JP2009254248A - Gene for controlling nonmovement of mouse in tail suspension test and forced swimming test - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、尾懸垂テスト(TST)および強制水泳テスト(FST)におけるマウスの無動時間を減少させる作用を有するタンパク質をコードする単離された変異ユビキチン特異的ペプチダーゼ（usp46）遺伝子および当該作用を有する変異USP46タンパク質に関する。また、本発明は変異usp46遺伝子を有するコンジェニックマウスに関する。 The present invention relates to an isolated mutant ubiquitin-specific peptidase (usp46) gene encoding a protein having an action of reducing the immobility time of a mouse in a tail suspension test (TST) and a forced swimming test (FST) and the action. It has a mutant USP46 protein. The present invention also relates to a congenic mouse having a mutant usp46 gene.
正常なマウスを水槽の中で強制的に泳がせたり（強制水泳テスト(FST)）、尾を固定してぶら下げたりする（尾懸垂テスト(TST)）と、逃避しようとして暴れるが、しばらくすると逃避を放棄して無動状態になる。この無動状態に陥った時間（無動時間）がヒトにおける鬱状態の程度を反映するとされており、抗鬱薬を評価する１つのパラメーターとなっている。 When normal mice are forced to swim in the aquarium (forced swimming test (FST)) or the tail is fixed and hung (tail suspension test (TST)), they try to escape, but after a while they escape. Abandon and become immobile. This time of immobility (immobility time) is considered to reflect the degree of depression in humans, and is one parameter for evaluating antidepressants.
遺伝的に純化された近交系マウスや遺伝子改変マウスを用いたFSTおよびTSTにおける無動時間の解析は、抗鬱薬の評価や鬱関連行動の発現機序を探る上で極めて有用であり、従来から多くの研究がなされている（非特許文献１、非特許文献２）。
Analysis of immobility time in FST and TST using genetically purified inbred and genetically modified mice is extremely useful for evaluating antidepressant drugs and exploring the mechanism of depression-related behavior. Many researches have been made (Non-Patent
しかしながら、強制水泳や尾懸垂行動のような複雑な遺伝形質の解析は極めて困難であるために、それらの行動を支配している遺伝子を特定することは未だ実現していない。 However, since it is extremely difficult to analyze complex genetic traits such as forced swimming and tail suspension behavior, it has not yet been possible to identify genes that control these behaviors.
従って当該分野において、強制水泳や尾懸垂行動を支配している遺伝子を特定し、その遺伝子を鬱病や躁病などの気分障害の発現機序の解明や有効な抗鬱薬などの気分障害改善薬の開発のために利用することが望まれていた。 Therefore, in this field, the genes that control forced swimming and tail suspension behavior are identified, the genes are used to elucidate the mechanism of mood disorders such as depression and gonorrhea, and the development of effective anti-depressant drugs such as antidepressants. It was hoped to use for.
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、正常なマウスと異なり、CSマウス（Abe Hら、J comp Physiol 184(3):234-251,1999；Watanabe Tら、NeuroSci Res 54(4):295-301,2006）はTSTおよびFSTにおいて無動時間を全く示さない異常行動を示すことを見出した。そこでCSマウスと野生型マウスとを交配し、染色体上の遺伝子マーカーを用いてどの染色体部位がどちらの系統から由来したかを明らかにして、無動時間の長短と比較した（QTL（量的形質遺伝子座群）解析）。その結果、この異常行動に関わっている遺伝子座群が第5染色体上にあることを見出した。さらに、CSマウスと野生型マウスとの交配により作製したコンジェニックマウスおよびサブコンジェニックマウスを用いた解析より、TSTおよびFSTにおける無動化を支配している責任遺伝子が第5染色体上のユビキチン特異的ペプチダーゼ46（usp46）遺伝子であることを見出し、さらに異常行動を示すマウスにおいてはこのusp46遺伝子が変異していることを見出した。そして、変異usp46遺伝子を有するマウスへ野生型usp46遺伝子を導入するレスキュー実験を行い、TSTおよびFSTにおける無動化行動がusp46遺伝子によって支配されていることを確認した。本願発明者らは、これらの知見を基に本発明を完成させるに至った。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that, unlike normal mice, CS mice (Abe H et al., J comp Physiol 184 (3): 234-251,1999; Watanabe T et al., NeuroSci Res 54 (4): 295-301, 2006) found that TST and FST showed abnormal behavior that showed no immobility time. Thus, CS mice were bred with wild-type mice, using which genetic markers on the chromosomes were used to clarify which chromosomal site originated from which strain, and compared with the length of immobility time (QTL (quantitative trait) (Locus group) analysis). As a result, we found that the locus group involved in this abnormal behavior is on
すなわち、本願発明は以下のとおりである。
［１］ 配列番号１の塩基配列、または該塩基配列に１から数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加もしくは挿入を含む塩基配列からなり、TSTおよびFSTにおける無動時間を減少させる作用を有するタンパク質をコードする単離された変異ユビキチン特異的ペプチダーゼ（usp46）遺伝子。
［２］ 配列番号３のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加もしくは挿入を含むアミノ酸配列からなり、TSTおよびFSTにおける無動時間を減少させる作用を有する変異ユビキチン特異的ペプチダーゼ（USP46）タンパク質。
［３］ ［１］の遺伝子を含む発現ベクター。
［４］ ［３］の発現ベクターを含む形質転換体。
［５］ CSマウスと野生型マウスとの交配により得られる、［１］の遺伝子を含むコンジェニックマウス。
［６］ ［１］の遺伝子をホモ接合型で有する、［５］のコンジェニックマウス。
That is, the present invention is as follows.
[1] It consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence that includes deletion, substitution, addition or insertion of one to several nucleotides in the nucleotide sequence, and has the effect of reducing immobility time in TST and FST An isolated mutant ubiquitin-specific peptidase (usp46) gene encoding a protein.
[2] It consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence containing a deletion, substitution, addition or insertion of one to several amino acids in the amino acid sequence, and has the effect of reducing immobility time in TST and FST Mutant ubiquitin-specific peptidase (USP46) protein.
[3] An expression vector comprising the gene of [1].
[4] A transformant comprising the expression vector of [3].
[5] A congenic mouse containing the gene of [1] obtained by crossing a CS mouse with a wild-type mouse.
[6] The congenic mouse of [5], which has the gene of [1] in a homozygous form.
本発明の変異usp46遺伝子は、ヒトでの鬱状態の程度を反映していると考えられている、TSTおよびFSTにおける無動時間を減少させることが可能である。さらに、本発明の変異usp46遺伝子は、ムシモール（GABAA受容体のアゴニスト）に対する反応性の低下、営巣行動の低下、アルコール嗜好性の低下、明暗周期下の明開始に伴う活動亢進などの行動異常を生じ得る。 The mutant usp46 gene of the present invention can reduce the immobility time in TST and FST, which is believed to reflect the degree of depression in humans. Furthermore, the mutant usp46 gene of the present invention has a behavioral abnormality such as decreased responsiveness to muscimol (GABA A receptor agonist), decreased nesting behavior, decreased alcohol preference, and increased activity associated with the onset of light under the light-dark cycle. Can result.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、配列番号１の塩基配列、または該塩基配列に１から数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加もしくは挿入を含む塩基配列からなり、TSTおよびFSTにおける無動時間を減少させる作用を有するタンパク質をコードする単離された変異ユビキチン特異的ペプチダーゼ（usp46）遺伝子に関する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence comprising a deletion, substitution, addition or insertion of one to several nucleotides in the nucleotide sequence, and has the effect of reducing immobility time in TST and FST. The present invention relates to an isolated mutant ubiquitin-specific peptidase (usp46) gene encoding a protein having the same.
本発明の変異usp46遺伝子は、配列番号１の塩基配列からなり、野生型usp46遺伝子の塩基配列（配列番号２：NM_177561.2）における271〜273位の塩基を欠失している。 The mutant usp46 gene of the present invention consists of the base sequence of SEQ ID NO: 1, and lacks the bases at positions 271 to 273 in the base sequence of the wild type usp46 gene (SEQ ID NO: NM_177561.2).
また、本発明の変異usp46遺伝子には、配列番号１の塩基配列において、1から数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入を有し、かつTSTおよびFSTにおける無動時間を減少させる作用を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるものも含まれ得る。「1から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、1から20個、好ましくは1から10個、より好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個、あるいは1個または2個である。 In addition, the mutant usp46 gene of the present invention has a deletion, substitution, addition or insertion of 1 to several nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and an effect of reducing immobility time in TST and FST Those consisting of a base sequence encoding a protein having a phenotype can also be included. Although the range of “1 to several” is not particularly limited, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, further preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to Three, or one or two.
また、本発明の変異usp46遺伝子には、配列番号１の塩基配列に相補的な配列からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつTSTおよびFSTにおける無動時間を減少させる作用を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるものも含まれ得る。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ナトリウム濃度が、10mM〜300mM、好ましくは20〜100mMであり、温度が25℃〜70℃、好ましくは42℃〜55℃での条件をいう。 In addition, the mutant usp46 gene of the present invention has an action of hybridizing with a base sequence consisting of a sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and reducing the immobility time in TST and FST. What consists of a base sequence which codes the protein which has is also included. Here, the stringent condition refers to a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. For example, the sodium concentration is 10 mM to 300 mM, preferably 20 to 100 mM, and the temperature Refers to conditions at 25 ° C to 70 ° C, preferably 42 ° C to 55 ° C.
さらに、本発明の変異usp46遺伝子には、配列番号１の塩基配列とBLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメーター）を用いて計算したときに、80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつTSTおよびFSTにおける無動時間を減少させる作用を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるものも含まれ得る。このような遺伝子には、例えば、マウスと異なる哺乳動物種（例えば、ヒト）のオルソログをコードする遺伝子が含まれ得る。 Further, the mutant usp46 gene of the present invention includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information)) (for example, , Default or default parameters), consisting of a base sequence having a homology of 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more, and immobility in TST and FST Those consisting of a base sequence encoding a protein having the effect of reducing time can also be included. Such genes can include, for example, genes encoding orthologs of mammalian species (eg, humans) different from mice.
本発明の変異usp46遺伝子がコードするタンパク質は、野生型のusp46遺伝子がコードするタンパク質と比較して、TSTおよびFSTにおける無動時間を25％以上、好ましくは50％以上、さらに好ましくは75％以上、特に好ましくは90％以上減少させる作用を有し得る。 The protein encoded by the mutant usp46 gene of the present invention has an immobility time in TST and FST of 25% or more, preferably 50% or more, more preferably 75% or more compared to the protein encoded by the wild-type usp46 gene. Particularly preferably, it may have a function of reducing by 90% or more.
本発明の変異usp46遺伝子がコードするタンパク質は、鬱状態の程度を緩和する効果を有し得る。 The protein encoded by the mutant usp46 gene of the present invention may have an effect of alleviating the degree of depression.
また、本発明の変異usp46遺伝子がコードするタンパク質は、野生型のusp46遺伝子がコードするタンパク質と比較して、ムシモール（GABAA受容体のアゴニスト）に対する反応性の低下、営巣行動の低下、アルコール嗜好性の低下、明暗周期下の明開始に伴う活動亢進などの行動異常を生じさせ得る。 In addition, the protein encoded by the mutant usp46 gene of the present invention is less responsive to muscimol (GABA A receptor agonist), decreased nesting behavior, alcohol preference compared to the protein encoded by the wild-type usp46 gene. It can cause behavioral abnormalities such as decreased sex and increased activity associated with the start of light under the light-dark cycle.
本発明はまた、配列番号３のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に1から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を含むアミノ酸配列からなり、TSTおよびFSTにおける無動時間を減少させる作用を有する変異USP46タンパク質に関する。 The present invention also comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or an amino acid sequence comprising a deletion, substitution, addition or insertion of one to several amino acids in the amino acid sequence, and the effect of reducing immobility time in TST and FST It relates to a mutant USP46 protein having
本発明の変異USP46タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列からなり、野生型USP46タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４：NM_177561.2）における第91位のリシン残基を欠失している。 The mutant USP46 protein of the present invention consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and lacks the lysine residue at position 91 in the amino acid sequence of the wild-type USP46 protein (SEQ ID NO: NM — 177561.2).
また、本発明の変異USP46タンパク質には、配列番号３のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を有し、かつTSTおよびFSTにおける無動時間を減少させる作用を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列からなるものも含まれ得る。「1から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、1から20個、好ましくは１から10個、より好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個、あるいは1個または2個である。このようなタンパク質には、例えば、マウスと異なる哺乳動物種（例えば、ヒト）のオルソログなどが含まれ得る。 In addition, the mutant USP46 protein of the present invention has a deletion, substitution, addition or insertion of one to several amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and has an effect of reducing immobility time in TST and FST Those consisting of an amino acid sequence encoding a protein having can be included. Although the range of “1 to several” is not particularly limited, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to Three, or one or two. Such proteins can include, for example, orthologs of mammalian species (eg, humans) different from mice.
また、本発明の変異USP46タンパク質は、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に標識ペプチドを結合させた融合タンパク質の形態であっても良い。代表的な標識ペプチドには、6〜10残基のヒスチジンリピート（Hisタグ）、FLAG、mycペプチド、GFPポリペプチドなどが挙げられるが、標識ペプチドはこれらに限られるものではない。 The mutant USP46 protein of the present invention may be in the form of a fusion protein in which a labeled peptide is bound to the C-terminus or N-terminus of the polypeptide. Representative labeled peptides include histidine repeats (His tag) of 6 to 10 residues, FLAG, myc peptide, GFP polypeptide, etc., but the labeled peptide is not limited to these.
本発明の変異USP46タンパク質は、野生型のUSP46タンパク質と比較して、TSTおよびFSTにおける無動時間を25％以上、好ましくは50％以上、さらに好ましくは75％以上、特に好ましくは90％以上減少させる作用を有し得る。 The mutant USP46 protein of the present invention reduces the immobility time in TST and FST by 25% or more, preferably 50% or more, more preferably 75% or more, and particularly preferably 90% or more compared to the wild-type USP46 protein. May have an effect of
本発明の変異USP46タンパク質は、鬱状態の程度を緩和する効果を有し得る。 The mutant USP46 protein of the present invention may have the effect of alleviating the degree of depression.
また、本発明の変異USP46タンパク質は、野生型のUSP46タンパク質と比較して、ムシモール（GABAA受容体のアゴニスト）に対する反応性の低下、営巣行動の低下、アルコール嗜好性の低下、明暗周期下の明開始に伴う活動亢進などの行動異常を生じさせ得る。 In addition, the mutant USP46 protein of the present invention is less responsive to muscimol (GABA A receptor agonist), lower nesting behavior, lower alcohol preference, lower light / dark cycle than wild-type USP46 protein. It can cause behavioral abnormalities such as hyperactivity associated with the onset of light.
本発明の変異USP46タンパク質は、下記の本発明の形質転換体より、当業者にとって周知であるように、遺伝子工学的手法を用いて、製造・精製することが可能である。 The mutant USP46 protein of the present invention can be produced and purified from the following transformant of the present invention using genetic engineering techniques as is well known to those skilled in the art.
本発明はまた、上記変異usp46遺伝子を含む発現ベクターに関する。 The present invention also relates to an expression vector containing the mutant usp46 gene.
本発明の発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによって、変異usp46遺伝子にコードされる変異USP46タンパク質を発現させることが可能である。 By introducing the expression vector of the present invention into an appropriate host cell, the mutant USP46 protein encoded by the mutant usp46 gene can be expressed.
本発明の発現ベクターは、当業者に周知である遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。すなわち、当業者に公知である一般的な遺伝子導入および発現用のベクターに、上記変異usp46遺伝子を組み込んで作製することができる。本発明の発現ベクターに用いることができるベクターとしては、プラスミド、ファージ、ウイルス等、宿主細胞において複製可能である限り特に限定されないが、例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pKC30、pCFM536などの大腸菌プラスミド、pUB110などの枯草菌プラスミド、pG-1、YEp13、YCp50などの酵母プラスミド、λgt110、λZAPIIなどのファージのDNA、およびレトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、SV40、免疫不全症ウイルス(HIV)などのDNAウイルスまたはRNAウイルスが挙げられる。ベクターには、目的遺伝子の他に、宿主細胞における複製を可能とする複製起点、および形質転換体を同定する選択マーカー、さらに、好ましくは、宿主細胞由来の適切な転写または翻訳制御配列が、所望により変異usp46遺伝子配列に連結されて含まれ得る。制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、mRNAリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。用いることができるプロモーターとしては、宿主細胞内にて遺伝子発現を駆動できる限り、特に限定されず、例えばT3プロモーター、T7プロモーター、U6プロモーター、H1プロモーターなどのPolIIIプロモーターなど、当業者に公知であるプロモーターを適宜使用することができる。選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができ、例えばアンピシリン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシンなどの耐性遺伝子やウリジンやアルギニンなどの生合成遺伝子などが挙げられる。 The expression vector of the present invention can be prepared using genetic engineering techniques well known to those skilled in the art. That is, the mutant usp46 gene can be incorporated into a general gene transfer and expression vector known to those skilled in the art. The vector that can be used for the expression vector of the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in a host cell, such as a plasmid, phage, virus, etc. For example, E. coli such as pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pKC30, pCFM536, etc. Plasmids, Bacillus subtilis plasmids such as pUB110, yeast plasmids such as pG-1, YEp13, YCp50, DNA of phages such as λgt110, λZAPII, and retroviruses, herpesviruses, vaccinia viruses, poxviruses, polioviruses, synbisviruses, Examples include DNA viruses or RNA viruses such as Sendai virus, SV40, and immunodeficiency virus (HIV). In addition to the gene of interest, the vector should have an origin of replication that allows replication in the host cell and a selectable marker that identifies the transformant, and preferably an appropriate transcriptional or translational control sequence from the host cell. Can be included linked to the mutant usp46 gene sequence. Examples of regulatory sequences include transcription promoters, operators or enhancers, mRNA ribosome binding sites, and appropriate sequences that regulate transcription and translation initiation and termination. The promoter that can be used is not particularly limited as long as it can drive gene expression in the host cell. For example, promoters known to those skilled in the art, such as PolIII promoters such as T3 promoter, T7 promoter, U6 promoter, H1 promoter, etc. Can be used as appropriate. As the selectable marker, a commonly used one can be used in a conventional manner, and examples thereof include resistance genes such as ampicillin, bleomycin, hygromycin, neomycin and puromycin, and biosynthetic genes such as uridine and arginine.
本発明はまた、上記発現ベクターを含む形質転換体に関する。
本発明の形質転換体は上記発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換することによって作製することができる。
The present invention also relates to a transformant comprising the above expression vector.
The transformant of the present invention can be prepared by introducing the above expression vector into a host cell and transforming it.
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、リン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、PEGなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。 Examples of methods for introducing the expression vector into host cells include calcium phosphate method or calcium chloride / rubidium chloride method, electroporation method, electroinjection method, a method using chemical treatment such as PEG, a method using a gene gun, etc. Can be mentioned.
宿主細胞として用いることができるものとしては、E. coli、酵母、SF9、SF21、COS1、COS7、CHO、HEK293など周知の細胞が挙げられる。 Examples of host cells that can be used include well-known cells such as E. coli, yeast, SF9, SF21, COS1, COS7, CHO, and HEK293.
上記発現ベクターが導入された形質転換体は、変異USP46タンパク質を発現し得る。発現されたタンパク質は、宿主細胞より、タンパク質精製に用いられる公知の方法、例えば、硫安塩析、有機溶媒（エタノール、メタノール、アセトン等）による沈殿分離、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、基質または抗体などを利用したアフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理など、を1つまたは複数組み合わせて用いて精製することが可能である。 A transformant introduced with the expression vector can express a mutant USP46 protein. The expressed protein is obtained from a host cell by a known method used for protein purification, such as ammonium sulfate salting out, precipitation separation with an organic solvent (ethanol, methanol, acetone, etc.), ion exchange chromatography, isoelectric point chromatography, Gel filtration chromatography, hydrophobic chromatography, adsorption column chromatography, affinity chromatography using substrates or antibodies, chromatography such as reverse phase column chromatography, filtration treatment such as microfiltration, ultrafiltration, reverse osmosis filtration Etc. can be purified using one or a combination of the above.
本発明はまた、CSマウスと野生型マウスとの交配により得られる、上記変異usp46遺伝子を含むコンジェニックマウスに関する。 The present invention also relates to a congenic mouse containing the mutant usp46 gene obtained by crossing a CS mouse and a wild type mouse.
本発明のコンジェニックマウスは、上記変異USP46タンパク質を産生し得る。
本発明のコンジェニックマウスは、当業者に公知の方法によって作製することが可能であり、CSマウスに野生型マウスを用いて戻し交配を繰り返し行うことによって作製できる。
The congenic mouse of the present invention can produce the mutant USP46 protein.
The congenic mouse of the present invention can be produced by a method known to those skilled in the art, and can be produced by repeatedly performing backcross using a wild-type mouse as a CS mouse.
CSマウスは、NBC系統およびSIIマウスの交配により作製されたマウス(Staats J、Cancer Res 45:945-977, 1985)であり、名古屋大学生命農学研究科動物行動統御学研究室海老原史樹文博士より入手することが可能である。 The CS mouse is a mouse (Staats J, Cancer Res 45: 945-977, 1985) created by crossing NBC strain and SII mouse. From Dr. Fumiki Ebihara, Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University It is possible to obtain.
利用することが可能な野生型マウスは、特に限定されず、PGN2/Ms、SK/CamEi、SM/J、C57BL/6J、129/SvJ、SWR/J、NC/Nga、A/J、CBA/J、DBA/2Jなどの実験用近交系を用いることが可能であるが、好ましくはC57BL/6Jを用いる。 Wild type mice that can be used are not particularly limited, and PGN2 / Ms, SK / CamEi, SM / J, C57BL / 6J, 129 / SvJ, SWR / J, NC / Nga, A / J, CBA / Although an experimental inbred line such as J or DBA / 2J can be used, C57BL / 6J is preferably used.
本発明のコンジェニックマウスは、第5染色体上に変異usp46遺伝子をヘテロ接合型またはホモ接合型に有するマウスを含むが、好ましくは第5染色体上に変異usp46遺伝子をホモ接合型に有するマウスである。
The congenic mouse of the present invention includes a mouse having a mutant usp46 gene in a heterozygous or homozygous form on
本発明のコンジェニックマウスは、野生型マウスと比較して、TSTおよびFSTにおいて25％以上、好ましくは50％以上、さらに好ましくは75％以上、特に好ましくは90％以上減少した無動時間を示し得る。 The congenic mouse of the present invention exhibits an immobility time that is reduced by 25% or more, preferably 50% or more, more preferably 75% or more, particularly preferably 90% or more in TST and FST compared to wild-type mice. obtain.
また、本発明のコンジェニックマウスは、野生型マウスと比較して、ムシモール（GABAA受容体のアゴニスト）に対する反応性の低下、営巣行動の低下、アルコール嗜好性の低下、明暗周期下の明開始に伴う活動亢進などの行動異常を示し得る。 In addition, the congenic mouse of the present invention has a decreased responsiveness to muscimol (GABA A receptor agonist), a decrease in nesting behavior, a decrease in alcohol preference, and a light start under a light-dark cycle compared to a wild-type mouse. May exhibit behavioral abnormalities such as hyperactivity.
本発明はまたヒトの精神疾患を治療するための医薬組成物に関する。 The present invention also relates to a pharmaceutical composition for treating human mental illness.
TSTおよびFSTにおける無動時間はヒトでの鬱状態の程度を反映していると考えられており、無動時間の減少を指標として抗鬱薬などの薬理効果が試験されている。変異usp46遺伝子を有するマウスにおいては、この無動時間が減少していることから変異usp46遺伝子の遺伝子産物は鬱状態を改善するのに有効であり得る。 The immobility time in TST and FST is thought to reflect the degree of depression in humans, and pharmacological effects such as antidepressants are being tested using the decrease in immobility time as an index. In mice with a mutated usp46 gene, this immobility time is reduced, so that the gene product of the mutated usp46 gene may be effective in improving depression.
本発明の医薬組成物は、上記変異USP46タンパク質、上記変異usp46遺伝子を含む発現ベクターおよび上記発現ベクターが導入された形質転換体からなる群から選択される物質を有効成分として含み得る。 The pharmaceutical composition of the present invention may contain, as an active ingredient, a substance selected from the group consisting of the mutant USP46 protein, an expression vector containing the mutant usp46 gene, and a transformant introduced with the expression vector.
本発明の医薬組成物は、経口投与または非経口投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、注射による局所投与、腹腔または胸腔への投与、皮下投与、筋肉内投与、舌下投与、経皮吸収または直腸内投与など）、移植などの手段によって投与し得る。また、投与経路に応じて適当な剤形とすることが可能であり、具体的には注射剤、懸濁剤、乳化剤、軟膏剤、クリーム剤錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ錠、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤等の各種製剤形態に調製し得る。これらの各種製剤は、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、浸潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、着色料、香味剤、および安定化剤などを用いて常法により製造し得る。 The pharmaceutical composition of the present invention is administered orally or parenterally (for example, intravenous administration, intraarterial administration, local administration by injection, administration to the abdominal cavity or thoracic cavity, subcutaneous administration, intramuscular administration, sublingual administration, transdermal Absorption or rectal administration, etc.), or by means such as transplantation. Moreover, it can be made into a suitable dosage form according to the administration route, specifically, injection, suspension, emulsifier, ointment, cream tablet, capsule, granule, powder, pill, It can be prepared in various pharmaceutical forms such as fine granules, troches, rectal administration, oily suppositories, and water-soluble suppositories. These various preparations are commonly used excipients, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, preservatives. , Coloring agents, flavoring agents, stabilizers, etc.
本発明の医薬組成物に含まれ得る上記変異USP46タンパク質、発現ベクターおよび形質転換体は、患者の年齢、体重、疾患の重篤度などの要因によって変化し得るが、発現ベクター、およびタンパク質であれば1回につき体重1kgあたり0.0001mg〜100mg、形質転換体であれば約102細胞〜約109細胞の範囲から適宜選択される量を含めることができる。 The mutant USP46 protein, expression vector, and transformant that can be included in the pharmaceutical composition of the present invention can vary depending on factors such as the age, weight, and severity of disease of the patient. For example, an amount appropriately selected from the range of 0.0001 mg to 100 mg per kg of body weight per one time and about 10 2 cells to about 10 9 cells in the case of a transformant can be included.
また本発明は、鬱病や躁病などの気分障害の発現に関与する物質のスクリーニング方法に関する。以下の実施例にて詳細に記載されるように、本発明の変異usp46遺伝子およびその遺伝子産物、ならびに野生型usp遺伝子およびその遺伝子産物は、鬱状態の程度を制御し得る。従って、本発明の変異usp46遺伝子および変異USP46タンパク質、ならびに野生型usp遺伝子および野生型USPタンパク質の発現、活性などに影響を与える物質をスクリーニングすることによって、気分障害の発現に関与する因子を同定することが可能である。 The present invention also relates to a screening method for substances involved in the development of mood disorders such as depression and mania. As described in detail in the Examples below, the mutant usp46 gene and its gene product of the present invention, as well as the wild type usp gene and its gene product, can control the degree of depression. Therefore, by screening for a substance that affects the expression, activity, etc. of the mutant usp46 gene and mutant USP46 protein of the present invention and the wild-type usp gene and wild-type USP protein, factors involved in the expression of mood disorders are identified. It is possible.
（１）QTL解析
１．表現型の判定：
TST及びFSTは連続する三日間で行い、初日にTSTを、二日目・三日目にFSTを行った。実験はマウス飼育舎において、11:00〜15:00の間に行った。
(1) QTL analysis Determining the phenotype:
TST and FST were performed over three consecutive days, TST was performed on the first day, and FST was performed on the second and third days. The experiment was conducted in the mouse breeding house between 11:00 and 15:00.
TSTの方法：
マウスの尾にガムテープで輪ゴムをつなぎ、三足スタンドに取り付けたクランプのはさみ部分に引っ掛けてマウスを宙吊りにした。このとき、マウスの鼻先が約30ｃｍの高さにくるようにした。試行時間は7分間とし、後半6分間のうちマウスが無動化した時間を測定した。
TST method:
A rubber band was connected to the tail of the mouse with a rubber tape, and the mouse was suspended from the scissors of the clamp attached to the tripod stand. At this time, the nose of the mouse was set at a height of about 30 cm. The trial time was 7 minutes, and the time during which the mouse was immobilized in the
FSTの方法：
直径20cm、高さ30cmのプラスチック製のシリンダーに25℃の水を15cmの高さまで入れ、その中でマウスを泳がせた。一日目は15分間泳がせ、二日目は7分間泳がせた。二日目の7分間を試行時間とし、後半6分間のうちマウスが無動化した時間を測定した。
FST method:
A plastic cylinder having a diameter of 20 cm and a height of 30 cm was filled with water at 25 ° C. to a height of 15 cm, and the mouse was swam in it. I swam for 15 minutes on the first day and 7 minutes on the second day. 7 minutes on the second day was set as the trial time, and the time during which the mouse was immobilized in the
２．遺伝子型の判定：
ゲノムDNAの抽出は片耳をサンプルとして行った。組織をProteinase K（Takara）によって消化した後、DNAをエタノール沈殿によって抽出した。遺伝子型判定は、以下の表１に挙げたマイクロサテライトマーカーを用いて行った。
2. Genotyping:
Genomic DNA was extracted using one ear as a sample. After digesting the tissue with Proteinase K (Takara), DNA was extracted by ethanol precipitation. Genotyping was performed using the microsatellite markers listed in Table 1 below.
PCR反応は定法（Silver, 1995）にて行った。PCR産物を3.5%アガロース（FMC Bioproducts）で泳動し、エチジウムブロマイド染色後にUV下で泳動パターンを比較することにより遺伝子型を判定した。 PCR reaction was performed by a conventional method (Silver, 1995). PCR products were run on 3.5% agarose (FMC Bioproducts), and genotypes were determined by comparing migration patterns under UV after ethidium bromide staining.
３．インターバルマッピング：
CS系統（以後CSと記載）のマウスとC57BL/6J系統(以後B6と記載)のマウスとを交配し、得られたF2 (N=203)にTST、およびFSTを行い、それらの個体の遺伝子型を表 1に示したマイクロサテライトマーカーを用いて決定した。F2の各染色体部位の遺伝子型と表現型の相関をMAP MANAGER QTXb20 for windows (http://www.mapmanager.org/mmQTX.html)を用いてインターバルマッピングを行うことにより調べた。ゲノムワイドな有意水準Significant level及びSuggestive levelは1000回のpermutation testによって算出した。
3. Interval mapping:
Mice of CS strain (hereinafter referred to as CS) and C57BL / 6J strain (hereinafter referred to as B6) are crossed, and F2 (N = 203) obtained is subjected to TST and FST. The type was determined using the microsatellite markers shown in Table 1. The correlation between the genotype and phenotype of each chromosomal region of F2 was examined by performing interval mapping using MAP MANAGER QTXb20 for windows (http://www.mapmanager.org/mmQTX.html). The genome-wide significance level and the suggestive level were calculated by 1000 permutation tests.
４．QTL解析の結果
CSマウスおよびB6マウスを用いたTSTおよびFSTにおける、無動時間の解析結果を図１に示す。CSマウスはTSTおよびFSTにおいて無動時間を全く示さなかった。
表１に示したマイクロサテライトマーカーを用いたインターバルマッピングの結果を以下の表２および図２に示す。
4). Results of QTL analysis
FIG. 1 shows the results of analysis of immobility time in TST and FST using CS mice and B6 mice. CS mice showed no immobility time in TST and FST.
The results of interval mapping using the microsatellite markers shown in Table 1 are shown in Table 2 and FIG.
表２中、ピークLODスコア (分散%)はfree genetic modelによって算出し、アスタリスクは、有意なQTLを示す。ピーク位置は、マーカーの組換えおよびMouse Genome Informatics (MGI : http:// www.informatics.jax.org/)のコンセンサスマップより推測されるセントロメアからの距離を示す。 In Table 2, the peak LOD score (% variance) is calculated by free genetic model, and the asterisk indicates significant QTL. The peak position indicates the distance from the centromere estimated from the recombination of the marker and the consensus map of Mouse Genome Informatics (MGI: http://www.informatics.jax.org/).
表２および図２の結果より、TSTおよびFSTにおける異常行動の責任遺伝子が第4および第5染色体上にあること、特に第5染色体上に有意なQTLが存在することがわかった。
From the results of Table 2 and FIG. 2, it was found that genes responsible for abnormal behavior in TST and FST are located on
（２）コンジェニック系統の解析
１．B6.CS-Ngu1053系統の作製：
遺伝子型の判定は上記と同様の方法で行った。ただし、サンプリングは交配用のものは離乳前に、行動実験を行うものは試験場所であるコイトトロンに移してから行動実験を行うまでの間に、耳標（夏目製作所）による個体識別と同時に行った。
(2) Analysis of congenic strains Production of B6.CS-Ngu1053 line:
The genotype was determined by the same method as described above. However, sampling was performed at the same time as individual identification by ear tags (Natsume Seisakusho) before moving to Koitotron, which was the test site, before weaning for mating, before weaning. .
まず、雄のCSマウスと雌のB6マウスを交配してF1(N1)を得た。続いて雄のF1と雌のB6マウスを交配してN2を得た。N2の雄の中からTSTとFSTにおいて無動時間が減少していることを指標にして2匹選抜し、雌のB6マウスと交配させN3を得た。N3の雄の中からCSマウス由来の5番染色体断片をもつものを選抜し、スピードコンジェニック法（Markel et al, 1997）によってコンジェニック系統を作製した。N3の目的導入領域以外の全染色体について遺伝子型の判定を行い、B6ホモのアレルによく置き換わっている雄個体を次の戻し交配に用いた。これを繰り返し、D5BC40-D5Mit259をCSとB6のヘテロで、これ以外の全てのマイクロサテライトマーカーについてB6ホモ接合でもつ N7-1053を得た。N7-1053を雌のB6マウスと交配させ、D5BC40-D5Mit259のみをヘテロ接合でもつN8の雌雄を得た。これらの個体を交配させ、D5BC40-D5Mit259をB6のホモ、B6とCSのヘテロ、CSのホモ接合でもつ個体を作製し、以下の表現型解析を行った。N7-1053から複製したD5BC40-D5Mit259をCSのホモ接合でもつマウスをB6.CS-Ngu1053系統（以後、1053と記載）マウスと命名した（図３参照）。なお、本発明のコンジェニックマウスは、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター(理研BRC)にB6.CS-Ngu1053（登録番号01852）の名称で2007年12月13日に寄託した。
First, male CS mice and female B6 mice were mated to obtain F1 (N1). Subsequently, male F1 and female B6 mice were mated to obtain N2. Two N2 males were selected using TST and FST as the index of the decrease in immobility time, and mated with female B6 mice to obtain N3. Among N3 males, those having a
２．コンジェニック系統の表現型解析
コンジェニック系統の表現型解析はコイトトロンの前室で行った。マウスを実験の１週間前からコイトトロン（7:00 light on）に移した。実験開始の2時間前から前室に移し適応させた後、上記と同様の方法でTST及びFSTを行った。
2. Phenotypic analysis of congenic strains Phenotypic analysis of congenic strains was performed in the anterior chamber of Koitotron. Mice were transferred to Koitotron (7:00 light on) one week before the experiment. After 2 hours before the start of the experiment and moving to the anterior chamber for adaptation, TST and FST were performed in the same manner as described above.
その後、以下の方法でムシモール投与後の正向反射テスト、営巣行動、アルコール嗜好性、明暗周期下での行動解析の順に解析を行った。 After that, analysis was performed in the following order: forward reflex test after muscimol administration, nesting behavior, alcohol preference, and behavior analysis under light-dark cycle.
正向反射テスト
GABAA受容体のアゴニストであるムシモール（3mg/kg）を皮下投与し、マウスの正向反射の消失継続時間を調べた。ムシモールは生理食塩水に溶かして使用した。正向反射の有無はマウスをアクリル製のV字型のくぼみに仰向けにおいて判断した。これをムシモール投与から10分毎に、正向反射が回復するまで行った。
Direct reflection test
Muscimol (3 mg / kg), an agonist of GABA A receptor, was administered subcutaneously, and the duration of disappearance of the right reflex in mice was examined. Muscimol was used by dissolving in physiological saline. The presence or absence of forward reflection was determined with the mouse lying on its back in an acrylic V-shaped depression. This was performed every 10 minutes after muscimol administration until the right-angle reflex was restored.
ニトラゼパム投与による影響
ニトラゼパム投与（1mg/kg、20mg/kg）群及びVehicle投与群（0.3％CMC:Carboxymethylcellulose）のマウスを用いた。ニトラゼパムはGABAA受容体のベンゾジアゼピン結合部位のアゴニストであり、チャネルの開口頻度および開口時間を増加させる作用を有する。ニトラゼパムは0.3％CMCに溶かして使用した。ニトラゼパムまたはVehicleを皮下投与し、45分後にTSTまたはオープンフィールドテストを行った。
Effects of nitrazepam administration Mice of the nitrazepam administration (1 mg / kg, 20 mg / kg) group and the vehicle administration group (0.3% CMC: Carboxymethylcellulose) were used. Nitrazepam is an agonist of the GABA A receptor benzodiazepine binding site and has the effect of increasing the channel opening frequency and opening time. Nitrazepam was used by dissolving in 0.3% CMC. Nitrazepam or Vehicle was administered subcutaneously, and a TST or open field test was performed 45 minutes later.
オープンフィールドテストの方法：装置は40×40×40cmからなるプラスチック製の箱を用いた。この装置の床にはそれぞれ縦横5cm間隔で線が引かれており、5cm四方の正方形64区画に分けられている。装置の中心にマウスを静かに置き、自由に活動させて歩行運動量（床にかかれた区分線を横切った回数）を測定した。測定時間は5分間とした。 Open field test method: The apparatus used was a plastic box consisting of 40 x 40 x 40 cm. Lines are drawn on the floor of this device at 5cm vertical and horizontal intervals, and divided into 64 squares of 5cm square. The mouse was gently placed in the center of the apparatus and allowed to move freely, and the amount of walking movement (number of times crossing the dividing line on the floor) was measured. The measurement time was 5 minutes.
営巣行動テスト
マウスを消灯の約一時間前に約2.5g、約5 cm2の巣材（Lillico）の入ったテストケージ（単独飼育、おがくずの床敷、餌及び水は自由摂取）に移動させた。翌日の午前中、使用されないまま残った巣材の重量を計測し、使用前の重量との比を計算し、巣材の使用率とした。また、形成された巣の質を１．巣材の90%以上が未使用、２．50-90％が未使用、３．10-50%が未使用、４．0-10%が未使用でつくられた巣に高さがないもの、５．0-10%が未使用でつくられた巣に高さがあるもの、という基準でスコアを算出した。
Nesting behavior test Move the mouse to a test cage (single breeding, sawdust flooring, food and water ad libitum) containing about 2.5 g and about 5 cm 2 of nest material (Lillico) about 1 hour before extinction. It was. In the morning of the next day, the weight of the nest material remaining unused was measured, and the ratio with the weight before use was calculated to determine the usage rate of the nest material. In addition, the quality of the nest formed is as follows. 90% or more of the nest is unused, 2.50-90% unused, 3.10-50% unused, 4.0-10% unused Scores were calculated on the basis that 5.0-10% were unused and the nests were tall.
アルコール嗜好性
マウスを5日間、給水瓶を二つ設置したテストケージ（単独飼育、おがくずの床敷、餌及び水は自由摂取）で飼育した。次の5日間の初日に片方の給水瓶に水、もう片方に5%エタノール（v/v）を入れ、マウスの体重を計測した。位置による嗜好性をなくすため、3日目に給水瓶の位置を入れ換えた。5日目に水と5%エタノールの重量を計測し、それぞれの消費量を算出し、アルコール嗜好性（5%エタノール消費量 / 水消費量+5%エタノール消費量）を計算した。次の5日間は10％エタノール、その次の5日間は20%エタノールを用いて同様の作業を行った。
Alcohol preference Mice were raised for 5 days in a test cage with two water bottles (single breeding, sawdust flooring, food and water ad libitum). On the first day of the next 5 days, water was placed in one water bottle and 5% ethanol (v / v) was placed in the other, and the weight of the mice was measured. To eliminate palatability by location, the location of the water bottle was changed on the third day. On the fifth day, we measured the weight of water and 5% ethanol, calculated the consumption of each, and calculated the alcohol preference (5% ethanol consumption / water consumption + 5% ethanol consumption). The same operation was performed using 10% ethanol for the next 5 days and 20% ethanol for the next 5 days.
明暗周期下での行動解析
マウスを回転輪の付いたプラスチック製ケージで明期12時間（7：00〜19：00）、暗期12時間（19：00〜7：00）の光条件下で15日間飼育した。回転輪を回したシグナルをマイクロスイッチによりカウントし、The Chronobiology Kit (Stanford Software Systems) により記録した。記録したデータのうち、最初の5日間を除いた10日間の回転輪活動をAnalyze98およびClock lab software (Actimetrics) により解析した。アクティビティプロファイルは各個体の平均活動量(count/min)で標準化したものを用いた。
Behavioral analysis under light-dark cycle The mouse is placed in a plastic cage with a rotating wheel under light conditions of 12 hours (7: 00-19: 00) and 12 hours (19: 00-7: 00: 00) in the dark period. Raised for 15 days. The signal of rotating the rotating wheel was counted with a microswitch and recorded by The Chronobiology Kit (Stanford Software Systems). Of the recorded data, the 10-day rotating wheel activity, excluding the first 5 days, was analyzed by Analyze 98 and Clock lab software (Actimetrics). The activity profile standardized by the average activity (count / min) of each individual was used.
４．表現型の解析結果
1053マウスを用いた表現系解析の結果を以下に示す。
TSTおよびFSTにおいて、1053マウスは、B6マウスよりも無動時間が短く、CSマウスと同じく無動時間の減少が観察された（図４参照）。
4). Analysis result of phenotype
The results of phenotypic analysis using 1053 mice are shown below.
In TST and FST, 1053 mice had shorter immobility time than B6 mice, and a decrease in immobility time was observed as in CS mice (see FIG. 4).
正向反射テストにおいて、1053マウスはB6マウスよりも正向反射消失時間が短く、CSマウスと同じくムシモールに対する反応性が低下していることが観察された（図５参照）。 In the forward reflex test, 1053 mice were observed to have a shorter reflex disappearance time than B6 mice, and the reactivity to muscimol was decreased as in the CS mice (see FIG. 5).
ニトラゼパム投与による影響を調べたところ、CSマウスおよび1053マウスにおいて見られるTSTにおける無動時間の減少が、B6マウスのレベルまで回復することが観察された（図６のA参照）。ニトラゼパムは抗不安作用だけでなく筋弛緩作用もあることが知られており、ニトラゼパム投与後のTSTにおける無動状態は、筋弛緩によって個体の活動性が低下している可能性も考えられた。そこでオープンフィールドテストにおける歩行活動量を調べたところ、ニトラゼパム投与群と非投与群の間で自発活動量に有意な差がみられなかった（図６のB参照）。このことから、TSTにおけるニトラゼパム投与による無動時間の回復は筋弛緩作用によるものではないことが示唆された。ニトラゼパム投与の結果を上記正向反射テストの結果と合わせて考慮すると、CSマウスおよび1053マウスはGABAA受容体系に何らかの異常があることが示唆される。 When the influence of nitrazepam administration was examined, it was observed that the decrease in the immobility time in TST seen in CS mice and 1053 mice recovered to the level of B6 mice (see A in FIG. 6). It is known that nitrazepam has not only an anxiolytic effect but also a muscle relaxant effect. It was also possible that the activity of individuals in TST after administration of nitrazepam was reduced due to muscle relaxation. Therefore, when the amount of locomotor activity in the open field test was examined, no significant difference was observed in the amount of spontaneous activity between the nitrazepam-administered group and the non-administered group (see FIG. 6B). This suggests that recovery of immobility time by nitrazepam administration in TST is not due to muscle relaxation. Considering the results of nitrazepam administration together with the results of the above-mentioned direct reflex test, it is suggested that CS mice and 1053 mice have some abnormality in the GABA A receptor system.
営巣行動テストにおいて、1053マウスはB6マウスよりも巣材の使用率および巣の質が共に低下し、CSマウスと同じく営巣行動の低下が観察された（図７参照）。 In the nesting behavior test, 1053 mice had lower nesting material usage and nest quality than B6 mice, and a decrease in nesting behavior was observed as in CS mice (see FIG. 7).
アルコール嗜好性テストにおいて、1053マウスはCSマウスと同じく、B6マウスよりもアルコールに対する嗜好性が低下していることが観察された（図８参照）。 In the alcohol preference test, it was observed that 1053 mice had a lower preference for alcohol than B6 mice, as did CS mice (see FIG. 8).
明暗周期下での行動解析において、1053マウスは明開始直後20分間に急激な活動量の増加がみられ、CSマウスと同じく明開始に伴う急激な活動亢進が観察された（図９Ａおよび図９Ｂ参照）。 In behavioral analysis under the light-dark cycle, 1053 mice showed a rapid increase in activity in 20 minutes immediately after the start of light, and a rapid increase in activity accompanying the start of light was observed as in CS mice (FIGS. 9A and 9B). reference).
これら表現型の解析結果より、1053マウスはCSマウスと同様の表現型を有することが示され、CSマウスにおける異常行動の責任遺伝子が第5染色体上にあることが確認された。
These phenotypic analysis results showed that 1053 mice had a phenotype similar to that of CS mice, confirming that the gene responsible for abnormal behavior in CS mice was on
（３）サブコンジェニック系統の作製
1053に導入したCS由来のD5BC40-D5Mit259ゲノム領域の間で、B6のD5BC40-D5Mit259ゲノムと組み換えを起こしている個体を選抜し、上記と同様の方法で系統化した。得られた2系統のマウスをそれぞれ、B6.CS-Ngu 3042系統（以後、3042と記載）マウス、B6.CS-Ngu 2271系統（以後、2271と記載）マウスと命名した。これらのマウスを用いて表現型と遺伝子型の判定を上記と同じく行った。
(3) Production of subcongenic strains
Among the CS-derived D5BC40-D5Mit259 genomic region introduced in 1053, individuals recombined with the D5BC40-D5Mit259 genome of B6 were selected and systematized in the same manner as described above. The obtained two strains of mice were named B6.CS-
サブコンジェニック系統の遺伝子型の判定結果
結果を図１０および図１１に示す。3042マウスは1053マウスと同様にTSTにおいて無動時間の減少が見られ、一方、2271マウスは無動時間の減少が見られなかった（図１０参照）。
Results of determination of genotypes of subcongenic strains The results are shown in FIGS. 3042 mice, like 1053 mice, showed a decrease in immobility time in TST, while 2271 mice did not show a decrease in immobility time (see FIG. 10).
TSTにおいて無動時間の減少が見られた1053マウスおよび3042マウスと、無動時間の減少が見られなかった2271マウスにおける第5染色体上のマイクロサテライトマーカー遺伝子の由来を解析した結果、無動時間減少の有無で差異が示されたのは第5染色体上のD5B6CS40(74.19)-D5B6CS103(74.71)領域であった（図１１参照）。すなわち、この領域内に無動化を支配する責任遺伝子が存在することを確認した。
As a result of analyzing the origin of the microsatellite marker gene on
この領域にある遺伝子を図１２に示す。この領域には、Usp46、1700112M01Rik、2700023E23Rik、Rasl11bおよびScfd2が含まれており、これら遺伝子を無動化を支配する責任遺伝子の候補遺伝子として同定した。 The genes in this region are shown in FIG. This region includes Usp46, 1700112M01Rik, 2700023E23Rik, Rasl11b, and Scfd2, and these genes were identified as candidate genes for responsible genes that govern immobilization.
（４）候補遺伝子の検討
１．ORFの塩基配列の比較
TRIZOL Reagent（Invitrogen）を用いて、B6、2271、CSおよび1053のマウスよりRNAを抽出し、SuperScript III RT（Invitrogen）によって逆転写を行った。各系統由来のcDNAより候補遺伝子Usp46、1700112M01Rik、2700023E23Rik、Rasl11bおよびScfd2それぞれをPCRによって増幅し、ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v3.1（Applied Biosystems）によってシークエンスサンプルを調製した。シークエンスはABI Prism（Applied Biosystems）を用いて行った。
(4) Examination of candidate genes Comparison of ORF base sequences
RNA was extracted from B6, 2271, CS, and 1053 mice using TRIZOL Reagent (Invitrogen), and reverse transcription was performed using SuperScript III RT (Invitrogen). Candidate genes Usp46, 1700112M01Rik, 2700023E23Rik, Rasl11b and Scfd2 were amplified from the cDNAs derived from each strain by PCR, and sequence samples were prepared by ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v3.1 (Applied Biosystems). The sequence was performed using ABI Prism (Applied Biosystems).
２．候補遺伝子塩基配列の比較結果
各系統に由来する各候補遺伝子の塩基配列を、各系統間でアライメントした結果、無動時間の減少を生じるCSおよび1053由来のUsp46と、無動時間の減少を生じないB6および2271由来のUsp46との間に違いが見られた。他の生物種におけるUsp46の塩基配列と比較した結果(図１３参照)、CSおよび1053由来のUsp46においては、B6および2271由来のUsp46および他の生物種のUsp46に存在する第91位のリシンが欠失していることがわかった。
2. Comparison results of candidate gene base sequences As a result of aligning the base sequence of each candidate gene derived from each line between each line, CS and 1053-derived Usp46, which resulted in a decrease in immobility time, resulted in a decrease in immobility time There was a difference between B6 and Usp46 from 2271. As a result of comparison with the base sequence of Usp46 in other species (see FIG. 13), in Usp46 derived from CS and 1053, lysine at position 91 present in Usp46 derived from B6 and 2271 and Usp46 from other species is present. It was found to be deleted.
（５）トランスジェニックマウスの作製・解析
１．BAC DNAの精製
MSM/Ms系統由来のBACクローンMSMG01-414M07（Usp46の上流12 kb〜下流91 kbを含む）を理研BRCから入手した。このクローンを12.5mg/mlのクロラムフェニコールを含む500mlのLB培地で培養し、NucleoBond BAC 100 kit (MACHEREY-NAGEL) を用いてBAC DNAを精製した。MSM/Ms系統由来の約160kbpの配列とベクター由来の約10kbp配列を分離するため、制限酵素Not I (Takara) によって消化後、パルスフィールドゲル電気泳動を行った。ゲルから切り出したDNAをTEで透析して精製した。
(5) Production and analysis of transgenic mice BAC DNA purification
BAC clone MSMG01-414M07 (including 12 kb upstream to 91 kb downstream of Usp46) from MSM / Ms strain was obtained from RIKEN BRC. This clone was cultured in 500 ml of LB medium containing 12.5 mg / ml chloramphenicol, and BAC DNA was purified using
２．トランスジェニックマウスの作製
精製したBAC DNAを1 ng/μlに調製し、B6由来の前核受精卵にマイクロインジェクションをして導入した。この受精卵をICR系統の卵管に移植して仮母とした。ファウンダーの検出はPCRとサザンブロッティング法によって行った。
2. Production of Transgenic Mice Purified BAC DNA was prepared at 1 ng / μl and introduced into B6-derived pronuclear fertilized eggs by microinjection. The fertilized egg was transplanted into an oviduct of the ICR strain and used as a temporary mother. Founders were detected by PCR and Southern blotting.
３．トランスジェニックマウスの交配
9匹得られたファウンダーのうち、MSMG01-414M07の全長が導入されていることを確認した6匹をそれぞれ系統化し、Line4−9(TgB6/B6)とした。まず、ファウンダー(TgB6/B6)をB6/B6.CS-Ngu1053 F1 (B6/ CS)と交配し、TgB6/CSの遺伝子型をもつ個体を選抜した。この個体をB6/B6.CS-Ngu1053 F1 (B6/CS)と交配させることにより、Tgをもつかもたないか、コンジェニックの導入領域をB6/B6、B6/CS、CS/CSでもつか、合計六種類の遺伝子型（すなわち、B6/B6tg、B6/CStg、CS/CStg、B6/B6、B6/CS、CS/CS）をもつマウスを作製した。
3. Crossbreeding transgenic mice
Of the 9 founders, 6 were confirmed to be introduced with the full length of MSMG01-414M07, and each was systematized to Line 4-9 (TgB6 / B6). First, a founder (TgB6 / B6) was crossed with B6 / B6.CS-Ngu1053 F1 (B6 / CS) to select individuals having a TgB6 / CS genotype. By crossing this individual with B6 / B6.CS-Ngu1053 F1 (B6 / CS), it may have Tg, or the congenic introduction region may be B6 / B6, B6 / CS, CS / CS, Mice with a total of six genotypes (ie, B6 / B6tg, B6 / CStg, CS / CStg, B6 / B6, B6 / CS, CS / CS) were prepared.
４．トランスジェニックマウスの表現型解析
上記コンジェニック系統と同様にTST及びFSTを行い、その後、ムシモール投与後の正向反射テスト、営巣行動、アルコール嗜好性、明暗周期下での行動解析の順に解析を行った。
4). Phenotypic analysis of transgenic mice TST and FST were performed in the same manner as the above-mentioned congenic strains, and then analysis was performed in the order of directional reflex test after muscimol administration, nesting behavior, alcohol preference, and behavior analysis under light-dark cycle. It was.
５．トランスジェニックマウスのIn situ ハイブリダイゼーションによるUsp46発現解析
Usp46の配列（NM_177561.2）を元にアンチセンスプローブを設計した。オリゴヌクレオチドの標識は3’tailing法により行った。標識化合物には35S-dATP（NEG034H、NEN）を使用し、Terminal deoxynucleotidyl transferase、recombinant（rTDT、Invitrogen）を用いて37℃にて2時間反応させた。放射活性は液体シンチレーションカウンター（LSC-5100、Aloka）により測定した。
5. Analysis of Usp46 expression by in situ hybridization in transgenic mice
An antisense probe was designed based on the Usp46 sequence (NM_177561.2). Oligonucleotide labeling was performed by the 3'tailing method. 35 S-dATP (NEG034H, NEN) was used as the labeling compound, and the reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours using Terminal deoxynucleotidyl transferase and recombinant (rTDT, Invitrogen). Radioactivity was measured with a liquid scintillation counter (LSC-5100, Aloka).
4.0％パラホルムアルデヒド（TAAB）にて切片の固定を10分間行い、さらにプレハイブリダイゼーション（スライド1枚につきプレハイブリダイゼーション溶液を200μl）を室温で2時間行った。その後0.1×SSC・0.1％ザルコシル（Sigma）にて洗浄し、乾燥させたスライド１枚につき5×105dpmの放射標識オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション溶液（50〜75μl）を42℃にて約12時間パラフィルム下にて浸透させた。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、2×SSC・0.1％ザルコシルに室温で30分間、0.1％×SSC・0.1％ザルコシルに55℃で40分間×2回行った。乾燥させた切片をオートラジオグラム用カセット（Hypercassette、Amersham）に入れ、X線フィルム（Biomax-MR、Kodak）を室温にて14〜21日間感光させた。X線フィルムの現像には自動現像機（FPM800A、FUJI）を用いた。使用した試薬の組成は以下に示した。
PBS（pH7.4）
8.1mMリン酸水素二ナトリウム・12水
1.5mMリン酸二水素カリウム
2.7mM塩化カリウム
0.14mM塩化ナトリウム
SSC（pH7.4）
0.15M塩化ナトリウム
15mMクエン酸ナトリウム
プレハイブリダイゼーション溶液
0.2mg/ml酵母tRNA（Invitrogen）
33mMトリス（pH8.0）
1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）（pH8.0）（同人化学）
デンハルト溶液 0.002％フィコール（Pharmacia）
0.002％ポリビニルピロリドン（Sigma）
0.002％ウシ血清アルブミン（FractionV）（Sigma）
600mM塩化ナトリウム
50%脱イオン化ホルムアミド
0.25%ドデシル硫酸ナトリウム
ハイブリダイゼーション溶液
上記のプレハイブリダイゼーション溶液
10％硫酸デキストラン（Pharmacia）
0.1M (±)-Dithiothreitol
Sections were fixed with 4.0% paraformaldehyde (TAAB) for 10 minutes, and further prehybridization (200 μl of prehybridization solution per slide) was performed at room temperature for 2 hours. Then wash with 0.1 x SSC and 0.1% sarkosyl (Sigma) and dry the slides with 5 x 10 5 dpm of radiolabeled oligonucleotide hybridization solution (50-75 µl) at 42 ° C for about 12 hours. Penetration under parafilm. Washing after hybridization was performed twice in 2 × SSC · 0.1% sarkosyl at room temperature for 30 minutes and 0.1% × SSC · 0.1% sarkosyl in 55 ° C. for 40 minutes × 2. The dried sections were placed in an autoradiogram cassette (Hypercassette, Amersham), and X-ray film (Biomax-MR, Kodak) was exposed at room temperature for 14-21 days. An automatic processor (FPM800A, FUJI) was used for developing the X-ray film. The composition of the reagents used is shown below.
PBS (pH7.4)
8.1 mM disodium hydrogen phosphate, 12 water
1.5 mM potassium dihydrogen phosphate
2.7 mM potassium chloride
0.14 mM sodium chloride
SSC (pH7.4)
0.15M sodium chloride
15 mM sodium citrate prehybridization solution
0.2mg / ml yeast tRNA (Invitrogen)
33 mM Tris (pH 8.0)
1mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (pH8.0) (Doujin Chemical)
Denhardt's solution 0.002% Ficoll (Pharmacia)
0.002% polyvinylpyrrolidone (Sigma)
0.002% bovine serum albumin (FractionV) (Sigma)
600 mM sodium chloride
50% deionized formamide
0.25% sodium dodecyl sulfate hybridization solution Pre-hybridization solution above
10% dextran sulfate (Pharmacia)
0.1M (±) -Dithiothreitol
６．トランスジェニックマウスの表現型およびUsp46発現の解析結果
上記コンジェニックマウスの表現型解析において見られたTSTにおける無動時間の減少が、正常Usp46が導入された（Tgをもつ）トランスジェニックマウスにおいては回復していることが示された（図１４参照、図中Tgをもつマウスの結果はドットパターンにて示される）。
6). Results of analysis of transgenic mouse phenotype and Usp46 expression The decrease in immobility time in TST observed in the phenotype analysis of the above-mentioned congenic mice was recovered in transgenic mice with normal Usp46 (with Tg) (See FIG. 14, the result of the mouse having Tg in the figure is shown by a dot pattern).
また、上記コンジェニックマウスの表現型解析において見られた、ムシモール反応性の低下、営巣行動の低下、アルコール嗜好性の低下、明開始に伴う急激な活動亢進といった異常行動が、正常Usp46が導入された（Tgをもつ）トランスジェニックマウスにおいては回復していることが示された（図１５〜１８Ｂ参照、図中Tgをもつマウスの結果はドットパターンにて示される）。 In addition, abnormal behaviors observed in the phenotypic analysis of the congenic mice, such as decreased muscimol responsiveness, decreased nesting behavior, decreased alcohol preference, and suddenly increased activity associated with the onset of light, were introduced into normal Usp46. In addition, it was shown that the transgenic mice (with Tg) recovered (see FIGS. 15 to 18B, and the results of the mice with Tg are shown in a dot pattern).
これらの結果は、TSTおよびFSTなどにおいて見られるマウスの無動行動が第5染色体上に存在するusp46遺伝子によって支配されていることを示す。また、CSマウスにおいて見られる異常行動の原因が、第91位のリシンが欠失している変異usp46遺伝子によるものであることが示された。
These results indicate that the mouse immobilization behavior seen in TST and FST is dominated by the usp46 gene present on
B6マウスおよびトランスジェニックマウスにおいてUsp46は嗅球、嗅皮質、大脳皮質、帯状束、海馬、アミダグラ、小脳などにおいて発現していることが検出された（図１９参照）。 In B6 mice and transgenic mice, Usp46 was detected to be expressed in the olfactory bulb, olfactory cortex, cerebral cortex, zonal bundle, hippocampus, amidagra, cerebellum and the like (see FIG. 19).
本発明の変異usp46遺伝子は、ヒトでの鬱状態の程度を反映していると考えられている、TSTおよびFSTの無動時間を減少させることが可能である。従って、本発明の変異usp46遺伝子および野生型usp46遺伝子は、ヒトにおける鬱病や躁病などの気分障害の発現機序の解明や抗鬱薬などの有効な気分障害改善薬の開発に重要な貢献をすることが期待できる。 The mutant usp46 gene of the present invention can reduce the immobility time of TST and FST, which is thought to reflect the degree of depression in humans. Therefore, the mutant usp46 gene and the wild-type usp46 gene of the present invention make an important contribution to elucidation of the manifestation mechanism of mood disorders such as depression and mania in humans and the development of effective mood disorder improving drugs such as antidepressants. Can be expected.
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| EP3512189A1 (en) | 2009-11-05 | 2019-07-17 | Sony Corporation | Photographing apparatus, photographing control method and photographing control program |
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