JP2007174952A - Method for judging onset or onset possibility of rheumatoid arthritis and sleep disturbance in rheumatoid arthritis and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法、並びにその利用に関するものであって、特に、関節リウマチの発症に関連する遺伝子の発現量を測定することにより関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性を判定する方法、並びにその利用に関するものである。 The present invention relates to rheumatoid arthritis and a method for determining the onset or possibility of onset of sleep disorders in rheumatoid arthritis, and use thereof, and in particular, by measuring the expression level of genes related to the onset of rheumatoid arthritis. The present invention relates to a method for determining the onset or possibility of onset of sleep disorders in rheumatoid arthritis and rheumatoid arthritis, and use thereof.
関節リウマチ（rheumatoid arthritis、以下「ＲＡ」ともいう）は、多発するびらん性関節炎を主な特徴とするが、同時に多臓器を障害する原因不明の全身性炎症疾患である。ＲＡは寛解と増悪とを繰り返しながら慢性に進行し、無治療で放置すると関節の破壊や変形を来し、やがて運動器の機能障害を呈してくる。 Rheumatoid arthritis (hereinafter also referred to as “RA”) is a systemic inflammatory disease whose main cause is multiple erosive arthritis, but at the same time causes many organs to be damaged. RA progresses chronically with repeated remissions and exacerbations. If left untreated, it causes destruction and deformation of joints, and eventually exhibits dysfunction of motor organs.
ＲＡの原因である関節炎と関節破壊の様相、特にそれらの病理過程は、種々の研究を通じて次第に明らかになりつつあるが、ＲＡは生活環境を含めた多数の原因因子が重なり合ってはじめて疾患へと発展・増悪する疾患である。そのため、疾患の正しい解明と適切な診断や治療とを行うには、多因子相互作用の本体そのものが明らかにされなければならない。 The aspects of arthritis and joint destruction that are the cause of RA, especially their pathological processes, are gradually becoming clear through various studies, but RA develops into a disease only after many causative factors including the living environment overlap.・ It is an aggravating disease. Therefore, the body of the multifactor interaction itself must be clarified in order to correctly elucidate the disease and perform appropriate diagnosis and treatment.
このような状況下において、近年、本発明者らは、ＲＡの発症病因・病態を研究する中で、ＲＡの病態の主軸にc-fos遺伝子の過剰活性化による関節滑膜細胞やＴリンパ球の過剰活性化があることを明らかにした。具体的には、ＲＡでは、c-fos遺伝子の発現が過剰であるため、p21waf1/cip1が低下して細胞は強く増殖することを明らかにした（非特許文献１を参照）。 Under such circumstances, in recent years, the present inventors have studied the pathogenesis and pathogenesis of RA, and in the main axis of RA pathology, articular synoviocytes and T lymphocytes due to excessive activation of the c-fos gene are used. It was clarified that there was overactivation of. Specifically, in RA, since the expression of the c-fos gene is excessive, it has been clarified that p21 waf1 / cip1 decreases and the cells proliferate strongly (see Non-Patent Document 1).
これとは別に、本発明者らは、c-fos遺伝子発現細胞を長い間培養していると、次第に４倍体の核をもつ細胞が増加し、その原因は、Wee1キナーゼの亢進であることを明らかにしている。 Apart from this, when the present inventors have cultured c-fos gene-expressing cells for a long time, the number of cells with tetraploid nuclei gradually increases, and the cause is the increase in Wee1 kinase. It is revealed.
一般に、細胞分裂開始の引き金は、mitosis promoting factor（以下、「ＭＰＦ」ともいう）分子によって引かれる。ＭＰＦはサイクリンＢとcdc2分子とからなる複合体である。ＭＰＦは、cdc2分子の１５番目のチロシンがリン酸化されると不活性型となり、脱リン酸化されると活性型となって細胞分裂が始まる。上記Wee1キナーゼは、cdc2分子の１５番目のチロシンをリン酸化するものである。 In general, the trigger for cell division initiation is triggered by a mitosis promoting factor (hereinafter also referred to as “MPF”) molecule. MPF is a complex composed of cyclin B and cdc2 molecule. MPF becomes inactive when the 15th tyrosine of the cdc2 molecule is phosphorylated, and becomes active when dephosphorylated, and cell division begins. The Wee1 kinase phosphorylates the 15th tyrosine of the cdc2 molecule.
また、上記c-fos遺伝子については、リンパ球などの増殖性細胞において、G1前期にimmediate early geneとしてごく短時間だけ一過的に転写されることが以前から知られている。しかし、なぜc-fos遺伝子がこの時期にだけ一過的に増減するのか、その生理学的な意義については不明であった。 The c-fos gene has been known to be transiently transcribed as an immediate early gene in the early G1 period in proliferating cells such as lymphocytes. However, it was unclear why the c-fos gene increased or decreased temporarily only during this period.
近年、本発明者らは、細胞分裂のG1前期にc-Fosタンパク質がwee1遺伝子のプロモーターに作用してWee1キナーゼの発現量を一過的に増加させる直接の転写シグナル経路が存在することを明らかにした（非特許文献２を参照）。これにより、c-fos遺伝子は、細胞を増殖に向かわせると同時に、Wee1キナーゼの発現量を増加させて細胞分裂を一過的に阻止することを明らかとなった。つまり、生体では、このようなメカニズムを有することにより、細胞がＧ１前期からＳ期にあって盛んにＤＮＡを合成している時に、誤って細胞が分裂を起こさないように制御されているのである。 In recent years, the present inventors have revealed that there is a direct transcriptional signal pathway in which c-Fos protein acts on the promoter of the wee1 gene to transiently increase the expression level of Wee1 kinase in the early G1 of cell division (See Non-Patent Document 2). As a result, it was revealed that the c-fos gene temporarily prevented the cell division by increasing the expression level of Wee1 kinase while simultaneously causing the cells to proliferate. That is, in the living body, by having such a mechanism, when the cell is actively synthesizing DNA from the early G1 phase to the S phase, it is controlled so that the cell does not accidentally divide. .
しかし、ＲＡではその病態として、上述したようにc-fos遺伝子が持続的に過剰発現している。したがって、c-fos遺伝子の発現の亢進に連動してwee-lキナーゼの発現も亢進することとなる。この結果、c-fos遺伝子の過剰発現の効果で細胞が過剰増殖するのに対して、Wee1キナーゼの発現活性化の効果によって細胞分裂が阻止されるという矛盾した、いわば腫瘍様の病態がＲＡにおいて見られることを本発明者はこれまでに独自に導き出しているのである。 However, in RA, as described above, the c-fos gene is continuously overexpressed as a disease state. Therefore, the expression of wee-l kinase is also increased in conjunction with the increased expression of the c-fos gene. As a result, the cell overgrowth is caused by the overexpression of the c-fos gene, whereas the contradictory, so-called tumor-like pathological condition that the cell division is blocked by the effect of the activation of Wee1 kinase expression in RA. The present inventor has uniquely derived what can be seen.
また、ＲＡの病態には、ホルモン分泌異常が関与していることが知られている。その１つとして、視床下部−下垂体−副腎軸異常が挙げられる。これに関連して、本発明者らは、ＲＡ関節滑膜において、Urocortin（非特許文献３を参照）やＡＣＴＨ（非特許文献４を参照）が過剰発現されることを報告している。こういった事実は、ＲＡの増悪因子として体内ホルモンバランスの異常が作用する可能性を示すものである。しかし、体内ホルモンバランスの異常のみがＲＡに特有の滑膜増殖や骨軟骨破壊を導くものではない。 Moreover, it is known that abnormal hormone secretion is involved in the pathology of RA. One of them is hypothalamus-pituitary-adrenal axis abnormality. In connection with this, the present inventors have reported that Urocortin (refer nonpatent literature 3) and ACTH (refer nonpatent literature 4) are overexpressed in RA joint synovium. These facts indicate the possibility of abnormal hormone balance in the body acting as an exacerbation factor of RA. However, only abnormal hormone balance in the body does not lead to synovial proliferation and osteochondral destruction peculiar to RA.
例えば、ＲＡの滑膜病変の進行には関節滑膜の慢性炎症が必須であるが、その際、c-fos遺伝子やc-myc遺伝子といった癌原遺伝子が活性化され、炎症の遷延化に関与することが知られている。（非特許文献５を参照）。 For example, chronic inflammation of the joint synovium is essential for the progression of RA synovial lesions. At that time, proto-oncogenes such as c-fos gene and c-myc gene are activated, and are involved in the prolongation of inflammation. It is known to do. (See Non-Patent Document 5).
さらに、本発明者らは、c-fos遺伝子を過剰発現させたH2-c-fos遺伝子導入マウスにおいて実験的関節炎が重症化し、滑膜間葉系細胞にのみによる関節破壊が誘導されることを見出している（非特許文献６および７を参照）。 Furthermore, the present inventors have found that experimental arthritis becomes severe in H2-c-fos gene-introduced mice overexpressing the c-fos gene, and joint destruction is induced only by synovial mesenchymal cells. (See Non-Patent Documents 6 and 7).
また、本発明者らは、ＲＡ滑膜細胞においてc-fos遺伝子が転写因子activator protein-1(AP-1)として機能した結果、細胞因子調節因子であるWee1キナーゼの発現を直接制御することを明らかにしている（非特許文献８）。 In addition, the present inventors have found that the c-fos gene functions as a transcription factor activator protein-1 (AP-1) in RA synovial cells, and as a result, directly controls the expression of Wee1 kinase, a cellular factor regulator. It is clarified (Non-Patent Document 8).
ところで、上述のWee1キナーゼは、体内時計遺伝子であるCry1遺伝子およびcry2遺伝子をノックアウトしたマウス（Cry1/2遺伝子ノックアウトマウス、以下「Cry1/2KOマウス」ともいう）では、過剰に発現していることが知られている（非特許文献９および１０を参照）。 By the way, the above-mentioned Wee1 kinase is overexpressed in a mouse (Cry1 / 2 gene knockout mouse, hereinafter also referred to as “Cry1 / 2KO mouse”) in which Cry1 gene and cry2 gene, which are biological clock genes, are knocked out. It is known (see Non-Patent Documents 9 and 10).
上記体内時計遺伝子とは、体内時計を制御する遺伝子の総称である。体内時計は生物が地球の自転により起こる昼夜変化に適応するために獲得した基本形質であり、ヒトを含む哺乳類において特に発達している。体内時計のセンターは視床下部の小神経核である視交叉上核であるが、一方で皮膚をはじめ肝、腸管、腎などの臓器が個々に時計遺伝子を発現し、24時間周期の機能的変動を行う。 The biological clock gene is a general term for genes that control the biological clock. The circadian clock is a basic trait acquired by organisms to adapt to day and night changes caused by the rotation of the earth, and is especially developed in mammals including humans. The center of the circadian clock is the suprachiasmatic nucleus, the small nucleus of the hypothalamus. On the other hand, organs such as the skin, liver, intestinal tract, and kidney individually express clock genes, and functional fluctuations in a 24-hour cycle I do.
生体リズムの研究は近年、時計遺伝子が相次いで報告されたため急速に進展している。上記Cry1遺伝子およびcry2遺伝子は、転写抑制因子として働く時計遺伝子である。Cry1遺伝子およびcry2遺伝子以外の時計遺伝子としては、現在までにClock遺伝子、BMAL1遺伝子、Per1遺伝子、Per2遺伝子、Per3遺伝子、およびカゼインキナーゼ遺伝子が報告されている。これらの遺伝子群は、互いにその発現を調節しながら作用して体内ホルモンの分泌や代謝に日内リズムをもたらす。 In recent years, research on biological rhythm has been progressing rapidly because clock genes have been reported one after another. The Cry1 gene and the cry2 gene are clock genes that act as transcription repressors. As clock genes other than Cry1 gene and cry2 gene, Clock gene, BMAL1 gene, Per1 gene, Per2 gene, Per3 gene, and casein kinase gene have been reported so far. These genes act by regulating the expression of each other and bring about circadian rhythms in the secretion and metabolism of body hormones.
上記Cry1/2KOマウスでは、さらに、暗環境（暗闇）においても活動と睡眠とを細切れに繰り返し、睡眠障害に基づく機能異常を表現する。視交叉上核からの時間シグナルは、神経系の特性を生かして視床下部の内分泌・自律神経系の諸核に出力される。また、脳からのびる交感神経・副交感神経は、直接また間接的に副腎を介して諸臓器に分布する細胞の時間シグナルを調節する。
ＲＡにおいて、その本体が不明な症状として、古くから、ＲＡ患者に特有の性格が知られている。この特有の性格については、これまで多くの心理学的・精神医学的分析が多くなされてきたが、その本体は未だ解明されていない。上記「ＲＡ患者に特有の性格」とは、疑り深く頑固で容易に妥協しないといった類のものである。 In RA, a characteristic peculiar to RA patients has been known for a long time as a symptom whose body is unknown. Many psychological and psychiatric analyzes have been conducted on this unique character, but the main body has not yet been elucidated. The above-mentioned “characters specific to RA patients” are suspicious, stubborn and not easily compromised.
ところで、上述したように、ＲＡでは、Wee1キナーゼの過剰発現が見られる。このWee1キナーゼの過剰発現は、上述したようにＲＡにおける腫瘍様の病態を呈するのに寄与するが、ＲＡ患者に対して、その他どのような影響を及ぼすものであるかについては、全く知られていない。 By the way, as described above, overexpression of Wee1 kinase is observed in RA. This overexpression of Wee1 kinase contributes to exhibiting a tumor-like pathology in RA as described above, but it is completely known how it affects other RA patients. Absent.
一方、上記Cry1/2KOマウスは、上述した特徴をもつことから、視交叉上核という神経核レベルの異常を起点に、睡眠障害と全身性に伝播される行動・ホルモン異常、さらに細胞周期調節因子（Wee1キナーゼ）異常を具現するモデルマウスと捉えることができる。 On the other hand, since the Cry1 / 2KO mouse has the above-mentioned features, sleep disorders and behavioral / hormonal abnormalities that are transmitted systemically, as well as cell cycle regulators, originated from abnormalities in the nucleus of the nucleus of the chiasm (Wee1 kinase) It can be considered as a model mouse that embodies abnormalities.
本発明者らは、上記２つの知見、すなわち、（１）ＲＡにおけるWee1キナーゼの過剰発現と、（２）睡眠障害をもつCry1/2KOマウスにおけるWee1キナーゼの過剰発現とから、ＲＡにおいて、Wee1キナーゼが過剰発現することにより、睡眠異常という病態が現れることに起因して、上記のＲＡ患者に特有の性格が形成される可能性があることを独自に考え出した。しかしながら、これまで、ＲＡ患者における不眠は、疼痛によるものと考えられており、ＲＡと睡眠異常との関係を分子生物学的手法を用いて、生化学的に解析した研究例は全くない。 From the above two findings, namely, (1) overexpression of Wee1 kinase in RA and (2) overexpression of Wee1 kinase in Cry1 / 2KO mice with sleep disorders, Wee1 kinase in RA It has been independently devised that the above-mentioned personality of RA patients may be formed due to the appearance of a pathological condition of abnormal sleep due to overexpression of. However, so far, insomnia in RA patients is considered to be due to pain, and there is no research example that biochemically analyzed the relationship between RA and sleep abnormalities using molecular biological techniques.
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、ＲＡと睡眠異常との関係を生化学的に明らかにし、その知見を基づいて、新たな関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法、並びにその利用を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above problems, and its purpose is to clarify the relationship between RA and sleep abnormalities biochemically, and based on the findings, new rheumatoid arthritis and sleep of rheumatoid arthritis It is in providing the determination method of onset or possibility of onset of a disorder | damage | failure, and its utilization.
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、Cry1/2KOマウスは滑膜増殖を起こしやすい表現型を示し、重度の関節炎を発症するとともに、睡眠異常を引き起こすWee1キナーゼの活性上昇が見られることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、産業上有用な以下の発明を包含する。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventors have shown that Cry1 / 2KO mice exhibit a phenotype that is prone to synovial proliferation, develop severe arthritis, and increase the activity of Wee1 kinase that causes sleep abnormalities. The present invention has been found uniquely and the present invention has been completed. That is, the present invention includes the following industrially useful inventions.
（１）生体から分離した試料を用いて、体内時計遺伝子の発現を評価する工程を含むことを特徴とする関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法。 (1) A method for determining the onset or possibility of onset of rheumatoid arthritis and sleep disorders in rheumatoid arthritis, comprising a step of evaluating expression of a circadian clock gene using a sample isolated from a living body.
（２）体内時計遺伝子が、Cry1遺伝子、Cry2遺伝子、Clock遺伝子、BMAL1遺伝子、Per1遺伝子、Per2遺伝子、Per3遺伝子、およびカゼインキナーゼ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であることを特徴とする（１）に記載の関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法。 (2) The biological clock gene is at least one gene selected from the group consisting of Cry1 gene, Cry2 gene, Clock gene, BMAL1 gene, Per1 gene, Per2 gene, Per3 gene, and casein kinase gene. The method for determining the onset or likelihood of onset of rheumatoid arthritis and rheumatoid arthritis sleep disorder according to (1).
（３）Wee1キナーゼの発現量を測定する工程をさらに含むことを特徴とする（１）または（２）に記載の関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法。 (3) The method for determining the onset or possibility of onset of rheumatoid arthritis and rheumatoid arthritis sleep disorder according to (1) or (2), further comprising a step of measuring the expression level of Wee1 kinase.
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法を実施するために用いるキットであって、体内時計遺伝子の発現量を測定するために用いるプライマー、プローブ、および抗体のうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定キット。 (4) A kit used for carrying out the method for determining the onset or likelihood of onset of rheumatoid arthritis and rheumatoid arthritis according to any one of (1) to (3), wherein the expression level of a circadian clock gene Rheumatoid arthritis and rheumatoid arthritis sleep disorder determination kit, characterized by containing at least one of a primer, a probe, and an antibody used to measure the disease.
（５）さらに、Wee1キナーゼの発現量を測定するために用いるプライマー、プローブ、および抗体のうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする（４）に記載の関節リウマチの発症またはその可能性の判定キット。 (5) The onset of rheumatoid arthritis or the possibility thereof as described in (4), further comprising at least one of a primer, a probe, and an antibody used for measuring the expression level of Wee1 kinase Judgment kit.
（６）体内時計遺伝子に異常が見られ、Wee1キナーゼの発現量が過剰に上昇していることを特徴とする関節リウマチ発症モデル動物。 (6) A rheumatoid arthritis onset model animal characterized in that an abnormality is found in a circadian clock gene and an expression level of Wee1 kinase is excessively increased.
（７）上記体内時計遺伝子の異常が、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子の破壊であることを特徴とする（６）に記載の関節リウマチ発症モデル動物。 (7) The rheumatoid arthritis onset model animal according to (6), wherein the abnormality of the circadian clock gene is disruption of the Cry1 gene and the Cry2 gene.
（８）Wee1キナーゼの発現量が過剰に上昇するように体内時計遺伝子を操作する工程を含むことを特徴とする関節リウマチ発症モデル動物の製造方法。 (8) A method for producing a model animal for developing rheumatoid arthritis, comprising a step of manipulating a circadian clock gene so that the expression level of Wee1 kinase is excessively increased.
（９）上記体内時計遺伝子の操作が、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子の破壊であることを特徴とする（８）に記載の関節リウマチ発症モデル動物の製造方法。 (9) The method for producing a model animal for developing rheumatoid arthritis according to (8), wherein the manipulation of the circadian clock gene is destruction of the Cry1 gene and the Cry2 gene.
（１０）（６）または（７）に記載の関節リウマチ発症モデル動物に、被験化合物を投与する工程と、当該被験化合物を投与された関節リウマチ発症モデル動物における関節リウマチのマーカーを測定する工程とを含むことを特徴とする関節リウマチの治療薬剤のスクリーニング方法。 (10) a step of administering a test compound to the rheumatoid arthritis model animal according to (6) or (7), and a step of measuring a rheumatoid arthritis marker in the rheumatoid arthritis model animal administered with the test compound; A method for screening a therapeutic agent for rheumatoid arthritis, comprising:
（１１）上記被験化合物が、Wee1キナーゼの発現を阻害することが期待される化合物またはWee1キナーゼの活性を阻害することが期待される化合物であることを特徴とする（１０）に記載の関節リウマチの治療薬剤のスクリーニング方法。 (11) Rheumatoid arthritis according to (10), wherein the test compound is a compound expected to inhibit Wee1 kinase expression or a compound expected to inhibit Wee1 kinase activity Screening method for therapeutic drugs.
（１２）睡眠障害を改善する物質を含有することを特徴とする関節リウマチの治療薬剤。 (12) A therapeutic agent for rheumatoid arthritis, comprising a substance that improves sleep disorders.
（１３）Wee1キナーゼの発現量を抑制することを特徴とする（１２）に記載の関節リウマチの治療薬剤。 (13) The therapeutic agent for rheumatoid arthritis according to (12), wherein the expression level of Wee1 kinase is suppressed.
本発明にかかる関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法は、以上のように、体内時計遺伝子の発現量を指標とするものである。それゆえ、簡便に、かつ客観的に関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性を判定できるという効果を奏する。 As described above, the method for determining the onset or possibility of onset of sleep disorders in rheumatoid arthritis and rheumatoid arthritis according to the present invention uses the expression level of the body clock gene as an index. Therefore, it is possible to easily and objectively determine the onset or possibility of onset of rheumatoid arthritis and rheumatoid arthritis sleep disorder.
また、本発明にかかる関節リウマチ発症モデル動物は、体内時計遺伝子が操作されることにより、Wee1キナーゼの発現量およびc-fos遺伝子の発現量が上昇しているため、関節リウマチを発症している。それゆえ、新たな関節リウマチの治療薬剤や、治療方法の開発に好適に用いることができる。 In addition, the rheumatoid arthritis model animal according to the present invention develops rheumatoid arthritis because the expression level of Wee1 kinase and the expression level of c-fos gene are increased by manipulating the circadian clock gene. . Therefore, it can be suitably used for the development of new therapeutic agents for rheumatoid arthritis and therapeutic methods.
本発明者らは、関節リウマチ（rheumatoid arthritis、以下「ＲＡ」ともいう）患者に見られる不眠症状は、疼痛によるものだけではなく、体内時計の異常により引き起こされることを独自に見出した。具体的には、本発明者らは、これまでに、ＲＡ患者では、c-fos遺伝子の過剰活性化により、Wee1キナーゼの発現が上昇することにより、関節滑膜細胞やＴリンパ球が過剰活性化されることを見出していた。しかし、このWee1キナーゼの過剰発現が、ＲＡ患者において、そのほかにどのような症状を引き起こしているかについては全く知られていなかった。 The present inventors have uniquely found that insomnia symptoms observed in rheumatoid arthritis (hereinafter also referred to as “RA”) patients are caused not only by pain but also by an abnormality in the body clock. Specifically, the present inventors have so far demonstrated that synovial cells and T lymphocytes are overactive in RA patients due to increased expression of Wee1 kinase due to overactivation of the c-fos gene. I found out that However, it has not been known at all what other symptoms are caused by overexpression of this Weel kinase in RA patients.
そこで、c-fos遺伝子の過剰活性化以外の方法で、Wee1キナーゼの過剰発現を誘導した実験動物を用いて、ＲＡを発症するかを検証した。c-fos遺伝子の過剰活性化以外の方法として、本発明者らは、体内時計遺伝子であるCry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊する方法を用いた。 Therefore, it was verified whether RA was developed using experimental animals in which overexpression of Wee1 kinase was induced by a method other than overactivation of the c-fos gene. As a method other than the overactivation of the c-fos gene, the present inventors used a method of destroying the Cry1 gene and the Cry2 gene, which are biological clock genes.
マウスにおいて、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊すると、Wee1キナーゼが過剰発現し、睡眠障害を引き起こすことは知られていたが、ＲＡを発症するか否かについては全く検討もなされていなかった。 It has been known that when the Cry1 gene and the Cry2 gene are disrupted in mice, Wee1 kinase is overexpressed and causes sleep disorder, but whether or not to develop RA has not been studied at all.
上記の検証の結果、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊したマウスにおいて、ＲＡが発症されることが分かった。こうして、本発明者らは、これまで全く予測もされていなかった体内時計異常とＲＡ発症との相関を明らかにし、本発明を完成させるに至った。 As a result of the above verification, it was found that RA develops in mice in which the Cry1 gene and the Cry2 gene are disrupted. Thus, the present inventors have clarified the correlation between an abnormal biological clock and the onset of RA, which had never been predicted so far, and completed the present invention.
以下、本発明の実施形態について、説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 Hereinafter, although an embodiment of the present invention is described, the present invention is not limited to this.
＜１．ＲＡの発症またはその可能性の判定方法＞
本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法は、生体から分離した試料を用いて、体内時計遺伝子の発現を評価する工程を含んでいればよく、その他の具体的な工程や、使用する器具および装置は特に限定されるものではない。
<1. Method for determining the onset of RA or its possibility>
The method for determining the onset or possibility of onset of RA and RA sleep disorder according to the present invention may include a step of evaluating the expression of a circadian clock gene using a sample separated from a living body. There are no particular limitations on the processes and instruments and devices used.
本明細書において、上記体内時計遺伝子とは、体内時計を制御する遺伝子を意味する。また、上記「体内時計」とは、生物が地球の自転により起こる昼夜変化に適応するために獲得した基本形質を意味する。体内時計のセンターは視床下部の小神経核である視交叉上核である。一方で、皮膚をはじめ肝、腸管、腎などの臓器では個々に体内時計遺伝子が発現し、それら遺伝子が互いにその発現を調節しながら作用して体内ホルモンの分泌や代謝に日内リズムをもたらす。その結果として、生体内では、24時間周期の機能的変動が起こる。このような体内時計が正常でなくなると、睡眠障害等の症状が現れる。逆に言えば、睡眠障害がある場合、当該生物では、体内時計に異常がある可能性があると判断することができる。 In the present specification, the biological clock gene means a gene that controls the biological clock. The “internal clock” means a basic trait acquired by a living organism to adapt to day and night changes caused by the rotation of the earth. The center of the circadian clock is the suprachiasmatic nucleus, the small nucleus of the hypothalamus. On the other hand, body clock genes are individually expressed in organs such as skin, liver, intestinal tract, and kidneys, and these genes act while regulating their expression to bring about circadian rhythms in secretion and metabolism of body hormones. As a result, functional fluctuations in a 24-hour cycle occur in vivo. When such a biological clock becomes abnormal, symptoms such as sleep disorders appear. Conversely, if there is a sleep disorder, it can be determined that there is a possibility that the biological clock has an abnormality in the organism.
本発明において、上記体内時計遺伝子は特に限定されるものではなく、Cry1遺伝子、Cry2遺伝子、Clock遺伝子、BMAL1遺伝子、Per1遺伝子、Per2遺伝子、Per3遺伝子、およびカゼインキナーゼ遺伝子等を挙げることができる。本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法においては、上記例示したような体内時計遺伝子から、少なくとも１つ以上の遺伝子の発現量を測定すればよい。 In the present invention, the body clock gene is not particularly limited, and examples thereof include Cry1 gene, Cry2 gene, Clock gene, BMAL1 gene, Per1 gene, Per2 gene, Per3 gene, and casein kinase gene. In the method for determining the onset or possibility of onset of RA and RA sleep disorder according to the present invention, the expression level of at least one gene may be measured from the body clock genes as exemplified above.
上記Cry1遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３１７９７やＮＰ＿００４０６６に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００７７７１に登録されている塩基配列の５８４番目から２４０４番目までの塩基配列をオープンリーディングフレーム（以下、「ＯＲＦ」ともいう）として有する遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４０７５に登録されている塩基配列の５８７番目から２３４７番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子を例示することができる。 Examples of the Cry1 gene include a gene encoding a protein having an amino acid sequence registered in NCBI accession numbers NP_031797 and NP_004066. More specifically, a gene having the nucleotide sequence from the 584th to the 2404th of the nucleotide sequence registered in the NCBI accession number NM_007771 as an open reading frame (hereinafter also referred to as “ORF”), the NCBI accession number Examples thereof include genes having, as ORFs, the 587th to 2347th base sequences of the base sequence registered in NM_004075.
また、上記Cry2遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３４０９３やＮＰ＿０６６９４０に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００９９６３に登録されている塩基配列の６番目から１７８４番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２１１１７に登録されている塩基配列の１４番目から１７９５番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子を例示することができる。 Examples of the Cry2 gene include a gene encoding a protein having an amino acid sequence registered in NCBI accession numbers NP_040993 and NP_066940. More specifically, a gene having the 6th to 1784th base sequences registered in NCBI accession number NM_009963 as an ORF, or the 14th base sequence registered in NCBI accession number NM_021117 To the 1795th base sequence as an ORF.
上記Clock遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３１７４１やＮＰ＿００４８８９に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００７７１５に登録されている塩基配列の３８９番目から２９５６番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４８９８に登録されている塩基配列の３３９番目から２８７９番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子を例示することができる。 Examples of the Clock gene include a gene encoding a protein having an amino acid sequence registered in NCBI accession numbers NP_031741 and NP_004889. More specifically, a gene having the base sequence from the 389th to the 2956th base sequence registered in the NCBI accession number NM_007715 as an ORF, or a base sequence registered in the NCBI accession number NM_004898 Examples of the gene having the base sequence from the 339th to 2879th of the above as ORF can be exemplified.
上記BMAL1遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＡ１９９３５に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢ０００８１２に登録されている塩基配列の４１番目から１９２１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。 Examples of the BMAL1 gene include a gene encoding a protein having an amino acid sequence registered in NCBI Accession No. BAA19935. More specifically, a gene having the base sequence from the 41st to 1921st base sequences registered in NCBI accession number AB000812 as an ORF can be exemplified.
上記Per1遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３５１９５やＮＰ＿００２６０７に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１１０６５に登録されている塩基配列の２２６番目から４１０１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２６１６に登録されている塩基配列の１８８番目から４０６０番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。 Examples of the Per1 gene include a gene encoding a protein having an amino acid sequence registered in NCBI accession numbers NP_035195 and NP_002607. More specifically, a gene having the base sequence from the 226th to the 4101th base sequence registered in the NCBI accession number NM_011065 as an ORF, or the base sequence registered in the NCBI accession number NM_002616 A gene having the nucleotide sequence from 188th to 4060th as ORF can be exemplified.
上記Per2遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３５１９６やＮＰ＿０７３７２８に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１１０６６に登録されている塩基配列の１４５番目から３９１８番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２２８１７に登録されている塩基配列の１２３番目から３８９０番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。 Examples of the Per2 gene include a gene encoding a protein having an amino acid sequence registered in NCBI Accession Nos. NP — 035196 and NP — 073728. More specifically, a gene having the base sequence from the 145th to the 3918th of the base sequence registered in the NCBI accession number NM — 011066 as an ORF, or the base sequence registered in the NCBI accession number NM — 022817 A gene having the nucleotide sequence from the 123rd to the 3890th as an ORF can be exemplified.
上記Per3遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３５１９７やＮＰ＿０５８５１５に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１１０６７に登録されている塩基配列の３５８番目から３６９９番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１６８３１に登録されている塩基配列の１７６番目から３７８１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。 Examples of the Per3 gene include a gene encoding a protein having an amino acid sequence registered in NCBI accession numbers NP_035197 and NP_058515. More specifically, a gene having, as an ORF, the 358th to 3699th nucleotide sequences of the nucleotide sequence registered in NCBI accession number NM_011067, or the nucleotide sequence registered in NCBI accession number NM_016683 And a gene having the base sequence from the 176th position to the 3781th position as an ORF.
上記カゼインキナーゼ遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００１３１０に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１３１９に登録されている塩基配列の５４番目から１３０１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。 As said casein kinase gene, the gene which codes the protein which consists of an amino acid sequence registered into NCBI accession number NP_001310 is mentioned, for example. More specifically, a gene having, as an ORF, the 54th to 1301th base sequences registered in NCBI accession number NM_001319 can be exemplified.
本発明にかかる体内時計遺伝子は、上記例示したものに限定されるものではなく、上記例示した遺伝子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズし、かつ、上記例示した遺伝子の翻訳産物と同様の機能を有する翻訳産物を生じる遺伝子であってもよい。 The biological clock genes according to the present invention are not limited to those exemplified above, and hybridize with the above exemplified genes under stringent hybridization conditions and have the same functions as the translation products of the above exemplified genes. It may be a gene that produces a translation product having
上記「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の具体的な例として、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。また、上記ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al. Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではない。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。 Specific examples of the “stringent hybridization conditions” include, for example, a hybridization solution (50% formamide, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7. 6) Incubate overnight at 42 ° C. in 5 × Denhart solution, 10% dextran sulfate, and 20 μg / ml denatured sheared salmon sperm DNA, then in 0.1 × SSC at about 65 ° C. The conditions for washing the filter can be mentioned. The hybridization can be performed by a conventionally known method such as the method described in J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989). It is not limited. Usually, the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency (harder to hybridize).
上記のような条件でハイブリダイズする遺伝子としては、一般的には、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在する遺伝子が挙げられる。 Genes that hybridize under the conditions as described above are generally genes that have at least 90% identity, preferably at least 95% identity, most preferably at least 97% identity between sequences. Is mentioned.
本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法においては、上記のような体内時計遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子の発現を評価する工程を含んでいればよい。 In the method for determining the onset or possibility of onset of RA and RA sleep disorder according to the present invention, the method may include a step of evaluating the expression of at least one of the body clock genes as described above. .
本明細書において、「Ｘ遺伝子の発現を評価する」とは、以下の（ｉ）〜（ｖ）の全てを含む意味である。
（ｉ）Ｘ遺伝子の発現量を測定する。
（ｉｉ）Ｘ遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の発現量を測定する。
（ｉｉｉ）Ｘ遺伝子の翻訳産物であるタンパク質に由来する活性量を測定する。
（ｉｖ）Ｘ遺伝子の変異の有無を調べる。
（ｖ）Ｘ遺伝子の有無を調べる。
In the present specification, “evaluating the expression of the X gene” means including all of the following (i) to (v).
(I) The expression level of the X gene is measured.
(Ii) The expression level of the protein that is the translation product of the X gene is measured.
(Iii) The amount of activity derived from the protein that is the translation product of the X gene is measured.
(Iv) The presence or absence of a mutation in the X gene is examined.
(V) Check for the presence of the X gene.
以下、本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法について、より詳細に説明するが、本明細書において、「遺伝子の発現量」とは、当該遺伝子の転写量、すなわち、ｍＲＮＡ量を意味するだけではなく、当該遺伝子の翻訳産物であるタンパク質量をも含む意味で用いている。逆に、「タンパク質の発現量」についても、当該タンパク質の発現量に加えて、当該タンパク質をコードする遺伝子の発現量、すなわち、ｍＲＮＡ量をも含む意味で用いている。 Hereinafter, the method for determining the onset or possibility of onset of RA and RA sleep disorder according to the present invention will be described in more detail. In the present specification, the “gene expression level” refers to the transcription level of the gene, That is, not only the amount of mRNA but also the amount of protein that is a translation product of the gene is used. Conversely, “protein expression level” is also used to include the expression level of the gene encoding the protein, that is, the mRNA level, in addition to the expression level of the protein.
体内時計遺伝子の発現を評価する方法として、体内時計遺伝子の発現量を測定する方法を用いる場合、上記体内時計遺伝子の発現量の測定方法は、特に限定されるものではない。具体的には、上記体内時計遺伝子の発現量の測定方法は、ｍＲＮＡレベルで当該体内時計遺伝子の発現量を測定する方法であっても、また、タンパク質レベルで上記体内時計遺伝子の発現量の測定する方法であっても、さらにその両方を測定する方法であってもよい。より具体的には、（Ａ）体内時計遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を定量することにより、当該体内時計遺伝子の発現量を測定する方法、（Ｂ）体内時計遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を定量することにより、当該体内時計遺伝子の発現量を測定する方法のいずれをも用いることができる。また、上記（Ａ）および（Ｂ）の両方の方法で上記体内時計遺伝子の発現量を測定してもよい。そうすることにより、上記体内時計遺伝子の発現量をより正確に測定することができる。以下、上記（Ａ）および（Ｂ）の方法について説明する。 When a method for measuring the expression level of a biological clock gene is used as a method for evaluating the expression of the biological clock gene, the method for measuring the expression level of the biological clock gene is not particularly limited. Specifically, the method for measuring the expression level of the circadian clock gene is a method for measuring the expression level of the circadian clock gene at the mRNA level, or the measurement of the expression level of the circadian clock gene at the protein level. Or a method of measuring both of them. More specifically, (A) a method for measuring the expression level of the circadian clock gene by quantifying mRNA (cDNA) of the circadian clock gene, and (B) quantifying a protein that is a translation product of the circadian clock gene. Thus, any of the methods for measuring the expression level of the biological clock gene can be used. Further, the expression level of the circadian clock gene may be measured by both methods (A) and (B). By doing so, the expression level of the circadian clock gene can be measured more accurately. Hereinafter, the methods (A) and (B) will be described.
（Ａ）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる方法
ｍＲＮＡを利用する場合、例えば、被験者から採取した試料より抽出したｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを用いて、ノザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法などにより当該体内時計遺伝子のｍＲＮＡを定量することができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。
(A) Method using mRNA (cDNA) When using mRNA, for example, Northern hybridization method, dot blot method, DNA microarray method, etc. using mRNA or total RNA extracted from a sample collected from a subject The mRNA of the biological clock gene can be quantified. Furthermore, gene amplification techniques such as RT-PCR can be used. In the RT-PCR method, it is possible to perform more quantitative analysis of the expression of the gene of the present invention by using the PCR amplification monitoring method in the gene amplification process.
上記ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、両端に互いの蛍光を打ち消し合うことができる異なる蛍光色素で標識したプライマーを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲが進んでＴａｑポリメラーゼの５'−３'エクソヌクレアーゼ（exonuclease）活性により上記プライマーが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。上記検出対象についてコピー数の明らかな標準試料についても同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Holland,P.M.et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280;Livak,K.J.et al.,1995,PCR Methods and Applications 4(6):357-362;Heid,C.A.et al.,Genome Research 6:986-994;Gibson,E.M.U.et al.,1996,Genome Research 6:995-1001を参照）。これにより、検出対象を定量することができる。ＰＣＲ増幅モニター法においては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることができる。 In the PCR gene amplification monitoring method, primers labeled with different fluorescent dyes capable of canceling each other's fluorescence are used at both ends, and hybridized to a detection target (DNA or reverse transcription product of RNA). When the PCR proceeds and the primer is degraded by the 5′-3 ′ exonuclease activity of Taq polymerase, the two fluorescent dyes are separated and fluorescence is detected. This fluorescence is detected in real time. By simultaneously measuring a standard sample having a clear copy number with respect to the detection target, the copy number of the detection target in the target sample is determined based on the number of cycles in which PCR amplification is linear (Holland, PM et al., 1991). , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280; Livak, KJet al., 1995, PCR Methods and Applications 4 (6): 357-362; Heid, CAet al., Genome Research 6: 986 -994; Gibson, EMU et al., 1996, Genome Research 6: 995-1001). Thereby, a detection target can be quantified. In the PCR amplification monitoring method, for example, ABI PRISM 7700 (PE Biosystems) can be used.
上記プライマーは、特に限定されるものではなく、当該体内時計遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を利用して、従来公知の方法で設計すればよい。 The primer is not particularly limited, and may be designed by a conventionally known method using the base sequence of the cDNA of the biological clock gene.
上記試料からｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを抽出する方法は、特に限定されるものではなく、上記体内時計遺伝子を発現する生物学的試料（例えば、細胞、組織、生物個体等）などから、従来公知の方法を用いてｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを抽出することができる。上記生物学的試料としては、具体的には、胸腺、肝、脾、および四肢関節周囲軟部組織を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。 The method for extracting mRNA or total RNA from the sample is not particularly limited, and a conventionally known method from a biological sample (eg, cell, tissue, individual organism, etc.) that expresses the biological clock gene. Can be used to extract mRNA or total RNA. Specific examples of the biological sample include, but are not limited to, the thymus, liver, spleen, and soft tissue around the limb joint.
また、上記ＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーや、ノザンハイブリダイゼーション法やドットブロット法に用いるプローブを蛍光色素などにより標識する場合、その標識方法は特に限定されるものではない。例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーション法、ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識法、クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識法（Berger SL,Kimmel AR.(1987)Guide to Molecular Cloning Techniques,Method in Enzymology,Academic Press;Hames BD,Higgins SJ(1985)Genes Probes:A Practical Approach.IRL Press;Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.(1989)Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2nd Edn.Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照）、ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識法（Melton DA,Krieg,PA,Rebagkiati MR,Maniatis T,Zinn K,Green MR.(1984)Nucleic Acid Res.,12,7035−7056を参照）、放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Krick a LJ.(1992)Nonisotopic DNA Probing Techniques.Academic Pressを参照）などを用いることができる。 In addition, when the primer used in the RT-PCR or the probe used in the Northern hybridization method or the dot blot method is labeled with a fluorescent dye, the labeling method is not particularly limited. For example, nick translation method using DNA polymerase I, end labeling method using polynucleotide kinase, fill-in end labeling method using Klenow fragment (Berger SL, Kimmel AR. (1987) Guide to Molecular Cloning Techniques, Method in Enzymology, Academic Press; Hames BD, Higgins SJ ( 1985) Genes Probes: a Practical Approach.IRL Press; Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: see a Laboratory Manual, 2 nd Edn.Cold Spring Harbor Laboratory Press ), Labeling by transcription using RNA polymerase (see Melton DA, Krieg, PA, Rebagkiati MR, Maniatis T, Zinn K, Green MR. (1984) Nucleic Acid Res., 12, 7035-7056), radioisotope For example, a method of incorporating modified nucleotides without using DNA (see Krick a LJ. (1992) Nonisotopic DNA Probing Techniques. Academic Press) and the like can be used.
（Ｂ）タンパク質を用いる方法
被験者から採取した試料より抽出したタンパク質を用いる場合、分析対象となる体内時計遺伝子の翻訳産物であるタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、ウェスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法などの従来公知の免疫化学的手法により当該タンパク質を定量することができる。また、分析対象となるタンパク質の活性を測定することにより、当該タンパク質を定量することができる。さらに、本発明はこれに限定されず、従来公知のあらゆる手法を用いて、当該タンパク質を定量することができる。このように、体内時計遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を定量することで、上記体内時計遺伝子の発現量を測定することができる。
(B) Method using protein When using a protein extracted from a sample collected from a subject, Western blotting or ELISA using an antibody that specifically binds to a protein that is a translation product of a biological clock gene to be analyzed The protein can be quantified by a conventionally known immunochemical technique such as Further, the protein can be quantified by measuring the activity of the protein to be analyzed. Furthermore, the present invention is not limited to this, and the protein can be quantified using any conventionally known technique. Thus, the expression level of the biological clock gene can be measured by quantifying the protein that is the translation product of the biological clock gene.
また、試料からタンパク質を抽出する方法は、特に限定されるものではなく、上記タンパク質を含有する生物学的試料（例えば、細胞、組織、生物個体等）などから、当該タンパク質が分解されない条件下で、従来公知の緩衝液および装置、キット等を用いてタンパク質を抽出することができる。上記生物学的試料としては、具体的には、胸腺、肝、脾、四肢関節周囲軟部組織、末梢血リンパ球、および胸腺もしくは脾より採取したリンパ球を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。 In addition, the method for extracting the protein from the sample is not particularly limited, and the protein is not decomposed from a biological sample (eg, cell, tissue, individual organism, etc.) containing the protein. In addition, proteins can be extracted using conventionally known buffers, devices, kits, and the like. Specific examples of the biological sample include, but are not limited to, the thymus, liver, spleen, soft tissue around the limb joint, peripheral blood lymphocytes, and lymphocytes collected from the thymus or spleen. It is not something.
上記抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。また、上記抗体の取得方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、ポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物 の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離することにより取得することができる。また、ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。さらに、必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離してもよい。 The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Moreover, the acquisition method of the said antibody is not specifically limited, A conventionally well-known method can be used. For example, a polyclonal antibody can be obtained by taking blood of a mammal sensitized with an antigen and separating serum from this blood by a known method. Moreover, as a polyclonal antibody, the serum containing a polyclonal antibody can be used. Furthermore, if necessary, a fraction containing a polyclonal antibody may be further isolated from this serum.
また、モノクローナル抗体は、例えば、抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させて得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収することにより取得することができる。 Monoclonal antibodies can also be obtained by, for example, cloning a hybridoma obtained by removing immune cells from a mammal sensitized with an antigen and fusing them with myeloma cells and recovering the antibody from the culture. can do.
本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法においては、上記（Ａ）および／または（Ｂ）に例示したような方法で、被験者における体内時計遺伝子の発現量を測定する。その後、その発現量を、同様の方法で測定した健常者の発現量と比較する。両者の間で有意な相違が見られた場合、当該被験者は、体内時計に異常がある可能性があると判定する。上述したように、体内時計の異常は、睡眠障害を引き起こし、ＲＡを発症する可能性を示唆するものである。 In the method for determining the onset or possibility of onset of RA and RA sleep disorder according to the present invention, the expression level of the biological clock gene in the subject is measured by the method exemplified in (A) and / or (B) above. To do. Then, the expression level is compared with the expression level of a healthy person measured by the same method. If there is a significant difference between the two, the subject determines that there is a possibility that the biological clock is abnormal. As described above, abnormalities in the biological clock cause sleep disorder and suggest the possibility of developing RA.
より具体的にいえば、上記体内時計遺伝子がCry1遺伝子またはCry2遺伝子である場合、これら遺伝子の発現量が健常者と比較して低下していれば、ＲＡを発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。また、上記体内時計遺伝子がPer1遺伝子、Per2遺伝子、またはPer3遺伝子である場合、これら遺伝子の発現量が健常者と比較して低下していれば、ＲＡを発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。さらに上記体内時計遺伝子がClock遺伝子またはBMAL1遺伝子である場合、これら遺伝子の発現量が健常者と比較して上昇していれば、ＲＡを発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。 More specifically, when the body clock gene is a Cry1 gene or a Cry2 gene, if the expression level of these genes is lower than that of a healthy subject, RA has developed or will develop in the future. It can be determined that the possibility is high. In addition, when the body clock gene is a Per1 gene, a Per2 gene, or a Per3 gene, RA may develop or may develop in the future if the expression level of these genes is lower than that of healthy subjects. It can be determined that the property is high. Further, when the biological clock gene is the Clock gene or the BMAL1 gene, if the expression level of these genes is increased compared to that of a healthy person, it is determined that RA has developed or is likely to develop in the future. can do.
すなわち、本発明によれば、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害を現在発症しているか、もしくは将来的にＲＡおよびＲＡの睡眠障害を発症する可能性があると判定することができる。 That is, according to the present invention, it can be determined that RA and RA sleep disorders are presently occurring, or that RA and RA sleep disorders may develop in the future.
また、本発明では、体内時計遺伝子の発現を評価する方法として、体内時計遺伝子の変異の有無を調べる方法を用いることもできる。この場合の体内時計遺伝子の変異は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）、または翻訳産物であるタンパク質を用いて、従来公知の方法により調べることができる。 In the present invention, as a method for evaluating the expression of a biological clock gene, a method for examining the presence or absence of a mutation in the biological clock gene can also be used. The mutation of the biological clock gene in this case can be examined by a conventionally known method using genomic DNA, mRNA (cDNA), or a protein that is a translation product.
具体的には、ゲノムＤＮＡを用いる場合、例えば、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Oligonucleotide Ligation Assay）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＨＰＦＡ法、インベーダー法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法、プライマーオリゴベースエクステンション（Primer Oligo Base Extension）法、タイリング・アレイ法、および変性勾配ゲル電気泳動法などを用いて変異の有無を調べることができる。上記ゲノムＤＮＡは、常法により人体の全ての細胞より得ることが可能であるが、例えば、毛髪、各臓器、末梢リンパ球、滑膜細胞などから得ることができる。また、得られた細胞を培養し、増殖したものから得ることもできる。さらに、末梢血から得ることも可能である。 Specifically, when genomic DNA is used, for example, allyl-specific oligonucleotide probe method, oligonucleotide ligation assay (Oligonucleotide Ligation Assay) method, PCR-SSCP method, PCR-CFLP method, PCR-HPFA method, invader method, The presence or absence of mutation can be examined by using a RCA (Rolling Circle Amplification) method, a primer Oligo Base Extension method, a tiling array method, a denaturing gradient gel electrophoresis method, and the like. The genomic DNA can be obtained from all cells of the human body by a conventional method, but can be obtained from, for example, hair, organs, peripheral lymphocytes, synovial cells and the like. Further, the obtained cells can be obtained by culturing and proliferating. It can also be obtained from peripheral blood.
得られたゲノムは、そのまま用いてもよいし、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法およびＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅して用いてもよい。 The obtained genome may be used as it is, for example, PCR (Polymerase Chain Reaction) method, NASBA (Nucleic acid sequence based amplification) method, TMA (Transcription-mediated amplification) method, SDA (Strand Displacement Amplification) method, etc. It may be used after being amplified by the usual gene amplification method.
また、ｍＲＮＡを用いる場合、例えば、被験者の細胞より抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを作製し、上記遺伝子の領域を増幅後、増幅断片の塩基配列を直接シークエンスすることにより、またはＤＮＡチップを用いることにより、あるいはＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法を用いることにより、体内時計遺伝子の変異の有無を決定することができる。 When mRNA is used, for example, cDNA is prepared from mRNA extracted from a subject's cells by a reverse transcription reaction, and after amplification of the gene region, the base sequence of the amplified fragment is directly sequenced, or a DNA chip is prepared. By using this, or by using the RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) method, it is possible to determine the presence or absence of a mutation in the body clock gene.
また、被験者の細胞より調製したタンパク質を用いる場合、通常のタンパク質のシークエンス方法に準ずればよく、例えば、正常型もしくは変異型の体内時計タンパク質のみを認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法で検出する方法、タンパク質を単離し、直接または必要に応じ、酵素等で切断し、プロテインシークエンサーを利用して変異を検出する方法、アミノ酸の等電点の変異を検出する方法および質量分析により質量の差を検出する方法が挙げられる。 In addition, when a protein prepared from a subject's cells is used, it suffices to follow a normal protein sequencing method. For example, an antibody that recognizes only a normal or mutant biological clock protein is prepared and detected by an ELISA method. Method, Isolate protein, cut directly or if necessary with enzyme etc., detect mutation using protein sequencer, detect isoelectric point mutation of amino acid and mass analysis The method of detecting is mentioned.
このように、体内時計遺伝子の発現を評価する方法として、体内時計遺伝子の変異の有無を調べる方法を用いる場合、体内時計遺伝子における変異が検出されれば、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害を現在発症しているか、もしくは将来的にＲＡおよびＲＡの睡眠障害を発症する可能性があると判定することができる。この場合、さらに、翻訳産物であるタンパク質の定量や活性を評価することにより、健常者と比較して、体内時計遺伝子の発現に異常がないか調べることが好ましい。これにより、判定精度をより高めることができる。 As described above, when a method for examining the presence or absence of a mutation in the body clock gene is used as a method for evaluating the expression of the body clock gene, if a mutation in the body clock gene is detected, RA and RA sleep disorder are currently developed. It can be determined that there is a possibility of developing RA or RA sleep disorder in the future. In this case, it is further preferable to examine whether there is an abnormality in the expression of the circadian clock gene by evaluating the quantification and activity of the protein that is the translation product as compared with the healthy subject. Thereby, the determination accuracy can be further increased.
例えば、Cry1遺伝子、Cry2遺伝子、Per1遺伝子、Per2遺伝子、またはPer3遺伝子に変異が検出され、その結果、これら遺伝子の発現量が健常者と比較して低下していれば、ＲＡを発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。また、Clock遺伝子またはBMAL1遺伝子に変異があり、その結果、これら遺伝子の発現量が健常者と比較して上昇していれば、ＲＡを発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。 For example, if mutations are detected in the Cry1 gene, Cry2 gene, Per1 gene, Per2 gene, or Per3 gene, and as a result, the expression level of these genes is lower than that in healthy individuals, RA is developed. Or, it can be determined that there is a high possibility of developing in the future. In addition, if there is a mutation in the Clock gene or BMAL1 gene, and as a result, the expression level of these genes is increased compared with that of healthy individuals, it is determined that RA is developed or is likely to develop in the future. can do.
また、本発明では、体内時計遺伝子の発現を評価する方法として、体内時計遺伝子の有無を調べる方法を用いることもできる。具体的には、被験者のゲノムＤＮＡ上に、体内時計遺伝子が存在するかを従来公知の方法により調べることで、体内時計遺伝子の有無を調べることができる。体内時計遺伝子の欠損は、睡眠障害を引き起こし、ＲＡを発症する可能性を示唆するものである。 In the present invention, as a method for evaluating the expression of the biological clock gene, a method for examining the presence or absence of the biological clock gene can also be used. Specifically, the presence or absence of a circadian clock gene can be examined by examining whether a circadian clock gene is present on the genomic DNA of the subject by a conventionally known method. The deficiency of the circadian clock gene causes sleep disturbance and suggests the possibility of developing RA.
より具体的にいえば、Cry1遺伝子、Cry2遺伝子、Per1遺伝子、Per2遺伝子、またはPer3遺伝子が欠損している場合、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害を発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。 More specifically, when the Cry1 gene, Cry2 gene, Per1 gene, Per2 gene, or Per3 gene is deficient, RA and RA sleep disorders are developed or likely to develop in the future. Can be determined.
本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法は、さらに、Wee1キナーゼの発現量を測定する工程を含むことが好ましい。これにより、より精度よく、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性を判定することができる。より具体的には、被験者において測定したWee1キナーゼの発現量を、同様の方法で測定した健常者におけるWee1キナーゼの発現量と比較する。その結果、両者の間で有意な相違が見られた場合、具体的には、被験者においてWee1キナーゼの発現量の上昇が見られた場合、当該被験者は、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害を現在発症しているか、もしくは将来的にＲＡおよびＲＡの睡眠障害を発症する可能性があると判定することができる。 The method for determining the onset or possibility of onset of RA and RA sleep disorder according to the present invention preferably further comprises a step of measuring the expression level of Wee1 kinase. Thereby, the onset or possibility of onset of RA and RA sleep disorder can be determined with higher accuracy. More specifically, the expression level of Wee1 kinase measured in the subject is compared with the expression level of Wee1 kinase in healthy subjects measured by the same method. As a result, when there is a significant difference between the two, specifically, when the expression level of Wee1 kinase is increased in the subject, the subject currently develops RA and RA sleep disorder. It can be determined that there is a possibility of developing RA or RA sleep disorder in the future.
上記「Wee1キナーゼの発現量」には、Wee1キナーゼをコードするwee1遺伝子の転写レベルでの発現量、すなわちwee1遺伝子のｍＲＮＡ量、およびWee1キナーゼのタンパク質レベルでの発現量、すなわちWee1キナーゼのタンパク質量の両方の意味が含まれる。つまり、上記「Wee1キナーゼの発現量を測定する」とは、Wee1キナーゼの転写レベルでの発現量およびタンパク質レベルでの発現量のいずれを測定するものであってもよい。また、転写レベルでの発現量およびタンパク質レベルの両方の発現量を測定するものであってもよい。これにより、Wee1キナーゼの発現量をより精度よく測定することができる。 The expression level of "Wee1 kinase" includes the expression level of the wee1 gene encoding Wee1 kinase at the transcription level, that is, the mRNA level of the wee1 gene, and the expression level at the protein level of Wee1 kinase, that is, the protein level of Wee1 kinase. Both meanings are included. That is, the above “measuring the expression level of Wee1 kinase” may measure either the expression level of Wee1 kinase at the transcription level or the expression level at the protein level. Alternatively, the expression level at the transcription level and the expression level at the protein level may be measured. Thereby, the expression level of Wee1 kinase can be measured more accurately.
Wee1キナーゼの発現量を測定する方法は、特に限定されるものではなく、上述した体内時計遺伝子の発現量を測定する方法と同様の方法を用いることができる。 The method for measuring the expression level of Wee1 kinase is not particularly limited, and the same method as the method for measuring the expression level of the biological clock gene described above can be used.
また、上記wee1遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３３５４２やＮＰ＿００３３８１に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００９５１６に登録されている塩基配列の３１１番目から２２５１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００３３９０に登録されている塩基配列の１１４２番目から３０８２番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。 Examples of the wee1 gene include a gene encoding a protein having an amino acid sequence registered in NCBI accession numbers NP_033542 and NP_003381. More specifically, a gene having the nucleotide sequence from 311 to 2251 of the nucleotide sequence registered in NCBI accession number NM_009516 as an ORF, or the nucleotide sequence registered in NCBI accession number NM_003390 A gene having the nucleotide sequence from 1142 to 3082 as ORF can be exemplified.
さらに、本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法は、c-fos遺伝子の発現量を測定する工程を含むことが好ましい。これにより、さらに高精度にＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性を判定することができる。より具体的には、被験者において測定したc-fos遺伝子の発現量を、同様の方法で測定した健常者におけるc-fos遺伝子の発現量と比較する。その結果、両者の間で有意な相違が見られた場合、具体的には、被験者においてc-fos遺伝子の発現量の上昇が見られた場合、当該被験者は、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害を現在発症しているか、もしくは将来的にＲＡおよびＲＡの睡眠障害を発症する可能性があると判定することができる。 Furthermore, the method for determining the onset or possibility of onset of RA and RA sleep disorder according to the present invention preferably includes a step of measuring the expression level of the c-fos gene. Thereby, the onset or possibility of onset of RA and RA sleep disorder can be determined with higher accuracy. More specifically, the expression level of the c-fos gene measured in the subject is compared with the expression level of the c-fos gene in a healthy person measured by the same method. As a result, when there is a significant difference between the two, specifically, when an increase in the expression level of the c-fos gene is observed in the subject, the subject is presently suffering from RA and RA sleep disorder. It can be determined that it has developed or is likely to develop RA and RA sleep disorders in the future.
上記「c-fos遺伝子の発現量」には、c-fos遺伝子の転写レベルでの発現量、すなわちc-fos遺伝子のｍＲＮＡ量、およびc-fos遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の発現量、すなわちc-fos遺伝子タンパク質の量の両方の意味が含まれる。つまり、上記「c-fos遺伝子の発現量を測定する」とは、c-fos遺伝子の転写レベルでの発現量およびタンパク質レベルでの発現量のいずれを測定するものであってもよい。また、転写レベルでの発現量およびタンパク質レベルの両方の発現量を測定するものであってもよい。これにより、c-fos遺伝子の発現量をより精度よく測定することができる。 The expression level of the c-fos gene includes the expression level of the c-fos gene at the transcription level, that is, the mRNA level of the c-fos gene, and the expression level of the protein that is the translation product of the c-fos gene, Both meanings of the amount of c-fos gene protein are included. That is, the above-mentioned “measuring the expression level of the c-fos gene” may measure either the expression level at the transcription level of the c-fos gene or the expression level at the protein level. Alternatively, the expression level at the transcription level and the expression level at the protein level may be measured. Thereby, the expression level of the c-fos gene can be measured with higher accuracy.
c-fos遺伝子の発現量を測定する方法は、特に限定されるものではなく、上述した体内時計遺伝子の発現量を測定する方法と同様の方法を用いることができる。 The method for measuring the expression level of the c-fos gene is not particularly limited, and the same method as the method for measuring the expression level of the circadian clock gene described above can be used.
また、上記c-fos遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＣＡＡ２４７５６に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。 Moreover, as said c-fos gene, the gene which codes the protein which consists of an amino acid sequence registered into NCBI accession number CAA24756 is mentioned, for example.
本発明において、上記被験者は、特に限定されるものではないが、自覚症状として、睡眠障害、例えば、不眠を訴えている者や、関節炎を疑わせる症状を有する者であることが好ましい。さらに、本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法が適用される試料は、人体等の生体から分離された試料であればよく、上記例示されたものに限定されるものではない。 In the present invention, the subject is not particularly limited, but it is preferable that the subjective symptom is a person complaining of sleep disorder, for example, insomnia, or a person suspected of having arthritis. Furthermore, the sample to which the method for determining the onset or possibility of onset of RA and RA sleep disorder according to the present invention is applied is only required to be a sample separated from a living body such as a human body, and is limited to those exemplified above. It is not something.
＜２．ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定キット＞
本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定キット（換言すれば、ＲＡの診断キット）は、上記体内時計遺伝子の発現量を測定するための試薬を少なくとも含んでいればよく、その他の構成は特に限定されるものではない。上記体内時計遺伝子の発現量を測定するための試薬としては、例えば、プライマー、プローブ、および抗体などを挙げることができる。これらの試薬は、単独で含まれてもよく、また、複数の組み合わせで含まれていてもよい。さらに、上記判定キットは、上記例示する試薬に加えて、その他の試薬を組み合わせることによっても得ることができる。
<2. RA and RA sleep disorder determination kit>
The determination kit for the onset or possibility of onset of RA and RA sleep disorder according to the present invention (in other words, the RA diagnostic kit) includes at least a reagent for measuring the expression level of the biological clock gene. Other configurations are not particularly limited. Examples of the reagent for measuring the expression level of the circadian clock gene include a primer, a probe, and an antibody. These reagents may be contained alone or in a plurality of combinations. Furthermore, the determination kit can be obtained by combining other reagents in addition to the reagents exemplified above.
具体的には、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）または全ＲＮＡを用いて上記体内時計遺伝子の発現量を測定するキットとしては、上記体内時計遺伝子のｃＤＮＡの一部の領域を増幅できるように設計されたプライマーおよび／または上記体内時計遺伝子のｍＲＮＡに結合できるように設計されたプローブを含み、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法やノザンブロット法に用いられる試薬など、体内時計遺伝子の発現量を測定するために必要な試薬を１つ以上組み合わせたキットが挙げられる。なお、かかる試薬は、採用される検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法やノザンブロット法に用いることが可能な適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。 Specifically, as a kit for measuring the expression level of the circadian clock gene using mRNA (cDNA) or total RNA, primers designed to amplify a partial region of the circadian clock gene cDNA and Reagents necessary for measuring the expression level of biological clock genes such as reagents used for quantitative RT-PCR and Northern blotting, including probes designed to bind to mRNA of the biological clock genes One or more kits may be combined. Such a reagent is appropriately selected and employed depending on the detection method employed, and examples thereof include dATP, dUTP, dTTP, dGTP, and DNA synthase. Furthermore, an appropriate buffer and washing solution that can be used for quantitative RT-PCR and Northern blotting may be included.
上記プライマーやプローブは、特に限定されるものではない。具体的には、上記プライマーは、上記体内時計遺伝子のｃＤＮＡの一部の領域を増幅できるものであればよい。また、上記プローブは、上記体内時計遺伝子のｍＲＮＡに結合できるように設計されたものであればよい。 The primers and probes are not particularly limited. Specifically, the primer may be any primer that can amplify a partial region of the cDNA of the biological clock gene. The probe may be any probe designed so that it can bind to the mRNA of the biological clock gene.
さらに、タンパク質レベルで上記体内時計遺伝子の発現量を測定するキットとしては、例えば体内時計遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を認識する抗体を含むキットなどが挙げられる。 Furthermore, examples of the kit for measuring the expression level of the biological clock gene at the protein level include a kit containing an antibody that recognizes a protein that is a translation product of the biological clock gene.
また、上記判定キットには、Wee1キナーゼおよび／またはc-fos遺伝子の発現量を測定するために用いるプライマーや、プローブ、抗体が含まれることが好ましい。上記構成によれば、より精度よく、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性を判定することができる。 The determination kit preferably includes a primer, probe, or antibody used for measuring the expression level of Wee1 kinase and / or c-fos gene. According to the above configuration, it is possible to determine the onset or onset possibility of RA and RA sleep disorder with higher accuracy.
上述した判定キットを使用することにより、上記＜１．ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法＞の項で述べたように、ＲＡの診断（発症または発症可能性の判定）を客観的かつ簡便に行うことができる
また、本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定キットが適用される被験者は、特に限定されるものではないが、自覚症状として、睡眠障害、例えば、不眠を訴えている者や、関節炎を疑わせる症状を有する者であることが好ましい。
By using the determination kit described above, <1. As described in the section on the method for determining the onset or likelihood of onset of RA and RA sleep disorders>, RA diagnosis (determination of onset or onset possibility) can be performed objectively and simply. The subject to whom the determination kit for the onset or possibility of onset of RA and RA sleep disorder is not particularly limited, but as a subjective symptom, a person who is complaining of sleep disorder, for example, insomnia, It is preferable that the subject has a symptom suspected of arthritis.
＜３．ＲＡ発症モデル動物およびその製造方法＞
本発明にかかるＲＡ発症モデル動物は、体内時計遺伝子に異常が見られ、Wee1キナーゼの発現量が過剰に上昇し、ＲＡを発症しているモデル動物である。
<3. RA model animal and method for producing the same>
The RA-onset model animal according to the present invention is a model animal in which an abnormality is observed in the circadian clock gene, the expression level of Weel kinase is excessively increased, and RA is developed.
本明細書において、「モデル動物」とは、ヒトの疾患に対する予防法または治療法を開発するために用いられる実験動物をいい、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、サル、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌなどの非ヒト哺乳動物、およびその他の脊椎動物が挙げられる。 In the present specification, the “model animal” refers to an experimental animal used for developing a preventive or therapeutic method for human diseases, specifically, a mouse, a rat, a rabbit, a monkey, a goat, a pig, Non-human mammals such as sheep, cows, dogs, and other vertebrates.
上記体内時計遺伝子の異常とは、当該体内時計遺伝子の発現量の異常をもたらす体内時計遺伝子の異常であって、その原因は特に限定されるものではない。具体的には、体内時計遺伝子が破壊されることにより、体内時計遺伝子の発現量に異常が見られるモデル動物、いわゆる体内時計遺伝子のノックアウトモデル動物や、体内時計遺伝子に変異が導入された結果、体内時計遺伝子の発現量に異常が見られるモデル動物の変異体などが挙げられる。上記変異は、体内時計遺伝子の発現量を低下させる変異であっても、上昇させる変異であってもよい。 The abnormality of the biological clock gene is an abnormality of the biological clock gene that causes an abnormality in the expression level of the biological clock gene, and its cause is not particularly limited. Specifically, as a result of the introduction of mutations in model animals in which the expression level of the body clock gene is abnormal due to the destruction of the body clock gene, the so-called body clock gene knockout model animal, Examples include mutants of model animals in which abnormal expression of the circadian clock gene is observed. The mutation may be a mutation that decreases the expression level of the circadian clock gene or a mutation that increases it.
上記変異とは、遺伝子の置換、欠失、挿入、あるいは付加を示すものである。本発明においては、当該体内時計遺伝子の翻訳産物であるタンパク質のアミノ酸配列に変異を導入するものであることが好ましい。また、別の形態としては、当該体内時計遺伝子の転写調節領域を変異させることにより、当該体内時計遺伝子の発現そのものを調節するものであってもよい。 The above mutation refers to gene substitution, deletion, insertion, or addition. In the present invention, a mutation is preferably introduced into the amino acid sequence of a protein that is a translation product of the biological clock gene. As another form, the expression itself of the biological clock gene may be regulated by mutating the transcriptional regulatory region of the biological clock gene.
本発明にかかるＲＡ発症モデル動物では、さらに、c-fos遺伝子の発現量が過剰に上昇していることが好ましい。このようなモデル動物では、Wee1キナーゼの過剰発現により細胞分裂が抑制され、かつc-fos遺伝子の発現量が過剰に上昇することにより細胞増殖が活性化されるので、モデル動物にＲＡを発症させることができる。 In the RA onset model animal according to the present invention, it is further preferable that the expression level of the c-fos gene is excessively increased. In such a model animal, cell division is suppressed by overexpression of Wee1 kinase, and cell proliferation is activated by excessively increasing the expression level of the c-fos gene, thereby causing RA to develop in the model animal. be able to.
上記体内時計遺伝子は特に限定されるものではなく、具体的には、上記＜１．ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法＞の項で例示したものを同様に挙げることができる。その中でも、上記体内時計遺伝子は、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子であって、上記体内時計遺伝子の異常は、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子の破壊であることが好ましい。すなわち、本発明にかかるＲＡ発症モデル動物は、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子がともに破壊されたノックアウトモデル動物（以下、「cry1/2KOモデル動物」ともいう）であることが好ましい。 The body clock gene is not particularly limited, and specifically, <1. Examples exemplified in the section of the method for determining the onset or possibility of onset of RA and RA sleep disorder are the same. Among them, the body clock gene is preferably a Cry1 gene and a Cry2 gene, and the abnormality of the body clock gene is preferably disruption of the Cry1 gene and the Cry2 gene. That is, the RA onset model animal according to the present invention is preferably a knockout model animal in which both the Cry1 gene and the Cry2 gene are disrupted (hereinafter also referred to as “cry1 / 2KO model animal”).
後述の実施例においても実証しているように、cry1/2KOモデル動物では、c-fos遺伝子およびwee1遺伝子の発現が上昇する。つまり、c-fos遺伝子の発現の上昇により細胞増殖が活性化され、wee1遺伝子の発現の上昇により細胞分裂が抑制されるので、ＲＡが発症する。 As demonstrated in the examples described later, the expression of c-fos gene and wee1 gene is increased in the cry1 / 2KO model animal. That is, since the cell proliferation is activated by the increase in the expression of the c-fos gene and the cell division is suppressed by the increase in the expression of the wee1 gene, RA develops.
上記体内時計遺伝子が、Per1遺伝子、Per2遺伝子、またはPer3遺伝子である場合、当該体内時計遺伝子の異常は、Per1遺伝子、Per2遺伝子、またはPer3遺伝子の発現を低下させる異常であることが好ましい。 When the biological clock gene is a Per1 gene, Per2 gene, or Per3 gene, the abnormality of the biological clock gene is preferably an abnormality that decreases the expression of the Per1 gene, Per2 gene, or Per3 gene.
これによれば、wee1遺伝子の発現の上昇させることができ、その結果、当該モデル動物において、ＲＡを発症させることができる。 According to this, the expression of the wee1 gene can be increased, and as a result, RA can be developed in the model animal.
上記体内時計遺伝子がClock遺伝子またはBMAL1遺伝子である場合、上記体内時計遺伝子の異常は、Clock遺伝子またはBMAL1遺伝子が過剰発現する異常であることが好ましい。 When the biological clock gene is a Clock gene or a BMAL1 gene, the abnormality of the biological clock gene is preferably an abnormality in which the Clock gene or the BMAL1 gene is overexpressed.
Clock遺伝子またはBMAL1遺伝子の過剰発現は、上記wee1遺伝子を活性化し、発現量を増加させることができる。これにより、当該モデル動物において、ＲＡを発症させることができる。 Overexpression of the Clock gene or BMAL1 gene can activate the wee1 gene and increase the expression level. Thereby, RA can be developed in the model animal.
このようなＲＡ発症モデル動物は、体内時計の異常に伴い、睡眠障害を起こしている。したがって、上記ＲＡ発症モデル動物を用いることにより、ＲＡ患者に対する睡眠改善治療がＲＡの病態に及ぼす影響を評価することができ、新たなＲＡの治療方法の開発に用いることができる。 Such RA-onset model animals have sleep disorders associated with abnormalities in the body clock. Therefore, by using the RA model animal, it is possible to evaluate the influence of sleep improvement treatment on RA patients on the pathology of RA, and it can be used to develop a new RA treatment method.
本発明にかかるＲＡ発症モデル動物の製造方法は、Wee1キナーゼの発現量が過剰に上昇するようにモデル動物の体内時計遺伝子を操作する工程を含んでいればよく、その他の具体的な工程、材料、条件、使用装置、および使用機器等については、特に限定されるものではない。 The method for producing an RA-onset model animal according to the present invention only needs to include a step of manipulating the biological clock gene of the model animal so that the expression level of Wee1 kinase is excessively increased. Other specific steps and materials There are no particular restrictions on the conditions, equipment used, equipment used, and the like.
本明細書において、「モデル動物の遺伝子を操作する」とは、従来公知の遺伝子操作技術を用いて、モデル動物の遺伝子を操作するものであって、特に限定されるものではない。具体的には、モデル動物の遺伝子の遺伝子を破壊したり、当該遺伝子に変異を導入したり、さらには、当該モデル動物に外来遺伝子を導入したり、モデル動物を交雑したりすることをすべて包含する意味である。 In the present specification, “manipulating a gene of a model animal” is to manipulate a gene of a model animal using a conventionally known gene manipulation technique, and is not particularly limited. Specifically, it includes all of disrupting the gene of a model animal gene, introducing a mutation into the gene, introducing a foreign gene into the model animal, and crossing the model animals. That means
本発明において、モデル動物に特定の遺伝子を導入する方法としては、例えば、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法；位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）；胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法；レトロウィルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法；精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等を挙げることができる。上記精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（M.LavitranoetらCell,57,717,1989を参照）。 In the present invention, a method for introducing a specific gene into a model animal includes, for example, a method in which a gene and an egg are mixed and treated with calcium phosphate; a gene is introduced into the nucleus of a pronuclear stage egg using a microscopic pipette under a phase contrast microscope Method of direct introduction (microinjection method, US Pat. No. 4,873,191); method of using embryonic stem cells (ES cells); method of inserting a gene into a retroviral vector and infecting an egg; The sperm vector method etc. which are introduce | transduced into can be mentioned. The sperm vector method is a gene recombination method in which a foreign gene is introduced into a sperm by attaching the foreign gene to the sperm or incorporating it into a sperm cell by a method such as electroporation and then fertilizing the egg (M See Lavitranoet et al. Cell, 57,717, 1989).
また、本発明にかかるＲＡ発症モデル動物の製造方法において、モデル動物の体内時計遺伝子を破壊する場合の方法としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞ともいう）を用いて相同組換えを行い、一方の対立遺伝子を改変・破壊した胚性幹細胞を選別することにより、ノックアウト動物を製造する方法を用いることができる。より具体的には、受精卵に遺伝子を操作した胚性幹細胞を注入して、胚性幹細胞由来の細胞と胚由来の細胞が混ざったキメラ動物を得る。このキメラ動物と正常マウスとを交配することにより、一方の対立遺伝子の全てが改変・破壊されたヘテロ接合体を得ることができる。さらに、ヘテロ接合体同士を交配することにより、ホモ接合体を得ることができる。本発明にかかるＲＡ発症モデル動物は、これらヘテロ接合体と、ホモ接合体とのいずれをも含むものである。 Moreover, in the method for producing an RA-onset model animal according to the present invention, as a method for destroying the biological clock gene of the model animal, for example, homologous recombination is performed using embryonic stem cells (also referred to as ES cells), A method for producing a knockout animal can be used by selecting embryonic stem cells in which one allele has been altered / destroyed. More specifically, embryonic stem cells whose genes are manipulated are injected into fertilized eggs to obtain chimeric animals in which embryonic stem cell-derived cells and embryo-derived cells are mixed. By crossing this chimeric animal with a normal mouse, a heterozygote in which all of one allele has been modified and destroyed can be obtained. Furthermore, a homozygote can be obtained by crossing heterozygotes. The RA onset model animal according to the present invention includes both of these heterozygotes and homozygotes.
上記用語「キメラ」とは、２個以上の受精卵に基づいた体細胞で形成される単一個体をいう。また、用語「相同組換え」とは、遺伝子組換え機構で塩基配列が同じ、または非常に類似している２つの遺伝子間で起こる組換えのことをいう。相同組換えを起こした細胞の選別は、従来公知の方法およびそれらの変法を用いて容易に行うことができる。例えば、挿入遺伝子の一部、および挿入が期待される領域の一部の配列をもとに設計したプライマーを用いて、ＰＣＲを行い、増幅産物が生じた場合には、その細胞で相同組換えを起こしていると判定することができる。また、胚性幹細胞で発現している遺伝子に相同組み換えを起こさせる場合には、導入遺伝子にネオマイシン耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を結合させておき、そのマーカー遺伝子を用いて相同組換えが起こった細胞を選択することができる。 The term “chimera” refers to a single individual formed by somatic cells based on two or more fertilized eggs. The term “homologous recombination” refers to recombination that occurs between two genes that have the same or very similar base sequences in the genetic recombination mechanism. Selection of cells that have undergone homologous recombination can be easily carried out using conventionally known methods and variations thereof. For example, PCR is performed using primers designed based on part of the inserted gene and part of the region where insertion is expected, and if an amplified product is generated, homologous recombination occurs in the cell. It can be determined that In addition, when homologous recombination occurs in a gene expressed in embryonic stem cells, a marker gene such as a neomycin resistance gene is linked to the transgene, and the cell in which homologous recombination has occurred using the marker gene. Can be selected.
以上のように、本発明にかかるＲＡ発症モデル動物の製造方法によれば、Wee1キナーゼの発現量が上昇するように、モデル動物の体内時計遺伝子を操作することにより、ＲＡを発症したモデル動物を製造することができる。 As described above, according to the method for producing a RA-onset model animal according to the present invention, a model animal that has developed RA can be obtained by manipulating the biological clock gene of the model animal so that the expression level of Wee1 kinase is increased. Can be manufactured.
このようにして得られるＲＡ発症モデル動物は、ＲＡの治療薬剤のスクリーニングやＲＡの研究に利用することができる。したがって、抗ＲＡ薬の候補物質をスクリーニングするスクリーニング方法であって、ＲＡのモデル動物に被験化合物を与える過程と、上記＜１．ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法＞の項に記載の判定方法により、上記モデル動物のＲＡが治癒または改善されたか否かを診断する過程と、上記モデル動物のＲＡが治癒または改善していることを指標として、上記被験化合物が抗ＲＡ薬の候補化合物であると判定する過程と、を備えるスクリーニング方法も本発明に含まれる。 The RA-onset animal model thus obtained can be used for screening for RA therapeutic drugs and RA research. Accordingly, a screening method for screening a candidate substance for an anti-RA drug, the process of supplying a test compound to an RA model animal, and the above <1. The process of diagnosing whether or not RA in the model animal has been cured or improved by the determination method described in the section of the method for determining the onset or likelihood of onset of RA and RA sleep disorder, and the RA of the model animal A screening method comprising the step of determining that the test compound is a candidate compound of an anti-RA drug using the healing or improvement as an index is also included in the present invention.
＜４．ＲＡの治療薬剤のスクリーニング方法＞
本発明にかかるＲＡの治療薬剤のスクリーニング方法について、以下より詳細に説明する。
<4. Method for screening RA therapeutic drug>
The method for screening a therapeutic agent for RA according to the present invention will be described in more detail below.
本発明にかかるＲＡの治療薬剤のスクリーニング方法は、本発明にかかるＲＡ発症モデル動物に被験化合物を投与する工程と、当該被験化合物を投与されたＲＡ発症モデル動物におけるＲＡのマーカーを測定する工程とを含んでいればよい。つまり、上記ＲＡの治療薬剤のスクリーニング方法によれば、ＲＡ発症モデル動物に被験化合物を投与し、当該被験化合物を投与されたＲＡ発症モデル動物において、ＲＡが治癒または改善していることを指標として、上記被験物質が抗ＲＡ薬の候補化合物であると判定することができる。 The method for screening for a therapeutic drug for RA according to the present invention comprises the steps of administering a test compound to an RA model animal according to the present invention, and measuring an RA marker in the RA model animal administered with the test compound; Should be included. That is, according to the above-described method for screening a therapeutic drug for RA, a test compound is administered to an RA model animal, and RA is cured or improved in the RA model animal administered with the test compound as an index. It can be determined that the test substance is a candidate compound for an anti-RA drug.
上記被験化合物は、特に限定されるものではないが、Wee1キナーゼの発現を阻害することが期待される化合物またはWee1キナーゼの活性を阻害することが期待される化合物であることが好ましい。また、上記被験化合物は、睡眠を誘導する薬剤などのように、睡眠障害の治療に用いることができる薬剤であってもよい。 The test compound is not particularly limited, but is preferably a compound expected to inhibit Wee1 kinase expression or a compound expected to inhibit Wee1 kinase activity. The test compound may be a drug that can be used for the treatment of sleep disorders, such as a drug that induces sleep.
このような被験化合物を本発明にかかるＲＡ発症モデル動物に投与する方法は、特に限定されるものではなく、その被験化合物の物性等に応じて、それに適した方法を従来公知のものから選択して用いればよい。 The method for administering such a test compound to the animal model of RA development according to the present invention is not particularly limited, and a method suitable for the test compound is selected from conventionally known methods according to the physical properties of the test compound. Can be used.
また、上記ＲＡのマーカーとは、ＲＡの診断や治療において、ＲＡの発症や進行を判定するために用いられるマーカーを意味する。本発明において、上記ＲＡのマーカーは、特に限定されるものではないが、例えば、上述した体内時計遺伝子、wee1遺伝子、またはc-fos遺伝子を挙げることができる。また、本発明においては、ＩＬ−１、ＩＬ−６、またはＴＮＦ−αのような炎症性サイトカインや、リウマトイド因子（以下、「ＲＦ」という）、抗ガラクトース欠損ＩｇＧ抗体などをＲＡのマーカーとして用いることができる。 The RA marker means a marker used to determine the onset and progression of RA in the diagnosis and treatment of RA. In the present invention, the RA marker is not particularly limited, and examples thereof include the biological clock gene, the wee1 gene, and the c-fos gene described above. In the present invention, inflammatory cytokines such as IL-1, IL-6, or TNF-α, rheumatoid factor (hereinafter referred to as “RF”), anti-galactose-deficient IgG antibody, and the like are used as RA markers. be able to.
上記ＲＡのマーカーの測定方法は、特に限定されるものではなく、測定するＲＡのマーカーに種類に応じて、適宜従来公知の方法から選択することが好ましい。例えば、上述した体内時計遺伝子、wee1遺伝子、またはc-fos遺伝子をＲＡのマーカーとする場合、それら遺伝子の発現量は、＜１．ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法＞の項で述べた方法を用いて測定することができる。 The method for measuring the RA marker is not particularly limited, and it is preferable to appropriately select from conventionally known methods depending on the type of RA marker to be measured. For example, when the above-described biological clock gene, wee1 gene, or c-fos gene is used as a marker for RA, the expression level of these genes is <1. It can be measured using the method described in the section “Method for determining the onset or possibility of onset of RA and RA sleep disorder”.
＜５．ＲＡの治療薬剤および治療方法＞
本発明にかかるＲＡの治療薬剤は、睡眠障害を改善する物質を含有するものであればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。特に、Wee1キナーゼの発現量を抑制するものであることが好ましい。上記構成によれば、ＲＡ患者において、c-fos遺伝子の過剰発現により細胞が過剰増殖した場合であっても、細胞分裂が阻止されることがなく、ＲＡにおける腫瘍様の病態の進行を抑制することができる。
<5. RA therapeutic agent and method>
The therapeutic agent for RA according to the present invention is not particularly limited as long as it contains a substance that improves sleep disorders, and other specific configurations are not particularly limited. In particular, it is preferable to suppress the expression level of Wee1 kinase. According to the above configuration, even in the case of RA patients, cell division is not prevented even when cells are excessively proliferated due to overexpression of the c-fos gene, and the progression of tumor-like pathology in RA is suppressed. be able to.
上記睡眠障害を改善する物質としては、睡眠導入薬を挙げることができる。より具体的には、ジアゼパム剤や、メラトニンとビタミンＢ１２とを含む配合剤などを挙げることができる。 Examples of the substance that improves sleep disorders include sleep-inducing drugs. More specifically, a diazepam agent or a compounding agent containing melatonin and vitamin B12 can be used.
また、本発明にかかるＲＡの治療薬剤は、＜４．ＲＡの治療薬剤のスクリーニング方法＞の項で述べた方法を用いることにより、候補化合物から選抜することにより取得することができる。 The therapeutic agent for RA according to the present invention is <4. It can be obtained by selecting from candidate compounds by using the method described in the section “Method for screening therapeutic agent for RA>.
ところで、臨床適用のための治療薬剤の投与条件は、本明細書に記載したＲＡのモデル動物系を用いて決定することができる。すなわち、上記モデル動物を用いて投与量、投与間隔、投与ルートを含む投与条件を検討し、適切な予防または治療効果を得られる条件を決定することができる。このような治療薬剤は、ＲＡに対する予防または治療のための医薬となる。 By the way, the administration conditions of a therapeutic agent for clinical application can be determined using the RA model animal system described herein. That is, administration conditions including dosage, administration interval, and administration route can be examined using the model animal, and conditions for obtaining appropriate preventive or therapeutic effects can be determined. Such a therapeutic agent becomes a medicament for prevention or treatment of RA.
また、治療薬剤は、薬学的に許容できる所望の担体と組み合わせて組成物とすることができる。担体としては、例えば、滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、植物油、乳化剤、懸濁剤、塩、安定剤、保存剤、界面活性剤、徐放剤、他のタンパク質（ＢＳＡなど）、トランスフェクション試薬（リポフェクション試薬、リポソーム等を含む）等が挙げられる。さらに、使用可能な担体としては、グルコース、ラクトース、アラビアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンのり、マグネシウムトリシリケート、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、ばれいしょデンプン、尿素などが挙げられる。 The therapeutic agent can be combined with a desired pharmaceutically acceptable carrier to form a composition. Examples of the carrier include sterilized water, physiological saline, buffer, vegetable oil, emulsifier, suspension, salt, stabilizer, preservative, surfactant, sustained-release agent, other proteins (BSA, etc.), transfection Examples include reagents (including lipofection reagents and liposomes). Furthermore, usable carriers include glucose, lactose, gum arabic, gelatin, mannitol, starch paste, magnesium trisilicate, talc, corn starch, keratin, colloidal silica, potato starch, urea and the like.
製剤化する場合の剤型は制限されず、たとえば溶液（注射剤）、粉体、マイクロカプセル、錠剤などであってよい。投与は全身または局所的に行い得るが、全身投与による副作用や効果の低下がある場合には、局所投与することが好ましい。例えば本治療薬剤を徐放剤と組み合わせ、ＲＡを呈する疾患部位を標的とするドラッグデリバリーにより効果的に治療を行うことが可能と考えられる。 The dosage form for formulating is not limited, and may be, for example, a solution (injection), powder, microcapsule, tablet or the like. Administration can be performed systemically or locally, but when there are side effects or reduced effects due to systemic administration, local administration is preferred. For example, it is considered that this therapeutic agent can be combined with a sustained-release agent and effectively treated by drug delivery targeting a disease site exhibiting RA.
また、患者への投与は、特に限定されるものではなく、有効成分の性質に応じて、経口的に、または非経口的に行うことができる。経口的に投与する剤型としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、または懸濁剤等を選択することができる。非経口的な投与としては、例えば、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、皮下、脊髄腔内、もしくは脳室内への投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、非経口的に投与する剤型としては、例えば、注射剤、座薬、塗り薬等を挙げることができる。上記注射剤としては、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を挙げることができる。投与は全身的または局所的にされ得るが、全身投与による副作用が問題となる場合には病変部位への局所投与が好ましい。投与量、投与方法は、治療薬剤の有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。 Moreover, administration to a patient is not particularly limited, and can be performed orally or parenterally depending on the nature of the active ingredient. As a dosage form to be administered orally, granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions, suspensions and the like can be selected. Parenteral administration includes, for example, transdermal, intranasal, transbronchial, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, intraarticular, subcutaneous, intrathecal, or intraventricular. However, it is not limited to these. Examples of the dosage form administered parenterally include injections, suppositories, and coatings. Examples of the injection include subcutaneous injection, intramuscular injection, and intraperitoneal injection. Administration can be systemic or local, but when side effects due to systemic administration are a problem, local administration to the lesion site is preferred. The dosage and administration method vary depending on the tissue transferability of the active ingredient of the therapeutic agent, the purpose of treatment, the weight and age of the patient, symptoms, etc., but can be appropriately selected by those skilled in the art.
また、本発明の治療薬剤は一般的に、総組成物の重量で０．１〜９０％の治療薬物を含む。非経口投与では、１日当たり体重１ｋｇ当たり、０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜３００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１００ｍｇである。しかし、疾患状態、体重、及び治療に対する患者の個々反応、治療薬剤が投与される組成物の種類、および投与形態、病気の経過の段階または投与の間隔に依存して、これら投与速度は適宜調整する。したがって、上述した最小投与量より少なく使うことがときには適量であり、一方、他の場合には治療効果を得るために上限を越える必要がある。投与は１回〜数回に分けて行うことができ、１日あたり１〜５回投与することができる。 In addition, the therapeutic agents of the present invention generally comprise 0.1 to 90% therapeutic drug by weight of the total composition. For parenteral administration, the dose is 0.0001 mg to 1000 mg, preferably 0.001 mg to 300 mg, more preferably 0.01 mg to 100 mg per kg body weight per day. However, depending on the disease state, weight, and individual patient response to treatment, the type of composition to which the therapeutic agent is administered, and the mode of administration, the stage of the disease process or the interval between doses, these rates are adjusted accordingly To do. Therefore, it is sometimes appropriate to use less than the minimum dose mentioned above, while in other cases the upper limit must be exceeded to obtain a therapeutic effect. Administration can be performed once to several times and can be administered 1 to 5 times per day.
対象となる個体は、例えばヒト、およびマウス、ラット、ウサギ、サルなどの非ヒト哺乳動物、およびその他の脊椎動物が挙げられる。非ヒト哺乳動物への適用は、ヒトＲＡに対する予防法または治療法を開発するためのモデルとする上でも有用である。これにより、例えばＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症を予防する新たな治療プロトコルを開発することができる。したがって、本発明には、本発明にかかる治療薬剤を、ＲＡ患者に睡眠障害を緩和する薬剤を投与することにより、Wee1キナーゼの発現を抑制することにより、ＲＡを予防または治療するＲＡおよびＲＡの睡眠障害の予防または治療の方法が含まれる。 The subject individuals include, for example, humans and non-human mammals such as mice, rats, rabbits, monkeys, and other vertebrates. Application to non-human mammals is also useful as a model for developing preventive or therapeutic methods for human RA. Thereby, for example, a new treatment protocol for preventing the onset of RA and RA sleep disorder can be developed. Therefore, in the present invention, the therapeutic agent according to the present invention is used to prevent or treat RA by suppressing the expression of Wee1 kinase by administering an agent that alleviates sleep disorders to RA patients. Methods of preventing or treating sleep disorders are included.
なお本発明は、以上例示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術範囲に含まれる。 The present invention is not limited to the configurations exemplified above, and various modifications are possible within the scope shown in the claims, and the technical means disclosed in different embodiments are appropriately combined. The obtained embodiment is also included in the technical scope of the present invention.
本発明について、実施例および図１〜３に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。 Although this invention is demonstrated more concretely based on an Example and FIGS. 1-3, this invention is not limited to this. Those skilled in the art can make various changes, modifications, and alterations without departing from the scope of the present invention.
〔実施例１：体内時計の破壊による関節炎の発症〕
７〜８週齢のマウス（野生型マウス、並びに、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊したマウス（以下、「Cry-/-マウス」ともいう））の腹腔内に関節炎惹起モノクローナル抗体カクテル（Chondrex社、商品コードNo.62200）を５ｍｇ投与し、四肢関節の腫脹を１〜４点のスコア化することにより関節炎の発症を評価した。観察は、関節炎カクテル投与後、４〜５週間後まで行った。
[Example 1: Development of arthritis due to destruction of biological clock]
Arthritis-initiating monoclonal antibody cocktail (Chondrex, Inc. 5 mg of product code No. 62200) was administered, and the onset of arthritis was evaluated by scoring swelling of the limb joints by 1 to 4 points. Observation was performed until 4 to 5 weeks after administration of the arthritis cocktail.
野生型マウス、およびCry-/-マウスにおいて、関節炎の発症を比較したところ、Cry-/-マウスにやや強い関節炎誘導の傾向が見られた。すなわち、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊したマウスでは、関節炎を発症することが分かった。 When the onset of arthritis was compared in wild-type mice and Cry-/-mice, Cry-/-mice showed a slightly strong tendency to induce arthritis. That is, it was found that mice with Cry1 gene and Cry2 gene disrupted developed arthritis.
〔実施例２：関節炎におけるc-Fosタンパク質およびWee1キナーゼタンパク質の発現の上昇〕
関節炎発症後のマウスを屠殺し、肝臓より抽出したタンパク質におけるc-Fosタンパク質およびWee1キナーゼの発現量を、各タンパク質に対して特異的な抗体を用いて、ウェスタンブロット法により評価した。その結果、Cry-/-マウスにおいては、c-Fosタンパク質およびWee1キナーゼの発現が有意に強く誘導された。すなわち、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊したマウスでは、ＲＡに見られるのと同様の現象が起こることが分かった。
[Example 2: Increased expression of c-Fos protein and Wee1 kinase protein in arthritis]
Mice after the onset of arthritis were sacrificed, and the expression levels of c-Fos protein and Weel kinase in proteins extracted from the liver were evaluated by Western blotting using antibodies specific for each protein. As a result, the expression of c-Fos protein and Weel kinase was significantly strongly induced in Cry − / − mice. That is, it was found that the same phenomenon as that seen in RA occurs in mice in which the Cry1 gene and Cry2 gene are disrupted.
〔実施例３：体内時計の破壊による炎症性サイトカインの上昇〕
関節炎発症後のマウスを屠殺し、単離した脾細胞を抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８抗体（５μｇ／ｍｌ）を用いて２４時間刺激培養した。その後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法により培養上清中のＴＮＦ−αを測定した。
[Example 3: Increase in inflammatory cytokines due to destruction of biological clock]
Mice after the onset of arthritis were sacrificed, and isolated splenocytes were cultured for 24 hours with anti-CD3 antibody (2 μg / ml) and anti-CD28 antibody (5 μg / ml). Thereafter, the culture supernatant was collected, and TNF-α in the culture supernatant was measured by ELISA.
その結果、免疫の有無に関わらず、Cry-/-マウスの血清ＴＮＦ−α値が有意に高かった。ＲＡでは、ＴＮＦ−αが上昇することから、本実施例の結果からも、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊したマウスでは、ＲＡに見られるのと同様の現象が起こることが分かった。 As a result, the serum TNF-α value of Cry − / − mice was significantly high regardless of the presence or absence of immunity. Since RA increases TNF-α, the results of this Example also showed that the same phenomenon as observed in RA occurs in mice in which the Cry1 and Cry2 genes were disrupted.
なお、本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。 The present invention is not limited to the configurations described above, and various modifications are possible within the scope of the claims, and technical means disclosed in different embodiments and examples, respectively. Embodiments and examples obtained by appropriately combining the above are also included in the technical scope of the present invention. Moreover, all the academic literatures and patent literatures described in this specification are incorporated herein by reference.
以上のように、本発明では、体内時計遺伝子の発現量を指標として、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性を判定することができる。それゆえ、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法や判定キットに代表される診断医療の分野だけでなく、保健医学分野に広く利用することができる。さらに、本発明では、上記体内時計遺伝子を用いてＲＡ発症モデル動物を製造することができる。このようなＲＡ発症モデル動物は、ＲＡの治療薬剤や治療方法の開発に用いることができる。それゆえ、本発明は、製薬分野をはじめ、生命科学分野の産業に広く利用することができる。 As described above, in the present invention, the onset or possibility of onset of RA and RA sleep disorders can be determined using the expression level of the circadian clock gene as an index. Therefore, it can be widely used not only in the field of diagnostic medicine represented by RA and the method for determining the onset or possibility of onset of sleep disorders of RA, but also in the field of health medicine. Furthermore, in the present invention, an RA-onset model animal can be produced using the above body clock gene. Such RA-onset model animals can be used for the development of therapeutic agents and methods for RA. Therefore, the present invention can be widely used in industries in the life science field including the pharmaceutical field.
Claims (13)
体内時計遺伝子の発現量を測定するために用いるプライマー、プローブ、および抗体のうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定キット。 A kit used for carrying out the method for determining the onset or possibility of onset of rheumatoid arthritis and rheumatoid arthritis sleep disorder according to any one of claims 1 to 3,
Rheumatoid arthritis and rheumatoid arthritis sleep disorder determination kit characterized by containing at least one of a primer, a probe, and an antibody used for measuring the expression level of a circadian clock gene.
当該被験化合物を投与された関節リウマチ発症モデル動物における関節リウマチのマーカーを測定する工程とを含むことを特徴とする関節リウマチの治療薬剤のスクリーニング方法。 Administering a test compound to the rheumatoid arthritis onset model animal according to claim 6 or 7,
A method for screening a therapeutic agent for rheumatoid arthritis, comprising the step of measuring a marker for rheumatoid arthritis in a rheumatoid arthritis model animal administered with the test compound.
The therapeutic agent for rheumatoid arthritis according to claim 12, which suppresses the expression level of Wee1 kinase.
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