JP2009271014A - サンプル反応装置およびサンプル反応方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】転写膜に転写されたサンプルと、反応液とを均一に反応させるサンプル反応装置を提供する。
【解決手段】サンプル１１１を吸着するサンプル吸着領域１１２を備えている吸着構造体１１０と、反応液１２１を貯め、サンプル吸着領域１１２が反応液１２１と接するように吸着構造体１１０を収納する反応槽１２０と、吸着構造体１１０を反応槽１２０内で回転させる駆動手段１３０とを備えており、サンプル吸着領域１１２は、該回転の回転軸を覆う面上に設けられているサンプル反応装置１００を提供する。
【選択図】図１
【解決手段】サンプル１１１を吸着するサンプル吸着領域１１２を備えている吸着構造体１１０と、反応液１２１を貯め、サンプル吸着領域１１２が反応液１２１と接するように吸着構造体１１０を収納する反応槽１２０と、吸着構造体１１０を反応槽１２０内で回転させる駆動手段１３０とを備えており、サンプル吸着領域１１２は、該回転の回転軸を覆う面上に設けられているサンプル反応装置１００を提供する。
【選択図】図１
Description
本発明は、サンプルを反応液と反応させるために用いる装置および方法に関するものである。
ヒトゲノムプロジェクトが終了した後、プロテオーム研究が盛んに行われている。「プロテオーム」とは、特定の細胞、器官、臓器の中で翻訳生産されているタンパク質全体が意図され、その研究としてはタンパク質のプロファイリングなどが挙げられる。
タンパク質をプロファイリングする手法の１つとして最も用いられているものが、タンパク質の電気泳動、特に２次元電気泳動である。タンパク質は、電荷および分子量の独特の性質を有しているので、多数のタンパク質の混合物であるプロテオームから電荷のみまたは分子量のみに依存して個々のタンパク質を各成分に分離するよりも、両者を組み合わせることにより、より多くのタンパク質を高分解能にて分離することができる。
電気泳動によってタンパク質は電荷および／または分子量によって分離されるが、このような物理的性質のみで分離したタンパク質についてその分離位置から生物学的性質を特定することは困難である。また、タンパク質は合成された後にリン酸化などの化学的修飾（翻訳後修飾）を受けることによりその機能が制御されることが知られている。電気泳動のみではこのような翻訳後修飾に関する情報を得ることは困難である。
ウェスタンブロッティング法は電気泳動によって分離されたスラブゲル中のタンパク質を膜に転写する方法である。ウェスタンブロッティング法によりタンパク質が転写された膜上に特定の抗体をオーバーレイすれば、抗原抗体反応に基づいてタンパク質をある程度特定することが可能となる。また、翻訳後修飾の１つであるリン酸化について、タンパク質が転写された膜に抗リン酸化タンパク質抗体をオーバーレイすることにより、リン酸化の有無、リン酸化部位の相違を検出することが可能となる。
タンパク質が転写された膜上に特定の抗体をオーバーレイする方法は、通常、転写膜をタッパーウェアーやビニールバックなどの中において、ブロッキング緩衝液、一次抗体、洗浄液、および二次抗体のそれぞれと反応させることによって行われ、これらは通常手作業である。このとき、上記反応を促進させるために、上記タッパーウェアーまたはビニールバッグを往復運動または回転運動させることも行われる。また、特許文献１に記載のような検出法も開発されている。
特開２００４−１６３１４６号公報（平成１６年６月１０日公開）
しかしながら、従来技術では、転写膜に転写されたサンプルと、反応液とを均一に反応させることは困難であった。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、転写膜に転写されたサンプルと、反応液とを均一に反応させるサンプル反応装置を提供することを主たる目的とする。
本発明に係るサンプル反応装置は、上記課題を解決するために、サンプルを吸着するサンプル吸着領域を備えている吸着構造体と、反応液を貯め、該サンプル吸着領域が該反応液と接するように該吸着構造体を収納する反応槽と、該吸着構造体を該反応槽内で回転させる駆動手段とを備えており、該サンプル吸着領域は、該回転の回転軸を覆う面上に設けられていることを特徴としている。
上記の構成によれば、上記サンプル吸着領域は、上記反応液内で、水車のように途切れなく回転運動する。それゆえ、従来技術のように往復運動させた場合に比べ、上記サンプルと上記反応液とを均一に反応させることができ、従来技術のように、上記反応槽ごと回転させた場合と比べ、該回転槽の運動に伴う該反応液の偏りを避けることができるので、上記サンプルと上記反応液とを均一に反応させることができるという効果を奏する。
上記サンプル反応装置では、上記回転軸を覆う面が、上記回転軸と平行な面であることが好ましい。
上記の構成によれば、上記サンプル吸着領域が、回転軸と平行な面上に設けられている。そのため、上記サンプル吸着領域は、上記回転軸を中心とする回転に対して、直交する線から構成される。そのため、上記各線上のサンプル１１１は、上記回転に伴う移動速度が等しく、均一にサンプル１１１と反応液１２１とを接触させることができる。
上記サンプル反応装置では、上記回転軸を覆う面が、円柱面、または楕円柱面であることが好ましい。
上記の構成によれば、上記反応液内における上記サンプル吸着領域の運動をより滑らかにすることができるため、上記サンプルと、該反応液との反応のむらを抑制することができる。
上記サンプル反応装置では、上記吸着構造体が、上記サンプル吸着領域が設けられている転写膜と、該転写膜を支持する転写膜支持体とを備えていてもよい。
上記の構成によれば、上記転写膜上に上記サンプル吸着領域が設けられているため、上記サンプルを容易に上記吸着構造体に吸着させることができるという効果を奏する。
上記サンプル反応装置では、上記転写膜支持体と上記転写膜との間に空隙が設けられていることが好ましい。また、上記転写膜支持体が、上記駆動手段による回転の回転軸に平行な直線に斜めに交わる方向に沿った溝が設けられていることが好ましい。
上記の構成によれば、上記反応液が、上記転写膜の裏側を通過することが可能となる。そのため、上記反応液の流動が容易となり、上記サンプルと該反応液とをより均一に反応させることができるという効果を奏する。
上記サンプル反応装置では、上記吸着構造体が、上記サンプル吸着領域を覆うカバーをさらに備えていてもよい。
上記の構成によれば、上記サンプル吸着領域の外側にカバーが備えられているので、上記吸着構造体に上記サンプルを吸着させたまま保存することができるという効果を奏する。
上記サンプル反応装置では、上記カバーが、上記反応液が透過させることが好ましい。
上記の構成によれば、上記カバーが、上記反応液を透過するため、該カバーを付けたまま、上記吸着構造体を上記反応槽に収納させ、回転させることにより、上記サンプルと上記反応液とを反応させることができるという効果を奏する。
上記サンプル反応装置では、上記反応槽の内面が、半円柱面状、または六角柱以上の多角柱を長さ方向に対して平行な中心軸を通る面で切断したときの壁面状であることが好ましい。
上記の構成によれば、上記反応槽が、半円柱面か、または半円柱面に近い形状を有しているため、回転する上記吸着構造体をスペースの無駄なく収納することができ、これにより、必要となる上記反応液の液量を抑えられるという効果を奏する。
上記サンプル反応装置では、上記反応槽の内面に、上記回転軸に平行な直線に斜めに交わる方向に沿った溝または突起が設けられていてもよい。
上記の構成によれば、上記吸着構造体の回転により生じる上記反応液の該回転の方向に沿った流動が、該回転軸に平行な直線に斜めに交わる方向に沿った溝または突起によって、斜めに方向転換され、該反応液が、該回転の方向だけでなく、斜めの方向にも流動され、該反応液がより攪拌されるため、上記サンプルと該反応液とをより均一に反応させることができるという効果を奏する。
上記サンプル反応装置では、上記反応槽に、上記反応液を添加する添加手段と、該反応槽から流出する該反応液を受ける廃液槽とをさらに備えていてもよい。
上記の構成によれば、未反応の上記反応液を新たに添加し、反応済みの該反応液を回収することができるので、上記サンプルと未反応の該反応液とを反応させることができるという効果を奏する。
上記サンプル反応装置では、上記サンプルがタンパク質であり、上記反応液が、該タンパク質の抗体を含んでいるものであってもよい。
上記の構成によれば、二次元電気泳動によって分離されたタンパク質のように、均一に抗体と反応させることが重要なサンプルを均一に該抗体と反応させることができるという効果を奏する。
上記サンプル反応装置では、複数の上記反応槽を備えており、上記駆動手段が、上記吸着構造体を任意の該反応槽に移動させるものであってもよい。
上記の構成によれば、上記反応槽が複数であるので、一連の反応（例えば、抗体免疫反応における、ブロッキング反応、一次抗体反応、および二次抗体反応等）を連続して行うことができるという効果を奏する。
上記サンプル反応装置では、上記サンプルがタンパク質であり、上記複数の反応槽が、ブロッキング緩衝液を貯める第１反応槽、該タンパク質に結合する一次抗体を含む反応液を貯める第２反応槽、該一次抗体に結合する二次抗体を含む反応液を貯める第３反応槽、洗浄液を貯める第４反応槽を含んでいてもよい。
上記の構成によれば、二次元電気泳動によって分離されたタンパク質のウェスタンブロッティング後の上記サンプルの検出を好適に行うことができる。
本発明に係るサンプル反応装置はまた、サンプルを吸着する転写膜を支持する転写膜支持体と、反応液を貯め、該転写膜支持体が保持する転写膜が該反応液と接するように該転写膜支持体を収納する反応槽と、該転写膜支持体を該反応槽内で回転させる回転手段とを備えており、該転写膜支持体は、該転写膜を、該回転の回転軸を覆う面上に支持するものであってもよい。
上記の構成によれば、上記転写膜上に設けられたサンプル吸着領域は、該転写膜が上記転写膜支持体に支持されることにより、上記反応液内で回転運動する。それゆえ、上記サンプルと上記反応液とを均一に反応させることができるという効果を奏する。
本発明に係るサンプル反応方法は、サンプルを吸着するサンプル吸着領域を備えている吸着構造体を、反応液が貯められた反応槽内で回転させる工程を包含しており、該サンプル吸着領域は、該回転の回転軸を覆う面上に設けられていることを特徴としている。
上記の構成によれば、本発明に係るサンプル反応装置と同等の効果を奏することができる。
本発明に係るサンプル保存用チップは、一つの軸を覆うように設けられている、サンプルを吸着するサンプル吸着領域と、該サンプル吸着領域を覆うカバーとを備えていることを特徴としている。
上記の構成によれば、本発明に係るサンプル反応装置に組み込むための吸着構造体であって、サンプルが吸着されたまま保存可能なサンプル保存用チップを提供することができる。
本発明に係る第２のサンプル反応装置は、サンプルを吸着するサンプル吸着領域を備えている吸着構造体と、反応液を貯め、該サンプル吸着領域が該反応液と接するように該吸着構造体を収納する複数の反応槽と、該吸着構造体を任意の該反応槽に移動させる駆動手段とを備えているものであってもよい。
上記の構成によれば、複数の上記反応槽を備え、上記吸着構造体を該反応槽間で移動させる駆動手段を備えているので、一連の反応（例えば、抗体免疫反応における、ブロッキング反応、一次抗体反応、および二次抗体反応等）を連続して行うことができるという効果を奏する。
本発明に係る第２のサンプル反応方法は、サンプルを吸着するサンプル吸着領域を備えている吸着構造体を、第１反応液が貯められた第１反応槽内に移動させる第１反応工程と、第１反応工程の後に、上記吸着構造体を、第２反応液が貯められた第２反応槽に移動させる第２反応工程とを包含することを特徴としている。
上記の構成によれば、本発明に係る第２のサンプル反応装置と同等の効果を奏することができる。
本発明に係るサンプル反応装置は、サンプルを吸着するサンプル吸着領域を備えている吸着構造体を、反応液を貯める反応槽内で回転させるので、該サンプルを該反応液と均一に反応させることができる。
本発明は、サンプル反応装置を提供する。本明細書において、サンプル反応装置とは、サンプルを反応液と接触させるための装置が意図される。
用語「サンプル」は当該分野において標本、調製物と同義で用いられ、本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」またはその等価物が意図される。「生物学的サンプル」は、供給源としての生物材料（例えば、個体、体液、細胞株、組織培養物もしくは組織切片）から得られる、任意の調製物が意図される。生物学的サンプルとしては、体液（例えば、血液、唾液、歯垢、血清、血漿、尿、滑液、および随液）および組織供給源が挙げられる。好ましい生物学的サンプルは、被験体サンプルである。好ましい被験体サンプルは、被験体から得た皮膚病変部、喀痰、咽頭粘液、鼻腔粘液、膿、または分泌物である。本明細書中で使用される場合、用語「組織サンプル」は、組織供給源より得られた生物学的サンプルが意図される。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は当該分野で周知である。本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」としては、上記生物学的サンプルおよび上記組織サンプル以外に、上記生物学的サンプルおよび上記組織サンプルより抽出したタンパク質サンプル、ゲノムＤＮＡサンプルおよび／または総ＲＮＡサンプルも挙げられる。
本明細書において、用語「反応液」は、サンプルと反応させるための液状の試薬が意図される。本発明に係るサンプル反応装置に用いるための反応液としては、例えば、抗体溶液、酵素溶液、染色液、洗浄液、緩衝液等を用いることができるが、特に限定されず、用いるサンプルおよび目的に応じて当該分野において周知慣用の試薬を用いることができる。一例を挙げれば、本発明に係るサンプル反応装置を、ウェスタンブロッティング法により転写膜に転写されたタンパク質を抗体によって検出するために用いる場合、反応液としては、ブロッキング緩衝液、上記タンパク質と特異的に結合する一次抗体、該一次抗体と特異的に結合する二次抗体、洗浄液等のいずれかを好適に用いることができる。また、本発明に係るサンプル反応装置を、サザンブロッティング法により転写膜に転写されたＤＮＡをプローブＤＮＡによって検出するために用いる場合、プローブＤＮＡを含んだ溶液を反応液として用いることができる。さらに、反応液として、染色液を用いることにより、本発明に係るサンプル反応装置を、タンパク質の全自動染色装置として利用することもできる。上記染色液としては、タンパク質そのものを染色するもの、タンパク質の糖残基、リン酸基、ニトロ基等を染色するもの等を用いることができる。そのような染色液としては、これに限定されるものではないが、市販の、SYPRO Ruby（インビトロジェン株式会社）、MemCode Reversible Protein Stain Kit（タカラバイオ株式会社）、GelCode Glycoprotein Staining Kit（テクノケミカル（株））、Deep Purple Total Protein Stain（GEヘルスケア）等を用いることができる。
図１は、本発明の一実施形態に係るサンプル反応装置１００の概略構成を示す断面図である。また、図２は、サンプル反応装置１００の概略構成を示す斜視図である。図１および２に示すように、本実施形態に係るサンプル反応装置１００は、吸着構造体１１０と、反応槽１２０と、回転駆動部（駆動手段）１３０とを備えている。吸着構造体１１０は、転写膜１１５と、転写膜支持体１１４とを備えており、転写膜１１５上には、サンプル１１１を吸着するサンプル吸着領域１１２が設けられている。また、反応槽１２０には、反応液１２１が貯められている。回転駆動部１３０は、反応槽１２０側に設けられたモーター１３２およびギアセット１３３と、吸着構造体１１０に結合しているギア１３４とを備えている。
このように、サンプル反応装置１００は、サンプル１１１を吸着するサンプル吸着領域１１２を備えており、サンプル吸着領域１１２に吸着されたサンプル１１１と、反応液１２１とを接触させる。後述するように、本発明によれば、上記サンプル吸着領域の全域に渡って均一に、上記サンプルと上記反応液とを接触させることができる。そのため、従来なし得なかった、サンプルを反応液とを均一に反応させることが可能である。
サンプル吸着領域１１２は、サンプル１１１を吸着するものであればよく、サンプル１１１の吸着には、化学的、電気的、または物理的な特性等を用いることができる。
本実施形態では、吸着構造体１１０は、転写膜１１５と、転写膜１１５を支持する転写膜支持体１１４とから構成されており、転写膜１１５上に、サンプル吸着領域１１２が設けられている。なお、吸着構造体１１０は、転写膜支持体１１４と、転写膜１１５とから構成されている必要はなく、例えば、吸着構造体１１０が、棒状、またはパイプ状であって、表面にサンプル吸着領域１１２が設けられている構成であってもよい。
転写膜上にサンプルを吸着させる方法は、特に限定されず、周知慣用の方法（例えば、ウェスタンブロッティング、細胞の溶解物等を滴下等）を用いることができる。また、吸着構造体１１０が棒状、またはパイプ状であって、表面にサンプル吸着領域１１２が設けられている構成である場合には、吸着構造体１１０を、サンプル１１１が吸着しているゲル等の上を転がすことにより吸着させてもよい。
反応槽１２０は、反応液１２１を貯め、サンプル吸着領域１１２が反応液１２１と接するように吸着構造体１１０を収納する。なお、サンプル１１１または反応液１２１の性質に応じて、反応槽１２０の底面にペルチェ素子などを配置して、温度コントロールをおこなってもよい。
回転駆動部（駆動手段）１３０は、吸着構造体１１０を、反応槽１２０内において、回転軸１３１の周りに回転させるものであればよい。本実施形態では、モーター１３２の回転がギアセット１３３に伝えられ、ギアセット１３３とギア１３４とがかみ合うことによって、吸着構造体１１０を回転させることができる。このとき、回転軸１３１は、反応槽１２０内に設定され、ギアセット１３３は、ギア１３４の中心が回転軸１３１に一致する位置で、ギア１３４とかみ合うように設けられている。なお、モーター１３２は、吸着構造体１１０の内部に設けられていてもよく、その場合は、ギア１３４が、処理槽１２０に固定されたギアセット１３３にかみ合うことによって、吸着構造体１１０を回転させる。
ここで、図１および２に示すように、サンプル吸着領域１１２は、回転軸１３１を覆う面上に設けられている。それゆえ、吸着構造体１１０が回転することにより、サンプル反応領域１１２と反応液１２１とを良好に接触させることができる。なお、回転軸１３１を覆う面とは、回転軸１３１を取り囲むように設けられた面の外面である。
図３は、転写膜支持体１１４の構造のバリエーションを示す斜視図である。転写膜支持体１１４は、図３（ａ）に示すように棒状であってもよく、図３（ｂ）に示すようにパイプ状の構造体であってもよいが、図３（ｃ）に示すようなスクリュー状の構造体、図３（ｄ）に示すようなメッシュ状の構造体とすることにより、転写膜１１５との間に空隙を有するように転写膜１１５を支持することができる。転写膜支持体１１４が、転写膜１１５との間に空隙を有するように転写膜１１５を支持する場合、上記回転の際に、転写膜１１５の裏側にも反応液１２１が流動することになる。それゆえ、反応液１２１が滞留することがなく、サンプル１１１と、反応液１２１とをより好適に接触させることができる。
図４は、転写膜支持体１１４と転写膜１１５との結合様式のバリエーションを示す断面図である。転写膜１１５は、転写膜支持体１１４に設けられた結合部１１６に結合されている。結合部１１６の構造は、例えば、図４（ａ）に示すように、転写膜１１５を挟むスリットであってもよいし、図４（ｂ）に示すように、転写膜１１５を接着する接着物（磁石、両面テープ等）であってもよいし、図４（ｃ）に示すように、転写膜支持体１１４全体で転写膜１１５を挟み込む分割部であってもよく、転写膜１１５を支持することができる構造であれば特に限定されない。
図５〜７は、サンプル吸着領域１１２が設けられる面１１３を説明する模式図である。面１１３は、回転軸１３１を覆うように設けられていればよく、回転軸１３１と平行な面であることが好ましい。面１１３が、回転軸１３１と平行な面であれば、サンプル吸着領域１１２は、移動方向に直交する線から構成される面１１３上に設けられる。そのため、上記各線上のサンプル１１１は、それぞれが上記回転に伴う移動速度が等しく、均一にサンプル１１１と反応液１２１とを接触させることができる。なお、特定の直線に平行な面とは、該直線とは交わらない面を指す。
一つの局面において、面１１３は、図５（ａ）に示すように、回転軸１３１を中心軸１１９とする円柱面である。この場合、図５（ｂ）に示すように、面１１３上の各点は、反応液１２１内を同条件かつ滑らかに移動する。そのため、より均一にサンプル１１１と反応液１２１とを接触させることができる。
他の一つの局面において、面１１３は、図６（ａ）に示すように、回転軸１３１に平行な軸を中心軸１１９とする円柱面である。この場合、図５（ｂ）に示すように、面１１３上の各点は、反応液１２１内を滑らかに移動する。さらに、面１１３の回転により、反応液１２１が攪拌され、より好適にサンプル１１１と反応液１２１とを接触させることができる。なお、回転軸１３１と、面１１３の中心軸１１９との距離は、面１１３の半径の５０％以下であることが好ましい。上記距離が、上記半径の０％を超えれば、反応液１２１を攪拌することができる。上記距離が、上記半径の５０％以下であれば、反応液１２１とサンプル１１１とをより確実に接触させることができる。
さらに他の局面において、面１１３は、図７（ａ）に示すように、回転軸１３１を中心軸１１９とする楕円柱面である。この場合、図５（ｂ）に示すように、面１１３上の各点は、反応液１２１内を滑らかに移動する。さらに、面１１３の回転により、反応液１２１が攪拌され、より好適にサンプル１１１と反応液１２１とを接触させることができる。なお、面１１３の扁平率（長軸の長さ（ａ）−短軸の長さ（ｂ）／長軸の長さ（ａ））は、０．５以下であることが好ましい。上記扁平率が０を超えれば、反応液１２１を攪拌することができる。上記扁平率が０．５以下であれば、反応液１２１とサンプル１１１とをより均一に接触させることができる。
また、吸着構造体１１０は、サンプル吸着領域１１２を保護するための構造を備えていてもよい。図８は、カバー１１７を備えた吸着構造体１１０の概略構成を示す斜視図である。図９は、カバー１１７を備えた吸着構造体１１０の概略構成を示す断面図である。図８および９に示すように、カバー１１７は、転写膜１１５の外側に設けられ、サンプル吸着領域１１２を覆っている。そのため、サンプル吸着領域１１２に吸着したサンプル１１１が、他の物品と接触することを防ぐことができる。それゆえ、吸着構造体１１０を、サンプル１１１を吸着させたまま保存することが可能となる。このような、カバー１１７を備えた吸着構造体１１０は、２ＤＥチップとして予め冷蔵保存しておき、病気になった時に、装置にセットすることによって病気の診断などに再利用することが可能である。すなわち、本発明はまた、上述したような構成を有するサンプル保存用チップを提供する。
カバー１１７はまた、反応液１２１を透過させることが好ましい。そのようなカバー１１７としては、これに限定されるものではないが、開口部１１８を有し、開口部１１８から反応液１２１が入出可能であってもよい。開口部１１８は、切れ込みであってもよく、メッシュ状であってもよい。このとき、図９に示すように、カバー１１７がセットされた状態で吸着構造体１１０を、反応槽１２０内に収納して回転させた場合であっても、開口部１１８を介して反応液１２１が、サンプル吸着領域１１２に到達するため、サンプル１１１と、反応液１２１とを反応させることができる。なお、カバー１１７が、反応液１２１を透過しない場合は、吸着構造体１１０を、反応槽１２０に収納する前に、カバー１１７を除去すればよい。
図１０は、反応槽１２０のバリエーションを示す斜視図である。図１０（ａ）および（ｂ）に示すように、反応槽１２０の内面は、半円柱面、または半円柱面状、または六角柱以上の多角柱を長さ方向に対して平行な中心軸を通る面で切断したときの壁面状であることが好ましい。反応槽１２０の内面が半円柱面であれば、該半円柱面の中心軸と、吸着構造体１１０の回転軸を同じ位置とすることにより、吸着構造体１１０を好適に収納することができる。特に、吸着構造体１１０の直径と、反応槽１２０の内面の直径がほぼ等しい場合、反応槽１２０内に、吸着構造体１１０をわずかな隙間で収納することができる。このわずかな隙間に反応液１２１を充填することにより、わずかな液量で、反応液１２１を、吸着構造体１１０の広い範囲に接触させることができ、反応液１２１の必要量を低減させることができる。なお、反応槽１２０の内面が、半円柱面ではなく、上記壁面状であっても、半円柱面に近い効果を得ることができる。
反応槽１２０の内面にはまた、図１０（ｃ）に示すように回転軸１３１に平行な直線に斜めに交わる方向に沿った溝または突起が設けられていることが好ましい。図１１は、そのような溝または突起が設けられた反応層１２０の上面図である。図１１（ａ）は、反応槽１２０の片側に溝または突起が設けられた構成を示し、図１１（ｂ）は、反応槽１２０の両側に溝または突起が設けられた構成を示す。このとき、吸着構造体１１０の回転によって、反応液１２１が、該回転の方向に沿って流動するが、その流動方向が、上記の溝または突起に沿って斜めに方向転換される（図中矢印の方向）。それゆえ、反応液１２１の流動方向が一方向にならずに、攪拌され、サンプル１１１と反応液１２１とをより均一に接触させることができる。
本実施形態に係るサンプル反応装置１００は、例えば、二次元電気泳動によって分離されたタンパク質が転写された転写膜１１５について使用することができる。そのような転写膜は、面積が大きいため、従来技術では、全体を均一に反応液１２１と反応させることが困難であった。また、二次元電気泳動の解析のためには、特に、各部の濃度が均一であることが重要であるため、本実施形態に係るサンプル反応装置１００を特に好適に用いることができる。
本発明に係るサンプル反応装置はまた、反応槽を複数備えている構成であってもよい。図１２は、本発明の他の実施形態に係るサンプル反応装置２００の概略構成を示す模式図であり、図１２（ａ）は断面図を示し、図１２（ｂ）は上面図を示す。図１２に示すように、本実施形態に係るサンプル反応装置２００は、吸着構造体２１０と、反応槽２２０、２２２、２２４、および２２６と、廃液槽２２８と、駆動部（駆動手段）２３０とを備えている。反応槽２２０、２２２、２２４、および２２６には、それぞれ反応液２２１、２２３、２２５、および２２７が貯められている。駆動部２３０は、モーター２３２、ギアセット２３３およびアーム２３４を備えている。
吸着構造体２１０としては、上述したサンプル反応装置１００における吸着構造体１１０と同様のものを用いることができる。アーム２３４は、吸着構造体２１０を、任意の反応槽に移動させる。
したがって、本実施形態に係るサンプル反応装置２００を用いれば、所定の反応槽に吸着構造体２１０を移動させることにより、一連の反応を順次行うことができる。例えば、サンプル反応装置２００を、ブロッキング処理、一次抗体との反応、洗浄、および二次抗体との反応の一連の反応に用いることができる。この場合、反応液２２１としては、ブロッキング緩衝液、反応液２２３としては、一次抗体を含んだブロッキング緩衝液、反応液２２５としては、二次抗体を含んだブロッキング反応液、反応液２２７としては洗浄液とすることができる。
また、反応槽２２６には、反応液２２７としての洗浄液を、例えば、被添加部２２９において、逐次添加してもよい。その場合、あふれ出た反応液２２７を回収する廃液槽２２８を、図４に示すように、反応槽２２６に隣接させて設ければよい。
上述したように、本実施形態に係るサンプル反応装置２００を用いれば、一連の反応を順次行うことができるため、ウェスタンブロッティング結果の検出等の煩雑な工程を自動化することができる。サンプル反応装置２００の一実施例の写真を図１３に示す。
すなわち、他の観点から言えば、サンプル反応装置２００は、複数の反応槽を備え、サンプルを吸着する吸着構造体を、各反応槽を順次移動させることにより、一連の反応を自動化できることを目的の１つとしている。
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
（サンプルが吸着された転写膜の調製）
転写膜としては、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｒｏｎ−ｐＳＱ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた。サンプルとしては、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ（Ｃ−３９３４、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）の希釈系列（＃１：５．６３ｎｍｏｌｅ、＃２：５６３ｐｍｏｌｅ、＃３：５６．３ｐｍｏｌｅ、＃４：５．６３ｐｍｏｌｅ、＃５：５６３ｆｍｏｌｅ、＃６：５６．３ｆｍｏｌｅ）を用いた。希釈には蒸留水を用いた。
転写膜としては、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｒｏｎ−ｐＳＱ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた。サンプルとしては、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ（Ｃ−３９３４、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）の希釈系列（＃１：５．６３ｎｍｏｌｅ、＃２：５６３ｐｍｏｌｅ、＃３：５６．３ｐｍｏｌｅ、＃４：５．６３ｐｍｏｌｅ、＃５：５６３ｆｍｏｌｅ、＃６：５６．３ｆｍｏｌｅ）を用いた。希釈には蒸留水を用いた。
上記転写膜を、スクリーナーブロッター（サンプラテック社）に設置し、上記サンプルをそれぞれ８５μｌずつアプライし、４０分間静置して、該転写膜上に該サンプルを吸着させた。
（ブロッキング工程）
次に、上記転写膜をブロッキング緩衝液（１．５％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（２４．２ｇ／４Ｌ）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（３５ｇ／４Ｌ）））と３０分間反応させた。
次に、上記転写膜をブロッキング緩衝液（１．５％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（２４．２ｇ／４Ｌ）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（３５ｇ／４Ｌ）））と３０分間反応させた。
（一次抗体との反応工程）
ブロッキング処理後、上記転写膜を、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体（抗Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ ウサギ抗体（ＮＥ０２３／７Ｓ、Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂ．））と反応させた。
ブロッキング処理後、上記転写膜を、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体（抗Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ ウサギ抗体（ＮＥ０２３／７Ｓ、Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂ．））と反応させた。
（洗浄工程−１）
一次抗体との反応後、上記転写膜を、洗浄液（ＴＢＳ−Ｔ）により洗浄した。洗浄は３回５分ずつ行った。
一次抗体との反応後、上記転写膜を、洗浄液（ＴＢＳ−Ｔ）により洗浄した。洗浄は３回５分ずつ行った。
（二次抗体との反応工程）
洗浄後、上記転写膜を、ブロッキング緩衝液で希釈した二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ａ２１２４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．））と反応させた。
洗浄後、上記転写膜を、ブロッキング緩衝液で希釈した二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ａ２１２４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．））と反応させた。
（洗浄工程−２）
一次抗体との反応後、上記転写膜を、洗浄液（ＴＢＳ−Ｔ）により５分ずつ３回洗浄した。その後さらに、洗浄液（ＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（２４．２ｇ／４Ｌ）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（３５ｇ／４Ｌ））により５分間洗浄した。
一次抗体との反応後、上記転写膜を、洗浄液（ＴＢＳ−Ｔ）により５分ずつ３回洗浄した。その後さらに、洗浄液（ＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（２４．２ｇ／４Ｌ）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（３５ｇ／４Ｌ））により５分間洗浄した。
得られた転写膜上のバンドを、蛍光スキャナー（Typhoon TRIO+、GEヘルスケア社）により検出した。
〔実施例１〕
上述した、ブロッキング処理、一次抗体との反応、洗浄、および二次抗体との反応を、図１２に示すような、ブロッキング処理、一次抗体との反応、洗浄、および二次抗体との反応の、それぞれの反応のための反応槽を備えた、本発明に係るサンプル反応装置を用いて行った。また、転写膜支持体として、直径１９ｍｍの、図３（ｃ）に示すようなスクリュー形状のものを用いた。また、ブロッキング処理、一次抗体との反応、および二次抗体との反応のための反応槽として、直径２０ｍｍの半円柱形状のものを用い、洗浄のための反応槽として、直径２２ｍｍの半円柱形状のものを用いた。すべての反応は、２０℃、７０％の条件下で行った。
上述した、ブロッキング処理、一次抗体との反応、洗浄、および二次抗体との反応を、図１２に示すような、ブロッキング処理、一次抗体との反応、洗浄、および二次抗体との反応の、それぞれの反応のための反応槽を備えた、本発明に係るサンプル反応装置を用いて行った。また、転写膜支持体として、直径１９ｍｍの、図３（ｃ）に示すようなスクリュー形状のものを用いた。また、ブロッキング処理、一次抗体との反応、および二次抗体との反応のための反応槽として、直径２０ｍｍの半円柱形状のものを用い、洗浄のための反応槽として、直径２２ｍｍの半円柱形状のものを用いた。すべての反応は、２０℃、７０％の条件下で行った。
ブロッキング工程、一次抗体との反応工程、洗浄工程、二次抗体との反応工程は、それぞれのための反応槽内において、上記転写膜を支持する支持体を１８回転／分の速度で回転させることにより行った。
ブロッキング工程における、ブロッキング緩衝液の液量は５ｍｌとした。一次抗体または二次抗体との反応工程における反応液は、１μｌの上記抗体を全量５ｍｌとなるように希釈したものを用い、反応時間は６０分間とした。
結果を図１４（ａ）に示す。
〔実施例２〕
一次抗体または二次抗体との反応工程における反応時間を１５分間とした以外は、実施例１と同様に反応を行った。結果を図１４（ｂ）に示す。
一次抗体または二次抗体との反応工程における反応時間を１５分間とした以外は、実施例１と同様に反応を行った。結果を図１４（ｂ）に示す。
〔実施例３〕
一次抗体または二次抗体との反応工程における反応液を、１μｌの上記抗体を全量１．２３ｍｌとなるように希釈したものを用い、反応時間を１５分間とした以外は、実施例１と同様に反応を行った。結果を図１４（ｃ）に示す。
一次抗体または二次抗体との反応工程における反応液を、１μｌの上記抗体を全量１．２３ｍｌとなるように希釈したものを用い、反応時間を１５分間とした以外は、実施例１と同様に反応を行った。結果を図１４（ｃ）に示す。
〔比較例１〕
上述した、ブロッキング処理、一次抗体との反応、洗浄、および二次抗体との反応を、従来法により行った。具体的には、袋中に、上記転写膜と、上記各反応液とを投入した後、該袋を密封して袋ごと１８回転／分の速度で回転させた。反応はすべて室温で行った。
上述した、ブロッキング処理、一次抗体との反応、洗浄、および二次抗体との反応を、従来法により行った。具体的には、袋中に、上記転写膜と、上記各反応液とを投入した後、該袋を密封して袋ごと１８回転／分の速度で回転させた。反応はすべて室温で行った。
ブロッキング工程における、ブロッキング緩衝液の液量は２５ｍｌとした。一次抗体または二次抗体との反応工程における反応液は、５μｌの上記抗体を全量５ｍｌとなるように希釈したものを用い、反応時間は６０分間とした。洗浄工程における洗浄液の液量は２５ｍｌとした。結果を図１４（ｄ）に示す。
図１４（ａ）〜（ｃ）と図１４（ｄ）とを比較すれば判るように、従来法により得られたバンドは、中央部が薄くなっている（図１４（ｄ）参照）のに対し、本発明に係るサンプル反応装置を用いた場合は、全体が均一に発色している（図１４（ａ）〜（ｃ）参照）。
また、本発明に係るサンプル反応装置を用いることにより、従来法により得られたバンド（図１４（ｄ）参照）とほぼ同等の発色が、一次抗体および二次抗体の濃度を薄くした場合（図１４（ａ）参照）、該濃度を薄くし、さらに一次抗体および二次抗体との反応時間を短くした場合（図１４（ｂ）参照）、ならびに、一次抗体および二次抗体との反応工程において、反応液の液量を少なくし、さらに反応時間を短くした場合（図１４（ｃ）参照）においても得られた。
本発明は、各種実験装置、検査装置、および測定装置等の分野において利用可能である。
１００ サンプル反応装置
１１０ 吸着構造体
１１１ サンプル
１１２ サンプル吸着領域
１１３ 面
１１４ 転写膜支持体
１１５ 転写膜
１１６ 結合部
１１７ カバー
１１８ 開口部
１１９ 中心軸
１２０ 反応槽
１２１ 反応液
１２２ 溝
１３０ 回転駆動部（駆動手段）
１３１ 回転軸
１３２ モーター
１３３ ギアセット
１３４ ギア
２００ サンプル反応装置
２１０ 吸着構造体
２２０ 第１反応槽
２２１ 第１反応液
２２２ 第２反応槽
２２３ 第２反応液
２２４ 第３反応槽
２２５ 第３反応液
２２６ 第４反応槽
２２７ 第５反応液
２２８ 廃液槽
２２９ 添加部
２３２ モーター
２３３ ギアセット
２３４ アーム
１１０ 吸着構造体
１１１ サンプル
１１２ サンプル吸着領域
１１３ 面
１１４ 転写膜支持体
１１５ 転写膜
１１６ 結合部
１１７ カバー
１１８ 開口部
１１９ 中心軸
１２０ 反応槽
１２１ 反応液
１２２ 溝
１３０ 回転駆動部（駆動手段）
１３１ 回転軸
１３２ モーター
１３３ ギアセット
１３４ ギア
２００ サンプル反応装置
２１０ 吸着構造体
２２０ 第１反応槽
２２１ 第１反応液
２２２ 第２反応槽
２２３ 第２反応液
２２４ 第３反応槽
２２５ 第３反応液
２２６ 第４反応槽
２２７ 第５反応液
２２８ 廃液槽
２２９ 添加部
２３２ モーター
２３３ ギアセット
２３４ アーム
Claims (19)
- サンプルを吸着するサンプル吸着領域を備えている吸着構造体と、
反応液を貯め、該サンプル吸着領域が該反応液と接するように該吸着構造体を収納する反応槽と、
該吸着構造体を該反応槽内で回転させる駆動手段とを備えており、
該サンプル吸着領域は、該回転の回転軸を覆う面上に設けられていることを特徴とするサンプル反応装置。 - 上記回転軸を覆う面が、上記回転軸と平行な面であることを特徴とする請求項１に記載のサンプル反応装置。
- 上記回転軸を覆う面が、円柱面、または楕円柱面であることを特徴とする請求項１または２に記載のサンプル反応装置。
- 上記吸着構造体が、上記サンプル吸着領域が設けられている転写膜と、該転写膜を支持する転写膜支持体とを備えていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のサンプル反応装置。
- 上記転写膜支持体と上記転写膜との間に空隙が設けられていることを特徴とする請求項４に記載のサンプル反応装置。
- 上記転写膜支持体に、上記回転軸に平行な直線に斜めに交わる方向に沿った溝が設けられていることを特徴とする請求項４または５に記載のサンプル反応装置。
- 上記吸着構造体が、上記サンプル吸着領域を覆うカバーをさらに備えていることを特徴とする請求項１〜６の何れか一項に記載のサンプル反応装置。
- 上記カバーが、上記反応液を透過させることを特徴とする請求項７に記載のサンプル反応装置。
- 上記反応槽の内面が、半円柱面状、または六角柱以上の多角柱を長さ方向に対して平行な中心軸を通る面で切断したときの壁面状であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載のサンプル反応装置。
- 上記反応槽の内面に、上記回転軸に平行な直線に斜めに交わる方向に沿った溝または突起が設けられていることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載のサンプル反応装置。
- 上記反応槽に上記反応液を添加する添加手段と、該反応槽から流出する該反応液を受ける廃液槽とをさらに備えていることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載のサンプル反応装置。
- 複数の上記反応槽を備えており、上記駆動手段が、上記吸着構造体を任意の該反応槽に移動させることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載のサンプル反応装置。
- 上記サンプルがタンパク質であり、上記反応液が、該タンパク質の抗体を含んでいることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載のサンプル反応装置。
- 上記サンプルがタンパク質であり、上記複数の反応槽が、ブロッキング緩衝液を貯める第１反応槽、該タンパク質に結合する一次抗体を含む反応液を貯める第２反応槽、該一次抗体に結合する二次抗体を含む反応液を貯める第３反応槽、および洗浄液を貯める第４反応槽を含んでいることを特徴とする請求項１２に記載のサンプル反応装置。
- サンプルを吸着する転写膜を支持する転写膜支持体と、
反応液を貯め、該転写膜支持体が支持する転写膜が該反応液と接するように該転写膜支持体を収納する反応槽と、
該転写膜支持体を該反応槽内で回転させる駆動手段とを備えており、
該転写膜支持体は、該転写膜を、該回転の回転軸を覆う面上に支持することを特徴とするサンプル反応装置。 - サンプルを吸着するサンプル吸着領域を備えている吸着構造体を、反応液が貯められた反応槽内で回転させる工程を包含しており、
該サンプル吸着領域は、該回転の回転軸を覆う面上に設けられていることを特徴とするサンプル反応方法。 - 一つの軸を覆うように設けられている、サンプルを吸着するサンプル吸着領域と、該サンプル吸着領域を覆うカバーとを備えていることを特徴とするサンプル保存用チップ。
- サンプルを吸着するサンプル吸着領域を備えている吸着構造体と、
反応液を貯め、該サンプル吸着領域が該反応液と接するように該吸着構造体を収納する複数の反応槽と、
該吸着構造体を任意の該反応槽に移動させる駆動手段とを備えていることを特徴とするサンプル反応装置。 - サンプルを吸着するサンプル吸着領域を備えている吸着構造体を、第１反応液が貯められた第１反応槽内に移動させる第１反応工程と、
第１反応工程の後に、上記吸着構造体を、第２反応液が貯められた第２反応槽に移動させる第２反応工程とを包含することを特徴とするサンプル反応方法。
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| JP2008123928A JP4512840B2 (ja) | 2008-05-09 | 2008-05-09 | サンプル反応装置およびサンプル反応方法 |
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| JP2008123928A JP4512840B2 (ja) | 2008-05-09 | 2008-05-09 | サンプル反応装置およびサンプル反応方法 |
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| KR102198240B1 (ko) | 2017-12-08 | 2021-01-04 | 서울대학교산학협력단 | 회전기판 적용 생체물질 분석시스템 및 방법 |
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