JP2009249507A - Rare earth element-doped fluorescent substance nanoparticles, and biological substance labeling agent using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、水分散可能な希土類元素ドープ蛍光体ナノ粒子、およびそれを用いた生体物質標識剤に関する。 The present invention relates to a water-dispersible rare earth element-doped phosphor nanoparticle and a biological material labeling agent using the same.
生体物質を標識する手段として、分子標識物質を蛍光性物質に結合した生体物質標識剤を用いる方法が検討されている。従来使用されてきた有機蛍光色素などの蛍光性物質は、励起光照射時の劣化が激しく寿命が短いことが欠点であり、また発光効率が低く、感度も十分ではなかった。 As a means for labeling a biological substance, a method using a biological substance labeling agent in which a molecular labeling substance is bound to a fluorescent substance has been studied. Conventionally used fluorescent substances such as organic fluorescent dyes have the disadvantages that they are severely deteriorated when irradiated with excitation light and have a short lifetime, and the luminous efficiency is low and the sensitivity is not sufficient.
そのため、近年、上記蛍光性物質として半導体ナノ粒子を用いる方法が注目されている。例えば、極性官能基を有する高分子を半導体ナノ粒子の表面に物理的および／または化学的に吸接合した生体物質標識剤が検討されている（例えば特許文献１参照）。 Therefore, in recent years, a method using semiconductor nanoparticles as the fluorescent substance has attracted attention. For example, a biological substance labeling agent in which a polymer having a polar functional group is physically and / or chemically adsorbed and bonded to the surface of a semiconductor nanoparticle has been studied (see, for example, Patent Document 1).
しかしながら、これら従来の半導体ナノ粒子を用いた生体物質標識剤には発光精度等において未解決の問題が存在した。 However, there have been unsolved problems with respect to light emission accuracy and the like in the biomaterial labeling agents using these conventional semiconductor nanoparticles.
例えば、上記のＣｄＳｅ／ＺｎＳ型半導体ナノ粒子は一般的に量子ドットと呼ばれボーア励起子のサイズよりも小さな粒径を持つ場合に、バンドギャップがサイズに依存して変化するという性質、すなわち、同一組成で粒子サイズを変化させることで発光波長が変化するという特徴を持っている。このような量子ドット蛍光材料はサイズにより発光波長を自在に変化させることが可能であるという長所を持つ一方、粒径制御の精度が発光波長の精度につながるという短所があった。 For example, when the above-mentioned CdSe / ZnS type semiconductor nanoparticles are generally called quantum dots and have a particle size smaller than the size of Bohr excitons, the property that the band gap changes depending on the size, that is, The emission wavelength is changed by changing the particle size with the same composition. While such a quantum dot fluorescent material has the advantage that the emission wavelength can be freely changed depending on the size, it has the disadvantage that the accuracy of particle size control leads to the accuracy of the emission wavelength.
これに対し、希土類元素を発光中心とする無機蛍光体ナノ粒子は、その発光波長が、粒径制御に依存しないことから、発光精度の問題を解決できる生体標識材料となることが開示されている（例えば特許文献２参照）。 On the other hand, it is disclosed that inorganic phosphor nanoparticles having a luminescence center of a rare earth element can be a biomarker material that can solve the problem of emission accuracy because the emission wavelength does not depend on particle size control. (For example, refer to Patent Document 2).
しかしながら、希土類をドープした、リン酸ランタン体ナノ粒子に配位子交換により修飾した６ーアミノヘキシルカルボン酸を介しアビジンを結合させることにより、水溶化させたものが開示されている（例えば非特許文献１参照）。しかしながら、水分散状態において発光輝度が減少したとの記載があり、希土類元素を発光中心とする無機蛍光体ナノ粒子の生体標識材料では、発光輝度は十分ではないことが予想できる。 However, a solution obtained by dissolving a rare earth-doped lanthanum phosphate nanoparticle by avidin via 6-aminohexylcarboxylic acid modified by ligand exchange is disclosed (for example, non-patent) Reference 1). However, there is a description that the emission luminance is reduced in a water-dispersed state, and it can be predicted that the emission luminance is not sufficient for the biomarker material of inorganic phosphor nanoparticles having the emission center of a rare earth element.
一方非特許文献２には、希土類元素としてテルビウムをドープしたリン酸セリウムナノ粒子をコアに、リン酸ランタンをシェルとしたコアシェル型ナノ粒子は、その発光量子収率が、シェルをもたないものに比べ増大することが記載されている（例えば非特許文献２参照）。 On the other hand, Non-Patent Document 2 discloses that a core-shell type nanoparticle having cerium phosphate nanoparticles doped with terbium as a rare earth element as a core and lanthanum phosphate as a shell has an emission quantum yield that does not have a shell. It is described that it increases compared to the other (for example, see Non-Patent Document 2).
しかしながら、記載されているのは有機溶媒に分散させたものであり、生体標識材料として水分散中の利用を考えた場合、公知である希土類をドープした、リン酸ランタン体ナノ粒子に配位子交換により修飾した６ーアミノヘキシルカルボン酸を介しアビジンを結合させることにより、水溶化させた方法による親水性化では、同様に発光輝度が減少することが予想でき、十分ではないと考える。 However, what is described is a material dispersed in an organic solvent. When considering use in water dispersion as a biomarker material, a known rare earth-doped lanthanum phosphate nanoparticle is a ligand. By making avidin bound via 6-aminohexylcarboxylic acid modified by exchange, it is expected that the luminescence brightness will be reduced in the same way by making it hydrophilic by the water-solubilized method.
またカルボン酸を含む分子による表面修飾に基づく水溶化では、我々の検討の結果、生体中などを想定し、ｐＨを変動させた条件では、発光輝度が低下し、生体標識剤として用いるには不適であった。
本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、水分散状態で発光精度が高く、かつ発光強度が十分高い蛍光体ナノ粒子を提供することである。またそれを用いた生体物質標識剤を提供することである。 The present invention has been made in view of the above-described problems and situations, and a problem to be solved is to provide phosphor nanoparticles having high emission accuracy and sufficiently high emission intensity in an aqueous dispersion state. Moreover, it is providing the biological material labeling agent using the same.
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、平均粒径が２〜５０ｎｍである蛍光体ナノ粒子であって、その組成の少なくとも一部が前記一般式（１）Ｌｎ１ＰＯ４（式中、Ｌｎ１はＹ，ＬｕおよびＬａからなる群から選択される少なくとも１種以上の元素である）で表され、少なくとも１種の希土類元素がドープされている蛍光体ナノ粒子をコアとし、その表面を前記一般式（２）Ｌｎ２ＰＯ４（式中、Ｌｎ２はＹ，ＬｕおよびＬａからなる群から選択される少なくとも１種以上の元素である）からなる第一のシェル層、さらに第一のシェル層が第二の親水性シリカシェル層で覆われたことを特徴とする蛍光体ナノ粒子を見出し、さらには生体物質標識剤として好適に用いられることを見出した。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the inventors of the present invention are phosphor nanoparticles having an average particle diameter of 2 to 50 nm, and at least a part of the composition thereof is represented by the general formula (1) Ln1PO 4 ( In the formula, Ln1 is at least one element selected from the group consisting of Y, Lu, and La), and phosphor nanoparticles doped with at least one rare earth element are used as cores, A first shell layer comprising the general formula (2) Ln2PO 4 (wherein Ln2 is at least one element selected from the group consisting of Y, Lu and La), and a first shell The inventors have found phosphor nanoparticles characterized in that the layer is covered with a second hydrophilic silica shell layer, and further found that the layer can be suitably used as a biological material labeling agent.
上記蛍光体ナノ粒子において、第一のシェル層の存在は、表面にありドープされた希土類元素間の粒子間おけるエネルギー移動による消光を防ぐ効果があり、結果として量子収率の向上につながる。さらに第二のシェル層として、親水性のシリカシェルを形成させることは、公知のカルボン酸を含む分子の修飾により親水性基を結合させたものとは異なり、コアの希土類ドープナノ粒子と第一のシェルを強固に被覆することになったことが推測できる。したがって、水分散性が安定することになる。その結果、本発明のナノ粒子は、水分散状態でも発光強度が強くなると考えられる。 In the phosphor nanoparticles, the presence of the first shell layer has an effect of preventing quenching due to energy transfer between particles on the surface between doped rare earth elements, resulting in an improvement in quantum yield. Further, forming a hydrophilic silica shell as the second shell layer is different from the case where a hydrophilic group is bonded by modifying a molecule containing a known carboxylic acid, and the rare earth-doped nanoparticles of the core and the first shell layer It can be inferred that the shell was firmly covered. Accordingly, water dispersibility is stabilized. As a result, it is considered that the nanoparticles of the present invention have high emission intensity even in an aqueous dispersion state.
またナノ粒子の水分散性が安定したため、生体中を想定してｐＨ変動させた条件でも発光強度が維持でき、生体標識剤として好適となると推測できる。 Further, since the water dispersibility of the nanoparticles is stable, it can be presumed that the luminescence intensity can be maintained even under conditions where the pH is fluctuated assuming the inside of a living body and is suitable as a biomarker.
すなわち、本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
１．平均粒径が２〜５０ｎｍである蛍光体ナノ粒子であって、その組成の少なくとも一部が前記一般式（１）Ｌｎ１ＰＯ４（式中、Ｌｎ１はＹ，ＬｕおよびＬａからなる群から選択される少なくとも１種以上の元素である）で表され、少なくとも１種の希土類元素がドープされている蛍光体ナノ粒子をコアとし、その表面を前記一般式（２）Ｌｎ２ＰＯ４（式中、Ｌｎ２はＹ，ＬｕおよびＬａからなる群から選択される少なくとも１種以上の元素である）からなる第一のシェル層、さらに第一のシェル層が第二の親水性シリカシェル層で覆われたことを特徴とする蛍光体ナノ粒子。
２．１に蛍光体ナノ粒子と分子標識物質とを有機分子を介して結合させたことを特徴とする生体物質標識剤。
３．前記分子標識物質がヌクレオチド鎖であることを特徴とする前記２に記載の生体物質標識剤。
４．前記蛍光体ナノ粒子と分子標識物質とを結合させる有機分子が、ビオチン及びアビジンであることを特徴とする前記２又は３に記載の生体物質標識剤。
That is, the said subject which concerns on this invention is solved by the following means.
1. Phosphor nanoparticles having an average particle diameter of 2 to 50 nm, at least a part of the composition of which is selected from the group consisting of the general formula (1) Ln1PO 4 (wherein Ln1 is Y, Lu and La) And at least one rare-earth element-doped phosphor nanoparticle as a core, and the surface thereof is represented by the general formula (2) Ln2PO 4 (wherein Ln2 is Y , Lu and La, which are at least one element selected from the group consisting of, and the first shell layer is covered with a second hydrophilic silica shell layer Phosphor nanoparticles.
2. A biological material labeling agent characterized in that the phosphor nanoparticle and the molecular labeling material are bonded to each other via an organic molecule in 2.1.
3. 3. The biological substance labeling agent according to 2 above, wherein the molecular labeling substance is a nucleotide chain.
4). 4. The biological material labeling agent according to 2 or 3 above, wherein the organic molecules that bind the phosphor nanoparticles and the molecular labeling material are biotin and avidin.
本発明の上記手段により、粒径が極微小で、かつ水に分散するものでありながら発光強度が高く、加えてｐＨに対する発光安定性をそなえた蛍光体ナノ粒子を提供することができる。またそれを用いた生体物質標識剤を提供することができる。 By the above means of the present invention, it is possible to provide phosphor nanoparticles having a very small particle size and high light emission intensity while being dispersed in water, and additionally having light emission stability with respect to pH. Moreover, the biological material labeling agent using the same can be provided.
本発明の蛍光体ナノ粒子は、平均粒径が２〜５０ｎｍである蛍光体ナノ粒子であって、その組成の少なくとも一部が前記一般式（１）Ｌｎ１ＰＯ４（式中、Ｌｎ１はＹ，ＬｕおよびＬａからなる群から選択される少なくとも１種以上の元素である）で表され、少なくとも１種の希土類元素がドープされている蛍光体ナノ粒子をコアとし、その表面を前記一般式（２）Ｌｎ２ＰＯ４（式中、Ｌｎ２はＹ，ＬｕおよびＬａからなる群から選択される少なくとも１種以上の元素である）からなる第一のシェル層、さらに第一のシェル層が第二の親水性シェル層で覆われたことを特徴とする蛍光体ナノ粒子である。 The phosphor nanoparticles of the present invention are phosphor nanoparticles having an average particle diameter of 2 to 50 nm, and at least a part of the composition thereof is represented by the general formula (1) Ln1PO 4 (wherein Ln1 is Y, Lu And at least one element selected from the group consisting of La and a phosphor nanoparticle doped with at least one rare earth element as a core, the surface of which is the general formula (2) Ln2PO 4 (wherein, Ln2 is Y, Lu and at least one element selected from the group consisting of La) first shell layer made of, further the first shell layer second hydrophilic shell The phosphor nanoparticles are covered with a layer.
前記ドープされる希土類元素が、セリウム、プラセオジム、ネオジム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ディスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウムのいずれか一つ、または複数の組み合わせであることが好ましい。 The rare earth element to be doped is preferably cerium, praseodymium, neodymium, samarium, europium, gadolinium, terbium, dysprosium, holmium, erbium, thulium, ytterbium, or a combination thereof.
また、本発明の蛍光体ナノ粒子は、分子標識物質と有機分子を介して結合させることにより生体物質標識剤とすることができる。なお、生体物質標識剤において、前記分子標識物質がヌクレオチド鎖であることが好ましい。また、前記有機分子が、ビオチン及びアビジンであることが好ましい。 In addition, the phosphor nanoparticles of the present invention can be used as a biological substance labeling agent by binding with a molecular labeling substance via an organic molecule. In the biological substance labeling agent, the molecular labeling substance is preferably a nucleotide chain. The organic molecules are preferably biotin and avidin.
以下、本発明とその構成要素について詳細な説明をする。
（コア部）
本発明の蛍光体ナノ粒子コア部は、その組成の少なくとも一部が前記一般式（１）Ｌｎ１ＰＯ４（式中、Ｌｎ１はＹ，ＬｕおよびＬａからなる群から選択される少なくとも１種以上の元素である）で表され、少なくとも１種の希土類元素がドープされていることを特徴とする。
Hereinafter, the present invention and its components will be described in detail.
(Core part)
The phosphor nanoparticle core part of the present invention has at least a part of the composition represented by the general formula (1) Ln1PO 4 (wherein Ln1 is at least one element selected from the group consisting of Y, Lu and La) It is characterized by being doped with at least one rare earth element.
また、好ましい態様としては、共賦活剤として、プラセオジム及びテルビウムのうちの少なくともいずれかの元素を含有させる。 Moreover, as a preferable aspect, at least any one element of praseodymium and terbium is contained as a co-activator.
なお、最終的に形成する蛍光体ナノ粒子が５０ｎｍ以下の粒子である場合、構成元素中の金属元素の数が４種類以上となったときや、１０ａｔｏｍ％以下の共賦活剤を含有すると、従来の固相法で製造された粒子に比べて、また、金属元素が３種類のときや、共賦活剤を含有しないときにと比べて、格段に発光強度が高くなる。 In addition, when the phosphor nanoparticles finally formed are particles of 50 nm or less, when the number of metal elements in the constituent elements is 4 or more, or when containing a coactivator of 10 atom% or less, Compared with particles produced by the solid phase method, and when there are three types of metal elements or when no co-activator is contained, the emission intensity is remarkably increased.
本発明の蛍光体ナノ粒子コア部を製造するための製造方法としては、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｖｏｌ．１５，４６０４−４６１６（２００３）に記載の方法を適用することができる。 As a manufacturing method for manufacturing the phosphor nanoparticle core of the present invention, Chemistry of Materials Vol. 15, 4604-4616 (2003) can be applied.
本発明の蛍光体ナノ粒子コア部を製造するための原料としては、希土類元素の各種ハロゲン化物や硝酸塩等を用いることができる。例えば、塩化セリウム、塩化ネオジム、硝酸ネオジム、塩化イッテルビウム、硝酸イッテルビウム、塩化ランタン、硝酸ランタン、塩化イットリウム、硝酸イットリウム、塩化プラジオセム、塩化テルビウム、塩化ユウロピウムなどを用いることができる。 As raw materials for producing the phosphor nanoparticle core of the present invention, various rare earth halides, nitrates, and the like can be used. For example, cerium chloride, neodymium chloride, neodymium nitrate, ytterbium chloride, ytterbium nitrate, lanthanum chloride, lanthanum nitrate, yttrium chloride, yttrium nitrate, pradocem chloride, terbium chloride, europium chloride, and the like can be used.
リン酸源としては、オルトリン酸、リン酸二水素アンモニウム等を用いることができる。
（第一のシェル層）
本発明の蛍光体ナノ粒子は、上記希土類元素がドープされている蛍光体ナノ粒子をコア部とし、その表面を前記一般式（２）Ｌｎ２ＰＯ４（式中、Ｌｎ２はＹ，ＬｕおよびＬａからなる群から選択される少なくとも１種以上の元素である）からなる第一のシェル層で覆われていることを特徴とする。
As the phosphoric acid source, orthophosphoric acid, ammonium dihydrogen phosphate and the like can be used.
(First shell layer)
The phosphor nanoparticles of the present invention have phosphor cores doped with the rare earth element as a core part, and the surface thereof is the above general formula (2) Ln2PO 4 (wherein Ln2 is composed of Y, Lu and La). It is characterized by being covered with a first shell layer comprising at least one element selected from the group.
本発明の蛍光体ナノ粒子の第一のシェル部を製造するための製造方法としては、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｖｏｌ．４２，５５１３−５５１６（２００３）に記載の方法を適用することができる。 As a manufacturing method for manufacturing the first shell part of the phosphor nanoparticle of the present invention, Angewante Chemie International Edition Vol. 42, 5513-5516 (2003) can be applied.
本発明の蛍光体ナノ粒子第一のシェル部を製造するための原料としては、例えば塩化ランタン、硝酸ランタン、塩化イットリウム、硝酸イットリウム、塩化ルテチウムなどを用いることができる。リン酸源としては、オルトリン酸、リン酸二水素アンモニウム等を用いることができる。
（第二のシェル層）
本発明の蛍光体ナノ粒子は、上記希土類元素がドープされている蛍光体ナノ粒子をコア部、さらに上記一般式（２）であらわされる組成からなる第一のシェル層の表面を、第二の親水性シリカシェル層で覆われたことを特徴とする。
As a raw material for producing the phosphor nanoparticle first shell part of the present invention, for example, lanthanum chloride, lanthanum nitrate, yttrium chloride, yttrium nitrate, lutetium chloride, and the like can be used. As the phosphoric acid source, orthophosphoric acid, ammonium dihydrogen phosphate and the like can be used.
(Second shell layer)
The phosphor nanoparticle of the present invention comprises a phosphor nanoparticle doped with the rare earth element as a core, and a surface of a first shell layer having a composition represented by the general formula (2), It is characterized by being covered with a hydrophilic silica shell layer.
本発明の蛍光体ナノ粒子の第二の親水性シリカシェル部を製造するための製造方法としては、テトラエトキシシランのゾルゲル反応、塩基性条件下でのナトリウム水ガラスによる加水分解反応などがあげられる。 Examples of the production method for producing the second hydrophilic silica shell part of the phosphor nanoparticles of the present invention include a sol-gel reaction of tetraethoxysilane and a hydrolysis reaction with sodium water glass under basic conditions. .
本発明の蛍光体ナノ粒子の平均粒径が２〜５０ｎｍであることを特徴とする。 The average particle diameter of the phosphor nanoparticles of the present invention is 2 to 50 nm.
本発明において、上記蛍光体ナノ粒子の平均粒径は本来３次元で求める必要があるが、微粒子過ぎるため難しく、現実には二次元画像で評価せざるを得ないため、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真の撮影シーンを変えて数多く撮影し平均化することで求めることが好ましい。従って、本発明において、当該平均粒径は、ＴＥＭを用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めて、その算術平均を平均粒径とした。ＴＥＭで撮影する粒子数としては２０個以上が好ましく、１００個の粒子を撮影するのが更に好ましい。
（生体物質標識剤）
本発明に係る生体物質標識剤は、上述した末端に官能基を有するポリエチレングリコールにより表面処理された蛍光体ナノ粒子と、分子標識物質とを有機分子を介して結合させて得られる。
（分子標識物質）
本発明に係る生体物質標識剤は分子標識物質が目的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応することにより、生体物質の標識が可能となる。
In the present invention, the average particle diameter of the phosphor nanoparticles must originally be determined in three dimensions, but it is difficult because it is too fine, and in reality it must be evaluated with a two-dimensional image. ) Is preferably obtained by averaging a large number of images taken by changing the shooting scene of the electron micrograph. Therefore, in the present invention, the average particle diameter is a diameter obtained by taking an electron micrograph using a TEM, measuring a cross-sectional area of a sufficient number of particles, and setting the measured value as an area of a corresponding circle. Obtained as the diameter, the arithmetic average was taken as the average particle diameter. The number of particles photographed with a TEM is preferably 20 or more, and more preferably 100 particles.
(Biological substance labeling agent)
The biological material labeling agent according to the present invention is obtained by binding phosphor nanoparticles, which have been surface-treated with the above-described polyethylene glycol having a functional group at a terminal, and a molecular labeling substance via an organic molecule.
(Molecular labeling substance)
The biological substance labeling agent according to the present invention can label a biological substance by specifically binding and / or reacting with the target biological substance.
当該分子標識物質としては例えば、ヌクレオチド鎖、抗体、抗原およびシクロデキストリン等が挙げられる。
（有機分子）
本発明に係る生体物質標識剤は、親水化処理された蛍光体ナノ粒子と、分子標識物質とが有機分子により結合されている。該有機分子としては蛍光体ナノ粒子と分子標識物質とを結合できる有機分子であれば特に制限はないが、例えば、タンパク質中でも、アルブミン、ミオグロビンおよびカゼイン等、またタンパク質の一種であるアビジンをビオチンと共に用いることも好適に用いられる。上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着および化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
Examples of the molecular labeling substance include nucleotide chains, antibodies, antigens and cyclodextrins.
(Organic molecule)
In the biological material labeling agent according to the present invention, the phosphor nanoparticles subjected to the hydrophilization treatment and the molecular labeling substance are bound by organic molecules. The organic molecule is not particularly limited as long as it is an organic molecule capable of binding phosphor nanoparticles and a molecular labeling substance. For example, among proteins, albumin, myoglobin, casein, etc., and avidin, which is a kind of protein, are combined with biotin. It is also preferably used. The form of the bond is not particularly limited, and examples thereof include a covalent bond, an ionic bond, a hydrogen bond, a coordination bond, physical adsorption, and chemical adsorption. A bond having a strong bonding force such as a covalent bond is preferable from the viewpoint of bond stability.
具体的には、蛍光体ナノ粒子をメルカプトウンデカン酸で親水化処理した場合は、有機分子としてアビジンおよびビオチンを用いることができる。この場合親水化処理された当該ナノ粒子のカルボキシル基はアビジンと好適に共有結合し、アビジンがさらにビオチンと選択的に結合し、ビオチンがさらに生体物質標識剤と結合することにより生体物質標識剤となる。 Specifically, when the phosphor nanoparticles are hydrophilized with mercaptoundecanoic acid, avidin and biotin can be used as organic molecules. In this case, the carboxyl group of the nanoparticle subjected to hydrophilic treatment is preferably covalently bonded to avidin, and avidin is further selectively bonded to biotin, and biotin is further bonded to the biological material labeling agent to Become.
アミノ基が表面に露出した蛍光体ナノ粒子はＥＭＣＳ（Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）サクシンイミド）等の二価架橋剤を利用したり、あるいはＮＨＳエステル（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジルエステル）等で活性化されたカルボキシル基とアミド結合を形成することによって、アビジン若しくはストレプトアビジン、アビジン若しくはストレプトアビジンの融合タンパク質、ビオチン、抗体、抗原と連結することが出来る。これら蛍光体ナノ粒子の結合したアビジン若しくはストレプトアビジン、アビジン若しくはストレプトアビジンの融合タンパク質、ビオチン、抗体、抗原はサンドイッチ法の検出抗体や検出用酵素として利用できる。 The phosphor nanoparticles with amino groups exposed on the surface can be obtained by using a bivalent cross-linking agent such as EMCS (N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide) or NHS ester (N-hydroxysuccinimidyl ester). By forming an amide bond with the activated carboxyl group, it can be linked to avidin or streptavidin, avidin or streptavidin fusion protein, biotin, antibody or antigen. Avidin or streptavidin to which these phosphor nanoparticles are bound, avidin or streptavidin fusion protein, biotin, antibody, and antigen can be used as detection antibodies and detection enzymes in the sandwich method.
また、蛍光体ナノ粒子を機能性ビーズに取り込ませた場合には、フローサイトメトリーによって生体分子の検出や濃度の測定等に利用できる。この際の機能性ビーズとはポリスチレンビーズ、ポリプロピレンビーズ、架橋アクリルビーズ、ポリ乳酸ビーズ等のポリマービーズや、磁気ビーズ、ガラスビーズ、金属ビーズ等の大きさ０．１μｍ〜１００μｍのビーズの表面に生体由来の物質に特異的に吸着もしくは結合するような化学修飾を施こしたものを言う。 In addition, when fluorescent nanoparticles are incorporated into functional beads, they can be used for detection of biomolecules, concentration measurement, and the like by flow cytometry. In this case, the functional beads are formed on the surface of polymer beads such as polystyrene beads, polypropylene beads, cross-linked acrylic beads, polylactic acid beads, magnetic beads, glass beads, metal beads, etc. with a size of 0.1 μm to 100 μm. This refers to chemical modification that specifically adsorbs or binds to the derived substance.
そのような機能性ビーズに蛍光体ナノ粒子を分散させる方法としては、特に限定されないが、例えばポリマービーズを使用した機能性ビーズでは、溶媒中に予め蛍光体ナノ粒子を分散させておき、その溶媒中でビーズを膨潤させることによって蛍光体ナノ粒子を機能性ビーズ内に取り込ませることができる。 The method for dispersing the phosphor nanoparticles in such functional beads is not particularly limited. For example, in the case of functional beads using polymer beads, phosphor nanoparticles are dispersed in a solvent in advance, and the solvent is used. The phosphor nanoparticles can be incorporated into the functional beads by swelling the beads therein.
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、以下においては、蛍光体ナノ粒子を単に「蛍光体」と称する。希土類がドープされた無機材料の表記法として、たとえばセリウムおよびテルビウムがドープされたリン酸ランタンはＬａＰＯ４：Ｃｅ，Ｔｂと表記する。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to this. In the following, the phosphor nanoparticles are simply referred to as “phosphors”. For example, lanthanum phosphate doped with cerium and terbium is expressed as LaPO 4 : Ce, Tb.
コア部ＬａＰＯ４：Ｃｅ，Ｔｂ、第一のシェル層をＬａＰＯ４とした場合の表記法として、ＬａＰＯ４：Ｃｅ，Ｔｂ／ＬａＰＯ４と表記する。
〈実施例１〉ＳｉＯ２シェル層で被覆されたＬａＰＯ４：Ｃｅ，Ｔｂ／ＬａＰＯ４（蛍光体１）の製造方法
塩化ランタン、塩化セリウム、塩化テルビウムを用い、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｖｏｌ．４０，５７３−５７６（２００１）記載の方法により、ＬａＰＯ４：Ｃｅ，Ｔｂナノ粒子を合成した。
As a notation when the core portion LaPO 4 : Ce, Tb and the first shell layer is LaPO 4 , it is expressed as LaPO 4 : Ce, Tb / LaPO 4 .
<Example 1> SiO 2 LaPO coated with a shell layer 4: Ce, Tb / LaPO 4 ( Phosphor 1) production method of lanthanum chloride, cerium chloride, using terbium chloride, Angewandte Chemie International Edition Vol. 40, 573-576 (2001), LaPO 4 : Ce, Tb nanoparticles were synthesized.
上記ＬａＰＯ４：Ｃｅ，Ｔｂナノ粒子に対し、塩化ランタン、オルトリン酸を用いて、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｖｏｌ．４２，５５１３−５５１６（２００３）記載の方法により、ＬａＰＯ４：Ｃｅ，Ｔｂ／ＬａＰＯ４を合成した。 Using the lanthanum chloride and orthophosphoric acid to the LaPO 4 : Ce, Tb nanoparticles, Angelwande Chemie International Edition Vol. The 42,5513-5516 (2003) method described, LaPO 4: Ce, was synthesized Tb / LaPO 4.
磁気撹拌子を備えたフラスコ中に１００ｍｌの水をいれ、磁気撹拌機により撹拌しながら、合成したＬａＰＯ４：Ｃｅ，Ｔｂ／ＬａＰＯ４ナノ粒子１ｇをいれ、水酸化テトラメチルアンモニウム水溶液でｐＨ１２に調製した。ついで、該分散液にナトリウム水ガラス（ＳｉＯ２ ２７％、Ｎａ２Ｏ ８．１％）５００ｍｇをかくはんしながら加えた。１時間反応させた後、エタノール５０ｍｌを滴下した。生じた沈殿物を、遠心分離により除去した。得られた沈殿物を、脱イオン水中に再分散させる。ついで、分散しなかった固体をデカンテーションにより除いた。分散液をロータリーエバポレーターにより乾固させ、蛍光体１を得た。
（比較例１）ＳｉＯ２シェル層で被覆されたＬａＰＯ４：Ｃｅ，Ｔｂ（蛍光体２）の製造方法。
Into a flask equipped with a magnetic stir bar, 100 ml of water was put, and while stirring with a magnetic stirrer, 1 g of synthesized LaPO 4 : Ce, Tb / LaPO 4 nanoparticles was added and adjusted to pH 12 with an aqueous tetramethylammonium hydroxide solution. did. Subsequently, 500 mg of sodium water glass (SiO 2 27%, Na 2 O 8.1%) was added to the dispersion while stirring. After reacting for 1 hour, 50 ml of ethanol was added dropwise. The resulting precipitate was removed by centrifugation. The resulting precipitate is redispersed in deionized water. The solid that did not disperse was then removed by decantation. The dispersion was dried using a rotary evaporator to obtain phosphor 1.
(Comparative Example 1) LaPO 4 was coated with SiO 2 shell layer: Ce, manufacturing method of Tb (Phosphor 2).
ＬａＰＯ４による第一のシェルを形成しなかった他は、実施例１と同様の操作を行い、蛍光体２を得た。
〈比較例２〉アミノヘキシルカルボン酸で被覆されたＬａＰＯ４：Ｃｅ，Ｔｂ／ＬａＰＯ４（蛍光体３）の製造方法
実施例１と同様にしてＬａＰＯ４：Ｃｅ，Ｔｂ／ＬａＰＯ４を合成した。得られたＬａＰＯ４：Ｃｅ，Ｔｂ／ＬａＰＯ４に対して、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｖｏｌ．４３，５９５４−５９５７（２００４）に記載の方法を参考に、６−アミノヘキシルカルボン酸による表面修飾を行い、蛍光体３を得た。
A phosphor 2 was obtained in the same manner as in Example 1 except that the first shell of LaPO 4 was not formed.
Comparative Example 2 Production Method of LaPO 4 : Ce, Tb / LaPO 4 (Phosphor 3) Coated with Aminohexyl Carboxylic Acid LaPO 4 : Ce, Tb / LaPO 4 was synthesized in the same manner as in Example 1. For the obtained LaPO 4 : Ce, Tb / LaPO 4 , Angelwande Chemie International Edition Vol. 43, 5954-5957 (2004), with reference to the surface modification with 6-aminohexylcarboxylic acid, phosphor 3 was obtained.
上記のようにして形成した蛍光体１、２および３について粒子径は、ＴＥＭ観察を行い、粒子１００個について粒径を測定し、平均粒径を求めた。 With respect to the phosphors 1, 2 and 3 formed as described above, the particle diameter was measured by TEM, and the particle diameter was measured for 100 particles to obtain the average particle diameter.
また、水に分散させた状態で、励起光２７５ｎｍでの発光スペクトルを測定した。各蛍光体の発光ピーク波長と、蛍光体１の発光ピーク強度を１００としたときの、相対蛍光強度を表１に示す。 In addition, an emission spectrum at excitation light 275 nm was measured in a state dispersed in water. Table 1 shows the relative fluorescence intensity when the emission peak wavelength of each phosphor and the emission peak intensity of the phosphor 1 are defined as 100.
表１から、本発明の第一のシェルおよび親水性の第二のシリカシェル層をもつ蛍光体１は、親水性のシリカシェル層をもつが第一のシェルを持たない蛍光体２や、第一のシェルをもつが、親水性のカルボン酸分子により被覆された蛍光体３と比較して、発光強度が水分散状態でも十分高いことがわかる。 From Table 1, the phosphor 1 having the first shell and the hydrophilic second silica shell layer of the present invention includes the phosphor 2 having the hydrophilic silica shell layer but not having the first shell, It can be seen that the emission intensity is sufficiently high even in a water-dispersed state as compared with the phosphor 3 having one shell but coated with hydrophilic carboxylic acid molecules.
蛍光体１および３について、それぞれの水分散液についてｐＨを５、７、９に調製し、保存した。ｐＨ７に調製直後の蛍光体１分散液の発光強度を１００としたときの、３０日後の発光の相対強度を表２に示す。 For phosphors 1 and 3, the pH was adjusted to 5, 7, and 9 for each aqueous dispersion and stored. Table 2 shows the relative intensity of light emission after 30 days when the light emission intensity of the phosphor 1 dispersion immediately after preparation at pH 7 is taken as 100.
表２から本発明の第一のシェルおよび親水性の第二のシリカシェル層をもつ蛍光体１は、第一のシェルをもつが、親水性のカルボン酸分子により被覆された蛍光体３と比較して、ｐＨ変化に対して、長期保存したときの発光強度変化が小さく、化学的安定性が高いことがわかる。
〈実施例２〉
１０−５ｇの蛍光体１をメルカプトウンデカン酸０．２ｇが溶解した純水１０ｍｌ中に分散させて、４０℃、１０分間攪拌し、シェルの表面を処理することで表面をカルボキシル基で修飾した蛍光体４を得た。
From Table 2, the phosphor 1 having the first shell and the hydrophilic second silica shell layer of the present invention is compared with the phosphor 3 having the first shell but coated with hydrophilic carboxylic acid molecules. Thus, it can be seen that the change in light emission intensity when stored for a long period of time with respect to the change in pH is small and the chemical stability is high.
<Example 2>
10-5 g of phosphor 1 was dispersed in 10 ml of pure water in which 0.2 g of mercaptoundecanoic acid was dissolved, stirred at 40 ° C. for 10 minutes, and the surface of the shell was treated to modify the surface with a carboxyl group. Body 4 was obtained.
蛍光体４：１．０×１０−５ｍｏｌ／Ｌの水分散液にアビジン２５ｍｇを添加し４０℃で１０分間攪拌を行い、アビジンコンジュゲートナノ粒子を作製した。 Phosphor 4: 25 mg of avidin was added to an aqueous dispersion of 1.0 × 10 −5 mol / L and stirred at 40 ° C. for 10 minutes to prepare avidin-conjugated nanoparticles.
得られたアビジンコンジュゲートナノ粒子溶液にビオチン化された塩基配列が既知であるオリゴヌクレオチドを混合攪拌し、ナノ粒子で標識（ラベリング）されたオリゴヌクレオチドを作製した。 The resulting avidin-conjugated nanoparticle solution was mixed and stirred with a biotinylated oligonucleotide having a known base sequence to prepare an oligonucleotide labeled with a nanoparticle.
さまざまな塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを固定化したＤＮＡチップ上に上記の標識（ラベリング）したオリゴヌクレオチドを滴下・洗浄したところ、標識（ラベリング）されたオリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列をもつオリゴヌクレオチドのスポットのみが８１０ｎｍの励起光により発光した。 When the above labeled (labeled) oligonucleotide is dropped and washed on a DNA chip on which oligonucleotides having various base sequences are immobilized, the oligonucleotide has a complementary base sequence to the labeled (labeled) oligonucleotide. Only the spot of was emitted with excitation light of 810 nm.
このことより、ナノ粒子でのオリゴヌクレオチドの標識（ラベリング）を確認することができた。すなわち、この結果により、本発明の蛍光体ナノ粒子を用いた生体物質標識剤を提供することができることが分かる。 This confirmed the labeling (labeling) of the oligonucleotide with the nanoparticles. That is, it can be seen from this result that a biological substance labeling agent using the phosphor nanoparticles of the present invention can be provided.
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