JP5790352B2 - Fluorescent substance-containing nanoparticles and biological substance detection method using the same - Google Patents
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Description
本発明は、励起/発光特性の異なる複数の蛍光物質を内包した蛍光物質内包ナノ粒子、およびこれを用いた生体物質の検出方法に関する。 The present invention relates to a fluorescent substance-containing nanoparticle including a plurality of fluorescent substances having different excitation / emission characteristics, and a biological substance detection method using the same.
ナノメートルオーダーの粒子(以下、「ナノ粒子」)は、対応するバルク体とは異なる物性を示すことから近年注目を集めており、バイオアッセイや医療診断の分野を含む種々の分野において、種々の研究がなされている。 Nanometer-order particles (hereinafter referred to as “nanoparticles”) have attracted attention in recent years because they exhibit different physical properties from the corresponding bulk bodies. In various fields including bioassay and medical diagnosis, Research has been done.
例えば、特許文献1には、半導体超微粒子をガラスマトリックス中に分散させてなる蛍光体が開示されており、この蛍光体が良好な水分散性と高い発光性能を有することが記載されている。 For example, Patent Document 1 discloses a phosphor obtained by dispersing semiconductor ultrafine particles in a glass matrix, and describes that this phosphor has good water dispersibility and high light emission performance.
また、特許文献2には、蛍光色素化合物などの機能性化合物存在下で連通孔を有するシリカ粒子を調製してから、特定のテトラアルコキシシランを追加的に含有させてシリカのシェルを形成することにより当該機能性化合物をこのシェルにより閉じ込める工程を含む製造方法により、連通孔内に機能性化合物が内包されたコア−シェル構造のシリカナノ粒子を得ることが記載されている。 In Patent Document 2, silica particles having communication holes in the presence of a functional compound such as a fluorescent dye compound are prepared, and then a specific tetraalkoxysilane is additionally contained to form a silica shell. Thus, it is described that the core-shell structured silica nanoparticles in which the functional compound is encapsulated in the communication hole are obtained by the production method including the step of confining the functional compound with the shell.
しかし、半導体ナノ粒子と蛍光色素との両方を内包するシリカナノ粒子についての知見は、確認されていない。 However, the knowledge about the silica nanoparticle which includes both the semiconductor nanoparticle and the fluorescent dye has not been confirmed.
病理切片上の抗原の所在を確認するために、抗体修飾した蛍光標識を用いて蛍光標識化処理を行った組織を観察する場合、蛍光標識として一般的に用いられている蛍光色素を用いたときには、組織の自家蛍光によるバックグラウンドのノイズで蛍光標識のシグナルのSN比が低くなり、診断精度が悪くなるという課題があった。 In order to confirm the location of an antigen on a pathological section, when observing a tissue that has been subjected to fluorescent labeling using an antibody-modified fluorescent label, when using a fluorescent dye generally used as a fluorescent label The background noise caused by the autofluorescence of the tissue caused a problem that the signal-to-noise ratio of the signal of the fluorescent label was lowered and the diagnostic accuracy was deteriorated.
そのような自家蛍光による問題を解消する方法の一つとして、長残光蛍光体を蛍光標識として用いて時間分解測定を行うことにより、標識シグナルのみを観察する方法が挙げられる。ただ、単に長残光蛍光体を蛍光標識として用いただけでは、残光強度が低いために十分なS/N比を達成することが難しいという問題があった。通常可視励起発光においては、自家蛍光が紫外励起より軽減されるものの、輝度が不足し、十分なS/N比を得ることができなった。 One method for solving such a problem caused by autofluorescence is a method of observing only the label signal by performing time-resolved measurement using a long afterglow phosphor as a fluorescent label. However, simply using a long afterglow phosphor as a fluorescent label has a problem that it is difficult to achieve a sufficient S / N ratio because the afterglow intensity is low. Usually, in the case of visible excitation luminescence, although the autofluorescence is reduced compared to the ultraviolet excitation, the luminance is insufficient and a sufficient S / N ratio cannot be obtained.
そこで、本発明は、このような問題に対し、病理診断用蛍光標識剤として用いられたときに、高い精度で組織中の生体物質の検出を可能とするような蛍光物質内包ナノ粒子を提供することを目的とする。 Accordingly, the present invention provides a fluorescent substance-encapsulating nanoparticle that can detect a biological substance in a tissue with high accuracy when used as a fluorescent labeling agent for pathological diagnosis. For the purpose.
本発明者は、異なる励起/発光特性を有する複数の蛍光物質を内包する蛍光物質内包ナノ粒子を用いることにより、上記の課題を解決しうることを見出し、本発明に至った。
すなわち、本発明は、下記[1]〜[45]に示される。
The present inventor has found that the above-mentioned problems can be solved by using fluorescent substance-containing nanoparticles containing a plurality of fluorescent substances having different excitation / emission characteristics, and has reached the present invention.
That is, the present invention is shown in the following [1] to [ 45 ].
[1] 第1の蛍光物質と、該第1の蛍光物質と識別可能な励起/発光特性を有する第2の蛍光物質とを含み、
ポリスチレン樹脂またはメラミン樹脂である有機重合体樹脂によって、前記第1の蛍光物質および前記第2の蛍光物質が内包され、且つ、
表面に生体分子認識物質および水系分散用修飾化合物が結合している
蛍光物質内包ナノ粒子。
[2] 前記第1の蛍光物質が紫外領域に励起スペクトルを有さず、前記第2の蛍光物質が紫外領域に励起スペクトルを有する前記[1]記載の蛍光物質内包ナノ粒子。
[1] viewed contains a first fluorescent material and a second fluorescent material having a fluorescent material and distinguishable excitation / emission characteristics of the first,
The first fluorescent substance and the second fluorescent substance are encapsulated by an organic polymer resin that is a polystyrene resin or a melamine resin, and
A fluorescent substance-encapsulated nanoparticle having a biomolecule recognizing substance and an aqueous dispersion modifying compound bonded to the surface .
[2] The phosphor-containing nanoparticle according to [1], wherein the first fluorescent material does not have an excitation spectrum in the ultraviolet region, and the second fluorescent material has an excitation spectrum in the ultraviolet region.
[3] 無機蛍光体ナノ粒子と有機蛍光色素を内包する前記[2]記載の蛍光物質内包ナノ粒子。
[4] 前記無機蛍光体ナノ粒子がII−VI族化合物またはIII−V族化合物を含む前記[3]記載の蛍光物質内包ナノ粒子。
[3] The fluorescent substance-containing nanoparticle according to [2], wherein the inorganic fluorescent nanoparticle and the organic fluorescent dye are included.
[4] The phosphor-containing nanoparticle according to [3], wherein the inorganic phosphor nanoparticle includes a II-VI group compound or a III-V group compound.
[5] 前記無機蛍光体ナノ粒子が単体珪素を含む前記[3]記載の蛍光物質内包ナノ粒子。 [5] The phosphor-containing nanoparticle according to [3], wherein the inorganic phosphor nanoparticle contains simple silicon .
[6] 前記第1の蛍光物質が長残光蛍光体ではない蛍光物質であり、且つ前記第2の蛍光物質が長残光蛍光体である前記[1]記載の蛍光物質内包ナノ粒子。 [6 ] The fluorescent substance-containing nanoparticle according to [1], wherein the first fluorescent substance is a fluorescent substance that is not a long afterglow phosphor, and the second fluorescent substance is a long afterglow phosphor.
[7] 前記長残光蛍光体と有機蛍光色素を内包する前記[6]記載の蛍光物質内包ナノ粒子。
[8] 前記長残光蛍光体が無機粒子である前記[6]または[7]記載の蛍光物質内包ナノ粒子。
[ 7 ] The fluorescent substance-containing nanoparticles according to [ 6 ], wherein the long afterglow phosphor and the organic fluorescent dye are included.
[ 8 ] The phosphor-containing nanoparticle according to [ 6 ] or [ 7 ], wherein the long afterglow phosphor is an inorganic particle.
[9] 前記無機粒子の体積平均粒径が5nm以上、500nm以下である前記[8]記載の蛍光物質内包ナノ粒子。
[10] 前記無機粒子の体積平均粒径が5nm以上、300nm以下である前記[8]記載の蛍光物質内包ナノ粒子。
[ 9 ] The fluorescent substance-containing nanoparticle according to [ 8 ], wherein the inorganic particles have a volume average particle diameter of 5 nm or more and 500 nm or less.
[ 10 ] The phosphor-containing nanoparticle according to [ 8 ], wherein the inorganic particles have a volume average particle size of 5 nm or more and 300 nm or less.
[11] 前記長残光蛍光体が、母体と賦活剤とからなる賦活型蛍光体である前記[6]〜[10]のいずれかに記載の蛍光物質内包ナノ粒子。
[12] 前記賦活剤が希土類賦活剤である前記[11]記載の蛍光物質内包ナノ粒子。
[ 11 ] The phosphor-containing nanoparticle according to any one of [ 6 ] to [ 10 ], wherein the long afterglow phosphor is an activated phosphor composed of a matrix and an activator.
[ 12 ] The fluorescent substance-containing nanoparticles according to [ 11 ], wherein the activator is a rare earth activator.
[13] 前記賦活剤がMn2+である前記[11]記載の蛍光物質内包ナノ粒子。
[14] 前記賦活剤がEu3+である前記[11]記載の蛍光物質内包ナノ粒子。
[15] 前記母体がY2O3である前記[11]〜[14]のいずれかに記載の蛍光物質内包ナノ粒子。
[ 13 ] The fluorescent substance-containing nanoparticles according to [ 11 ], wherein the activator is Mn 2+ .
[ 14 ] The fluorescent substance-containing nanoparticle according to [ 11 ], wherein the activator is Eu3 + .
[15] a fluorescent material containing nanoparticles according to any one of the said base is a Y 2 O 3 [11] ~ [14].
[16] 前記母体がZn2SiO4である前記[11]〜[14]のいずれかに記載の蛍光物質内包ナノ粒子。 [ 16 ] The fluorescent substance-containing nanoparticle according to any one of [ 11 ] to [ 14 ], wherein the matrix is Zn 2 SiO 4 .
[17] 前記[1]〜[16]のいずれかに記載の蛍光物質内包ナノ粒子を含む病理診断用蛍光標識剤。 [17 ] A fluorescent labeling agent for pathological diagnosis comprising the fluorescent substance-containing nanoparticles according to any one of [1] to [ 16 ].
[18] (a)第1の蛍光物質と、該第1の蛍光物質と識別可能な励起/発光特性を有する第2の蛍光物質とを含む蛍光物質内包ナノ粒子を用いて組織を標識化処理する工程と、
(b)前記工程(a)で得られた組織について、同一視野で紫外線励起画像と可視光励起画像を撮影する工程と、
(c)前記工程(b)で得られた前記紫外線励起画像と前記可視光励起画像とを比較し、該紫外線励起画像と該可視光励起画像との両方の画像において輝点として検出された画素のみを有効な輝点と認識する工程と
を含む、組織中の生体物質の測定方法。
[19] 前記第1の蛍光物質が紫外領域に励起スペクトルを有さず、前記第2の蛍光物質が紫外領域に励起スペクトルを有する前記[18]記載の測定方法。
[20] 前記蛍光物質内包ナノ粒子が、無機蛍光体ナノ粒子と有機蛍光色素を内包する前記[19]記載の測定方法。
[21] 前記無機蛍光体ナノ粒子がII−VI族化合物またはIII−V族化合物を含む前記[20]記載の測定方法。
[22] 前記無機蛍光体ナノ粒子が単体珪素を含む前記[20]記載の測定方法。
[23] 前記蛍光物質内包ナノ粒子が、有機重合体樹脂によって、前記第1の蛍光物質および前記第2の蛍光物質が内包された蛍光物質内包ナノ粒子である前記[18]〜[22]のいずれかに記載の測定方法。
[24] 前記有機重合体樹脂がポリスチレン樹脂である前記[23]記載の測定方法。
[25] 前記有機重合体樹脂がメラミン樹脂である前記[23]記載の測定方法。
[26] 前記蛍光物質内包ナノ粒子が、シリカによって、前記第1の蛍光物質および前記第2の蛍光物質が内包された蛍光物質内包ナノ粒子である前記[18]〜[22]のいずれかに記載の測定方法。
[27] 前記蛍光物質内包ナノ粒子の表面に生体分子認識物質が結合している前記[18]〜[26]のいずれかに記載の測定方法。
[28] 前記蛍光物質内包ナノ粒子の表面に水系分散用修飾化合物が結合している前記[18]〜[27]のいずれかに記載の測定方法。
[ 18 ] (a) A tissue is labeled using a fluorescent substance-containing nanoparticle including a first fluorescent substance and a second fluorescent substance having excitation / emission characteristics distinguishable from the first fluorescent substance. And a process of
(B) For the tissue obtained in the step (a), a step of photographing an ultraviolet excitation image and a visible light excitation image in the same visual field;
(C) The ultraviolet excitation image obtained in the step (b) is compared with the visible light excitation image, and only pixels detected as bright spots in both the ultraviolet excitation image and the visible light excitation image are detected. A method for measuring a biological material in a tissue, comprising a step of recognizing an effective bright spot.
[19] The measurement method according to [18], wherein the first fluorescent material does not have an excitation spectrum in the ultraviolet region, and the second fluorescent material has an excitation spectrum in the ultraviolet region.
[20] The measurement method according to [19], wherein the fluorescent substance-containing nanoparticles include inorganic fluorescent nanoparticles and an organic fluorescent dye.
[21] The measurement method according to [20], wherein the inorganic phosphor nanoparticles include a II-VI group compound or a III-V group compound.
[22] The measurement method according to [20], wherein the inorganic phosphor nanoparticles include simple silicon.
[23] The above [18] to [22], wherein the fluorescent substance-containing nanoparticles are fluorescent substance-containing nanoparticles in which the first fluorescent substance and the second fluorescent substance are included by an organic polymer resin. The measuring method in any one.
[24] The measurement method according to [23], wherein the organic polymer resin is a polystyrene resin.
[25] The measurement method according to [23], wherein the organic polymer resin is a melamine resin.
[26] The phosphor-containing nanoparticle according to any one of [18] to [22], wherein the phosphor-containing nanoparticle is a phosphor-containing nanoparticle in which the first fluorescent material and the second fluorescent material are encapsulated with silica. The measuring method described.
[27] The measurement method according to any one of [18] to [26], wherein a biomolecule recognition substance is bonded to the surface of the fluorescent substance-containing nanoparticle.
[28] The measurement method according to any one of [18] to [27], wherein a modification compound for aqueous dispersion is bonded to a surface of the fluorescent substance-containing nanoparticle.
[29] (a)第1の蛍光物質と、該第1の蛍光物質と識別可能な励起/発光特性を有する第2の蛍光物質とを含む蛍光物質内包ナノ粒子を用いて組織を標識化処理する工程と、
(b)前記工程(a)で得られた組織について、同一視野で、励起光照射時に得られる励起画像と時間分解蛍光測定により得られる残光画像とを撮影する工程と、
(c)前記工程(b)で得られた前記励起画像と前記残光画像とを比較し、該励起画像と該残光画像との両方の画像において輝点として検出された画素のみを有効な輝点と認識する工程と
を含み、
前記第1の蛍光物質が長残光蛍光体ではない蛍光物質であり、且つ前記第2の蛍光物質が長残光蛍光体である、組織中の生体物質の測定方法。
[30] 前記蛍光物質内包ナノ粒子が、前記長残光蛍光体と有機蛍光色素を内包する[29]記載の測定方法。
[31] 前記長残光蛍光体が無機粒子である[29]または[30]記載の測定方法。
[32] 前記無機粒子の体積平均粒径が5nm以上、500nm以下である[31]記載の測定方法。
[33] 前記無機粒子の体積平均粒径が5nm以上、300nm以下である[31]記載の測定方法。
[34] 前記長残光蛍光体が、母体と賦活剤とからなる賦活型蛍光体である[29]〜[33]のいずれかに記載の測定方法。
[35] 前記賦活剤が希土類賦活剤である[34]記載の測定方法。
[36] 前記賦活剤がMn 2+ である[34]記載の測定方法。
[37] 前記賦活剤がEu 3+ である[34]記載の測定方法。
[38] 前記母体がY 2 O 3 である[34]〜[37]のいずれかに記載の測定方法。
[39] 前記母体がZn 2 SiO 4 である請求項[34]〜[37]のいずれかに記載の測定方法。
[40] 前記蛍光物質内包ナノ粒子が、有機重合体樹脂によって、前記第1の蛍光物質および前記第2の蛍光物質が内包された蛍光物質内包ナノ粒子である[29]〜[39]のいずれかに記載の測定方法。
[41] 前記有機重合体樹脂がポリスチレン樹脂である[40]記載の測定方法。
[42] 前記有機重合体樹脂がメラミン樹脂である[40]記載の測定方法。
[43] 前記蛍光物質内包ナノ粒子が、シリカによって、前記第1の蛍光物質および前記第2の蛍光物質が内包された蛍光物質内包ナノ粒子である[29]〜[39]のいずれかに記載の測定方法。
[44] 前記蛍光物質内包ナノ粒子の表面に生体分子認識物質が結合している[29]〜[43]のいずれかに記載の測定方法。
[45] 前記蛍光物質内包ナノ粒子の表面に水系分散用修飾化合物が結合している[29]〜[44]のいずれかに記載の測定方法。
[ 29 ] (a) A tissue is labeled using a fluorescent substance-containing nanoparticle including a first fluorescent substance and a second fluorescent substance having excitation / emission characteristics distinguishable from the first fluorescent substance. And a process of
(B) For the tissue obtained in the step (a), a step of photographing an excitation image obtained at the time of excitation light irradiation and an afterglow image obtained by time-resolved fluorescence measurement in the same visual field;
(C) The excitation image obtained in the step (b) is compared with the afterglow image, and only pixels detected as bright spots in both the excitation image and the afterglow image are effective. viewing including the step of recognizing a bright spot,
A method for measuring a biological material in a tissue, wherein the first fluorescent material is a fluorescent material that is not a long afterglow phosphor, and the second fluorescent material is a long afterglow phosphor .
[30] The measurement method according to [29], wherein the fluorescent substance-containing nanoparticles include the long afterglow phosphor and the organic fluorescent dye.
[31] The measurement method according to [29] or [30], wherein the long afterglow phosphor is inorganic particles.
[32] The measurement method according to [31], wherein the inorganic particles have a volume average particle size of 5 nm or more and 500 nm or less.
[33] The measurement method according to [31], wherein the inorganic particles have a volume average particle size of 5 nm or more and 300 nm or less.
[34] The measurement method according to any one of [29] to [33], wherein the long afterglow phosphor is an activated phosphor composed of a matrix and an activator.
[35] The measuring method according to [34], wherein the activator is a rare earth activator.
[36] The measuring method according to [34], wherein the activator is Mn 2+ .
[37] The measurement method according to [34], wherein the activator is Eu 3+ .
[38] The measurement method according to any one of [34] to [37], wherein the matrix is Y 2 O 3 .
[39] The measurement method according to any one of [34] to [37], wherein the base material is Zn 2 SiO 4 .
[40] Any of [29] to [39], wherein the fluorescent substance-containing nanoparticles are fluorescent substance-containing nanoparticles in which the first fluorescent substance and the second fluorescent substance are included by an organic polymer resin. The measuring method of crab.
[41] The measurement method according to [40], wherein the organic polymer resin is a polystyrene resin.
[42] The measuring method according to [40], wherein the organic polymer resin is a melamine resin.
[43] The fluorescent substance-containing nanoparticles are any one of [29] to [39], wherein the fluorescent substance-containing nanoparticles are fluorescent substance-containing nanoparticles in which the first fluorescent substance and the second fluorescent substance are included in silica. Measuring method.
[44] The measurement method according to any one of [29] to [43], wherein a biomolecule recognition substance is bonded to the surface of the fluorescent substance-containing nanoparticle.
[45] The measurement method according to any one of [29] to [44], wherein a modified compound for aqueous dispersion is bonded to the surface of the fluorescent substance-containing nanoparticles.
本発明の蛍光物質内包ナノ粒子は異なる励起/発光特性を有する複数の蛍光物質を内包していることから、同一視野において異なる複数の測定条件下で得られる蛍光発光を足し合わせることで、輝度向上が可能となる。また、同一視野において異なる複数の測定条件下で得られる複数の発光画像を通じて、同一の画素で蛍光が確認された部分のみを信号として取り出す演算処理を可能とすることによりS/N比を飛躍的に改良することもでき、病理診断用蛍光標識剤として用いられたときに、組織中の生体物質を高精度に検出することを可能とする。 Since the fluorescent substance-encapsulating nanoparticles of the present invention contain a plurality of fluorescent substances having different excitation / emission characteristics, the luminance can be improved by adding together the fluorescent emission obtained under different measurement conditions in the same field of view. Is possible. In addition, the S / N ratio is dramatically improved by enabling calculation processing to extract only a portion where fluorescence is confirmed at the same pixel as a signal through a plurality of light emission images obtained under a plurality of different measurement conditions in the same visual field. When used as a fluorescent labeling agent for pathological diagnosis, it is possible to detect a biological substance in a tissue with high accuracy.
〔蛍光物質内包ナノ粒子〕
本発明に係る蛍光物質内包ナノ粒子は、第1の蛍光物質と、この第1の蛍光物質と識別可能な励起/発光特性を有する第2の蛍光物質とを含む粒子である。
[Fluorescent substance-containing nanoparticles]
The fluorescent substance-containing nanoparticle according to the present invention is a particle including a first fluorescent substance and a second fluorescent substance having excitation / luminescence characteristics distinguishable from the first fluorescent substance.
蛍光物質
本発明で用いられる蛍光物質としては、蛍光有機色素および半導体ナノ粒子をあげることができる。200〜700nmの範囲内の波長の紫外〜可視光により励起されたときに、400〜900nmの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示すことが好ましい。
Fluorescent substance Examples of the fluorescent substance used in the present invention include fluorescent organic dyes and semiconductor nanoparticles. When excited by ultraviolet to visible light having a wavelength in the range of 200 to 700 nm, it preferably emits visible to near infrared light having a wavelength in the range of 400 to 900 nm.
より好ましくは、同一粒子内に内包される蛍光体の発光波長は発光ピークがプラスマイナス5nmであることが、観察上好ましい。
本発明に係る蛍光物質内包ナノ粒子において、第1の蛍光物質及び第2の蛍光物質のいずれも、励起波長及び発光波長がそれぞれ上記の範囲内にあることが好ましいが、第2の蛍光物質は、第1の蛍光物質と識別可能な励起/発光特性を有する必要がある。本発明の典型的な態様において、第1の蛍光物質として、一般的な励起/発光特性を有する、既存の蛍光標識剤として一般的に用いられている蛍光物質が用いられ、第2の蛍光物質として、第1の蛍光物質が実質的に蛍光発光しない状況下で蛍光発光可能な蛍光物質が用いられる。ここで、「一般的な励起/発光特性を有する」蛍光物質は、蛍光寿命が短く、多くの場合可視〜近赤外光の領域に励起/発光特性を有することから、第2の蛍光物質として、蛍光寿命が長い蛍光物質(すなわち、長残光蛍光体)、および紫外領域に励起スペクトルを有する蛍光物質が挙げられる。
More preferably, the emission wavelength of the phosphor contained in the same particle preferably has an emission peak of plus or minus 5 nm for observation.
In the fluorescent substance-containing nanoparticle according to the present invention, it is preferable that both the first fluorescent substance and the second fluorescent substance have the excitation wavelength and the emission wavelength in the above ranges, respectively. It is necessary to have excitation / emission characteristics distinguishable from the first fluorescent material. In a typical embodiment of the present invention, a fluorescent material generally used as an existing fluorescent labeling agent having general excitation / emission characteristics is used as the first fluorescent material, and the second fluorescent material is used. As the fluorescent material, a fluorescent material capable of emitting fluorescence under the condition that the first fluorescent material does not substantially emit fluorescence is used. Here, a fluorescent substance having “general excitation / emission characteristics” has a short fluorescence lifetime and often has excitation / emission characteristics in the visible to near infrared light region. , Fluorescent substances having a long fluorescence lifetime (that is, long afterglow phosphors), and fluorescent substances having an excitation spectrum in the ultraviolet region.
ここで、本明細書において「紫外領域に励起スペクトルを有する」とは、400nm未満の波長を有する励起光により、400nm以上900nm以下の範囲内にある波長を有する蛍光を発することを意味する。ただ、蛍光測定時における、本発明に係る蛍光物質内包ナノ粒子による標識化を行った生体物質の変性を最小限に抑える観点から、実用上は、200nm以上400nm未満の範囲内にある波長を有する励起光により、400nm以上900nm以下の範囲内にある波長を有する蛍光を発する意味に用いられる。 Here, “having an excitation spectrum in the ultraviolet region” in this specification means that fluorescence having a wavelength in the range of 400 nm to 900 nm is emitted by excitation light having a wavelength of less than 400 nm. However, from the viewpoint of minimizing the denaturation of the biological substance labeled with the fluorescent substance-encapsulating nanoparticles according to the present invention at the time of fluorescence measurement, it has a wavelength in the range of 200 nm to less than 400 nm in practice. It is used to mean that the excitation light emits fluorescence having a wavelength in the range of 400 nm to 900 nm.
以下、第1の蛍光物質及び/または第2の蛍光物質となり得る蛍光物質の具体例を示す。
・有機蛍光色素
本発明において、有機色素を蛍光物質として用いることができる。ここで、有機蛍光色素は、芳香環、複素環など共役π電子系の存在により蛍光を発光する有機化合物をいい、その例として、生化学の分野において広く用いられる蛍光標識剤が挙げられる。
Hereinafter, specific examples of the fluorescent substance that can be the first fluorescent substance and / or the second fluorescent substance are shown.
Organic fluorescent dye In the present invention, an organic dye can be used as a fluorescent substance. Here, the organic fluorescent dye refers to an organic compound that emits fluorescence due to the presence of a conjugated π-electron system such as an aromatic ring or a heterocyclic ring, and examples thereof include fluorescent labeling agents widely used in the field of biochemistry.
有機蛍光色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Alexa Fluor(インビトロジェン社製)系色素分子、BODIPY(インビトロジェン社製)系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、NBD系色素分子、ピレン系色素分子、Texas Red系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。 Organic fluorescent dyes include fluorescein dye molecules, rhodamine dye molecules, Alexa Fluor (Invitrogen) dye molecules, BODIPY (Invitrogen) dye molecules, cascade dye molecules, coumarin dye molecules, and eosin dyes. Examples include molecules, NBD dye molecules, pyrene dye molecules, Texas Red dye molecules, and cyanine dye molecules.
具体的には、5−カルボキシ−フルオレセイン、6−カルボキシ−フルオレセイン、5,6−ジカルボキシ−フルオレセイン、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン、6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ−2’,7’−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、5−カルボキシ−ローダミン、6−カルボキシ−ローダミン、5,6−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン 6G、テトラメチルローダミン、X−ローダミン、及びAlexa Fluor 350,Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、BODIPY FL,BODIPY TMR、BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665(以上インビトロジェン社製)、メトキシクマリン、エオジン、NBD、ピレン、Cy5、Cy5.5、Cy7等を挙げることができる。 Specifically, 5-carboxy-fluorescein, 6-carboxy-fluorescein, 5,6-dicarboxy-fluorescein, 6-carboxy-2 ′, 4,4 ′, 5 ′, 7,7′-hexachlorofluorescein, 6 -Carboxy-2 ', 4,7,7'-tetrachlorofluorescein, 6-carboxy-4', 5'-dichloro-2 ', 7'-dimethoxyfluorescein, naphthofluorescein, 5-carboxy-rhodamine, 6-carboxy Rhodamine, 5,6-dicarboxy-rhodamine, rhodamine 6G, tetramethylrhodamine, X-rhodamine, and Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 500, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 633 , Alexa Fluor 750, BODIPY FL, BODIPY TMR, BODIPY 493/503, BODIPY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, 3030 ODIPY 650/665 (all manufactured by Invitrogen), methoxy coumarin, eosin, NBD, pyrene, Cy5, Cy5.5, can be mentioned Cy7 like.
これらの有機蛍光色素は、1種単独で用いてもよく、あるいは複数種を組み合わせて用いてもよい。
本発明で用いられる有機蛍光色素は、多くの場合、可視領域、具体的には400nm以上700nm以下の範囲内の波長を有する励起光により励起されたときに、可視〜近赤外領域、具体的には400nm以上900nm以下の範囲内の波長を有する蛍光を発光する蛍光物質であり、紫外領域に励起スペクトルを有さない。したがって、有機蛍光色素は、通常「第1の蛍光物質」として用いられる。
These organic fluorescent dyes may be used alone or in combination of two or more.
In many cases, the organic fluorescent dye used in the present invention has a visible region, specifically, a visible to near-infrared region, specifically when excited by excitation light having a wavelength in the range of 400 nm to 700 nm. Is a fluorescent substance that emits fluorescence having a wavelength in the range of 400 nm to 900 nm, and does not have an excitation spectrum in the ultraviolet region. Therefore, the organic fluorescent dye is usually used as a “first fluorescent substance”.
ただ、Alexa Fluor 350(最大吸収波長346nm)やクマリン系色素分子など一部の有機蛍光色素では、紫外領域の光、具体的には400nm未満の波長を有する光により励起し蛍光を発することがある。したがって、このような有機蛍光色素は、より励起波長の大きい蛍光物質、例えば、励起波長が500〜700nmの範囲内にある蛍光物質と組み合わせることにより、「第2の蛍光物質」として用いることもできる。 However, some organic fluorescent dyes such as Alexa Fluor 350 (maximum absorption wavelength 346 nm) and coumarin dye molecules may excite and emit fluorescence by light in the ultraviolet region, specifically light having a wavelength of less than 400 nm. . Therefore, such an organic fluorescent dye can be used as a “second fluorescent material” by combining with a fluorescent material having a larger excitation wavelength, for example, a fluorescent material having an excitation wavelength in the range of 500 to 700 nm. .
・半導体ナノ粒子
本発明において、上記「有機蛍光色素」のほかに半導体ナノ粒子も蛍光物質として用いることができる。ここで、半導体ナノ粒子としては、II−VI族化合物、III−V族化合物、及びIV族元素の単体を成分としてそれぞれ含有する半導体ナノ粒子(それぞれ、「II−VI族半導体ナノ粒子」、「III−V族半導体ナノ粒子」、及び「IV族半導体ナノ粒子」ともいう。)のいずれかを用いることができる。
Semiconductor nanoparticles In the present invention, in addition to the above “organic fluorescent dyes”, semiconductor nanoparticles can also be used as fluorescent substances. Here, as semiconductor nanoparticles, II-VI group compounds, III-V group compounds, and semiconductor nanoparticles each containing a group IV element as a component ("II-VI group semiconductor nanoparticles", " Any of “III-V semiconductor nanoparticles” and “Group IV semiconductor nanoparticles”) can be used.
具体的には、CdSe、CdS、CdTe、ZnSe、ZnS、ZnTe、InP、InN、InAs、InGaP、GaP、GaAs、Si、Geが挙げられるが、これらに限定されない。 Specific examples include, but are not limited to, CdSe, CdS, CdTe, ZnSe, ZnS, ZnTe, InP, InN, InAs, InGaP, GaP, GaAs, Si, and Ge.
上記半導体ナノ粒子をコアとし、その上にシェルを設けたコア/シェル構造の半導体ナノ粒子を用いることもできる。以下本明細書中シェルを有する半導体ナノ粒子の表記法として、コアがCdSe、シェルがZnSの場合、CdSe/ZnSと表記する。例えばCdSe/ZnS、CdS/ZnS、InP/ZnS、InGaP/ZnS、Si/SiO2、Si/ZnS、Ge/GeO2、Ge/ZnSなどを用いることができるが、これらに限定されない。 It is also possible to use semiconductor nanoparticles having a core / shell structure in which the semiconductor nanoparticles are used as a core and a shell is provided thereon. Hereinafter, as a notation method of the semiconductor nanoparticles having a shell in this specification, when the core is CdSe and the shell is ZnS, it is expressed as CdSe / ZnS. For example, CdSe / ZnS, CdS / ZnS, InP / ZnS, InGaP / ZnS, Si / SiO 2 , Si / ZnS, Ge / GeO 2 , Ge / ZnS, and the like can be used, but are not limited thereto.
これらの半導体ナノ粒子は、1種単独で用いてもよく、あるいは複数種を組み合わせて用いてもよい。
本発明で用いられる半導体ナノ粒子は、公知の方法により製造することができるし、あるいは、市販されているものを用いることもできる。ここで、半導体ナノ粒子は必要に応じて、有機ポリマーなどにより表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するCdSe/ZnS(インビトロジェン社製)、表面アミノ基を有するCdSe/ZnS(インビトロジェン社製)などがあげられる。
These semiconductor nanoparticles may be used individually by 1 type, or may be used in combination of multiple types.
The semiconductor nanoparticles used in the present invention can be produced by a known method, or commercially available ones can also be used. Here, as the semiconductor nanoparticles, those subjected to surface treatment with an organic polymer or the like may be used as necessary. Examples thereof include CdSe / ZnS having a surface carboxy group (manufactured by Invitrogen), CdSe / ZnS having a surface amino group (manufactured by Invitrogen), and the like.
以上の半導体ナノ粒子は、構成成分や粒径によって波長特性を変えることができるので、第1の蛍光物質にも第2の蛍光物質にもなり得る。例えば、紫外領域に励起スペクトルを有する半導体ナノ粒子を第2の蛍光物質として用い、紫外領域に励起スペクトルを有さない別の半導体ナノ粒子または上記有機蛍光色素を第1の蛍光物質として組み合わせることもできる。 Since the semiconductor nanoparticles described above can change the wavelength characteristics depending on the constituent components and the particle diameter, they can be used as the first fluorescent material and the second fluorescent material. For example, semiconductor nanoparticles having an excitation spectrum in the ultraviolet region may be used as the second fluorescent material, and another semiconductor nanoparticle having no excitation spectrum in the ultraviolet region or the organic fluorescent dye may be combined as the first fluorescent material. it can.
・長残光蛍光体
本発明において、上記「有機蛍光色素」および「半導体ナノ粒子」のほかに、長残光蛍光体も蛍光物質として用いることができる。ここで、本明細書において「長残光」とは、励起光の照射を終了してから1ミリ秒経過後においても、蛍光が励起時の1/10以上の発光強度を維持することをいう。なお、上述した「有機蛍光色素」や「半導体ナノ粒子」は、一般に、励起光の照射を終了してから1ミリ秒経過する前に消光することから、長残光蛍光体ではない蛍光物質に該当する。
-Long afterglow phosphor In the present invention, in addition to the above "organic fluorescent dye" and "semiconductor nanoparticle", a long afterglow phosphor can also be used as a fluorescent substance. Here, “long afterglow” in this specification means that the fluorescence maintains a light emission intensity of 1/10 or more of that at the time of excitation even after 1 millisecond has elapsed since the end of the excitation light irradiation. . In addition, since the above-mentioned “organic fluorescent dye” and “semiconductor nanoparticle” are generally extinguished before one millisecond elapses after the irradiation of the excitation light, the phosphor is not a long afterglow phosphor. Applicable.
ここで、長残光蛍光体は、その組成に特に制限はなく、公知の種々の組成を適用することができるが、安定性の点から、無機化合物からなる蛍光体、例えば無機酸化物蛍光体、無機ハロゲン化物蛍光体であると好ましい。 Here, the composition of the long afterglow phosphor is not particularly limited, and various known compositions can be applied. From the viewpoint of stability, a phosphor composed of an inorganic compound, for example, an inorganic oxide phosphor An inorganic halide phosphor is preferable.
本発明で好適に用いることのできる長残光蛍光体として、母体と賦活剤とからなる賦活型蛍光体が挙げられる。ここで、母体として、Y2O3、Zn2SiO4等に代表される金属酸化物、Ca5(PO4)3Cl等に代表されるリン酸塩及びZnS、SrS、CaS 等に代表される硫化物が挙げられ、その好ましい例としては、例えば、ZnS、Y2O2S、(Y,Gd)3Al5O12、YAlO3、BaAl2Si2O8、Y3Al5O12、Y2SiO3、Zn2SiO4、Y2O3、BaMgAl10O17、BaAl12O19、(Ba,Sr,Mg)O・aAl2O3、(Y,Gd)BO3、YO3、(Zn,Cd)S、SrGa2S4、SrS、SnO2、Ca10(PO4)6(F,Cl)2、(Ba,Sr)(Mg,Mn)Al10O17、(Sr,Ca,Ba,Mg)10(PO4)6Cl2、(La,Ce)PO4、CeMgAl11O19、GdMgB5O10、Sr2P2O7、Sr4Al14O25、BaMgAl14O23、Ba2Mg2Al12O22、Ba2Mg4Al8O18、Ba3Mg5Al18O35、(Ba,Sr,Ca)(Mg,Zn,Mn)Al10O17を挙げることができる。これらのうち、発光強度の点から、Y2O3、Zn2SiO4が好ましく用いられる。 Examples of the long afterglow phosphor that can be suitably used in the present invention include an activated phosphor composed of a matrix and an activator. Here, the matrix is represented by metal oxides typified by Y 2 O 3 , Zn 2 SiO 4 , phosphates typified by Ca 5 (PO 4 ) 3 Cl, and ZnS, SrS, CaS 2, etc. Preferred examples thereof include, for example, ZnS, Y 2 O 2 S, (Y, Gd) 3 Al 5 O 12 , YAlO 3 , BaAl 2 Si 2 O 8 , Y 3 Al 5 O 12. Y 2 SiO 3 , Zn 2 SiO 4 , Y 2 O 3 , BaMgAl 10 O 17 , BaAl 12 O 19 , (Ba, Sr, Mg) O · aAl 2 O 3 , (Y, Gd) BO 3 , YO 3 , (Zn, Cd) S, SrGa 2 S 4 , SrS, SnO 2 , Ca 10 (PO 4 ) 6 (F, Cl) 2 , (Ba, Sr) (Mg, Mn) Al 10 O 17 , (Sr, Ca, Ba, Mg) 10 ( PO 4) 6 Cl 2, (La, Ce) PO 4, CeMgAl 11 O 19, dMgB 5 O 10, Sr 2 P 2 O 7, Sr 4 Al 14 O 25, BaMgAl 14 O 23, Ba 2 Mg 2 Al 12 O 22, Ba 2 Mg 4 Al 8 O 18, Ba 3 Mg 5 Al 18 O 35 , (Ba, Sr, Ca) (Mg, Zn, Mn) Al 10 O 17 . Of these, Y 2 O 3 and Zn 2 SiO 4 are preferably used from the viewpoint of emission intensity.
また、賦活剤として、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb等の希土類金属のイオンやAg、Al、Mn、Sb等の金属のイオンが挙げられ、発光波長と発光寿命の点から、特にMn2+,Eu3+が好ましく用いられる。 Further, as activators, ions of rare earth metals such as Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, and Yb, and ions of metals such as Ag, Al, Mn, and Sb In view of the emission wavelength and the emission lifetime, Mn 2+ and Eu 3+ are particularly preferably used.
以上の母体及び賦活剤は、元素組成には特に制限はなく、同族の元素と一部置き換えることもでき、得られた無機蛍光体は紫外線を吸収して可視光を発するものが好ましい。
以下に、本発明で長残光蛍光体として使用される蛍光体の具体的な化合物を示すが、これに限定されるものではない:
Zn2GeO4:Mn,Y2O2S:Eu3+,
(Ba,Mg)2SiO4:Eu3+,
Ca2Y8(SiO4)6O2:Eu3+,
LiY9(SiO4)6O2:Eu3+,
(Ba,Mg)Al16O27:Eu3+,
(Ba,Ca,Mg)5(PO4)3Cl:Eu3+,
YVO4:Eu3+,
YVO4:Eu3+,Bi3+,
CaS:Eu3+,
Y2O3:Eu3+,
YAlO3:Eu3+,
YBO3:Eu3+,
(Y,Gd)BO3:Eu3+。
The above matrix and activator are not particularly limited in elemental composition and can be partially replaced with elements of the same family, and the obtained inorganic phosphor preferably absorbs ultraviolet rays and emits visible light.
The specific compounds of the phosphor used as the long afterglow phosphor in the present invention are shown below, but are not limited thereto:
Zn 2 GeO 4 : Mn, Y 2 O 2 S: Eu 3+ ,
(Ba, Mg) 2 SiO 4 : Eu 3+ ,
Ca 2 Y 8 (SiO 4 ) 6 O 2 : Eu 3+ ,
LiY 9 (SiO 4 ) 6 O 2 : Eu 3+ ,
(Ba, Mg) Al 16 O 27 : Eu 3+ ,
(Ba, Ca, Mg) 5 (PO 4 ) 3 Cl: Eu 3+ ,
YVO 4 : Eu 3+ ,
YVO 4 : Eu 3+ , Bi 3+ ,
CaS: Eu 3+ ,
Y 2 O 3 : Eu 3+ ,
YAlO 3 : Eu 3+ ,
YBO 3 : Eu 3+ ,
(Y, Gd) BO 3 : Eu 3+ .
本発明で用いられる長残光蛍光体の製造方法として、公知の方法を用いることができ、例えば、固相法、液相法、水熱法、燃焼法等を用いることができる。例えば、母体を構成する上記の化合物と賦活剤を構成する上記の化合物を混合し、焼成することにより、長寿命蛍光体を無機粒子の形で得ることができる。このような無機粒子を内包する蛍光物質内包ナノ粒子が、ナノサイズの大きさを有するよう、この無機粒子の体積平均粒径は、5nm以上500nm以下であることが好ましく、5nm以上300nm以下であることがより好ましい。 As a method for producing the long afterglow phosphor used in the present invention, a known method can be used. For example, a solid phase method, a liquid phase method, a hydrothermal method, a combustion method, or the like can be used. For example, the long-life phosphor can be obtained in the form of inorganic particles by mixing and firing the above-mentioned compound constituting the matrix and the above-described compound constituting the activator. The volume average particle size of the inorganic particles is preferably 5 nm or more and 500 nm or less so that the phosphor-containing nanoparticles encapsulating such inorganic particles have a nano-size size, and preferably 5 nm or more and 300 nm or less. It is more preferable.
以上の長残光蛍光体は、上述の「有機蛍光色素」および「半導体ナノ粒子」と比べて蛍光寿命が長いことから、本発明においては「第2の蛍光物質」として用いられることができ、「有機蛍光色素」または「半導体ナノ粒子」を「第1の蛍光物質」として組み合わせることができる。 Since the above long afterglow phosphor has a longer fluorescence lifetime than the above-mentioned “organic fluorescent dye” and “semiconductor nanoparticle”, it can be used as a “second fluorescent substance” in the present invention. “Organic fluorescent dyes” or “semiconductor nanoparticles” can be combined as a “first fluorescent substance”.
蛍光物質内包ナノ粒子の基本的な構成
本発明の蛍光物質内包ナノ粒子は、上記「蛍光物質」を内包したナノ粒子であり、上記第1の蛍光物質と、この第1の蛍光物質と識別可能な励起/発光特性を有する第2の蛍光物質とを含んでいる。ここで、本発明の典型的な態様において、第1の蛍光物質として、一般的な励起/発光特性を有する、既存の蛍光標識剤として一般的に用いられている蛍光物質が用いられ、第2の蛍光物質として、第1の蛍光物質が実質的に蛍光発光しない状況下で蛍光発光可能な蛍光物質が用いられる。そして、具体的には、この第1の蛍光物質と第2の蛍光物質とが基材の内部に内包された状態で存在している。
Basic Structure of Fluorescent Substance-Incorporated Nanoparticle The fluorescent substance-encapsulating nanoparticle of the present invention is a nanoparticle including the above-mentioned “fluorescent substance”, and can be distinguished from the first fluorescent substance and the first fluorescent substance. And a second fluorescent material having excellent excitation / emission characteristics. Here, in a typical embodiment of the present invention, a fluorescent material generally used as an existing fluorescent labeling agent having general excitation / emission characteristics is used as the first fluorescent material. As the fluorescent material, a fluorescent material capable of emitting fluorescence under the condition that the first fluorescent material does not substantially emit fluorescence is used. Specifically, the first fluorescent material and the second fluorescent material are present in a state of being included in the base material.
本発明の第1の実施態様に係る蛍光物質内包ナノ粒子は、第1の蛍光物質として紫外領域に励起スペクトルを有さない蛍光物質と、第2の蛍光物質として紫外領域に励起スペクトルを有する蛍光物質とを含む蛍光物質内包ナノ粒子である。この第1の実施態様の典型例として、第1の蛍光物質として有機蛍光色素を用いるとともに、第2の蛍光物質として無機蛍光体ナノ粒子を用いる態様が挙げられる。 The fluorescent substance-encapsulating nanoparticles according to the first embodiment of the present invention include a fluorescent substance having no excitation spectrum in the ultraviolet region as the first fluorescent substance, and a fluorescence having an excitation spectrum in the ultraviolet area as the second fluorescent substance. It is the fluorescent substance inclusion | inner_cover nanoparticle containing a substance. As a typical example of the first embodiment, an organic fluorescent dye is used as the first fluorescent material, and an inorganic fluorescent nanoparticle is used as the second fluorescent material.
また、本発明の第2の実施態様に係る蛍光物質内包ナノ粒子は、第1の蛍光物質として長残光蛍光体ではない蛍光物質と、第2の蛍光物質として長残光蛍光体とを含む蛍光物質内包ナノ粒子である。この第2の実施態様において、第1の蛍光物質として有機蛍光色素を用いるとともに、第2の蛍光物質として無機粒子、特に母体と賦活剤とからなる賦活型蛍光体を用いる態様が挙げられる。ここで、第1の蛍光物質として、有機蛍光色素の代わりに、あるいは有機蛍光色素とともに上記半導体ナノ粒子を用いることもできる。 The fluorescent substance-encapsulating nanoparticles according to the second embodiment of the present invention include a fluorescent substance that is not a long afterglow phosphor as the first fluorescent substance and a long afterglow phosphor as the second fluorescent substance. It is a fluorescent substance-containing nanoparticle. In the second embodiment, an organic fluorescent dye is used as the first fluorescent substance, and an activated fluorescent substance composed of inorganic particles, particularly a base material and an activator, is used as the second fluorescent substance. Here, as the first fluorescent substance, the semiconductor nanoparticles can be used instead of the organic fluorescent dye or together with the organic fluorescent dye.
本発明において「蛍光物質内包ナノ粒子」とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたものを言い、「蛍光物質内包ナノ粒子」において、蛍光物質が基材と化学的に結合していてもよいし、結合していなくてもよい。 In the present invention, the “fluorescent substance-encapsulating nanoparticle” means a substance in which the fluorescent substance is dispersed inside the nanoparticle. In the “fluorescent substance-encapsulating nanoparticle”, even if the fluorescent substance is chemically bonded to the base material. It does not have to be bonded.
ナノ粒子を構成する基材は特に限定されるものではなく、ポリスチレン樹脂、メラミン樹脂およびポリ乳酸樹脂などの有機重合体樹脂、並びにシリカなどをあげることができる。 The base material constituting the nanoparticles is not particularly limited, and examples thereof include organic polymer resins such as polystyrene resin, melamine resin and polylactic acid resin, and silica.
本発明で用いられる蛍光物質内包ナノ粒子は、公知の方法により作成することが可能である。
例えば、蛍光有機色素を内包したシリカナノ粒子は ラングミュア 8巻 2921ページ(1992)に記載されているFITC内包シリカ粒子の合成を参考に合成することができる。FITCの代わりに所望の蛍光有機色素を用いることで種々の蛍光有機色素内包シリカナノ粒子が合成できる。
The fluorescent substance-containing nanoparticles used in the present invention can be prepared by a known method.
For example, silica nanoparticles encapsulating a fluorescent organic dye can be synthesized with reference to the synthesis of FITC-encapsulated silica particles described in Langmuir 8, Vol. 2921 (1992). By using a desired fluorescent organic dye instead of FITC, various fluorescent organic dye-encapsulated silica nanoparticles can be synthesized.
半導体ナノ粒子を内包したシリカナノ粒子は ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー 33巻 561ページ(2009)に記載されているCdTe内包シリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。 Silica nanoparticles encapsulating semiconductor nanoparticles can be synthesized with reference to the synthesis of CdTe-encapsulated silica nanoparticles described in New Journal of Chemistry, Vol. 33, p. 561 (2009).
蛍光有機色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許 4326008(1982)に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許 5326692(1992)に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光有機色素の含浸法を用いて作成することができる。 Polystyrene nanoparticles encapsulating a fluorescent organic dye may be copolymerized using an organic dye having a polymerizable functional group described in US Pat. No. 4,326,008 (1982) or polystyrene described in US Pat. No. 5,326,692 (1992). It can be created using a method of impregnating nanoparticles with a fluorescent organic dye.
半導体ナノ粒子を内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー バイオテクノロジー 19巻631ページ(2001)記載のポリスチレンナノ粒子への半導体ナノ粒子の含浸法を用いて作成することができる。 Polymer nanoparticles encapsulating semiconductor nanoparticles can be prepared using the method of impregnating semiconductor nanoparticles into polystyrene nanoparticles described in Nature Biotechnology, Vol. 19, p. 631 (2001).
本発明で用いられる蛍光物質を内包したナノ粒子とは、平均粒径は特に限定されないが、30〜800nm程度のものを用いることができる。また粒径のばらつきを示す変動係数は特に限定されないが、20%のものを用いることができる。本発明において、平均粒径とは、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めたものである。本願においては、1000個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、1000個の粒子の粒径分布から算出した値とした。 The average particle diameter of the nanoparticles encapsulating the fluorescent material used in the present invention is not particularly limited, but those having a size of about 30 to 800 nm can be used. Further, the coefficient of variation indicating the variation in the particle diameter is not particularly limited, but 20% can be used. In the present invention, the average particle diameter is obtained when an electron micrograph is taken using a scanning electron microscope (SEM), the cross-sectional area is measured for a sufficient number of particles, and the measured value is defined as the area of a corresponding circle. Is obtained as the particle diameter. In the present application, the arithmetic average of the particle sizes of 1000 particles is defined as the average particle size. The coefficient of variation was also a value calculated from the particle size distribution of 1000 particles.
表面に生体物質認識物質が結合している蛍光物質内包ナノ粒子
本発明の蛍光物質内包ナノ粒子は、主として病理診断用蛍光標識剤として用いられるものである。したがって、本発明の蛍光物質内包ナノ粒子は、標識化の対象とする生体物質(以下、「目的とする生体物質」と呼ばれる場合がある。)を特異的に標識化することができるよう、生体物質認識部位として機能する生体分子認識物質が表面に結合していることが好ましい。すなわち、本発明の蛍光物質内包ナノ粒子は、表面に生体分子認識物質を表面に有していることが好ましい。ここで、本発明において、生体物質認識部位とは、目的とする生体物質と特異的に結合及び/又は反応する部位である。なお、本明細書において、本発明に係る蛍光物質内包ナノ粒子のうち、生体分子認識物質が表面に結合している蛍光物質内包ナノ粒子を、特に「生体分子認識物質修飾蛍光物質内包ナノ粒子」と呼ぶことがある。
Fluorescent substance-encapsulated nanoparticles having a biological substance recognition substance bonded to the surface The fluorescent substance-encapsulated nanoparticles of the present invention are mainly used as a fluorescent labeling agent for pathological diagnosis. Therefore, the fluorescent substance-encapsulating nanoparticles of the present invention can be used to specifically label biological substances to be labeled (hereinafter sometimes referred to as “target biological substances”). A biomolecule recognition substance that functions as a substance recognition site is preferably bound to the surface. That is, the fluorescent substance-encapsulating nanoparticles of the present invention preferably have a biomolecule recognition substance on the surface. Here, in the present invention, the biological material recognition site is a site that specifically binds and / or reacts with the target biological material. In the present specification, among the fluorescent substance-containing nanoparticles according to the present invention, fluorescent substance-encapsulated nanoparticles in which a biomolecule recognition substance is bound to the surface are particularly referred to as “biomolecule recognition substance-modified fluorescent substance-containing nanoparticles”. Sometimes called.
本発明で用いられる生体分子認識物質は、目的とする生体物質と特異的に結合及び/又は反応する物質である限り特に限定されるものではないが、例えば、ヌクレオチド鎖、タンパク質、抗体等が挙げられる。 The biomolecule recognition substance used in the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that specifically binds and / or reacts with the target biomaterial, and examples thereof include nucleotide chains, proteins, and antibodies. It is done.
このうち、抗体については、抗体医薬を構成する抗体を含めた各種抗体を用いることができる。ここで、本発明において、「抗体」という用語は、任意の抗体断片または誘導体を含む意味で用いられ、Fab、Fab'2、CDR、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体(ScFv)などの各種抗体を含む。 Among these, for antibodies, various antibodies including antibodies constituting antibody drugs can be used. Here, in the present invention, the term “antibody” is used to include any antibody fragment or derivative, and includes Fab, Fab ′ 2 , CDR, humanized antibody, multifunctional antibody, single chain antibody (ScFv), and the like. Including various antibodies.
具体的には、細胞表面に存在するタンパク質であるHER2に特異的に結合する抗HER2抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体(ER)に特異的に結合する抗ER抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体などがあげられる。中でも抗HER2抗体および抗ER抗体を、蛍光物質内包ナノ粒子に結合させたものが乳がんの投薬選定に用いることができ好ましい。 Specifically, an anti-HER2 antibody that specifically binds to HER2, which is a protein present on the cell surface, an anti-ER antibody that specifically binds to an estrogen receptor (ER) present in the cell nucleus, and actin that forms a cytoskeleton And an anti-actin antibody that specifically binds to. Of these, anti-HER2 antibody and anti-ER antibody combined with fluorescent substance-encapsulated nanoparticles are preferable because they can be used for selection of breast cancer dosage.
また、「目的とする生体物質」(すなわち、本発明の蛍光物質内包ナノ粒子による標識化の対象とする生体物質)は、特に限定されるものではないが、多くの場合、抗原抗体反応を通じて標識化が行われることから、上記生体分子認識物質に対する抗原として機能するものが挙げられる。 Further, the “target biological substance” (that is, the biological substance to be labeled with the fluorescent substance-encapsulating nanoparticles of the present invention) is not particularly limited, but in many cases, it is labeled through an antigen-antibody reaction. Therefore, those that function as an antigen for the biomolecule recognition substance can be mentioned.
本発明において、「抗原」という用語は、生体物質、特に、分子または分子断片を指すものであり、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸(一本鎖であっても二本鎖であってもよいDNA、RNA、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、PNA(ペプチド核酸)等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子)、タンパク質(ポリペプチド、オリゴペプチド等)、アミノ酸(修飾アミノ酸も含む。)、糖質(オリゴ糖、多糖類、糖鎖等)、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。例えば、抗がん剤として用いられる抗体医薬を抗体として用いる場合、がんの増殖制御因子,転移制御因子,増殖制御因子受容体および転移制御因子受容体等が好適な標的抗原として挙げられる。また、がんに関連する抗原以外に、TNF−α(Tumor Necrosis Factor α),IL−6(Interleukin-6)受容体などの炎症性サイトカイン、RSV F蛋白質等のウィルス関連分子なども「目的とする生体物質」となりうる。 In the present invention, the term “antigen” refers to a biological substance, in particular, a molecule or molecular fragment. Examples of such “molecule” or “molecular fragment” include nucleic acids (single-stranded, DNA, RNA, polynucleotide, oligonucleotide, PNA (peptide nucleic acid) etc., or nucleoside, nucleotide and their modified molecules), protein (polypeptide, oligopeptide etc.), amino acid (modified) Amino acids are also included), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or modified molecules or complexes thereof, such as tumor markers, signaling substances, hormones, etc. There may be, and it is not specifically limited. For example, when an antibody drug used as an anticancer agent is used as an antibody, cancer growth control factors, metastasis control factors, growth control factor receptors, metastasis control factor receptors, and the like are suitable target antigens. In addition to antigens related to cancer, inflammatory cytokines such as TNF-α (Tumor Necrosis Factor α) and IL-6 (Interleukin-6) receptor, virus-related molecules such as RSV F protein, etc. Can be a biological material.
例えば、HER2等の、細胞増殖因子およびその受容体や、エストロゲン受容体(ER)が「目的とする生体物質」として好適に用いられる。
上記生体分子認識物質と蛍光物質内包ナノ粒子との結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
For example, cell growth factors such as HER2 and their receptors, and estrogen receptor (ER) are preferably used as the “target biological substance”.
The mode of binding between the biomolecule recognition substance and the fluorescent substance-encapsulating nanoparticles is not particularly limited, and examples thereof include covalent bonding, ionic bonding, hydrogen bonding, coordination bonding, physical adsorption, and chemical adsorption. A bond having a strong bonding force such as a covalent bond is preferable from the viewpoint of bond stability.
また生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子との間にはこれらを連結する有機分子があってもよい。例えば、生体物質との非特異的吸着を抑制するためポリエチレングリコール鎖を用いることができ、例えばThermoScientific社製 SM(PEG)12を用いることができる。 Moreover, there may be an organic molecule for linking these between the biological substance recognition site and the fluorescent substance-containing nanoparticle. For example, a polyethylene glycol chain can be used to suppress non-specific adsorption with a biological substance, and for example, SM (PEG) 12 manufactured by Thermo Scientific can be used.
蛍光物質内包シリカナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、半導体ナノ粒子の場合でも、同様の手順を適用することができる。
例えば、無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基などの官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。
When the biological substance recognition site is bound to the fluorescent substance-containing silica nanoparticles, the same procedure can be applied regardless of whether the fluorescent substance is a fluorescent organic dye or a semiconductor nanoparticle.
For example, a silane coupling agent that is a compound widely used for bonding an inorganic substance and an organic substance can be used. This silane coupling agent is a compound having an alkoxysilyl group that gives a silanol group by hydrolysis at one end of the molecule and a functional group such as a carboxyl group, an amino group, an epoxy group, an aldehyde group at the other end, Bonding with an inorganic substance through an oxygen atom of the silanol group.
具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤(例えば、Gelest社製PEG−silane no.SIM6492.7)などがあげられる。シランカップリング剤を用いる場合、1種単独で用いてもよいし2種以上を併用してもよい。 Specifically, mercaptopropyltriethoxysilane, glycidoxypropyltriethoxysilane, aminopropyltriethoxysilane, a silane coupling agent having a polyethylene glycol chain (for example, PEG-silane no. SIM6492.7 manufactured by Gelest), etc. Can be given. When using a silane coupling agent, you may use individually by 1 type and may use 2 or more types together.
なお、生体物質との非特異的吸着を抑制するために導入される上記ポリエチレングリコール鎖や、ポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤等の親水性官能基を有するシランカップリング剤は、水系分散用修飾化合物としても機能するものである。したがって、本発明の蛍光物質内包ナノ粒子における一態様では、表面に水系分散用修飾化合物が結合している。 Silane coupling agents having hydrophilic functional groups such as the polyethylene glycol chain introduced to suppress non-specific adsorption with biological materials and silane coupling agents having a polyethylene glycol chain are used for aqueous dispersion. It also functions as a modifying compound. Therefore, in one embodiment of the fluorescent substance-containing nanoparticles of the present invention, the aqueous dispersion modifying compound is bonded to the surface.
有機蛍光色素内包シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。
例えば、得られた蛍光色素内包シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で12時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光物質内包シリカナノ粒子を得ることができる。続いて、アミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し、抗体を蛍光有機色素内包シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じEDC(1−Ethyl−3−[3−Dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride:Pierce社製)のような縮合剤を用いることもできる。
A known procedure can be used for the reaction procedure of the organic fluorescent dye-encapsulated silica nanoparticles and the silane coupling agent.
For example, the obtained fluorescent dye-encapsulated silica nanoparticles are dispersed in pure water, aminopropyltriethoxysilane is added, and the mixture is reacted at room temperature for 12 hours. After completion of the reaction, fluorescent substance-encapsulated silica nanoparticles whose surface is modified with an aminopropyl group can be obtained by centrifugation or filtration. Subsequently, by reacting an amino group with a carboxyl group in the antibody, the antibody can be bound to the fluorescent organic dye-containing silica nanoparticles via an amide bond. If necessary, a condensing agent such as EDC (1-Ethyl-3- [3-Dimethylaminopropyl] carbohydrate Hydrochloride: Pierce) may be used.
必要により有機分子修飾された有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。
具体例として、アミノ基と選択的に反応する部位と、メルカプト基と選択的に反応する部位との両方をもつsulfo−SMCC(Sulfosuccinimidyl 4[N−maleimidomethyl]−cyclohexane−1−carboxylate:Pierce社製)を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基とを結合させることで、抗体結合した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子ができる。
If necessary, a linker compound having a site capable of directly binding to organic fluorescent dye-encapsulated silica nanoparticles modified with an organic molecule and a site capable of binding to a molecular target substance can be used.
As a specific example, sulfo-SMCC (Sulfosuccinimidyl 4 [N-maleimidemethyl] -cyclohexane-1-carboxylate: manufactured by Pierce, Inc.) having both a site selectively reacting with an amino group and a site reacting selectively with a mercapto group. ), The amino group of the organic fluorescent dye-encapsulated silica nanoparticles modified with aminopropyltriethoxysilane and the mercapto group in the antibody are bonded to each other to produce antibody-bound organic fluorescent dye-encapsulated silica nanoparticles.
蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、半導体ナノ粒子の場合でも、同様の手順を適用することができる。すなわち、アミノ基など官能基をもつポリスチレンナノ粒子へ蛍光有機色素または半導体ナノ粒子を含浸することにより、官能基をもつ蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子を得ることができ、以降EDCもしくはsulfo−SMCCを用いることで、抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子ができる。 When the biological substance recognition site is bound to the fluorescent substance-encapsulated polystyrene nanoparticles, the same procedure can be applied regardless of whether the fluorescent substance is a fluorescent organic dye or a semiconductor nanoparticle. That is, by impregnating fluorescent nanoparticles or semiconductor nanoparticles with polystyrene nanoparticles having a functional group such as an amino group, fluorescent substance-containing polystyrene nanoparticles having a functional group can be obtained. Thereafter, EDC or sulfo-SMCC is used. In this way, antibody-bound fluorescent substance-encapsulated polystyrene nanoparticles can be produced.
〔病理診断用蛍光標識剤〕
上述した蛍光物質内包ナノ粒子は、異なる励起/発光特性を有する第1の蛍光物質と第2の蛍光物質を内包していることから、組織の標識化処理に用いたときに、同一視野で、第1の蛍光物質から発光された蛍光を含む第1の発光画像と、第2の蛍光物質から発光された蛍光は含むが第1の蛍光物質からの蛍光を含まない第2の発光画像を撮影して、これらの発光画像に基づく演算処理を行うことにより、組織の自家蛍光によるバックグラウンドによる影響が除去された病理診断用データを与えることができる。
[Fluorescent labeling agent for pathological diagnosis]
Since the fluorescent substance-containing nanoparticles described above include the first fluorescent substance and the second fluorescent substance having different excitation / emission characteristics, when used for the tissue labeling process, A first emission image including fluorescence emitted from the first fluorescent material and a second emission image including fluorescence emitted from the second fluorescent material but not including fluorescence from the first fluorescent material are captured. Then, by performing arithmetic processing based on these luminescent images, it is possible to provide pathological diagnosis data from which the influence of the background due to the autofluorescence of the tissue is removed.
したがって、本発明では、このような蛍光物質内包ナノ粒子を含む病理診断用蛍光標識剤も提供される。ここで、本発明の病理診断用蛍光標識剤は、上述した蛍光物質内包ナノ粒子それ自体でもよく、PBSなど適当な水系溶媒に溶解または分散した形態のものでもよく、あるいは、上述した蛍光物質内包ナノ粒子に加えて、所要により、安定剤等の補助剤、製薬上許容される充填剤などのその他の成分を構成成分として含むものであってもよい。 Therefore, in the present invention, a fluorescent labeling agent for pathological diagnosis including such fluorescent substance-containing nanoparticles is also provided. Here, the fluorescent labeling agent for pathological diagnosis of the present invention may be the above-described fluorescent substance-encapsulating nanoparticles themselves, may be in a form dissolved or dispersed in an appropriate aqueous solvent such as PBS, or the above-described fluorescent substance-encapsulating agent. In addition to the nanoparticles, other components such as adjuvants such as stabilizers and pharmaceutically acceptable fillers may be included as constituents as required.
〔生体物質の測定方法〕
以下本発明に係る生体物質の測定方法について述べる。
本発明に係る生体物質の測定方法は、上述した蛍光物質内包ナノ粒子を病理診断用蛍光標識剤として用いて組織中の生体物質の測定方法に係るものであり、具体的には、
(a)上述した蛍光物質内包ナノ粒子を用いて組織を標識化処理する工程と、
(b)前記工程(a)で得られた組織について、同一視野で、第1の蛍光物質から発光された蛍光を含む第1の発光画像と、第2の蛍光物質から発光された蛍光は含むが第1の蛍光物質からの蛍光を含まない第2の発光画像を撮影する工程と、
(c)前記工程(b)で得られた前記第1の発光画像と前記第2の発光画像とを比較し、該第1の発光画像と該第2の発光画像との両方の画像において輝点として検出された画素のみを有効な輝点と認識する工程と
を含む、組織中の生体物質の測定方法に係るものである。
[Measurement method of biological material]
The biological material measurement method according to the present invention will be described below.
The method for measuring a biological material according to the present invention relates to a method for measuring a biological material in a tissue using the fluorescent substance-containing nanoparticles described above as a fluorescent labeling agent for pathological diagnosis. Specifically,
(A) a step of labeling the tissue using the fluorescent substance-containing nanoparticles described above;
(B) About the tissue obtained in the step (a), the first emission image including the fluorescence emitted from the first fluorescent substance and the fluorescence emitted from the second fluorescent substance are included in the same visual field. Taking a second emission image that does not include fluorescence from the first fluorescent material;
(C) The first light emission image and the second light emission image obtained in the step (b) are compared, and brightness is obtained in both the first light emission image and the second light emission image. The present invention relates to a method for measuring a biological material in a tissue, including a step of recognizing only pixels detected as dots as effective bright spots.
ここで、第2の蛍光物質として紫外領域に励起スペクトルを有する蛍光物質を用いる実施態様においては、上記工程(b)および(c)は、それぞれ、
(b-1)前記工程(a)で得られた組織について、同一視野で紫外線励起画像と可視光励起画像を撮影する工程、および、
(c-1)前記工程(b)で得られた前記紫外線励起画像と前記可視光励起画像とを比較し、該紫外線励起画像と該可視光励起画像との両方の画像において輝点として検出された画素のみを有効な輝点と認識する工程と
として行うことができる。この場合、可視光励起画像が第1の発光画像、紫外線励起画像が第2の発光画像にそれぞれ相当する。
Here, in the embodiment using a fluorescent material having an excitation spectrum in the ultraviolet region as the second fluorescent material, the steps (b) and (c) are respectively
(B-1) For the tissue obtained in the step (a), a step of taking an ultraviolet excitation image and a visible light excitation image in the same visual field, and
(C-1) A pixel detected as a bright spot in both the ultraviolet excitation image and the visible light excitation image by comparing the ultraviolet excitation image obtained in the step (b) with the visible light excitation image Can be performed as a process of recognizing only the effective bright spot. In this case, the visible light excitation image corresponds to the first emission image, and the ultraviolet excitation image corresponds to the second emission image.
また、第2の蛍光物質として長残光蛍光体を用いる実施態様においては、上記工程(b)および(c)は、それぞれ、
(b-2)前記工程(a)で得られた組織について、同一視野で、励起光照射時に得られる励起画像と時間分解蛍光測定により得られる残光画像とを撮影する工程、および、
(c-2)前記工程(b)で得られた前記励起画像と前記残光画像とを比較し、該励起画像と該残光画像との両方の画像において輝点として検出された画素のみを 有効な輝点と認識する工程
として行うことができる。この場合、前記励起画像が第1の発光画像、前記残光画像が第2の発光画像にそれぞれ相当する。
In the embodiment using a long afterglow phosphor as the second phosphor, the steps (b) and (c) are respectively
(B-2) For the tissue obtained in the step (a), in the same field of view, a step of photographing an excitation image obtained at the time of excitation light irradiation and an afterglow image obtained by time-resolved fluorescence measurement; and
(C-2) The excitation image obtained in the step (b) is compared with the afterglow image, and only pixels detected as bright spots in both the excitation image and the afterglow image are detected. This can be performed as a step of recognizing an effective bright spot. In this case, the excitation image corresponds to the first light emission image, and the afterglow image corresponds to the second light emission image.
1.工程(a)について
本発明の測定方法では、工程(a)として、上記記載の蛍光物質内包ナノ粒子を用いて組織を標識化処理する工程が行われる。具体的には、標識化の対象とする生体物質を認識する物質(すなわち、生体分子認識物質)が表面に結合している上記蛍光物質内包ナノ粒子を組織と反応させ、抗原抗体反応を通じてこの組織上に存在する「標識化の対象とする生体物質」を標識化する工程である。ここで、組織を標識化処理する方法は特に限定されず、従来公知の手法を用いて標識化処理を行うことができる。例えば、従来公知の細胞染色と同様の手法により、病理切片組織に対して標識化処理を行うことができる。ただ、本発明の測定方法は、病理切片組織に限らず種々の組織に適用可能である。
1. Step (a) In the measurement method of the present invention, as the step (a), a step of labeling the tissue using the fluorescent substance-containing nanoparticles described above is performed. Specifically, the fluorescent substance-encapsulating nanoparticles having a substance that recognizes a biological substance to be labeled (that is, a biomolecule recognition substance) bound to the surface react with the tissue, and this tissue is reacted through an antigen-antibody reaction. This is a step of labeling the “biological substance to be labeled” existing above. Here, the method for labeling the tissue is not particularly limited, and the labeling can be performed using a conventionally known method. For example, a labeling process can be performed on a pathological section tissue by a technique similar to that of conventionally known cell staining. However, the measurement method of the present invention is applicable not only to a pathological section tissue but also to various tissues.
本発明の測定方法が適用できる組織として用いることのできる切片の作製法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。
たとえば、病理切片として汎用されているパラフィン包埋切片を組織として用いる場合は、次のような手順で工程(a)を行えばよい。
A method for preparing a section that can be used as a tissue to which the measurement method of the present invention can be applied is not particularly limited, and a method prepared by a known method can be used.
For example, when a paraffin-embedded section that is widely used as a pathological section is used as a tissue, step (a) may be performed in the following procedure.
(1)脱パラフィン処理工程
キシレンを入れた容器に、病理切片を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
(1) Deparaffinization treatment step A pathological section is immersed in a container containing xylene to remove paraffin. The temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature. The immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, xylene may be exchanged during the immersion.
ついで、エタノールを入れた容器に病理切片を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。 Next, the pathological section is immersed in a container containing ethanol to remove xylene. The temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature. The immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, ethanol may be exchanged during the immersion.
水を入れた容器に、病理切片を浸漬させ、エタノール除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中で水を交換してもよい。 The pathological section is immersed in a container containing water and ethanol is removed. The temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature. The immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, water may be exchanged during the immersion.
(2)賦活化処理工程
公知の方法にならい、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。
賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、0.01Mクエン酸緩衝液(pH6.0)、1mMEDTA溶液(pH8.0)、5%尿素、0.1Mトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は50〜130℃、時間は5〜30分で行うことができる。
(2) Activation treatment process The activation process of the target biological substance is performed according to a known method.
The activation conditions are not particularly defined, but as the activation liquid, 0.01 M citrate buffer (pH 6.0), 1 mM EDTA solution (pH 8.0), 5% urea, 0.1 M Tris-HCl buffer, etc. are used. be able to. As the heating device, an autoclave, a microwave, a pressure cooker, a water bath, or the like can be used. The temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature. The temperature can be 50 to 130 ° C. and the time can be 5 to 30 minutes.
ついで、PBSを入れた容器に、賦活処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でPBSを交換してもよい。 Next, the section after the activation treatment is immersed in a container containing PBS and washed. The temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature. The immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, PBS may be replaced during the immersion.
(3)蛍光物質内包ナノ粒子を用いた標識化
上記蛍光物質内包ナノ粒子のPBS分散液を調製し、病理切片に載せて、検出対象とする生体物質と反応させる。このとき用いられる蛍光物質内包ナノ粒子は、予め生体物質を表面に結合させて「生体分子認識物質修飾蛍光物質内包ナノ粒子」の形態としたものを用いることが好ましい。
(3) Labeling with fluorescent substance-encapsulating nanoparticles A PBS dispersion of the fluorescent substance-encapsulating nanoparticles is prepared, placed on a pathological section, and reacted with a biological substance to be detected. The fluorescent substance-encapsulating nanoparticles used at this time are preferably used in the form of “biomolecule recognition substance-modified fluorescent substance-encapsulating nanoparticles” by previously binding a biological substance to the surface.
ここで、複数の「目的とする生体物質」に対して標識化を行う場合は、各生体物質に対応した生体分子認識物質が結合した蛍光物質内包ナノ粒子のPBS分散液をそれぞれ調製し、それらを病理切片に載せ、それぞれ目的とする生体物質との反応を行うことができる。このとき、複数の「目的とする生体物質」を互いに区別できるよう、生体分子認識物質ごとに蛍光物質内包ナノ粒子を構成する上記第1の蛍光物質及び/または第2の蛍光物質を変えてもよい。 Here, when labeling a plurality of “target biological substances”, PBS dispersions of fluorescent substance-containing nanoparticles bound with biomolecule recognition substances corresponding to each biological substance are prepared, respectively. Can be placed on a pathological section and each can react with a target biological substance. At this time, even if the first fluorescent substance and / or the second fluorescent substance constituting the fluorescent substance-containing nanoparticles are changed for each biomolecule recognition substance so that a plurality of “target biological substances” can be distinguished from each other. Good.
病理切片に載せる際に、それぞれの蛍光物質内包ナノ粒子PBS分散液をあらかじめ混合してもよいし、別々に順次載せてもよい。第1の蛍光物質を含む蛍光物質内包ナノ粒子と第2の蛍光物質を含む蛍光物質内包ナノ粒子との混合比は特に限定されるものではないが、本発明の効果が表れるには両者の比は1:1〜5:1でよい。 When placed on a pathological section, each fluorescent substance-containing nanoparticle PBS dispersion may be mixed in advance, or may be placed separately and sequentially. The mixing ratio of the fluorescent substance-containing nanoparticles containing the first fluorescent substance and the fluorescent substance-containing nanoparticles containing the second fluorescent substance is not particularly limited, but the ratio of the two is sufficient for the effect of the present invention to be exhibited. May be 1: 1 to 5: 1.
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、30分以上24時間以下であることが好ましい。なお、蛍光物質内包ナノ粒子による染色を行う前に、BSA含有PBSなど公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。 The temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature. The reaction time is preferably 30 minutes or more and 24 hours or less. In addition, it is preferable to dripping well-known blocking agents, such as BSA containing PBS, before dyeing | staining with a fluorescent substance inclusion nanoparticle.
ついで、PBSを入れた容器に、染色後の切片を浸漬させ、未反応蛍光物質内包ナノ粒子の除去を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でPBSを交換してもよい。
組織の形態観察のため、ヘマトキシリン−エオジン染色を行ってもよい。
カバーガラスを切片に載せ、封入する。必要に応じて市販封入剤を使用してもよい。
Next, the stained section is immersed in a container containing PBS to remove unreacted fluorescent substance-containing nanoparticles. The temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature. The immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, PBS may be replaced during the immersion.
Hematoxylin-eosin staining may be performed for tissue morphology observation.
A cover glass is placed on the section and sealed. A commercially available mounting agent may be used as needed.
2.工程(b)について
本発明の測定方法では、工程(b)として、上記工程(a)で得られた組織について、同一視野で、第1の蛍光物質から発光された蛍光を含む第1の発光画像と、第2の蛍光物質から発光された蛍光は含むが第1の蛍光物質からの蛍光を含まない第2の発光画像を撮影する工程が行われる。
2. Step (b) In the measurement method of the present invention, as the step (b), the first luminescence containing the fluorescence emitted from the first fluorescent substance in the same field of view for the tissue obtained in the step (a). A step of capturing a second light-emitting image including the image and the fluorescence emitted from the second fluorescent material but not including the fluorescence from the first fluorescent material is performed.
本発明において、第1の発光画像および第2の発光画像は、蛍光顕微鏡を用いて取得することができ、共焦点顕微鏡を用いて三次元情報を含む画像の形で取得することもできる。この第1の発光画像および第2の発光画像を撮影する際には、用いた蛍光物質内包ナノ粒子を構成する蛍光物質の吸収極大波長および蛍光波長に対応した励起光源および蛍光検出用光学フィルターを選択する。 In the present invention, the first luminescent image and the second luminescent image can be acquired using a fluorescence microscope, and can also be acquired in the form of an image including three-dimensional information using a confocal microscope. When the first light emission image and the second light emission image are taken, an excitation light source and a fluorescence detection optical filter corresponding to the absorption maximum wavelength and the fluorescence wavelength of the fluorescent material constituting the fluorescent material-containing nanoparticles are used. select.
ここで、第2の蛍光物質として紫外領域に励起スペクトルを有する蛍光物質を用いる実施態様においては、工程(b)を、前記工程(a)で得られた組織について、同一視野で紫外線励起画像と可視光励起画像を撮影する工程として行うことができる。この場合、第1の発光画像を、励起光として可視光を用いて撮影するとともに、これと同一視野のもとで、第2の発光画像を、励起光として紫外光を用いて撮影することになる。ここで励起光として用いられる可視光は、具体的には400nm以上700nm以下の範囲にある光であり、紫外光は、400nm未満の光、より実用的には200nm以上400nm未満の範囲にある光である。そして、第1の発光画像および第2の発光画像は、励起光の影響を受けない限りにおいて可視領域から近赤外領域にかけての範囲、より具体的には、400nm以上900nm以下の波長範囲で取得することができる。 Here, in an embodiment in which a fluorescent material having an excitation spectrum in the ultraviolet region is used as the second fluorescent material, the step (b) is the same as the ultraviolet excitation image in the same field for the tissue obtained in the step (a). This can be performed as a step of capturing a visible light excitation image. In this case, the first emission image is taken using visible light as excitation light, and the second emission image is taken using ultraviolet light as excitation light in the same field of view. Become. Here, the visible light used as the excitation light is specifically light in the range of 400 nm to 700 nm, and the ultraviolet light is light in the range of less than 400 nm, more practically in the range of 200 nm to less than 400 nm. It is. The first emission image and the second emission image are acquired in the range from the visible region to the near infrared region, more specifically in the wavelength range from 400 nm to 900 nm, as long as they are not affected by the excitation light. can do.
また、第2の蛍光物質として紫外領域に励起スペクトルを有する蛍光物質を用いる実施態様においては、工程(b)を、前記工程(a)で得られた組織について、同一視野で、励起光照射時に得られる励起画像と時間分解蛍光測定により得られる残光画像とを撮影する工程として行うことができる。この場合、励起光存在下で第1の発光画像を撮影した後、励起光を消灯して一定時間経過後(例えば、励起光を消灯して100マイクロナノ秒から10ミリ秒後)に、当該第1の発光画像と同一視野で第2の発光画像を撮影することになる。 In an embodiment using a fluorescent material having an excitation spectrum in the ultraviolet region as the second fluorescent material, the step (b) is performed in the same field of view with the excitation light irradiation for the tissue obtained in the step (a). This can be performed as a step of photographing the obtained excitation image and the afterglow image obtained by time-resolved fluorescence measurement. In this case, after taking the first emission image in the presence of excitation light, the excitation light is extinguished and a certain time elapses (for example, after the excitation light is extinguished and after 100 micron to 10 milliseconds), The second light emission image is taken with the same field of view as the first light emission image.
3.工程(c)について
本発明の測定方法では、工程(c)として、上記工程(b)で得られた前記第1の発光画像と前記第2の発光画像とを比較し、該第1の発光画像と該第2の発光画像との両方の画像において輝点として検出された画素のみを有効な輝点と認識する工程が行われる。
3. Step (c) In the measurement method of the present invention, as the step (c), the first light emission image obtained in the step (b) is compared with the second light emission image, and the first light emission. A step of recognizing only pixels detected as bright spots in both the image and the second light emission image as effective bright spots is performed.
具体的には、
(i) 上記工程(b)で得られた第1の発光画像および第2の発光画像のそれぞれについて輝点数及び/または発光輝度を計測し、
(ii) 第1の発光画像上の各ピクセルと第2の発光画像上の対応する各ピクセルとを対比して、第1の発光画像と第2の発光画像との両方において発光が認められたピクセルについては有効な輝点としてカウントして足し合わせ、そうでないピクセルについては輝点としてカウントしない演算処理を行うことにより解析輝点データを得る
工程が行われる。
In particular,
(i) Measure the number of bright spots and / or emission luminance for each of the first emission image and the second emission image obtained in the step (b),
(ii) Light emission was recognized in both the first light emission image and the second light emission image by comparing each pixel on the first light emission image with each corresponding pixel on the second light emission image. The pixel is counted as an effective bright spot and added, and a process for obtaining the analytical bright spot data is performed by performing a calculation process that does not count the bright pixel as a bright spot.
このような工程を得ることで、組織の自家蛍光によるバックグラウンドのノイズを除去することができるので、S/N比の高い輝点データを得ることができ、診断精度を向上させることができるのである。 By obtaining such a process, background noise due to tissue autofluorescence can be removed, so that bright spot data with a high S / N ratio can be obtained and diagnostic accuracy can be improved. is there.
そして、このような工程により得られた解析輝点データにおける輝点の数または発光輝度をもとに、目的とする生体物質の発現レベルを計測することができる。
輝点数または発光輝度の計測は、市販画像解析ソフト、例えば株式会社ジーオングストローム社製全輝点自動計測ソフトG-Countを用いて行うことができる。
And the expression level of the target biological substance can be measured based on the number of bright spots or light emission luminance in the analytical bright spot data obtained by such a process.
The measurement of the number of bright spots or emission luminance can be performed using commercially available image analysis software, for example, G-Count, a total bright spot automatic measurement software manufactured by G. Angstrom.
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
各蛍光体の残光時間はPTI−3000(大塚電子株式会社製)を用いて1/10残光時間を測定した。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these.
The afterglow time of each phosphor was measured by 1/10 afterglow time using PTI-3000 (manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.).
[合成例1−1:Cy5内包シリカナノ粒子の合成]
下記工程(1)〜(4)の方法により、「ナノ粒子A1」を作製した。
工程(1):Cy5のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体(GEヘルスケア社製)1mg(0.00126mmol)とテトラエトキシシラン 400μL(1.796mmol)とを混合した。
工程(2):エタノール40mL、14%アンモニア水10mLを混合した。
工程(3):工程(2)で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程(1)で調製した混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。
工程(4):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
得られたシリカナノ粒子A1の走査型電子顕微鏡(SEM;日立社製S−800型)観察を行ったところ、平均粒径は110nm、変動係数は12%であった。
[Synthesis Example 1-1: Synthesis of Cy5-encapsulated silica nanoparticles]
“Nanoparticles A1” were produced by the methods of the following steps (1) to (4).
Step (1): 1 mg (0.00126 mmol) of N-hydroxysuccinimide ester derivative of Cy5 (manufactured by GE Healthcare) and 400 μL (1.796 mmol) of tetraethoxysilane were mixed.
Step (2): Ethanol 40 mL and 14% aqueous ammonia 10 mL were mixed.
Step (3): The mixture prepared in Step (1) was added to the mixture prepared in Step (2) while stirring at room temperature. Stirring was performed for 12 hours from the start of addition.
Step (4): The reaction mixture was centrifuged at 10,000 G for 60 minutes, and the supernatant was removed. Ethanol was added to disperse the sediment and centrifuged again. In the same procedure, washing with ethanol and pure water was performed once.
When the obtained silica nanoparticle A1 was observed with a scanning electron microscope (SEM; Hitachi S-800 type), the average particle size was 110 nm and the coefficient of variation was 12%.
[合成例1−2:Cy5内包ポリスチレンナノ粒子の合成]
下記工程(1)〜(3)の方法により、「ナノ粒子A2」を作製した。
工程(1):Cy5のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体(GEヘルスケア社製)1mg(0.00126mmol)、ジクロロメタン60μL、エタノール120μLに溶解させた
工程(2):アミノ基を表面官能基として有するポリスチレンナノ粒子(粒径100nm)の水分散液(micromod社製)1.5mLを激しく撹拌しているところに、工程(1)で作製した混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。
工程(3):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を1回ずつ行った。
得られたポリスチレンナノ粒子A2のSEM観察を行ったところ、平均粒径は100nm、変動係数は6%であった。
[Synthesis Example 1-2: Synthesis of Cy5-encapsulated polystyrene nanoparticles]
“Nanoparticles A2” were produced by the methods of the following steps (1) to (3).
Step (1): Cy5 N-hydroxysuccinimide ester derivative (GE Healthcare) 1 mg (0.00126 mmol), dichloromethane 60 μL, ethanol 120 μL Step (2): Polystyrene having amino group as surface functional group The mixture prepared in step (1) was added to 1.5 mL of a nanoparticle (particle size: 100 nm) aqueous dispersion (manufactured by micromod) while vigorously stirring. Stirring was performed for 12 hours from the start of addition.
Step (3): The reaction mixture was centrifuged at 10,000 G for 60 minutes, and the supernatant was removed. Ethanol was added to disperse the sediment and centrifuged again. Washing with ethanol and pure water was performed once by the same procedure.
When SEM observation of the obtained polystyrene nanoparticles A2 was performed, the average particle size was 100 nm and the coefficient of variation was 6%.
[合成例1−3:蛍光有機色素内包メラミンナノ粒子形成]
下記工程の方法により、「ナノ粒子A3」を作製した。
450gの水とCy5(GEヘルスケア社製)1mg(0.00126mmol)を70℃に温める。樹脂(15mgのMadurit SMW818)を50gの水中において攪拌し、70℃にて添加する。溶液は澄明なままである。温度を再び70℃に上げ、2μlの98〜100%ギ酸を添加し、混合物の攪拌をこの温度にてさらに20分間行う。約1分の後、バッチは僅かな濁りを示した。その後、限外濾過(30キロダルトンのメンブラン)による精製を行ったところ、メラミンナノ粒子A3が得られた。
得られた粒子群の平均粒子径は約46nmであることが、走査電子顕微鏡による測定で確認された。
[Synthesis Example 1-3: Formation of fluorescent organic dye-encapsulated melamine nanoparticles]
“Nanoparticles A3” were produced by the following method.
450 g of water and 1 mg (0.00126 mmol) of Cy5 (manufactured by GE Healthcare) are warmed to 70 ° C. Resin (15 mg of Madurit SMW818) is stirred in 50 g of water and added at 70 ° C. The solution remains clear. The temperature is raised again to 70 ° C., 2 μl of 98-100% formic acid is added and the mixture is stirred for a further 20 minutes at this temperature. After about 1 minute, the batch showed a slight turbidity. Then, when refinement | purification by ultrafiltration (30 kilodalton membrane) was performed, the melamine nanoparticle A3 was obtained.
It was confirmed by measurement with a scanning electron microscope that the average particle size of the obtained particle group was about 46 nm.
[合成例2−1:InP/ZnS QDの合成]
下記工程の方法により、「無機蛍光体ナノ粒子a」を作製した。
ミリスチン酸インジウム 0.1mmol、
ステアリン酸0.1mmol、
トリメチルシリルフォスフィン 0.1mmmol、
ドデカンチオール 0.1mmol、
ウンデシレン酸亜鉛 0.1mmol
を、オクタデセン8mlとともに三口フラスコに入れ、窒素雰囲気下で還流を行いながら300℃1時間加熱した。室温に下げた後、メルカプトプロピオン酸0.01gを添加して2時間撹拌したところ、無機蛍光体ナノ粒子aとして、発光ピーク波長670nm、濃度3.0 InPMのInP/ZnS半導体ナノ粒子溶液を得た。
[Synthesis Example 2-1: Synthesis of InP / ZnS QD]
“Inorganic phosphor nanoparticles a” were prepared by the following process.
Indium myristate 0.1 mmol,
Stearic acid 0.1 mmol,
Trimethylsilylphosphine 0.1 mmol,
0.1 mmol of dodecanethiol,
Zinc undecylenate 0.1mmol
Was placed in a three-necked flask together with 8 ml of octadecene and heated at 300 ° C. for 1 hour while refluxing in a nitrogen atmosphere. After lowering to room temperature, 0.01 g of mercaptopropionic acid was added and stirred for 2 hours. As a result, an InP / ZnS semiconductor nanoparticle solution having an emission peak wavelength of 670 nm and a concentration of 3.0 InPM was obtained as inorganic phosphor nanoparticle a. .
[合成例2−2:CdSe/ZnS QDの合成]
下記工程の方法により、「無機蛍光体ナノ粒子b」を作製した。
Se粉末(0.7896g)を、トリオクチルホスフィン(TOP、7.4g)へ添加し、混合物を150℃まで加熱して(窒素気流下)、TOP−Seストック溶液を作成した。
[Synthesis Example 2-2: Synthesis of CdSe / ZnS QD]
“Inorganic phosphor nanoparticles b” were produced by the method of the following steps.
Se powder (0.7896 g) was added to trioctylphosphine (TOP, 7.4 g) and the mixture was heated to 150 ° C. (under a nitrogen stream) to make a TOP-Se stock solution.
別途、CdO(0.450g)及びステアリン酸(8g)をアルゴン雰囲気下、三口フラスコ中で150℃まで加熱した。CdOが溶解した後、溶液を室温まで冷却した。前記溶液に、トリオクチルホスフィンオキサイド(TOPO、8g)、及び1−ヘプタデシル−オクタデシルアミン(HDA、12g)を添加し、混合物を再び150℃まで加熱し、ここで、TOP-ストック溶液を素早く添加する。そののちチャンバーの温度を220℃まで加熱し、さらに一定の速度で、120分かけて250℃まで上昇させた。その後、温度を100℃まで下げ、酢酸亜鉛二水和物を添加撹拌し溶解させたのち、ヘキサメチルジシリルチアンのトリオクチルフォスフィン溶液を滴下し、数時間撹拌を続けて反応を終了した。室温に下げた後、メルカプトプロピオン酸0.01gを添加して1時間20撹拌したのち、洗浄し、純水中に再分散したところ、無機蛍光体ナノ粒子bとして、発光ピーク波長670nm、濃度3.0 CdMのCdSe/ZnS半導体ナノ粒子溶液を得た。 Separately, CdO (0.450 g) and stearic acid (8 g) were heated to 150 ° C. in a three-necked flask under an argon atmosphere. After CdO dissolved, the solution was cooled to room temperature. To the solution is added trioctylphosphine oxide (TOPO, 8 g) and 1-heptadecyl-octadecylamine (HDA, 12 g) and the mixture is again heated to 150 ° C., where the TOP-stock solution is quickly added. . Thereafter, the temperature of the chamber was heated to 220 ° C., and further increased to 250 ° C. over 120 minutes at a constant rate. Thereafter, the temperature was lowered to 100 ° C., zinc acetate dihydrate was added and stirred for dissolution, and then a trioctylphosphine solution of hexamethyldisilylthiane was added dropwise, and stirring was continued for several hours to complete the reaction. After the temperature was lowered to room temperature, 0.01 g of mercaptopropionic acid was added and stirred for 1 hour 20 hours, then washed and redispersed in pure water. A 0 CdM CdSe / ZnS semiconductor nanoparticle solution was obtained.
[合成例2−3:Si/SiO2半導体ナノ粒子の合成
下記工程の方法により、「無機蛍光体ナノ粒子c」を作製した。
Si半導体ナノ粒子
モノシランガス0.5リットル/min、窒素ガス19.45リットル/minの混合ガスを温度700℃、圧力50KPaで保持した石英ガラス製の反応管に導入し0.5時間反応させた。このとき反応管の下部に粉末が形成した。
[Synthesis Example 2-3: Synthesis of Si / SiO 2 Semiconductor Nanoparticles] “Inorganic phosphor nanoparticles c” were produced by the following method.
A mixed gas of Si semiconductor nanoparticle monosilane gas 0.5 liter / min and nitrogen gas 19.45 liter / min was introduced into a reaction tube made of quartz glass held at a temperature of 700 ° C. and a pressure of 50 KPa, and reacted for 0.5 hour. At this time, powder formed in the lower part of the reaction tube.
反応管を窒素ガスで置換し、大気圧とした。反応管を回転させながら粉末を1時間1100℃で加熱した。
その後、降温時に800℃で空気を20リットル/minで10分間導入したのち、再度窒素置換を行い、反応管を冷却した。
The reaction tube was replaced with nitrogen gas to atmospheric pressure. The powder was heated at 1100 ° C. for 1 hour while rotating the reaction tube.
Thereafter, air was introduced at 800 ° C. at 20 liter / min for 10 minutes when the temperature was lowered, and then nitrogen replacement was performed again to cool the reaction tube.
反応管を室温まで冷却した後、粉末1mgに対して100mlの純水、0.5mgのメルカプトウンデカン酸を添加し40℃で10分間攪拌し、Siコア/SiO2シェル組成をもつ 無機蛍光体ナノ粒子cを得た。 After cooling the reaction tube to room temperature, 100 ml of pure water and 0.5 mg of mercaptoundecanoic acid are added to 1 mg of powder and stirred for 10 minutes at 40 ° C. Inorganic phosphor nanoparticles with Si core / SiO 2 shell composition c was obtained.
[合成例3−1:(Y,Gd)BO3:Eu3+内包ナノ粒子合成]
まず、下記の組成を有するA〜D液を調製した:
A液:低分子ゼラチン15%溶液1000cc;
B液:水500ccに硝酸イットリウム6水和物0.156mol、硝酸ガドリニウム0.90molを溶解した液;
C液:硝酸ユーロピウム0.0065molを水50ccに溶解した液;
D液:水500ccにほう酸0.123molを溶解した液。
[Synthesis Example 3-1: Synthesis of (Y, Gd) BO 3 : Eu 3+ Encapsulated Nanoparticles]
First, liquids A to D having the following compositions were prepared:
Liquid A: Low molecular weight gelatin 15% solution 1000 cc;
Liquid B: a liquid obtained by dissolving 0.156 mol of yttrium nitrate hexahydrate and 0.90 mol of gadolinium nitrate in 500 cc of water;
C liquid: a solution obtained by dissolving 0.0065 mol of europium nitrate in 50 cc of water;
Liquid D: A liquid obtained by dissolving 0.123 mol of boric acid in 500 cc of water.
上記A液を60℃で激しく攪拌させ、その中に同じく60℃に保ったB,C,D液を4分間かけて同時に各々等速で添加を行なった。A液中に形成した白色沈殿をろ過、乾燥の後、1400℃大気中で2時間焼成したところ、ナノ粒子dを得た。 The solution A was vigorously stirred at 60 ° C., and the solutions B, C and D, which were also kept at 60 ° C., were simultaneously added at a constant rate over 4 minutes. The white precipitate formed in the liquid A was filtered, dried, and then baked in the atmosphere at 1400 ° C. for 2 hours to obtain nanoparticles d.
[合成例3−2:Zn2SiO4:Mn2+内包ナノ粒子の合成]
まず、下記の組成を有するA〜D液を調製した:
A液:低分子ゼラチン15%水溶液1000cc;
B液:硝酸亜鉛6水和物35.33gと、硝酸マンガン6水和物1.79gを純水に溶解し、500ccとした液;
C液:28%アンモニア水18.25gを純水と混合し500ccとした液;
D液:クラリアントジャパン社製コロイダルシリカ30R25粒径20nm30%溶液12.52gを純水と混合し200ccとした液。
[Synthesis Example 3-2: Synthesis of Zn 2 SiO 4 : Mn 2+ Encapsulating Nanoparticles]
First, liquids A to D having the following compositions were prepared:
Liquid A: Low molecular gelatin 15% aqueous solution 1000 cc;
Liquid B: A solution prepared by dissolving 35.33 g of zinc nitrate hexahydrate and 1.79 g of manganese nitrate hexahydrate in pure water to make 500 cc;
Liquid C: Liquid in which 18.25 g of 28% ammonia water was mixed with pure water to make 500 cc;
Liquid D: Liquid obtained by mixing 12.52 g of a colloidal silica 30R25 particle size 20 nm 30% solution 12.52 g manufactured by Clariant Japan with pure water to make 200 cc.
室温において、A液を激しく攪拌した中に、B液とC液を30分間かけて等速で添加したところ、白色の沈殿が生じた。続けてD液を4分間かけてA液中に添加した後、加圧ろ過法により固液分離を行った。次いで、回収されたケーキを100℃24Hr乾燥し、乾燥済み前駆体を得た。得られた前駆体を大気中で700℃3hr焼成後、さらに窒素100%の雰囲気中で1200℃、3時間焼成してナノ粒子eを得た。 While liquid A was vigorously stirred at room temperature, liquid B and liquid C were added at a constant rate over 30 minutes. As a result, a white precipitate was formed. Subsequently, after adding D liquid in A liquid over 4 minutes, solid-liquid separation was performed by the pressure filtration method. Next, the recovered cake was dried at 100 ° C. for 24 hours to obtain a dried precursor. The obtained precursor was calcined at 700 ° C. for 3 hours in the air, and further calcined at 1200 ° C. for 3 hours in an atmosphere of 100% nitrogen to obtain nanoparticles e.
[合成例4−1:蛍光有機色素、無機蛍光体ナノ粒子内包シリカナノ粒子の合成]
下記工程(1)〜(3)の方法により、「ナノ粒子A4」を作製した。
工程(1):Cy5のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体(GEヘルスケア社製)1mg(0.00126mmol)、無機蛍光体ナノ粒子a 0.00126μmol、およびテトラエトキシシラン 400μL(1.796mmol)を混合した。
工程(2):エタノール40mLと14%アンモニア水10mLとの混合液を室温下撹拌しているところに、工程(1)で調製した混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。
工程(3):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
得られたシリカナノ粒子A4の走査型電子顕微鏡(SEM;日立社製S−800型)観察を行ったところ、平均粒径は110nm、変動係数は12%であった。
[Synthesis Example 4-1: Synthesis of Fluorescent Organic Dye and Inorganic Phosphor Nanoparticle Encapsulated Silica Nanoparticle]
“Nanoparticles A4” were produced by the following steps (1) to (3).
Step (1): Cy5 N-hydroxysuccinimide ester derivative (manufactured by GE Healthcare) 1 mg (0.00126 mmol), inorganic phosphor nanoparticles a 0.00126 μmol, and tetraethoxysilane 400 μL (1.796 mmol) were mixed. .
Step (2): The mixture prepared in Step (1) was added to a mixture of 40 mL of ethanol and 10 mL of 14% aqueous ammonia at room temperature. Stirring was performed for 12 hours from the start of addition.
Step (3): The reaction mixture was centrifuged at 10,000 G for 60 minutes, and the supernatant was removed. Ethanol was added to disperse the sediment and centrifuged again. In the same procedure, washing with ethanol and pure water was performed once.
When the obtained silica nanoparticle A4 was observed with a scanning electron microscope (SEM; Hitachi S-800 type), the average particle size was 110 nm and the coefficient of variation was 12%.
[合成例4−2:蛍光有機色素、無機蛍光体ナノ粒子内包ポリスチレンナノ粒子合成]
下記工程(1)〜(3)の方法により、「ナノ粒子A5」を作製した。
工程(1):Cy5のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体(GEヘルスケア社製)1mg(0.00126mmol)、および、エタノールに分散させた無機蛍光体ナノ粒子b0.00126μmol、ジクロロメタン60μL、エタノール120μLに溶解させた。
工程(2):表面官能基アミノ基で粒径100nmポリスチレンナノ粒子水分散液(micromod社製)1.5mLを激しく撹拌しているところに、工程(1)で作製した混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。
工程(3):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を1回ずつ行った。
得られたポリスチレンナノ粒子A5のSEM観察を行ったところ、平均粒径は100nm、変動係数は6%であった。
[Synthesis Example 4-2: Synthesis of Fluorescent Organic Dye, Inorganic Phosphor Nanoparticle-Incorporated Polystyrene Nanoparticle]
“Nanoparticles A5” were produced by the methods of the following steps (1) to (3).
Step (1): 1 mg (0.00126 mmol) of N-hydroxysuccinimide ester derivative of Cy5 (manufactured by GE Healthcare) and inorganic phosphor nanoparticles b0.00126 μmol dispersed in ethanol, dissolved in 60 μL of dichloromethane, and 120 μL of ethanol I let you.
Step (2): The liquid mixture prepared in Step (1) was added to 1.5 mL of a polystyrene nanoparticle aqueous dispersion (manufactured by micromod) having a surface functional group amino group and vigorously stirred. Stirring was performed for 12 hours from the start of addition.
Step (3): The reaction mixture was centrifuged at 10,000 G for 60 minutes, and the supernatant was removed. Ethanol was added to disperse the sediment and centrifuged again. Washing with ethanol and pure water was performed once by the same procedure.
When SEM observation of the obtained polystyrene nanoparticles A5 was performed, the average particle size was 100 nm and the coefficient of variation was 6%.
[合成例4−3:蛍光有機色素、無機蛍光体メラミンナノ粒子合成]
下記工程の方法により、「ナノ粒子A6」を作製した。
450gの水とCy5(GEヘルスケア社製)1mg(0.00126mmol)、無機蛍光体ナノ粒子c0.00126μmolを70℃に温める。樹脂(15mgのMadurit SMW818)を50gの水中において攪拌し、70℃にて添加する。溶液は澄明なままである。温度を再び70℃に上げ、2μlの98〜100%ギ酸を添加し、混合物の攪拌をこの温度にてさらに20分間行う。約1分の後、バッチは僅かな濁りを示した。その後、限外濾過(30キロダルトンのメンブラン)による精製を行ったところ、メラミンナノ粒子A6が得られた。得られた粒子群の平均粒子径は約46nmであることが、走査電子顕微鏡による測定で確認された。
[Synthesis Example 4-3: Synthesis of fluorescent organic dye and inorganic phosphor melamine nanoparticles]
“Nanoparticles A6” were produced by the method of the following step.
450 g of water, 1 mg (0.00126 mmol) of Cy5 (manufactured by GE Healthcare), and 0.00126 μmol of inorganic phosphor nanoparticles c are warmed to 70 ° C. Resin (15 mg of Madurit SMW818) is stirred in 50 g of water and added at 70 ° C. The solution remains clear. The temperature is raised again to 70 ° C., 2 μl of 98-100% formic acid is added and the mixture is stirred for a further 20 minutes at this temperature. After about 1 minute, the batch showed a slight turbidity. Then, when refinement | purification by ultrafiltration (30 kilodalton membrane) was performed, the melamine nanoparticle A6 was obtained. It was confirmed by measurement with a scanning electron microscope that the average particle size of the obtained particle group was about 46 nm.
[合成例5−1:蛍光有機色素、無機蛍光体ナノ粒子内包シリカナノ粒子合成]
下記工程(1)〜(3)の方法により、「ナノ粒子A7」を作製した。
工程(1):Cy5のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体(GEヘルスケア社製)1mg(0.00126mmol)、エタノールに分散させたナノ粒子d 0.00126μmol、およびテトラエトキシシラン 400μL(1.796mmol)とを混合した。
工程(2):エタノール40mLと14%アンモニア水10mLとの混合液を室温下撹拌しているところに、工程(1)で調製した混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。
工程(3):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
得られたシリカナノ粒子A7の走査型電子顕微鏡(SEM;日立社製S−800型)観察を行ったところ、平均粒径は110nm、変動係数は12%であった。
[Synthesis Example 5-1: Synthesis of fluorescent organic dye, silica nanoparticles encapsulating inorganic phosphor nanoparticles]
“Nanoparticles A7” were produced by the methods of the following steps (1) to (3).
Step (1): 1 mg (0.00126 mmol) of N-hydroxysuccinimide ester derivative of Cy5 (manufactured by GE Healthcare), 0.00126 μmol of nanoparticles d dispersed in ethanol, and 400 μL (1.796 mmol) of tetraethoxysilane Were mixed.
Step (2): The mixture prepared in Step (1) was added to a mixture of 40 mL of ethanol and 10 mL of 14% aqueous ammonia at room temperature. Stirring was performed for 12 hours from the start of addition.
Step (3): The reaction mixture was centrifuged at 10,000 G for 60 minutes, and the supernatant was removed. Ethanol was added to disperse the sediment and centrifuged again. In the same procedure, washing with ethanol and pure water was performed once.
When the obtained silica nanoparticle A7 was observed with a scanning electron microscope (SEM; Hitachi S-800 type), the average particle size was 110 nm and the coefficient of variation was 12%.
[合成例5−2:蛍光有機色素、無機蛍光体ナノ粒子内包ポリスチレンナノ粒子合成]
下記工程(1)〜(3)の方法により、「ナノ粒子A8」を作製した。
工程(1):Cy5のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体(GEヘルスケア社製)1mg(0.00126mmol)、および、エタノールに分散させた無機蛍光体ナノ粒子b0.00126μmol、ジクロロメタン60μL、エタノール120μLに溶解させた
工程(2):表面官能基アミノ基で粒径100nmポリスチレンナノ粒子水分散液(micromod社製)1.5mLを激しく撹拌しているところに、工程(1)で作製した混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。
工程(3):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を1回ずつ行った。
得られたポリスチレンナノ粒子A8のSEM観察を行ったところ、平均粒径は100nm、変動係数は6%であった。
[Synthesis Example 5-2: Synthesis of Fluorescent Organic Dye, Inorganic Phosphor Nanoparticle-Incorporated Polystyrene Nanoparticle]
“Nanoparticles A8” were produced by the methods of the following steps (1) to (3).
Step (1): 1 mg (0.00126 mmol) of N-hydroxysuccinimide ester derivative of Cy5 (manufactured by GE Healthcare) and inorganic phosphor nanoparticles b0.00126 μmol dispersed in ethanol, dissolved in 60 μL of dichloromethane, and 120 μL of ethanol Step (2): The mixture prepared in Step (1) was added to a vigorously stirred 1.5 mL polystyrene nanoparticle aqueous dispersion (made by micromod) with a surface functional group amino group. did. Stirring was performed for 12 hours from the start of addition.
Step (3): The reaction mixture was centrifuged at 10,000 G for 60 minutes, and the supernatant was removed. Ethanol was added to disperse the sediment and centrifuged again. Washing with ethanol and pure water was performed once by the same procedure.
When SEM observation of the obtained polystyrene nanoparticles A8 was performed, the average particle size was 100 nm and the coefficient of variation was 6%.
[合成例5−3:蛍光有機色素、無機蛍光体メラミンナノ粒子]
下記工程の方法により、「ナノ粒子A9」を作製した。
450gの水とCy5(GEヘルスケア社製)1mg(0.00126mmol)、無機蛍光ナノ粒子a0.00126μmolを70℃に温める。樹脂(15mgのMadurit SMW818)を50gの水中において攪拌し、70℃にて添加する。溶液は澄明なままである。温度を再び70℃に上げ、2μlの98〜100%ギ酸を添加し、混合物の攪拌をこの温度にてさらに20分間行う。約1分の後、バッチは僅かな濁りを示した。その後、限外濾過(30キロダルトンのメンブラン)による精製を行ったところ、メラミンナノ粒子A9が得られた。生成の後に得られた粒子群の平均粒子径は約46nmであることが、走査電子顕微鏡による測定により確認された。
[Synthesis Example 5-3: Fluorescent Organic Dye, Inorganic Phosphor Melamine Nanoparticle]
“Nanoparticles A9” were produced by the following method.
450 g of water, 1 mg (0.00126 mmol) of Cy5 (manufactured by GE Healthcare), and inorganic fluorescent nanoparticles a0.00126 μmol are warmed to 70 ° C. Resin (15 mg of Madurit SMW818) is stirred in 50 g of water and added at 70 ° C. The solution remains clear. The temperature is raised again to 70 ° C., 2 μl of 98-100% formic acid is added and the mixture is stirred for a further 20 minutes at this temperature. After about 1 minute, the batch showed a slight turbidity. Then, when refinement | purification by ultrafiltration (30 kilodalton membrane) was performed, the melamine nanoparticle A9 was obtained. It was confirmed by measurement with a scanning electron microscope that the average particle size of the particle group obtained after the generation was about 46 nm.
[実施例1:ナノ粒子への抗体の結合]
ナノ粒子A1〜A9に対して以下の手順により抗体結合を行った。
詳しくは、工程(1)〜(12)の操作をおこなって抗体を結合し「抗体結合粒子1〜9」を作成した。
工程(1):1mgのナノ粒子A1〜A9を純水5mLに分散させた。アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液100μLを添加し、室温で12時間撹拌した。
工程(2):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程(3):エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を1回ずつ行ったところ、ナノ粒子A1〜A9にそれぞれ対応するアミノ基修飾ナノ粒子B1〜B9がそれぞれ得られた。得られたナノ粒子B1〜B9のFT−IR測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾できたことを確認できた。
工程(4):工程(3)で得られたアミノ基修飾ナノ粒子B1〜B9を、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)を2mM含有したPBS(リン酸緩衝液生理的食塩水)を用いて3nMに調整した。
工程(5):工程(4)で調整した溶液に最終濃度10mMとなるようSM(PEG)12(サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl−[(N−maleomidopropionamid)−dodecaethyleneglycol]ester)を混合し、1時間反応させた。
工程(6):反応混合液を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程(7):EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行った。最後に500μLPBSを用い再分散させた。
工程(8):100μgの抗HER2抗体を100μLのPBSに溶解させたところに1Mジチオスレイトール(DTT)を添加し、30分反応させた。
工程(9):反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のDTTを除去し、還元化抗HER2抗体溶液を得た。
工程(10):工程(7)で得られた各粒子分散液と工程(9)で得られた還元化抗HER2抗体溶液とをPBS中で混合し、1時間反応させた。
工程(11):10mMメルカプトエタノール4μLを添加し、反応を停止させた。
工程(12):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した後EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行った。最後に500μLのPBSを用い再分散させたところ、ナノ粒子A1〜A9にそれぞれ対応する、抗体結合粒子1〜9がそれぞれ得られた。
[Example 1: Binding of antibody to nanoparticles]
Antibody binding was performed on the nanoparticles A1 to A9 by the following procedure.
Specifically, the operations of steps (1) to (12) were performed to bind the antibodies, thereby producing “antibody-binding particles 1 to 9”.
Step (1): 1 mg of nanoparticles A1 to A9 were dispersed in 5 mL of pure water. 100 μL of aminopropyltriethoxysilane aqueous dispersion was added and stirred at room temperature for 12 hours.
Step (2): The reaction mixture was centrifuged at 10,000 G for 60 minutes, and the supernatant was removed.
Step (3): Ethanol was added to disperse the sediment, followed by centrifugation again. When washing with ethanol and pure water was performed once in the same procedure, amino group-modified nanoparticles B1 to B9 respectively corresponding to the nanoparticles A1 to A9 were obtained. When FT-IR measurement of the obtained nanoparticles B1 to B9 was performed, absorption derived from an amino group could be observed, and it was confirmed that the amino group could be modified.
Step (4): The amino group-modified nanoparticles B1 to B9 obtained in Step (3) are adjusted to 3 nM using PBS (phosphate buffered saline) containing 2 mM of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid). did.
Step (5): SM (PEG) 12 (manufactured by Thermo Scientific, succinimidyl-[(N-maleidopropionamidyl) -dodecaethyleneglycol] ester) is mixed with the solution prepared in step (4) to a final concentration of 10 mM, The reaction was carried out for 1 hour.
Step (6): The reaction mixture was centrifuged at 10,000 G for 60 minutes, and the supernatant was removed.
Step (7): PBS containing 2 mM of EDTA was added, the precipitate was dispersed, and centrifuged again. The washing | cleaning by the same procedure was performed 3 times. Finally, it was redispersed using 500 μL PBS.
Step (8): 1 M dithiothreitol (DTT) was added to 100 μL of anti-HER2 antibody dissolved in 100 μL of PBS and allowed to react for 30 minutes.
Step (9): Excess DTT was removed from the reaction mixture with a gel filtration column to obtain a reduced anti-HER2 antibody solution.
Step (10): Each particle dispersion obtained in step (7) and the reduced anti-HER2 antibody solution obtained in step (9) were mixed in PBS and allowed to react for 1 hour.
Step (11): 4 μL of 10 mM mercaptoethanol was added to stop the reaction.
Step (12): The reaction mixture was centrifuged at 10,000 G for 60 minutes, the supernatant was removed, PBS containing 2 mM of EDTA was added, the precipitate was dispersed, and centrifuged again. The washing | cleaning by the same procedure was performed 3 times. Finally, when 500 μL of PBS was redispersed, antibody-bound particles 1 to 9 corresponding to the nanoparticles A1 to A9, respectively, were obtained.
[実施例2:病理染色実験]
評価実験:(1)抗体結合粒子1〜9を用いた組織染色
上記実施例1で作製した抗体結合粒子1〜9を用いてヒト乳房組織の免疫染色を行った。
[Example 2: Pathological staining experiment]
Evaluation experiment: (1) Tissue staining using antibody-binding particles 1-9 Human breast tissue was immunostained using antibody-binding particles 1-9 prepared in Example 1 above.
染色切片はコスモバイオ社製の組織アレイスライド(CB-A712)を用いた。あらかじめDAB染色によりHER2染色濃度を観察し、(1)HER2発現量が高いロットと、(2)HER2発現量が低いロットとの2種のロットを用意し、これらのロットの組織スライドについて、抗体結合粒子を用いてそれぞれ染色を行った。ここで、このような組織染色を、抗体結合粒子1〜9のそれぞれについて行った。 As a stained section, a tissue array slide (CB-A712) manufactured by Cosmo Bio was used. Observe the HER2 staining concentration in advance by DAB staining, and prepare two types of lots: (1) a lot with a high HER2 expression level and (2) a lot with a low HER2 expression level. Staining was performed using the binding particles. Here, such tissue staining was performed for each of the antibody-binding particles 1 to 9.
ここで、抗体結合粒子ごとに、HER2発現量が高いロットの組織アレイスライド(以下、「スライド1」)とHER2発現量が低いロットの組織アレイスライド(以下、「スライド2」)のそれぞれについて、下記(1)〜(10)に記載の操作を行った。 Here, for each antibody-bound particle, each of a tissue array slide of a lot with a high HER2 expression level (hereinafter “slide 1”) and a tissue array slide of a lot with a low HER2 expression level (hereinafter “slide 2”), The operations described in (1) to (10) below were performed.
(1):キシレンを入れた容器に病理切片を30分浸漬させた。途中3回キシレンを交換した。
(2):エタノールを入れた容器に病理切片を30分浸漬させた。途中3回エタノールを交換した。
(3):水を入れた容器に、病理切片を30分浸漬させた。途中3回水を交換した。
(4):10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)に病理切片を30分浸漬させた。
(5):121℃で10分オートクレーブ処理を行った。
(6):PBSを入れた容器に、オートクレーブ処理後の切片を30分浸漬させた。
(7):1%BSA含有PBSを組織に載せて、1時間放置した。
(8):1%BSA含有PBSで0.05nMに希釈した抗体結合粒子10μLとを混合し、組織に載せて3時間放置した。
(9):PBSを入れた容器に、染色後の切片をそれぞれ30分浸漬させた。
(10):Merck Chemicals社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ封入した。
(1): A pathological section was immersed in a container containing xylene for 30 minutes. The xylene was changed three times during the process.
(2): A pathological section was immersed in a container containing ethanol for 30 minutes. The ethanol was changed three times during the process.
(3): The pathological section was immersed in a container containing water for 30 minutes. The water was changed three times along the way.
(4): A pathological section was immersed in 10 mM citrate buffer (pH 6.0) for 30 minutes.
(5): The autoclave process was performed at 121 degreeC for 10 minutes.
(6): The section after autoclaving was immersed in a container containing PBS for 30 minutes.
(7) 1% BSA-containing PBS was placed on the tissue and left for 1 hour.
(8) 10 μL of antibody-bound particles diluted to 0.05 nM with PBS containing 1% BSA was mixed and placed on the tissue and left for 3 hours.
(9): The stained sections were each immersed for 30 minutes in a container containing PBS.
(10): Aquex made by Merck Chemicals was dropped, and then a cover glass was placed and enclosed.
評価実験:(2)抗体結合粒子1〜6を用いて染色した組織の輝点計測
上記評価実験(1)により染色した組織切片に励起光を照射して蛍光発光させ、その組織切片からオリンパス社製DSU共焦点顕微鏡を用いて画像を取得した。励起波長は633nmと、365nmを切り替えて励起し、検出波長660nmとした。
ジーオンオングストロング社製輝点計測ソフト、G−countを用いて輝点数および発光輝度を計測した。計測方法は以下の2つの方法で実施した。
Evaluation experiment: (2) Bright spot measurement of tissue stained with antibody-binding particles 1 to 6 The tissue section stained by the above evaluation experiment (1) is irradiated with excitation light to fluoresce, and the tissue section is subjected to Olympus. Images were acquired using a DSU confocal microscope. The excitation wavelength was switched to 633 nm and 365 nm to obtain a detection wavelength of 660 nm.
The number of bright spots and light emission luminance were measured using G-count, a bright spot measurement software manufactured by Zeon Angstrom. The measurement method was implemented by the following two methods.
・計測方法1
上記抗体結合粒子1〜6で染色した組織について、励起波長を633nm、検出波長を660nmにそれぞれ設定して観察を行った。
・ Measurement method 1
The tissue stained with the antibody-binding particles 1 to 6 was observed with the excitation wavelength set to 633 nm and the detection wavelength set to 660 nm.
輝点数は、組織アレイスライド中の8スポットについて各30細胞の輝点を計測し、その平均値を求めた。発光輝度は、8スポットそれぞれについて視野全体の蛍光強度を合算し、その平均値を求めた。 The number of bright spots was determined by measuring the bright spots of 30 cells for each of 8 spots in the tissue array slide, and calculating the average value. The luminous intensity was obtained by adding the fluorescence intensity of the entire field of view for each of the 8 spots and calculating the average value.
・計測方法2
上記抗体結合粒子1〜6で染色した組織について、励起波長を633nm、450nmの2種、検出波長を660nmにそれぞれ設定して観察を行った。
・ Measurement method 2
The tissues stained with the antibody-binding particles 1 to 6 were observed with two excitation wavelengths of 633 nm and 450 nm and a detection wavelength of 660 nm.
輝点数は、同一視野で、励起波長の異なる2種の画像を重ね合わせ、同時に2つの画像で輝点となっているピクセル値を輝点とし、輝点の発光強度を足し合わせた。そうでない場合には、輝点としてカウントしないという処理を行った。 For the number of bright spots, two images with different excitation wavelengths were superimposed in the same field of view, and the pixel value that was the bright spot in the two images at the same time was taken as the bright spot, and the luminous intensity of the bright spot was added. Otherwise, a process of not counting as bright spots was performed.
組織アレイスライド中の8スポットについて各30細胞の輝点を計測し、その平均値を求めた。発光輝度は、8スポットそれぞれについて視野全体の蛍光強度を合算し、その平均値を求めた。 The bright spot of each 30 cells was measured for 8 spots in the tissue array slide, and the average value was obtained. The luminous intensity was obtained by adding the fluorescence intensity of the entire field of view for each of the 8 spots and calculating the average value.
上記計測方法2により得られた結果を、上記計測方法1により得られた結果と共に下記表1に示す。ここで、表1において、抗体結合粒子1〜6を、それぞれ粒子1〜6と表している。 The results obtained by the measurement method 2 are shown in Table 1 below together with the results obtained by the measurement method 1. Here, in Table 1, antibody binding particles 1 to 6 are represented as particles 1 to 6, respectively.
・計測方法3
上記抗体結合粒子1〜3及び7〜9について、励起波長を254nm、検出波長を、粒子1,3,7,9については510〜540nmに、粒子2,8については600〜700nmの範囲にそれぞれ設定して観察を行った。試料に励起光照射ののち、励起光照射を終了後1msec後に観察画像を取得した。
・ Measurement method 3
For the antibody-binding particles 1 to 3 and 7 to 9, the excitation wavelength is 254 nm, the detection wavelength is 510 to 540 nm for particles 1, 3, 7, and 9, and 600 to 700 nm for particles 2 and 8, respectively. Set and observe. After irradiating the sample with excitation light, an observation image was acquired 1 msec after ending the excitation light irradiation.
輝点数は、同一視野で、励起波長の異なる2種の画像を重ね合わせ、同時に2つの画像で輝点となっているピクセル値を輝点とし、輝点の発光強度を足し合わせた。そうでない場合には、輝点としてカウントしないという処理を行った。 For the number of bright spots, two images with different excitation wavelengths were superimposed in the same field of view, and the pixel value that was the bright spot in the two images at the same time was taken as the bright spot, and the luminous intensity of the bright spot was added. Otherwise, a process of not counting as bright spots was performed.
組織アレイスライド中の8スポットについて各30細胞の輝点を計測し、その平均値を求めた。発光輝度は、8スポットそれぞれについて視野全体の蛍光強度を合算し、その平均値を求めた。 The bright spot of each 30 cells was measured for 8 spots in the tissue array slide, and the average value was obtained. The luminous intensity was obtained by adding the fluorescence intensity of the entire field of view for each of the 8 spots and calculating the average value.
上記計測方法3により得られた結果を、上記計測方法1による結果と対比して下記表2に示す。ここで、表2において、抗体結合粒子1〜3および7〜9を、それぞれ粒子1〜3および7〜9と表している。 The results obtained by the measurement method 3 are shown in Table 2 below in comparison with the results by the measurement method 1. Here, in Table 2, antibody binding particles 1 to 3 and 7 to 9 are represented as particles 1 to 3 and 7 to 9, respectively.
一方、抗体結合粒子1〜3で標識化したスライド1および2について、計測方法3を用いたときには、スライドに用いた組織におけるHER2発現量の多寡にかかわらず輝点がほとんど観測されなかった。 On the other hand, with respect to slides 1 and 2 labeled with antibody-binding particles 1 to 2, when measuring method 3 was used, no bright spots were observed regardless of the amount of HER2 expression in the tissue used for the slide.
以上のように、本発明の計測方法を用いることによって、S/N比が、飛躍的に改善されることが示された。 As described above, it was shown that the S / N ratio was dramatically improved by using the measurement method of the present invention.
Claims (45)
ポリスチレン樹脂またはメラミン樹脂である有機重合体樹脂によって、前記第1の蛍光物質および前記第2の蛍光物質が内包され、且つ、
表面に生体分子認識物質および水系分散用修飾化合物が結合している
蛍光物質内包ナノ粒子。 A first fluorescent substance and a second fluorescent material having a fluorescent material and distinguishable excitation / emission characteristics of the first look-containing,
The first fluorescent substance and the second fluorescent substance are encapsulated by an organic polymer resin that is a polystyrene resin or a melamine resin, and
A fluorescent substance-encapsulated nanoparticle having a biomolecule recognizing substance and an aqueous dispersion modifying compound bonded to the surface .
(b)前記工程(a)で得られた組織について、同一視野で紫外線励起画像と可視光励起画像を撮影する工程と、
(c)前記工程(b)で得られた前記紫外線励起画像と前記可視光励起画像とを比較し、該紫外線励起画像と該可視光励起画像との両方の画像において輝点として検出された画素のみを有効な輝点と認識する工程と
を含む、組織中の生体物質の測定方法。 (A) a step of labeling a tissue using a fluorescent substance-containing nanoparticle including a first fluorescent substance and a second fluorescent substance having excitation / emission characteristics distinguishable from the first fluorescent substance ; ,
(B) For the tissue obtained in the step (a), a step of photographing an ultraviolet excitation image and a visible light excitation image in the same visual field;
(C) The ultraviolet excitation image obtained in the step (b) is compared with the visible light excitation image, and only pixels detected as bright spots in both the ultraviolet excitation image and the visible light excitation image are detected. A method for measuring a biological material in a tissue, comprising a step of recognizing an effective bright spot.
(b)前記工程(a)で得られた組織について、同一視野で、励起光照射時に得られる励起画像と時間分解蛍光測定により得られる残光画像とを撮影する工程と、
(c)前記工程(b)で得られた前記励起画像と前記残光画像とを比較し、該励起画像と該残光画像との両方の画像において輝点として検出された画素のみを有効な輝点と認識する工程と
を含み、
前記第1の蛍光物質が長残光蛍光体ではない蛍光物質であり、且つ前記第2の蛍光物質が長残光蛍光体である、組織中の生体物質の測定方法。 (A) a step of labeling a tissue using a fluorescent substance-containing nanoparticle including a first fluorescent substance and a second fluorescent substance having excitation / emission characteristics distinguishable from the first fluorescent substance ; ,
(B) For the tissue obtained in the step (a), a step of photographing an excitation image obtained at the time of excitation light irradiation and an afterglow image obtained by time-resolved fluorescence measurement in the same visual field;
(C) The excitation image obtained in the step (b) is compared with the afterglow image, and only pixels detected as bright spots in both the excitation image and the afterglow image are effective. viewing including the step of recognizing a bright spot,
A method for measuring a biological material in a tissue, wherein the first fluorescent material is a fluorescent material that is not a long afterglow phosphor, and the second fluorescent material is a long afterglow phosphor .
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