table 2002-534219 特開２００７−２１０９４８号公報JP 2007-210948 A Kondoh M. et. al., Mol Pharmacol. 2005 Mar;67(3):749-56Kondoh M. et.al., Mol Pharmacol. 2005 Mar; 67 (3): 749-56

本発明は、この様な状況下為されたものであり、タイトジャンクション機能の不全による皮膚バリア機能の低下を改善する成分が、傷害されたタイトジャンクションにおいてどの様にその機能の回復をせしめるかを視覚的に鑑別できる鑑別法を提供することを課題とする。 The present invention has been made under such circumstances, and how the component that improves the deterioration of the skin barrier function due to the failure of the tight junction function can restore the function of the damaged tight junction. It is an object to provide a discrimination method that can be visually discriminated.

この様な状況に鑑みて、本発明者らは.タイトジャンクション機能の不全による皮膚バリア機能の低下を改善する成分が、傷害されたタイトジャンクションにおいてどの様にその機能の回復をせしめるかを視覚的に鑑別できる鑑別法を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、カプリン酸処理などで作製したタイトジャンクション傷害皮膚モデルを被験体で処理し、しかる後に、タイトジャンクション機能の標識処理を行い、しかる後に標識の存在状況よりタイトジャンクション機能を鑑別することにより、傷害されたタイトジャンクションの機能回復過程を視覚的に捉えられることを見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示すとおりである。
（１）皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理してなる、タイトジャンクション傷害皮膚モデル。
（２）前記皮膚乃至は皮膚三次元モデルが、培養ヒト皮膚三次元モデルであることを特徴とする、（１）に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデル。
（３）前記タイトジャンクションの傷害処理が、中鎖飽和直鎖脂肪酸処理であることを特徴とする、（１）又は（２）に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデル。
（４）皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング用であることを特徴とする、（１）〜（３）何れか１項に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデル。
（５）標識されていても良いビオチンと、標識されていても良いアビジンからなるタイトジャンクション機能トレーサーキットであって、前記ビオチン又はアビジンのどちらかは蛍光標識されていることを特徴とする、タイトジャンクション機能トレーサー。
（６）（１）〜（４）何れか１項に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデルのタイトジャンクション機能を鑑別すべきものであることを特徴とする、（５）に記載のタイトジャンクション機能トレーサーキット。
（７）（１）〜（４）何れか１項に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデルを標識されていても良いビオチンで処理する工程と、標識されていても良いビオチンで処理したタイトジャンクション傷害皮膚モデルから顕微鏡用切片を切り出す工程と、標識されていても良いアビジンで処理する工程を有する使用態様で使用されることを特徴とする、（６）に記載のタイトジャンクション機能トレーサーキット。
（８）（１）〜（４）何れか１項に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデルを被験体で処理し、しかる後に、タイトジャンクション機能の標識処理を行い、しかる後に標識の存在状況よりタイトジャンクション機能を鑑別することを特徴とする、タイトジャンクション機能回復剤の鑑別法。
（９）タイトジャンクション機能の標識処理が、（５）〜（７）何れか１項に記載のタイトジャンクション機能トレーサーによるものであることを特徴とするタイトジャンクション機能回復剤の鑑別法。
（１０）（５）〜（８）何れか１項に記載のタイトジャンクション機能回復剤の鑑別法において、コントロールに対して有意にタイトジャンクション機能回復を示すことを特徴とする、タイトジャンクション機能回復剤。
（１１）ε，γ−グルタミルリジン及び／又はパルマリア抽出物であることを特徴とする、（１０）に記載のタイトジャンクション機能回復剤。 In view of this situation, the present inventors have visually shown how a component that improves the deterioration of the skin barrier function due to the failure of the tight junction function can restore the function of the damaged tight junction. As a result of earnest research efforts to find a differentiation method that can be distinguished, the tight junction injury skin model prepared by capric acid treatment, etc. is treated with the subject, and then the tight junction function labeling treatment is performed. By distinguishing the tight junction function from the presence of the sign, it was found that the functional recovery process of the injured tight junction can be visually grasped, and the present invention has been completed. That is, the present invention is as follows.
(1) A tight junction injury skin model obtained by injuring a tight junction of skin or a cultured skin three-dimensional model.
(2) The tight junction injury skin model according to (1), wherein the skin or the skin three-dimensional model is a cultured human skin three-dimensional model.
(3) The tight junction injury skin model according to (1) or (2), wherein the injury treatment of the tight junction is a medium-chain saturated linear fatty acid treatment.
(4) The tight junction injury skin model according to any one of (1) to (3), which is used for screening for a skin barrier function improving component.
(5) A tight junction functional tray circuit composed of biotin which may be labeled and avidin which may be labeled, wherein either biotin or avidin is fluorescently labeled. Junction function tracer.
(6) The tight junction function tray circuit according to (5), wherein the tight junction function of the tight junction injury skin model according to any one of (1) to (4) should be differentiated.
(7) The step of treating the tight junction injury skin model according to any one of (1) to (4) with biotin which may be labeled, and the tight junction injury skin treated with biotin which may be labeled The tight junction functional tray circuit according to (6), characterized in that it is used in a usage mode having a step of cutting out a section for a microscope from a model and a step of treating with a labeled avidin.
(8) The tight junction injury skin model according to any one of (1) to (4) is treated with a subject, and after that, the tight junction function is labeled, and then the tight junction is determined from the presence of the label. A method for differentiating a tight junction function recovery agent characterized by distinguishing functions.
(9) A method for identifying a tight junction function recovery agent, wherein the labeling treatment of the tight junction function is performed by the tight junction function tracer according to any one of (5) to (7).
(10) In the method for identifying a tight junction function recovery agent according to any one of (5) to (8), the tight junction function recovery agent is characterized by significantly recovering the tight junction function relative to the control. .
(11) The tight junction function recovery agent according to (10), which is ε, γ-glutamyllysine and / or palmaria extract.

本発明によれば、タイトジャンクション機能の不全による皮膚バリア機能の低下を改善する成分が、傷害されたタイトジャンクションにおいてどの様にその機能の回復をせしめるかを視覚的に鑑別できる鑑別法を提供できる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the identification method which can distinguish visually how the component which improves the fall of the skin barrier function by the failure of a tight junction function makes the recovery | restoration of the function in an injured tight junction can be provided. .

＜１＞本発明のタイトジャンクション傷害皮膚モデル
本発明のタイトジャンクション傷害皮膚モデルは、皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング用のものであって、皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理してなることを特徴とする。前記の皮膚としては、所望により体毛を除去し、生体より採取した皮膚断片であって、表皮顆粒層、表皮基底層及び真皮部分からなるものが好ましく、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウサギの皮膚断片が好ましい。又、前記培養皮膚三次元モデルとしては、ヒト乃至はヒトを除く動物の皮膚より採取した、正常な（癌化していない）ケラチノサイト、フィブロブラストなどの皮膚細胞を培養し、三次元構造を構築し、皮膚の皮膚の構造に疑似させたものが好ましく、この様な形態の市販品を購入して使用することもできる。好ましい市販品としては、例えば、倉敷紡績株式会社から販売されている「EFT-400」（正常培養ヒト三次元皮膚モデル）などが好適に例示できる。特に表皮成分のみで構成される「EPI-200」や、USA MaTek社から販売されている「EpiDerm」などがさらに好適に例示できる。かかる皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルは、真皮側乃至は表皮基底層側から傷害手段を講じてタイトジャンクション部分を傷害する。傷害手段としては、例えば、紫外線や化学物質などが好ましく例示でき、紫外線であれば、波長２８０〜３２０ｎｍの紫外線を７．５〜２００ｍJ／ｃｍ^２、さらに好ましくは５０〜１６０ｍJ／ｃｍ^２の単位あたりのエネルギー量で照射すれば良く、化学的な処置であれば、カプリン酸、カプリル酸などの中鎖長（炭素数８〜１２）の脂肪族飽和直鎖脂肪酸またはその一価金属塩の０．１〜１０ｍM、さらに好ましくは０．５〜２ｍMの溶液を真皮側乃至は表皮基底層側から、５〜２４時間、さらに好ましくは１０〜１５時間作用させれば良い。また、オクルディンやクローディンの細胞外ドメインを認識する中和抗体を使用することもできる。これらの傷害処置の内、特に好ましいものは化学的傷害処置であり、なかでもカプリン酸ナトリウムによる処理が特に好ましい。これはタイトジャンクションに対して均質な損傷がなしうるからである。この様な均質な傷害は、後記の傷害タイトジャンクションの回復促進剤のスクリーニングにおいては、そのメカニズムを的確に鑑別する上で非常に重要な因子となる。処置後傷害手段は直ちに皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルより離脱させる。離脱は、紫外線照射であれば照射を終了することによりできるし、化学的傷害手段であれば、培地乃至はPBS（リン酸緩衝生理食塩水）などで洗浄することによりなしうる。斯くして得られたタイトジャンクション傷害皮膚モデルは、後記タイトジャンクション機能回復剤の鑑別法に用いられ、傷害されたタイトジャンクションの回復促進剤のスクリーニングに好適に使用される。 <1> Tight Junction Injury Skin Model of the Present Invention The tight junction injury skin model of the present invention is for screening for a skin barrier function-improving component, and treats a tight junction of a skin or a cultured skin three-dimensional model. It is characterized by. The skin is preferably a skin fragment obtained by removing body hair and collecting it from a living body, if desired, and consisting of an epidermis granule layer, an epidermis basal layer and a dermis part, and skin of mouse, rat, guinea pig, pig and rabbit Fragments are preferred. In addition, as the cultured skin three-dimensional model, normal (non-cancerous) keratinocytes, fibroblasts and other skin cells collected from human or non-human animal skin are cultured to construct a three-dimensional structure. Those which are simulated by the skin structure of the skin are preferable, and commercially available products of such a form can also be purchased and used. Preferable examples of commercially available products include “EFT-400” (normally cultured human three-dimensional skin model) sold by Kurashiki Boseki Co., Ltd. In particular, “EPI-200” composed only of an epidermis component, “EpiDerm” sold by USA MaTek, and the like can be more suitably exemplified. Such a skin or cultured skin three-dimensional model injures a tight junction portion by applying an injury means from the dermis side or the epidermal basal layer side. As the injury means, for example, ultraviolet rays and chemical substances can be preferably exemplified. In the case of ultraviolet rays, ultraviolet rays having a wavelength of 280 to 320 nm are per unit of 7.5 to 200 mJ / cm ² , more preferably 50 to 160 mJ / cm ² . In the case of chemical treatment, the saturated saturated linear fatty acid having a medium chain length (carbon number of 8 to 12) such as capric acid or caprylic acid or a monovalent metal salt thereof may be used. A solution of 1 to 10 mM, more preferably 0.5 to 2 mM, may be allowed to act for 5 to 24 hours, more preferably 10 to 15 hours from the dermis side or epidermal basal layer side. A neutralizing antibody that recognizes the extracellular domain of occludin or claudin can also be used. Among these treatments for injury, particularly preferred is a treatment for chemical injury, and treatment with sodium caprate is particularly preferred. This is because homogeneous damage can occur to tight junctions. Such homogeneous injury is a very important factor in accurately identifying the mechanism in screening for a recovery accelerator for injury tight junction described later. The post-treatment injury means is immediately removed from the skin or cultured skin three-dimensional model. Detachment can be achieved by terminating the irradiation if ultraviolet irradiation is performed, and can be performed by washing with a medium or PBS (phosphate buffered saline) or the like if chemical injury means. The tight junction injury skin model thus obtained is used for the later-described method for identifying a tight junction function recovery agent, and is preferably used for screening a recovery accelerator for an injured tight junction.

＜２＞本発明のタイトジャンクション機能トレーサーキット
本発明のタイトジャンクション機能トレーサーキットは、標識されていても良いビオチンと、標識されていても良いアビジンからなるタイトジャンクション機能トレーサーキットであって、前記ビオチン又はアビジンのどちらかは蛍光標識されていることを特徴とする。前記標識としては、例えば、フルオロセイン、ローダミン、フルオテトラメチルローダミン、ダンシルなどの蛍光標識、ルシフェリンなどの発光標識、ガリウムなどの放射性標識、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼなどの酵素標識などが例示でき、感度高く、視覚的にタイトジャンクション機能を鑑別するには、ビオチン乃至はアビジンのどちらかに蛍光標識を用いることが好ましい。タイトジャンクションの機能を鑑別するためには、本発明のキットでは、標識されていても良いビオチンを、真皮側乃至は表皮基底層側から作用させ、表皮顆粒層に向かって作用させる。この時、タイトジャンクションの機能が正常であれば標識されていても良いビオチンは表皮顆粒層で食い止められ、角層には移動しない。タイトジャンクションの機能が不全であれば、標識されていても良いビオチンは角層へと移動する。この様な皮膚組織中での、標識されていても良いビオチンの移動は標識されていても良いアビジンを作用させることにより、可視化できる。前記アビジンとしては、ビオチンとの不可逆的結合性を有するものであれば、何れも用いることが出来、例えば、ストレプトアビジン等が、その入手の容易性から好適に例示できる。かかるアビジンの標識としては、蛍光標識サクシニルビオチンなど、蛍光標識されていることが好ましい。本発明のキットについて、真皮側乃至は表皮基底層側より作用させる物質として標識されていても良いアビジンを選択し、組織中の標識されていても良いアビジンの可視化手段として標識されていても良いビオチンを用いることもできるが、タイトジャンクションの機能の正確な鑑別には、真皮側より作用させる物質として標識されていても良いビオチンを用い、該ビオチンの可視化手段として標識されていても良いアビジンを用いることがより好ましい。該ビオチンの好ましい市販品としては、EZ-Link^TM-スルフォ-NHS-LC-ビオチン（ピアス社製；PIERCE）などが好適に例示できる。また該アビジンの好ましい市販品としては、ストレプトアビジン-テキサスレッド（オンコジーン社製；ONCOGENE）などが好適に例示される。なお角層と表皮顆粒層の境界については、光学顕微鏡下で撮影した画像をもとに判断しても良いし、角層あるいは表皮顆粒層、好ましくはタイトジャンクションをトレーサーで使用するものと明らかに蛍光波長の異なる蛍光物質で標識することによって蛍光顕微鏡下で同時に判断しても良い。例えばタイトジャンクションに特異的に反応する抗体を用いることができるが、抗オクルディン抗体を用い、蛍光標識二次抗体による染色を併用した二重染色条件で本願の発明を実施することが好適に例示できる。 <2> Tight Junction Functional Tray Circuit of the Present Invention The tight junction functional tray circuit of the present invention is a tight junction functional tray circuit composed of biotin which may be labeled and avidin which may be labeled. Alternatively, either avidin is fluorescently labeled. Examples of the label include fluorescent labels such as fluorescein, rhodamine, fluotetramethylrhodamine, dansyl, luminescent labels such as luciferin, radioactive labels such as gallium, enzyme labels such as horseradish peroxidase, and the like. In order to visually distinguish the tight junction function, it is preferable to use a fluorescent label for either biotin or avidin. In order to discriminate the function of the tight junction, in the kit of the present invention, biotin which may be labeled is allowed to act from the dermis side or the epidermis basal layer side and act toward the epidermal granule layer. At this time, if the function of the tight junction is normal, biotin which may be labeled is stopped by the epidermal granular layer and does not move to the stratum corneum. If the tight junction function is defective, biotin that may be labeled moves to the stratum corneum. The movement of biotin which may be labeled in such skin tissue can be visualized by the action of avidin which may be labeled. Any avidin may be used as long as it has an irreversible binding property to biotin. For example, streptavidin can be preferably exemplified from its availability. The avidin is preferably fluorescently labeled such as fluorescently labeled succinylbiotin. For the kit of the present invention, avidin that may be labeled as a substance that acts from the dermis side or the epidermis basal layer side is selected, and it may be labeled as a means for visualizing the avidin that may be labeled in the tissue. Biotin can also be used, but for accurate discrimination of tight junction functions, biotin that may be labeled as a substance that acts from the dermis side is used, and avidin that may be labeled as a means for visualizing the biotin is used. More preferably, it is used. Preferable examples of commercially available biotin include EZ-Link ^™ -sulfo-NHS-LC-biotin (Pierce). Moreover, as a preferable commercial item of this avidin, streptavidin-Texas Red (made by Oncogene; ONCOGENE) etc. are illustrated suitably. Note that the boundary between the stratum corneum and the epidermal granule layer may be judged based on an image taken under an optical microscope, and it is clear that the stratum corneum or epidermal granule layer, preferably a tight junction is used in the tracer. You may judge simultaneously under a fluorescence microscope by labeling with the fluorescent substance from which a fluorescence wavelength differs. For example, an antibody that specifically reacts with a tight junction can be used, but it is preferable to implement the invention of the present application under double staining conditions using an anti-occludin antibody and staining with a fluorescently labeled secondary antibody. .

＜３＞本発明のタイトジャンクション機能回復剤の鑑別法
本発明のタイトジャンクション機能回復剤の鑑別法は、前記タイトジャンクション傷害皮膚モデルを検体で処理したものと、未処理のものとを、前記タイトジャンクション機能トレーサーキットで処理し、トレーサーの皮膚組織内における分布状況を調べ、表皮顆粒層から角層へのトレーサーの動きが、検体で処理することにより妨げられている蓋然性が、未処理のものに比して有意に高い場合には、前記検体の投与が皮膚のタイトジャンクションを回復させる効果を有し、該回復によって皮膚バリア機能が向上すると鑑別することを特徴とする。前記蓋然性は、タイトジャンクション傷害皮膚モデルを、蛍光顕微鏡下観察することに容易に鑑別しうる。蓋然の差の有意性は、蛍光顕微鏡の観察像をコンピューターなどに取込み、アドビ社製の「フォトショップ」などの画像処理ソフトを用いて、二値化などの画像処理を行い、蛍光部位と非蛍光部位とを分けて、角層部に透過した蛍光部位の総面積比を求め、これを統計処理することにより明らかにできる。検体未処理と、処理とにおける、この値の差が大きいほど、検体のタイトジャンクション傷害回復作用、言い換えればバリア機能の回復作用が優れると鑑別できる。又、検体の濃度は実際に皮膚に投与した場合に外挿できるように設定し、ドーズを振って用量効果をみることも好ましい。本発明の鑑別法では、画像として、タイトジャンクションの傷害からの回復が鑑別できるので、蛍光部分の偏りや、時系列的変化などを追うことにより、タイトジャンクションの回復過程のメカニズムなども知ることができる。以上の作業を工程に分けて表現すると以下のようになる。
（工程１）皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害手段により傷害し、タイトジャンクション傷害皮膚モデルを作製する工程
（工程２）タイトジャンクション傷害皮膚モデルを検体で処理する工程
（工程３）工程２の検体で処理したタイトジャンクション傷害皮膚モデルと、検体で処理しないタイトジャンクション傷害皮膚モデルをタイトジャンクション機能トレーサーキットの片方、好ましくは標識されたビオチンで処理する工程
（工程４）工程３のトレーサー処理した皮膚モデルより顕微鏡用の標本を作製する工程
（好ましくは工程５）工程４の標本を抗オクルディン抗体で処理し、蛍光標識二次抗体にて処理する工程
（工程６）工程４の標本をトレーサーキットのもう一方、好ましくは、蛍光標識アビジンで処理する工程
（工程７）工程４の標本を顕微鏡下、好ましくは蛍光顕微鏡下観察する工程
（好ましくは工程８）工程７の顕微鏡像をイメージ画像としてコンピューターに取込み、画像処理し、蛍光部と非蛍光部とに分け、角層部に透過した蛍光部の量を求める工程
（好ましくは工程９）工程８の蛍光部の量を、検体未処理の場合の工程８の蛍光部の量からの差を求め、タイトジャンクション機能の回復促進作用の有無を鑑別する工程 <3> A method for distinguishing the tight junction function recovery agent of the present invention The method for distinguishing the tight junction function recovery agent of the present invention comprises: treating the tight junction injury skin model with a specimen; Junction function Treated with a trace circuit to examine the distribution of the tracer in the skin tissue, and the probability that the tracer movement from the epidermal granule layer to the stratum corneum is hindered by the treatment with the sample is untreated. If the sample is significantly higher, the administration of the specimen has an effect of recovering the skin tight junction, and it is distinguished that the recovery improves the skin barrier function. The probability can be easily distinguished by observing a tight junction injury skin model under a fluorescence microscope. The significance of the difference in probability is that the observation image of the fluorescence microscope is taken into a computer, etc., and image processing software such as “Photoshop” made by Adobe is used for image processing such as binarization, and the fluorescence site is not detected. It can be clarified by dividing the fluorescent part and obtaining the total area ratio of the fluorescent part transmitted through the horny layer and statistically processing it. It can be discriminated that the larger the difference between the values of the untreated sample and the treated sample, the better the tight junction injury recovery action of the specimen, in other words, the better barrier function recovery action. It is also preferable to set the concentration of the specimen so that it can be extrapolated when actually administered to the skin, and observe the dose effect by shaking the dose. In the discrimination method of the present invention, recovery from tight junction injury can be discriminated as an image, so that the mechanism of the recovery process of tight junction can be known by following the bias of the fluorescent part, time-series changes, etc. it can. The above work is divided into processes and expressed as follows.
(Step 1) Step of injuring tight junction of skin or cultured skin three-dimensional model with injury means to produce tight junction injury skin model (Step 2) Step of processing tight junction injury skin model with specimen (Step 3) Step The process of treating the tight junction injury skin model treated with the specimen 2 and the tight junction injury skin model not treated with the specimen with one of the tight junction functional tray circuits, preferably labeled biotin (Step 4) and the tracer treatment of Step 3 Step of preparing a microscope specimen from the skin model (preferably step 5) Treating the specimen of step 4 with an anti-occludin antibody and treating with a fluorescent-labeled secondary antibody (step 6) Tracing the specimen of step 4 Treat with the other side of the circuit, preferably fluorescently labeled avidin Step (Step 7) Step 4 of observing the specimen of step 4 under a microscope, preferably under a fluorescence microscope (preferably step 8). The amount of fluorescent part transmitted to the stratum corneum is calculated (preferably step 9). The amount of fluorescent part in step 8 is the difference from the amount of fluorescent part in step 8 when the sample is not processed. The process of determining the presence or absence of the action to promote recovery of the tight junction function

斯くして、タイトジャンクションの傷害回復に有効であると鑑別された検体は、化粧料などの皮膚外用剤の有効成分として有用である。かかる成分を製剤上の任意成分とともに、化粧料などの皮膚外用剤に含有せしめ、皮膚に投与することにより、タイトジャンクションの傷害により、皮膚バリア機能が低下した皮膚において、タイトジャンクション機能を回復せしめ、皮膚バリア機能を向上させ、肌荒れなどの好ましくない事象を改善したり、更に悪くなるのを予防したりする作用を発現する。この様な成分が、本発明に言う、タイトジャンクション機能回復剤である。かかるタイトジャンクション機能回復剤としては、ε，γ−グルタミルリジン及び／又はパルマリア抽出物が好ましく例示できる。パルマリア抽出物とは、紅藻類のパルマリア・パルメート（Palmaria palmate）を水で抽出して、所望により限外濾過などで分子量を整え、溶媒除去した抽出物である。これらの２種の混合物が特に好ましい。かかる成分の化粧料などの皮膚外用剤における好ましい含有量は、０．０５〜１質量％である。 Thus, the specimen that has been identified as being effective for recovery from tight junction injury is useful as an active ingredient of an external preparation for skin such as cosmetics. By incorporating these ingredients into an external preparation for skin, such as cosmetics, together with optional ingredients in the preparation, and administering them to the skin, the tight junction function is restored in the skin where the skin barrier function has been lowered due to tight junction injury, It enhances the skin barrier function, and exhibits an effect of improving undesirable events such as rough skin and preventing further worsening. Such a component is a tight junction function recovery agent referred to in the present invention. Preferred examples of such a tight junction function recovery agent include ε, γ-glutamyllysine and / or palmaria extract. Palmaria extract is an extract obtained by extracting red algae Palmaria palmate with water, adjusting the molecular weight by ultrafiltration or the like, if necessary, and removing the solvent. A mixture of these two is particularly preferred. The preferable content of such components in a skin external preparation such as a cosmetic is 0.05 to 1% by mass.

以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加える。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.

（工程１）「EPI-200」を、１ｍMカプリン酸ナトリウムを含む培地で１２時間培養した。
（工程２、３）処理検体として５００μｇ／ｍｌε，γ−グルタミルリジンと０．１％パルマリア抽出物の混合物を含む、１ｍMカプリン酸ナトリウムを含まない培地に交換して培養を続け、一定時間ごとに「EPI-200」を回収する１時間前にトレーサーとして「EZ-Link^TM-スルフォ-NHS-LC-ビオチン」を最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌになるように加えた。一方、未処理検体として５００μｇ／ｍｌε，γ−グルタミルリジンと０．１％パルマリア抽出物を含まない７０％エタノール水溶液を添加し、同様に培養を続けた。
（工程４）工程１〜３で処理した「EPI-200」を回収し、「OCTコンパウンド」（サクラファインテック社製）に浸漬し、液体窒素中で凍結した。続いて凍結切片作製装置にて凍結切片標本を作製した。
（工程５）該標本をウサギ抗オクルディン抗体（インビトロジェン社製）と反応させ、その後FITC標識ロバ抗ウサギ抗体（ICN-ファーマシューティカル社製）及びストレプトアビジン-テキサスレッド（オンコジーン社製）と反応させた。
（工程６）工程５で得た標本を４８８、５４３ｎｍの２波長で、蛍光顕微鏡下で観察した。 (Step 1) “EPI-200” was cultured in a medium containing 1 mM sodium caprate for 12 hours.
(Steps 2 and 3) The culture was continued by exchanging with a medium containing no mixture of 1 mM sodium caprate containing a mixture of 500 μg / ml ε, γ-glutamyllysine and 0.1% palmaria extract as a treated specimen. One hour before collecting “EPI-200”, “EZ-Link ^™ -sulfo-NHS-LC-biotin” was added as a tracer to a final concentration of 0.1 mg / ml. On the other hand, 500 μg / ml ε, γ-glutamyllysine and a 70% ethanol aqueous solution not containing 0.1% palmaria extract were added as untreated samples, and the culture was continued in the same manner.
(Step 4) “EPI-200” treated in Steps 1 to 3 was collected, immersed in “OCT Compound” (manufactured by Sakura Finetech), and frozen in liquid nitrogen. Subsequently, a frozen section specimen was prepared with a frozen section preparation apparatus.
(Step 5) The specimen is reacted with a rabbit anti-occludin antibody (manufactured by Invitrogen), and then reacted with a FITC-labeled donkey anti-rabbit antibody (ICN-pharmaceutical) and streptavidin-Texas red (manufactured by Oncogene). It was.
(Step 6) The specimen obtained in Step 5 was observed under a fluorescence microscope at two wavelengths of 488 and 543 nm.

図１〜３は無処理コントロール、図４〜６は１ｍMカプリン酸ナトリウムで処理したときの皮膚モデル組織切片像である。図１、４はトレーサーの染色画像、図２、５は抗オクルディン抗体の染色画像（矢印）、図３、６はトレーサー、抗オクルディン抗体それぞれの染色画像を重ね合わせた像である。図１〜３より表皮基底層側（下）より添加したトレーサーが細胞間を通ってタイトジャンクションの位置（矢印、抗オクルディン抗体染色部位）、即ち顆粒層のところで止まっていることが判り、図４〜６よりカプリン酸ナトリウム処理でタイトジャンクションを傷害せしめることによってトレーサーが一部顆粒層より上の角層部分に漏出していることが判る（図６＊印）。図７〜９はその後３時間経過、図１０〜１２は６時間経過後の皮膚モデル組織切片像である。一方、図１３〜１５はタイトジャンクション傷害後に５００μｇ／ｍｌε，γ−グルタミルリジンと０．１％パルマリア抽出物の混合物を含む培地で培養した３時間経過後、図１６〜１８はその６時間経過後の皮膚モデル組織切片像である。図７、１０、１３、１６はトレーサーの染色画像、図８、１１、１４、１７は抗オクルディン抗体の染色画像（矢印）、図９、１２、１５、１８はトレーサー、抗オクルディン抗体それぞれの染色画像を重ね合わせた像である。図７〜９及び１０〜１２よりカプリン酸ナトリウムによってタイトジャンクション傷害後、カプリン酸ナトリウムを離脱せしめてもトレーサーが角層部分に漏出したままであったが（図９、１２＊印）、図１３〜１５及び１６〜１８に示すようにε，γ−グルタミルリジンとパルマリア抽出物の混合物で処理することによってトレーサーの角層部分への漏出が防がれていることが判る。なお、図１９〜２１にはタイトジャンクション傷害後に５００μｇ／ｍｌε，γ−グルタミルリジンのみを、図２２〜２４にはタイトジャンクション傷害後に０．１％パルマリア抽出物のみを添加して６時間後の結果も示す。図１９、２２はトレーサーの染色画像、図２０、２３は抗オクルディン抗体の染色画像（矢印）、図２１、２４はトレーサー、抗オクルディン抗体それぞれの染色画像を重ね合わせた像である。ε，γ−グルタミルリジン、パルマリア抽出物はいずれも単独でもトレーサーの角層部分への漏出を防ぐことが判る。即ち本鑑別法は、タイトジャンクション機能に関与した皮膚バリア改善素材のスクリーニングに適していることが判る。 1 to 3 are untreated controls, and FIGS. 4 to 6 are skin model tissue slice images when treated with 1 mM sodium caprate. 1 and 4 are stained images of the tracer, FIGS. 2 and 5 are stained images of the anti-occludin antibody (arrows), and FIGS. 3 and 6 are images obtained by superimposing the stained images of the tracer and the anti-occludin antibody, respectively. 1-3, it can be seen that the tracer added from the epidermal basal layer side (bottom) passes through the cells and stops at the position of the tight junction (arrow, anti-occludin antibody staining site), that is, at the granular layer. It can be seen from ˜6 that the tracer leaks in part of the horny layer above the granular layer by damaging the tight junction with sodium caprate treatment (FIG. 6 *). FIGS. 7-9 are skin model tissue slice images after 3 hours, and FIGS. 10-12 are skin model tissue images after 6 hours. On the other hand, FIGS. 13 to 15 show 3 hours after culturing in a medium containing a mixture of 500 μg / ml ε, γ-glutamyl lysine and 0.1% palmaria extract after tight junction injury, and FIGS. 16 to 18 show 6 hours after that. FIG. 7, 10, 13, and 16 are tracer staining images, FIGS. 8, 11, 14, and 17 are staining images (arrows) of anti-occludin antibodies, and FIGS. 9, 12, 15, and 18 are staining of tracer and anti-occludin antibodies, respectively. It is an image obtained by superimposing images. 7-9 and 10-12, the tracer remained leaking into the stratum corneum even after the sodium caprate was released after the tight junction injury with sodium caprate (FIG. 9, 12 *), FIG. It can be seen that leakage to the stratum corneum of the tracer is prevented by treatment with a mixture of ε, γ-glutamyllysine and palmaria extract as shown in -15 and 16-18. In addition, only 500 microgram / ml (epsilon), (gamma) -glutamyl lysine is shown in FIGS. 19-21 after a tight junction injury, and only the 0.1% palmaria extract is added to FIGS. 22-24 after a tight junction injury, and the result 6 hours after. Also shown. 19 and 22 are stained images of the tracer, FIGS. 20 and 23 are stained images of the anti-occludin antibody (arrows), and FIGS. 21 and 24 are images obtained by superimposing the stained images of the tracer and the anti-occludin antibody, respectively. It can be seen that ε, γ-glutamyllysine and palmaria extract alone prevent leakage to the stratum corneum of the tracer. That is, it can be seen that this discrimination method is suitable for screening for a skin barrier improving material involved in the tight junction function.

本発明は、化粧料などの皮膚外用剤の有効成分の評価に応用できる。 The present invention can be applied to the evaluation of active ingredients of external preparations for skin such as cosmetics.

無処理コントロールにおけるトレーサーの染色画像を示す図である。図中点線で囲まれた部分が角層で、それよりも下の部分が表皮層である。以下同様。（図面代用写真）It is a figure which shows the dyeing | staining image of the tracer in untreated control. The part surrounded by the dotted line in the figure is the stratum corneum, and the part below it is the epidermis layer. The same applies hereinafter. (Drawing substitute photo) 図１と同様の、抗オクルディン抗体の染色画像（矢印）を示す図である。（図面代用写真）It is a figure which shows the dyeing | staining image (arrow) of an anti- occludin antibody similar to FIG. (Drawing substitute photo) 図１と同様の、トレーサー、抗オクルディン抗体（矢印）それぞれの染色画像を重ね合わせた像を示す図である。（図面代用写真）FIG. 2 is a diagram illustrating an image obtained by superimposing stained images of a tracer and an anti-occludin antibody (arrow), similar to FIG. 1. (Drawing substitute photo) １ｍMカプリン酸ナトリウム処理におけるトレーサーの染色画像を示す図である。（図面代用写真）It is a figure which shows the dyeing | staining image of the tracer in 1 mM sodium caprate treatment. (Drawing substitute photo) 図４と同様の、抗オクルディン抗体の染色画像（矢印）を示す図である。（図面代用写真）It is a figure which shows the dyeing | staining image (arrow) of an anti- occludin antibody similar to FIG. (Drawing substitute photo) 図４と同様の、トレーサー、抗オクルディン抗体（矢印）それぞれの染色画像を重ね合わせた像を示す図である。＊印は角層部分へのトレーサーの漏出を示す。（図面代用写真）FIG. 5 is a view showing an image obtained by superimposing stained images of a tracer and an anti-occludin antibody (arrow), similar to FIG. * Indicates a leak of the tracer into the stratum corneum. (Drawing substitute photo) １ｍMカプリン酸ナトリウム処理後、カプリン酸ナトリウムを含まない培地に交換して３時間後のトレーサーの染色画像を示す図である。（図面代用写真）It is a figure which shows the dyeing | staining image of the tracer 3 hours after replacing | exchanging to the culture medium which does not contain sodium caprate after 1 mM sodium caprate treatment. (Drawing substitute photo) 図７と同様の、抗オクルディン抗体の染色画像（矢印）を示す図である。（図面代用写真）It is a figure which shows the dyeing | staining image (arrow) of an anti- occludin antibody similar to FIG. (Drawing substitute photo) 図７と同様の、トレーサー、抗オクルディン抗体（矢印）それぞれの染色画像を重ね合わせた像を示す図である。＊印は角層部分へのトレーサーの漏出を示す。（図面代用写真）It is a figure which shows the image which overlap | superposed each stained image of a tracer and an anti- occludin antibody (arrow) similar to FIG. * Indicates a leak of the tracer into the stratum corneum. (Drawing substitute photo) １ｍMカプリン酸ナトリウム処理後、カプリン酸ナトリウムを含まない培地に交換して６時間後のトレーサーの染色画像を示す図である。（図面代用写真）It is a figure which shows the dyeing | staining image of the tracer 6 hours after replacing | exchanging to the culture medium which does not contain sodium caprate after 1 mM sodium caprate treatment. (Drawing substitute photo) 図１０と同様の、抗オクルディン抗体の染色画像（矢印）を示す図である。（図面代用写真）It is a figure which shows the dyeing | staining image (arrow) of an anti- occludin antibody similar to FIG. (Drawing substitute photo) 図１０と同様の、トレーサー、抗オクルディン抗体（矢印）それぞれの染色画像を重ね合わせた像を示す図である。＊印は角層部分へのトレーサーの漏出を示す。（図面代用写真）It is a figure which shows the image which overlap | superposed each stained image of a tracer and an anti- occludin antibody (arrow) similar to FIG. * Indicates a leak of the tracer into the stratum corneum. (Drawing substitute photo) １ｍMカプリン酸ナトリウム処理後、カプリン酸ナトリウムを含まず、５００μｇ／ｍｌε，γ−グルタミルリジンと０．１％パルマリア抽出物の混合物を含む培地に交換して３時間後のトレーサーの染色画像を示す図である。（図面代用写真）The figure which shows the dyeing | staining image of the tracer 3 hours after replacing | exchanging to the culture medium which does not contain sodium caprate, but contains 500 micrograms / ml epsilon, (gamma) -glutamyl lysine, and a 0.1% palmaria extract after 1 mM sodium caprate treatment. It is. (Drawing substitute photo) 図１３と同様の、抗オクルディン抗体の染色画像（矢印）を示す図である。（図面代用写真）It is a figure which shows the dyeing | staining image (arrow) of an anti- occludin antibody similar to FIG. (Drawing substitute photo) 図１３と同様の、トレーサー、抗オクルディン抗体（矢印）それぞれの染色画像を重ね合わせた像を示す図である。＊印は角層部分へのトレーサーの漏出を示す。（図面代用写真）It is a figure which shows the image which overlap | superposed each stained image of a tracer and an anti- occludin antibody (arrow) similar to FIG. * Indicates a leak of the tracer into the stratum corneum. (Drawing substitute photo) １ｍMカプリン酸ナトリウム処理後、カプリン酸ナトリウムを含まず、５００μｇ／ｍｌε，γ−グルタミルリジンと０．１％パルマリア抽出物の混合物を含む培地に交換して６時間後のトレーサーの染色画像を示す図である。（図面代用写真）The figure which shows the dyeing | staining image of the tracer 6 hours after replacing | exchanging to the culture medium which does not contain sodium caprate, but contains 500 micrograms / ml epsilon, (gamma) -glutamyl lysine, and a 0.1% palmaria extract after 1 mM sodium caprate treatment. It is. (Drawing substitute photo) 図１６と同様の、抗オクルディン抗体の染色画像（矢印）を示す図である。（図面代用写真）It is a figure which shows the dyeing | staining image (arrow) of an anti- occludin antibody similar to FIG. (Drawing substitute photo) 図１６と同様の、トレーサー、抗オクルディン抗体（矢印）それぞれの染色画像を重ね合わせた像を示す図である。（図面代用写真）FIG. 17 is a view showing an image obtained by superimposing stained images of a tracer and an anti-occludin antibody (arrow), similar to FIG. (Drawing substitute photo) １ｍMカプリン酸ナトリウム処理後、カプリン酸ナトリウムを含まず、５００μｇ／ｍｌε，γ−グルタミルリジンを含む培地に交換して６時間後のトレーサーの染色画像を示す図である。（図面代用写真）It is a figure which shows the dyeing | staining image of the tracer 6 hours after replacing | exchanging to the culture medium which does not contain sodium caprate but contains 500 microgram / ml (epsilon), gamma-glutamyl lysine after 1 mM sodium caprate treatment. (Drawing substitute photo) 図１９と同様の、抗オクルディン抗体の染色画像（矢印）を示す図である。（図面代用写真）It is a figure which shows the dyeing | staining image (arrow) of an anti- occludin antibody similar to FIG. (Drawing substitute photo) 図１９と同様の、トレーサー、抗オクルディン抗体（矢印）それぞれの染色画像を重ね合わせた像を示す図である。（図面代用写真）FIG. 20 is a view showing an image obtained by superimposing stained images of a tracer and an anti-occludin antibody (arrow), similar to FIG. (Drawing substitute photo) １ｍMカプリン酸ナトリウム処理後、カプリン酸ナトリウムを含まず、０．１％パルマリア抽出物を含む培地に交換して６時間後のトレーサーの染色画像を示す図である。（図面代用写真）It is a figure which shows the dyeing | staining image of the tracer 6 hours after replacing | exchanging to the culture medium which does not contain sodium caprate but contains 0.1% palmaria extract after 1 mM sodium caprate treatment. (Drawing substitute photo) 図２２と同様の、抗オクルディン抗体の染色画像（矢印）を示す図である。（図面代用写真）It is a figure which shows the dyeing | staining image (arrow) of an anti- occludin antibody similar to FIG. (Drawing substitute photo) 図２２と同様の、トレーサー、抗オクルディン抗体（矢印）それぞれの染色画像を重ね合わせた像を示す図である。（図面代用写真）FIG. 23 is a view showing an image obtained by superimposing stained images of a tracer and an anti-occludin antibody (arrow), similar to FIG. (Drawing substitute photo)

Claims

A tight junction injury skin model obtained by performing injury treatment on a skin or a three-dimensional model skin tight junction.

The tight junction injury skin model according to claim 1, wherein the skin or skin three-dimensional model is a cultured human skin three-dimensional model.

The tight junction injury skin model according to claim 1 or 2, wherein the injury treatment of the tight junction is a medium-chain saturated linear fatty acid treatment.

The tight junction injury skin model according to any one of claims 1 to 3, wherein the tight junction injury skin model is used for screening for a skin barrier function improving component.

A tight junction functional tracer consisting of biotin which may be labeled and avidin which may be labeled, wherein either biotin or avidin is fluorescently labeled .

The tight junction function tray circuit according to claim 5, wherein the tight junction function of the tight junction injury skin model according to any one of claims 1 to 4 should be identified.

A microscopic section from a step of treating the tight junction injury skin model according to any one of claims 1 to 4 with biotin which may be labeled, and a tight junction injury skin model treated with biotin which may be labeled. The tight junction functional tray circuit according to claim 6, wherein the tight junction functional tray circuit is used in a usage mode having a step of cutting out a slag and a step of treating with an avidin which may be labeled.

A tight junction injury skin model according to any one of claims 1 to 4 is treated with a subject, and after that, a tight junction function labeling treatment is performed, and then the tight junction function is distinguished from the presence of the label. A method for identifying a tight junction function recovery agent.

A method for identifying a tight junction function recovery agent, wherein the labeling treatment of the tight junction function is performed by the tight junction function tracer according to any one of claims 5 to 7.

The tight junction function recovery agent according to any one of claims 5 to 8, wherein the tight junction function recovery agent significantly exhibits a tight junction function recovery relative to a control.

The tight junction function recovery agent according to claim 10, which is ε, γ-glutamyllysine and / or palmaria extract.