JP2009240171A - Method for producing high 4-hydroxy isoleucine-containing fenugreek sprout using isoleucine - Google Patents

Method for producing high 4-hydroxy isoleucine-containing fenugreek sprout using isoleucine Download PDF

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利弥 森
Nobuaki Tsuge
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing fenugreek sprouts enriched in 4-OH-Ile to an unconventional extent. <P>SOLUTION: The method for producing the Fenugreek sprouts enriched in 4-hydroxy isoleucine (4-OH-Ile) includes growing fenugreek seeds in hydroponics, and supplies isoleucine in the hydroponics. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、4−ヒドロキシイソロイシン高含有フェヌグリークスプラウト、及びイソロイシンを利用したその製造方法を提供する。   The present invention provides fenugreek sprout with a high content of 4-hydroxyisoleucine and a method for producing the same using isoleucine.

4−ヒドロキシイソロイシン(以下、4-OH-Ileと記す)等の分岐鎖アミノ酸は、骨格筋や肝臓におけるタンパク質の合成を促進し、分解を抑制することが従来から知られていた。また近年、分岐鎖アミノ酸は糖代謝を調節する作用を有することも解明されつつある。(非特許文献1)したがって4-OH-Ileは糖尿病等の糖代謝が関与する疾患に対して治療的な作用を有するものと期待される。   It has been conventionally known that branched chain amino acids such as 4-hydroxyisoleucine (hereinafter referred to as 4-OH-Ile) promote protein synthesis in skeletal muscle and liver and suppress degradation. In recent years, it has also been elucidated that branched chain amino acids have an action of regulating sugar metabolism. (Non-patent document 1) Therefore, 4-OH-Ile is expected to have a therapeutic effect on diseases involving sugar metabolism such as diabetes.

一方、非特許文献2には、フェヌグリーク種子を暗所で水栽培したとき、個体あたりおよび乾燥重量あたりの4-OH-Ile含量が経時的に増加した(栽培期間1週間)ことが示されている。このことは、4-OH-Ileは栽培中にフェヌグリークスプラウト内で生合成されることを示す。非特許文献2では更に、水栽培開始5日目のフェヌグリークスプラウト摩砕液から高分子画分(分子量1000以上)を得、これに外部からイソロイシン及び補酵素を添加することにより、4-OH-Ileの合成されたことを確認している。このことより、4-OH-Ileの前駆体はイソロイシンであり、4-OH-Ileはイソロイシンより酵素的に合成されることを示した。   On the other hand, Non-Patent Document 2 shows that when hydroponically cultivated fenugreek seeds, the 4-OH-Ile content per individual and per dry weight increased over time (cultivation period 1 week). . This indicates that 4-OH-Ile is biosynthesized in fenugreek sprout during cultivation. Further, in Non-Patent Document 2, a high molecular fraction (molecular weight 1000 or more) is obtained from the fenugreek sprout grinding liquid on the 5th day of hydroponics, and by adding isoleucine and coenzyme from the outside, 4-OH-Ile It is confirmed that it was synthesized. This indicates that the precursor of 4-OH-Ile is isoleucine, and 4-OH-Ile is enzymatically synthesized from isoleucine.

化学と生物, Vol.45, No.3, 203−210 (2007)Chemistry and Biology, Vol. 45, no. 3, 203-210 (2007) Phytochemistry 44, 563−566 (1997)Phytochemistry 44, 563-566 (1997)

非特許文献2では、フェヌグリークスプラウトをペースト化した後、4-OH-Ile合成酵素の含まれる高分子画分を分離し、同画分にイソロイシンを添加して4-OH-Ileを合成する方法が記載されている。しかしこの方法は工業的応用は難しく、効率も悪い。   In Non-Patent Document 2, after a fenugreek sprout is pasted, a polymer fraction containing 4-OH-Ile synthase is separated, and isoleucine is added to the fraction to synthesize 4-OH-Ile. Is described. However, this method is difficult to apply industrially and is inefficient.

従来の方法では、4-OH-Ileの含量の高い植物体を作ることはできなかった。   In the conventional method, a plant having a high 4-OH-Ile content could not be produced.

そこで本発明は、4-OH-Ileが富化されたフェヌグリークスプラウトを製造する方法を提供することを目的とする。   Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing fenugreek sprout enriched with 4-OH-Ile.

本発明は以下の発明を包含する。
(1)フェヌグリーク種子から水栽培により、4−ヒドロキシイソロイシン(4-OH-Ile)が富化されたフェヌグリークスプラウトを製造する方法であって、前記水栽培においてイソロイシンを供給することを特徴とする方法。
(2)イソロイシンの供給が、前記水栽培における、生長するスプラウトの単位乾燥重量あたりの4-OH-Ile量の増加速度が最大となる時点を中心とした48時間の期間を含む、72時間以上の期間行われることを特徴とする、(1)記載の方法。
(3)イソロイシンの供給が、前記水栽培においてスプラウトの胚軸部分と根部分との合計長が1cmとなる時点から6cmとなる時点までの期間少なくとも行われることを特徴とする、(1)記載の方法。
(4)イソロイシンの供給が、水栽培開始24時間後の時点から96時間後の時点までの期間行われることを特徴とする、(1)記載の方法。
(5)イソロイシンが水溶液の形態で供給されることを特徴とする(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)イソロイシン水溶液の濃度が10〜100mMであることを特徴とする(5)記載の方法。
(7)(1)〜(6)のいずれかに記載の方法で作られたフェヌグリークスプラウトであって、4-OH-Ile含量が40〜70mg/g(乾燥重量基準)であるフェヌグリークスプラウト。
The present invention includes the following inventions.
(1) A method for producing fenugreek sprout enriched with 4-hydroxyisoleucine (4-OH-Ile) by hydroponics from fenugreek seeds, wherein isoleucine is supplied in the hydroponics.
(2) The supply of isoleucine is a period of 72 hours or more, including a period of 48 hours centering on the point at which the rate of increase of 4-OH-Ile amount per unit dry weight of the growing sprout in the hydroponics is maximized. The method according to (1), wherein the method is performed for a period of time.
(3) The supply of isoleucine is performed at least for a period from the time when the total length of the hypocotyl part and the root part of the sprout is 1 cm to 6 cm in the hydroponics. Method.
(4) The method according to (1), wherein the supply of isoleucine is performed for a period from a time point 24 hours after the start of hydroponics to a time point 96 hours later.
(5) The method according to any one of (1) to (4), wherein isoleucine is supplied in the form of an aqueous solution.
(6) The method according to (5), wherein the concentration of the isoleucine aqueous solution is 10 to 100 mM.
(7) A fenugreek sprout produced by the method according to any one of (1) to (6), wherein the 4-OH-Ile content is 40 to 70 mg / g (dry weight basis).

本発明の方法によって、4-OH-Ileを多量、例えば通常のフェヌグリークスプラウトが有する量の1.8倍以上の量を含んだフェヌグリークスプラウトを提供することができる(図4)。   By the method of the present invention, it is possible to provide a fenugreek sprout containing a large amount of 4-OH-Ile, for example, 1.8 times or more the amount of ordinary fenugreek sprout (FIG. 4).

イソロイシンの供給時期を限定することで、使用するイソロイシン量を減らし、供給する作業工程を減らすことが可能になり、低コストで上記フェヌグリークスプラウトを提供することができる。   By limiting the supply timing of isoleucine, it is possible to reduce the amount of isoleucine to be used, reduce the number of work steps to be supplied, and provide the fenugreek sprout at a low cost.

1.水栽培の手順
フェヌグリークスプラウトとは、フェヌグリーク種子を水栽培して得られる発芽野菜のことである。上記水栽培は、水耕栽培ともいい、土を使用せずに水単独あるいは必要な養分(窒素、リン酸、カリウム、カルシウム、マグネシウム等)を液肥(ハイボニカ肥料等)で与えながら栽培する方法で、稲の水耕栽培では数千年前から行なわれている。
1. Hydroponics Procedure Fenugreek sprout is a germinated vegetable obtained by hydroponically cultivating fenugreek seeds. The above hydroponics is also called hydroponics, and is a method of cultivating water alone or using the necessary nutrients (nitrogen, phosphate, potassium, calcium, magnesium, etc.) with liquid fertilizer (hybonica fertilizer, etc.) without using soil. Hydroponic cultivation of rice has been carried out for thousands of years.

フェヌグリークスプラウトの典型的な栽培方法は以下の通りである。   Typical cultivation methods for fenugreek sprout are as follows.

まず、次亜塩素酸水溶液やエタノール水溶液などの殺菌剤でフェヌグリーク種子を殺菌する。   First, fenugreek seeds are sterilized with a disinfectant such as hypochlorous acid aqueous solution or ethanol aqueous solution.

そして殺菌後の種子を温度が一定に調節された暗所(例えば20〜30℃)で一晩水浸漬した後、温度が一定に調節された環境(例えば20〜30℃)下で、播種した後に水を供給する。その後、播種した時点を起点(0時間)(水栽培開始)として、播種直後48時間後から播種直後96〜168時間後まで、暗所のままあるいは光照射下で生育させ、フェヌグリークスプラウトを収穫する。   The sterilized seeds were immersed in water in a dark place (eg, 20 to 30 ° C.) where the temperature was kept constant, and then sown in an environment (eg, 20 to 30 ° C.) where the temperature was kept constant. Later, water is supplied. Thereafter, the seeding time is set as the starting point (0 hour) (start of hydroponics), and the plant is grown in the dark or under light irradiation from 48 hours immediately after sowing to 96 to 168 hours immediately after sowing, and fenugreek sprout is harvested.

上記光照射は、従来のスプラウトで通常使用される光強度 (20 μmol/m2/sec)の人工光が使用される。 For the light irradiation, artificial light having a light intensity (20 μmol / m 2 / sec) normally used in a conventional sprout is used.

栽培時の温度は、一般に植物の発芽・成長に適している20〜30℃が望ましい。   The temperature during cultivation is preferably 20 to 30 ° C., which is generally suitable for plant germination and growth.

スプラウトの生産のための容器としては、ポットもしくはトレーなどであり、室としては、スプラウト製造装置などである。   A container for production of sprout is a pot or a tray, and a chamber is a sprout production apparatus.

容器には例えばバーミュキュライトや土と一緒に水を入れて栽培を行う。   For example, water is put into a container together with vermiculite or soil for cultivation.

スプラウト栽培装置は、場所を選ばず簡単にスプラウトを栽培する装置であり、スプラウトに水と空気を同時にタイマーによって自動的に散布できる。必要に応じて、容器および室は温度、光照射時間や光強度を制御できる恒温槽に入れて栽培を行う。   The sprout cultivation apparatus is an apparatus for easily cultivating sprout regardless of the place, and water and air can be automatically sprayed on the sprout simultaneously by a timer. If necessary, the container and the chamber are cultivated in a thermostatic bath capable of controlling temperature, light irradiation time and light intensity.

イソロイシンの供給方法は、植物体にイソロイシンを供給できる方法であれば特に限定されないが、スプラウトに効率よく吸収させることを考えると、イソロイシンの水溶液の形態で供給する方法が望ましい。   The method for supplying isoleucine is not particularly limited as long as it can supply isoleucine to a plant body. However, considering the efficient absorption by sprout, a method of supplying isoleucine in the form of an aqueous solution of isoleucine is desirable.

イソロイシン水溶液の供給方法は特に限定されないが、例えば(i)水溶液を植物体全体に供給する方法や、(ii)水溶液を根部から吸収させる方法などがある。イソロイシンは高価であるため、イソロイシン水溶液の供給にあたっては、イソロイシン水溶液を循環させて使用するのが望ましい。   The method for supplying the isoleucine aqueous solution is not particularly limited. For example, there are (i) a method for supplying the aqueous solution to the whole plant, and (ii) a method for absorbing the aqueous solution from the root. Since isoleucine is expensive, it is desirable to circulate the isoleucine aqueous solution when supplying the isoleucine aqueous solution.

水栽培におけるイソロイシン水溶液の供給は連続的又は断続的に行うことが好ましい。断続的に行う場合、例えば、6時間〜12時間の時間間隔で噴霧等の方法により供給することができる。   It is preferable to supply the aqueous isoleucine solution in hydroponics continuously or intermittently. When performing intermittently, it can supply by methods, such as spraying, at the time interval of 6 hours-12 hours, for example.

水溶液中のイソロイシン濃度は、10mM以上、好ましくは25mM〜100mMで、さらに好ましくは25mM〜50mMである。96時間の栽培においては、10mM以上の濃度イソロイシン溶液を使うことにより、スプラウト個体の乾燥重量あたりの4-OH-Ile量はコントロール群(水供給群)に対して有意に増加する。25〜100mMの濃度範囲では、水供給群の場合と比較してスプラウト個体の乾燥重量あたりの4-OH-Ile含量が1.6倍まで増加させることができる(図2)。   The concentration of isoleucine in the aqueous solution is 10 mM or more, preferably 25 mM to 100 mM, more preferably 25 mM to 50 mM. In 96 hours of cultivation, by using an isoleucine solution having a concentration of 10 mM or more, the amount of 4-OH-Ile per dry weight of the sprout individual is significantly increased with respect to the control group (water supply group). In the concentration range of 25 to 100 mM, the 4-OH-Ile content per dry weight of the sprout individual can be increased up to 1.6 times compared to the case of the water supply group (FIG. 2).

イソロイシン濃度が25〜100mMでは、スプラウト中に観察されるイソロイシン量に差はあるが、スプラウト内に蓄積する4-OH-Ile量に差が無いことから、過剰にイソロイシンがあっても4-OH-Ile合成量は増加しないことがわかる。従って、高価なイソロイシンを無駄にすることなく4-OH-Ileを増加させるのに適したイソロイシン濃度は、25mM〜50mMである(図2)。   When the isoleucine concentration is 25 to 100 mM, there is a difference in the amount of isoleucine observed in the sprout, but there is no difference in the amount of 4-OH-Ile accumulated in the sprout. -Ile synthesis amount does not increase. Therefore, a suitable isoleucine concentration for increasing 4-OH-Ile without wasting expensive isoleucine is 25 mM to 50 mM (FIG. 2).

2.イソロイシンの供給時期
イソロイシンは高価であることから水栽培の際に効率的に供給することができればより一層望ましい。
2. When to supply isoleucine Since isoleucine is expensive, it is even more desirable if it can be supplied efficiently during hydroponics.

本発明者らは、驚くべきことに、イソロイシンを、水栽培における、生長するスプラウトの単位乾燥重量あたりの4-OH-Ile量の増加速度が最大となる時点を中心とした48時間の期間を含む、72時間以上の期間供給すれば、水栽培の全期間に亘りイソロイシンを供給した場合と同等の4-OH-Ileが蓄積されることを見出した。4-OH-Ileの合成が盛んになる時期にイソロイシンを多く存在させておくことで、合成酵素が誘導され、その後の4-OH-Ile合成が増加すると考えられる。そこで本発明では、4-OH-Ileの合成速度が盛んになる時期に、スプラウト中に十分量のイソロイシンを存在させるのである。ここで「生長するスプラウトの単位乾燥重量あたりの4-OH-Ile量の増加速度が最大となる時点を中心とした48時間の期間」とは、同時点の24時間前の時点から、24時間後の時点に至る48時間の期間を意味する。本発明では、この期間を含む、連続した72時間以上の期間に亘りイソロイシンを供給することを特徴とする。また「生長するスプラウトの単位乾燥重量あたりの4-OH-Ile量の増加速度が最大となる時点」とは次のように決定できる。まず4-OH-Ile富化フェヌグリークスプラウトの所望の水栽培条件と、イソロイシンを供給しない以外は同一の条件によりフェヌグリークスプラウトの水栽培を行う。そして、水栽培開始後の植物体を経時的にサンプリングして単位乾燥重量あたりの4-OH-Ile量を測定する。水栽培開始後の経過時間と4-OH-Ile量との関係から、4-OH-Ile量の増加速度が最も大きい時点(T)を知ることができる。   The inventors surprisingly included isoleucine in a 48 hour period centered around the point at which the rate of increase of 4-OH-Ile per unit dry weight of growing sprout in hydroponics is maximized. It was found that if a period of 72 hours or longer is supplied, 4-OH-Ile equivalent to that obtained when isoleucine is supplied over the entire period of hydroponics is found. It is considered that the presence of a large amount of isoleucine at the time when the synthesis of 4-OH-Ile is prosperous induces a synthase and increases the subsequent 4-OH-Ile synthesis. Therefore, in the present invention, a sufficient amount of isoleucine is present in the sprout at a time when the synthesis rate of 4-OH-Ile becomes active. Here, “a 48-hour period centering on the point at which the rate of increase in the 4-OH-Ile amount per unit dry weight of the growing sprout is maximum” means 24 hours from the point 24 hours before the same point. It means a 48 hour period leading to a later time. The present invention is characterized in that isoleucine is supplied over a continuous period of 72 hours or more including this period. Further, “the point at which the increase rate of the 4-OH-Ile amount per unit dry weight of the growing sprout becomes maximum” can be determined as follows. First, hydroculture of fenugreek sprout is carried out under the same conditions as the hydroculture conditions of 4-OH-Ile-enriched fenugreek sprout except that isoleucine is not supplied. And the plant body after a hydroponics start is sampled with time, and the amount of 4-OH-Ile per unit dry weight is measured. From the relationship between the elapsed time after the start of hydroponics and the 4-OH-Ile amount, the time point (T) at which the increase rate of the 4-OH-Ile amount is the highest can be known.

より好ましくはイソロイシンを、水栽培における、生長するスプラウトの単位乾燥重量あたりの4-OH-Ile量の増加速度が最大となる時点の24時間前から、前記時点の48時間後までの72時間の期間供給する。例えば168時間の水栽培では、栽培開始後48時間で4-OH-Ile量の増加速度が最大となり、栽培開始後96時間で4-OH-Ileの合成がほぼ終了する。そこで、イソロイシンは、スプラウトの単位乾燥重量あたりの4-OH-Ile量の増加速度が最大となる時点の24時間前から、水栽培開始96時間後(すなわち前記時点の48時間後)までの期間供給することが好ましい。このとき栽培開始後96時間からイソロイシンを供給しても、4-OH-Ileの増加量はイソロイシン無添加条件と相違が無い。   More preferably, isoleucine is used in hydroponics for a period of 72 hours from 24 hours before the maximum rate of increase in the amount of 4-OH-Ile per unit dry weight of growing sprout to 48 hours after that point. Supply. For example, in hydroponics for 168 hours, the rate of increase of 4-OH-Ile is maximized 48 hours after the start of cultivation, and the synthesis of 4-OH-Ile is almost completed 96 hours after the start of cultivation. Therefore, isoleucine is supplied for a period from 24 hours before the point at which the increase rate of 4-OH-Ile per unit dry weight of the sprout is maximized to 96 hours after the start of hydroponics (ie, 48 hours after that point). It is preferable to do. At this time, even if isoleucine is supplied from 96 hours after the start of cultivation, the increase amount of 4-OH-Ile is not different from the condition without addition of isoleucine.

「水栽培開始96時間後の時点」及び後述する「水栽培開始24時間後の時点」とは、上記「1.水栽培の手順」で説明した、温度が一定に調節された暗所での殺菌種子の水浸漬後の播種を起点として、96時間後の時点、及び24時間後の時点である。   The “time point after 96 hours of hydroponics” and the “time point after 24 hours of hydroponics” described later refer to the sterilization seeds in the dark where the temperature is adjusted to a constant as described in “1. Starting from sowing after water immersion, the time point after 96 hours and the time point after 24 hours.

本発明者らはまた、フェヌグリークスプラウトの水栽培において、4-OH-Ile量の増加曲線がスプラウトの成長(胚軸部+根部の長さ)曲線に相関すること、並びに、4-OH-Ile量の増加速度を測定しなくともフェヌグリーク成長具合からイソロイシンの添加時期を規定することができることを見出した。すなわち、イソロイシンを、水栽培においてスプラウトの胚軸部分と根部分との合計長が1cmとなる時点から6cmとなる時点までの期間供給すれば、水栽培の全期間に亘りイソロイシンを供給した場合と同等の4-OH-Ileが蓄積されることを見出した。   The present inventors also found that in hydroponics of fenugreek sprout, the 4-OH-Ile amount increase curve correlates with the sprout growth (hypocotyl part + root length) curve, and the 4-OH-Ile amount It was found that the addition time of isoleucine can be defined from the growth of fenugreek without measuring the rate of increase in the growth rate. That is, if isoleucine is supplied for a period from the time when the total length of the sprout hypocotyl part and root part is 1 cm to 6 cm in hydroponics, it is equivalent to the case where isoleucine is supplied over the entire period of hydroponics. We found that 4-OH-Ile was accumulated.

まず、4-OH-Ile富化フェヌグリークスプラウトの所望の栽培条件と、イソロイシンを供給しない以外は同一の条件によりフェヌグリークスプラウトの水栽培を行い、スプラウトの長さの経時変化をあらかじめ確認しておくことが望ましい。実施例に示すとおり、イソロイシンの添加の有無によってフェヌグリークスプラウトの生長速度は変動しない。   First, hydroponically cultivate fenugreek sprout under the same conditions except that it does not supply isoleucine with the desired cultivation conditions of 4-OH-Ile-enriched fenugreek sprout, and it is possible to confirm in advance the change in sprout length over time desirable. As shown in the Examples, the growth rate of fenugreek sprout does not vary depending on whether or not isoleucine is added.

本発明者らはまた、イソロイシンを、水栽培開始24時間後の時点から96時間後の時点までの期間供給すれば、水栽培の全期間に亘りイソロイシンを供給した場合と同等の4-OH-Ileが蓄積されることを見出した。   The present inventors also provided isoleucine for a period from the time point 24 hours after the start of hydroponics to the time point 96 hours later, when 4-OH-Ile equivalent to the case of supplying isoleucine over the entire hydroponics period is obtained. I found that it was accumulated.

上述のいずれの形態においても、イソロイシンを、所定の期間のみ供給することが最も効率がよいが、当該所定の期間の前後も含めた期間、イソロイシンの供給を行うことも本発明の範囲に包含される。   In any of the above forms, it is most efficient to supply isoleucine only for a predetermined period. However, it is also included in the scope of the present invention to supply isoleucine for a period including before and after the predetermined period. The

3.4-OH-Ile富化フェヌグリークスプラウト
本発明の方法により得られたフェヌグリークスプラウトは、40〜70mg/g(乾燥重量基準)の4-OH-Ileを含有する。また、本発明の方法により得られたフェヌグリークスプラウトは、通常は、水栽培の工程において供給されたイソロイシンを含んでいる。
3. 4-OH-Ile -enriched fenugreek sprout The fenugreek sprout obtained by the method of the present invention contains 40-70 mg / g (dry weight basis) of 4-OH-Ile. Moreover, the fenugreek sprout obtained by the method of the present invention usually contains isoleucine supplied in the hydroponics process.

(実験方法)
種子はインド産フェヌグリークを使用した。栽培は「スプラウト栽培専用装置」(図1)を用いた。これは排水口のあるトレイに蒔いた種子に、間欠的に空気と水を散布できる装置である。種子25 gを以下に示す5条件の3倍量水溶液:(1) 水 (コントロール)、(2) 10 mMイソロイシン水溶液、(3) 25 mMイソロイシン水溶液、(4) 50 mMイソロイシン水溶液、(5) 100 mMイソロイシン水溶液、に16時間浸漬後、トレイ (内寸33 cm x 6 cm) にじかに高密度で種子を撒き(吸水前の種子重量として0.28 g/cm2)、イソロイシン水溶液を定期的に散布しながら25℃で栽培した。1回の散布は約4.5 ml/min/1トレイで、散布と通気時間 (散布と同時に行われる) は15分間とし、6時間毎に行った。播種直後を0時間として48時間後から、1日16時間光照射した。光は、蛍光灯 (光量約25 μmol/m2/sec、照度約2500 lx) と赤色LED (660 nm、光量約25 μmol/m2/sec、照度約350 lx) が、4-OH-Ile量に及ぼす影響に差がないため、区別なく使用した。播種96時間後に収穫し、乾燥重量あたりの4-OH-Ile量を測定した。
(experimental method)
The seed used was Indian fenugreek. Cultivation was carried out using the “special equipment for sprout cultivation” (Fig. 1). This is a device that can intermittently sprinkle air and water on seeds in a tray with a drain. Seed 25 g of 3 conditions aqueous solution of 5 conditions shown below: (1) water (control), (2) 10 mM isoleucine aqueous solution, (3) 25 mM isoleucine aqueous solution, (4) 50 mM isoleucine aqueous solution, (5) After soaking in 100 mM isoleucine aqueous solution for 16 hours, seeds are seeded at a high density in a tray (inner dimensions 33 cm x 6 cm) (0.28 g / cm 2 as seed weight before water absorption) and sprayed with isoleucine aqueous solution periodically While growing at 25 ℃. Each spraying was about 4.5 ml / min / 1 tray, spraying and aeration time (performed simultaneously with spraying) was 15 minutes, and every 6 hours. Light irradiation was performed for 16 hours a day from 48 hours after 0 hours immediately after sowing. Fluorescent lamps (light intensity approx. 25 μmol / m 2 / sec, illuminance approx. 2500 lx) and red LEDs (660 nm, light intensity approx. 25 μmol / m 2 / sec, illuminance approx. 350 lx), 4-OH-Ile Since there was no difference in the effect on the amount, they were used without distinction. Harvested 96 hours after sowing, the amount of 4-OH-Ile per dry weight was measured.

フェヌグリークスプラウトの乾燥重量あたりの4-OH-Ile量の測定は以下の方法により行なった。   The amount of 4-OH-Ile per dry weight of fenugreek sprout was measured by the following method.

スプラウトを50 g量り取り、蒸留水20 gを添加し、8分間ホモジナイズ(10,000 rpm)した。摩砕物約1 gを量り取り(精秤)、70 %エタノールで20 mlにメスアップし、4時間放置したものをHPLC分析の検液とした。4-OH-Ile量の測定は、HPLC(アジレント社製1100シリーズ)を用いて、アミノ酸誘導体化試薬のOPAを用いたプレカラム法により行なった。摩砕物の水分量は、別途摩砕物約1 gを量り取り (精秤)、105℃で16時間乾燥することにより測定した。4-OH-Ile標準品の濃度から、70%エタノールの抽出液の4-OH-Ile濃度を算出後、精秤サンプル中の4-OH-Ile量を算出した。そして上記摩砕物中の水分量からフェヌグリークスプラウト乾燥重量あたりの4-OH-Ile量を算出した。また、乾燥重量あたりのイソロイシン量は、イソロイシンと4-OH-Ileの構造が非常に似ているために、4-OH-Ile検量線を利用し、イソロイシンのHPLC分析の面積値を4-OH-Ileの検量線式に代入し、4-OH-Ile量として算出した。   50 g of sprout was weighed, 20 g of distilled water was added, and homogenized (10,000 rpm) for 8 minutes. About 1 g of the milled product was weighed (precisely weighed), made up to 20 ml with 70% ethanol, and left for 4 hours as a test solution for HPLC analysis. The amount of 4-OH-Ile was measured by a precolumn method using an amino acid derivatization reagent OPA using HPLC (1100 series manufactured by Agilent). The water content of the milled product was measured by separately weighing about 1 g of the milled product (precisely weighed) and drying at 105 ° C. for 16 hours. From the concentration of the 4-OH-Ile standard product, the 4-OH-Ile concentration in the 70% ethanol extract was calculated, and then the amount of 4-OH-Ile in the precisely weighed sample was calculated. Then, the amount of 4-OH-Ile per dry weight of fenugreek sprout was calculated from the amount of water in the ground product. Also, the isoleucine amount per dry weight is similar to the structure of isoleucine and 4-OH-Ile, so the 4-OH-Ile calibration curve was used, and the HPLC analysis area value of isoleucine was 4-OH. Substituted into the -Ile calibration curve, and calculated as 4-OH-Ile amount.

(結果)
10 mM以上のイソロイシン水溶液で、合成される4-OH-Ile量はコントロールである水供給区に対して有意に増加した。また、25 mM、50 mMおよび100 mMイソロイシン水溶液の間で、合成される4-OH-Ile量に変化は無かった (図2)。スプラウト中に存在するイソロイシン量については、水供給区では全く見られないのに対して、イソロイシン供給区では図2に示すようになった。これより、供給するイソロイシンがスプラウト中に吸収されて、4-OH-Ileに変換されたことにより、水供給区と比較して4-OH-Ileが増加することが確認できた。また、イソロイシン水溶液の濃度依存的にスプラウト中のイソロイシンが増加しているのは確認できたが、イソロイシン濃度が25〜100 mMの間では合成される4-OH-Ile量に変化が無かった (図2)。
(result)
The amount of 4-OH-Ile synthesized with an aqueous isoleucine solution of 10 mM or more significantly increased compared to the control water supply section. Moreover, there was no change in the amount of 4-OH-Ile synthesized between 25 mM, 50 mM and 100 mM isoleucine aqueous solutions (FIG. 2). The amount of isoleucine present in the sprout was not seen at all in the water supply area, whereas it was as shown in FIG. 2 in the isoleucine supply area. From this, it was confirmed that the supplied isoleucine was absorbed into the sprout and converted to 4-OH-Ile, so that 4-OH-Ile increased compared to the water supply zone. In addition, it was confirmed that isoleucine in the sprout increased depending on the concentration of the aqueous isoleucine solution, but there was no change in the amount of 4-OH-Ile synthesized when the isoleucine concentration was between 25 and 100 mM ( Figure 2).

(実験方法)
種子および栽培装置は実施例1と同様のものを使用した。浸漬および栽培は以下の9つの条件で行った。
条件(1):
種子25 gを3倍量の50 mMイソロイシン水溶液に16時間浸漬後、実施例1と同様な方法でトレイに種子を播種し、96時間栽培を行った。散布量および散布時間は実施例1と同じ条件で行なった。
条件(2)〜(8):
種子25 gを3倍量の水に16時間浸漬後、実施例1と同様な温度及び方法でトレイに種子を播種し、96時間栽培を行った。50 mMイソロイシン水溶液の散布期間は播種直後を0時間として、(2) 播種後0時間〜96時間、(3) 播種後0時間〜72時間、(4)播種後24時間〜96時間、(5)播種後24時間〜72時間、(6)播種後48時間〜96時間、(7)播種後24時間〜48時間、(8)播種後72時間〜96時間とし、それ以外の日は水を散布した。散布量および散布時間は実施例1と同じ条件で行なった。
条件(9):
種子25 gを3倍量の水に16時間浸漬後、実施例1と同様な方法でトレイに種子を播種し、96時間栽培を行った。散布量および散布時間は実施例1と同じ条件で行なった。
(experimental method)
The same seeds and cultivation apparatus as in Example 1 were used. Immersion and cultivation were performed under the following nine conditions.
Condition 1):
After 25 g of seeds were soaked in 3 times the amount of 50 mM isoleucine aqueous solution for 16 hours, seeds were sown in the same manner as in Example 1 and cultivated for 96 hours. The application amount and application time were the same as in Example 1.
Conditions (2) to (8):
After immersing 25 g of seeds in 3 times the amount of water for 16 hours, the seeds were sown on the tray at the same temperature and method as in Example 1 and cultivated for 96 hours. The application period of 50 mM isoleucine aqueous solution is 0 hours immediately after sowing, (2) 0 to 96 hours after sowing, (3) 0 to 72 hours after sowing, (4) 24 to 96 hours after sowing, (5 ) 24 to 72 hours after sowing, (6) 48 to 96 hours after sowing, (7) 24 to 48 hours after sowing, (8) 72 to 96 hours after sowing, and water on other days Scattered. The application amount and application time were the same as in Example 1.
Condition (9):
After immersing 25 g of seeds in 3 times the amount of water for 16 hours, seeds were sown in the same manner as in Example 1 and cultivated for 96 hours. The application amount and application time were the same as in Example 1.

光照射、収穫、およびフェヌグリークスプラウトの乾燥重量あたりの4-OH-Ile量の測定は実施例1と同じ方法で行なった。   Light irradiation, harvesting, and measurement of 4-OH-Ile amount per dry weight of fenugreek sprout were performed in the same manner as in Example 1.

(結果)
播種直後を0時間として、イソロイシン水溶液を播種後0〜96時間まで、全栽培期間供給しても又は播種後24時間から供給しても、4-OH-Ile量に有意な差は無かった(図3)。すなわち、50 mMイソロイシンを播種後0時間〜72時間あるいは24時間〜96時間まで供給すれば、0〜96時間供給するのと同じ量の4-OH-Ileが合成した。このことから、イソロイシンの使用期間を限定できることが確認できた。
(result)
There was no significant difference in the amount of 4-OH-Ile, even if it was supplied from 0 to 96 hours after sowing, even if it was supplied from the whole cultivation period or from 24 hours after sowing, immediately after sowing as 0 hours ( (Figure 3). That is, if 50 mM isoleucine was supplied from 0 hours to 72 hours or 24 hours to 96 hours after seeding, the same amount of 4-OH-Ile as that supplied for 0 to 96 hours was synthesized. From this, it was confirmed that the use period of isoleucine can be limited.

(実験方法)
種子および栽培装置は実施例1と同様のものを使用した。種子25 gを3倍量の水に16時間浸漬後、実施例1と同様な方法でトレイに種子を播種し、下記の(1)〜(4)の4条件で播種直後を0時間として、168時間栽培を行った。散布量および散布時間は実施例1と同じ条件で行なった。播種後0時間〜168時間まで24時間毎に収穫し、乾燥重量あたりの4-OH-Ile量を測定した。光照射は実施例1と同じ温度及び方法で行なった。
条件(1):水を播種後0時間〜168時間まで散布
条件(2):50 mMイソロイシン水溶液を播種後24時間〜168時間に散布
条件(3):50 mMイソロイシン水溶液を播種後96時間〜168時間に散布
条件(4):50 mMイソロイシン水溶液を播種後24時間〜96時間に散布
(2)〜(4)では、イソロイシン水溶液を散布しない期間は水を散布した。
(experimental method)
The same seeds and cultivation apparatus as in Example 1 were used. After soaking 25 g of seeds in 3 times the amount of water for 16 hours, seeding the trays in the same manner as in Example 1, and immediately after sowing under the following four conditions (1) to (4) as 0 hours, Cultivated for 168 hours. The application amount and application time were the same as in Example 1. The plants were harvested every 24 hours from 0 to 168 hours after sowing, and the amount of 4-OH-Ile per dry weight was measured. Light irradiation was performed at the same temperature and method as in Example 1.
Condition (1): Spraying from 0 to 168 hours after seeding with water Condition (2): Spraying with 50 mM isoleucine aqueous solution 24 to 168 hours after seeding (3): 96 hours after seeding with 50 mM isoleucine aqueous solution 168 hours spraying condition (4): 50 mM isoleucine aqueous solution sprayed 24 to 96 hours after seeding
In (2) to (4), water was sprayed during a period when the isoleucine aqueous solution was not sprayed.

フェヌグリークスプラウトの乾燥重量あたりの4-OH-Ile量の測定は以下の方法により行なった。スプラウトを20 g量り取り、蒸留水40 gを添加し、8分間ホモジナイズ(10,000 rpm)した。摩砕物約2 gを量り取り(精秤)、70 %エタノールで20 mlにメスアップし、4時間放置したものをHPLC分析の検液とした。4-OH-Ile量の測定は、HPLC(アジレント社製1100シリーズ)を用いて、アミノ酸誘導体化試薬のOPAを用いたプレカラム法により行なった。摩砕物の水分量は、別途摩砕物約2 gを量り取り (精秤)、105℃で16時間乾燥することにより測定した。4-OH-Ile標準品の濃度から、70%エタノールの抽出液の4-OH-Ile濃度を算出後、精秤サンプル中の4-OH-Ile量を算出した。そして上記摩砕物中の水分量からフェヌグリークスプラウト乾燥重量あたりの4-OH-Ile量を算出した。また、乾燥重量あたりのイソロイシン量は、イソロイシンと4-OH-Ileの構造が非常に似ているために、4-OH-Ile検量線を利用し、イソロイシンのHPLC分析の面積値を4-OH-Ileの検量線式に代入し、4-OH-Ile量として算出した。   The amount of 4-OH-Ile per dry weight of fenugreek sprout was measured by the following method. 20 g of sprout was weighed out, 40 g of distilled water was added, and homogenized (10,000 rpm) for 8 minutes. About 2 g of the milled product was weighed (precisely weighed), made up to 20 ml with 70% ethanol, and left for 4 hours as a test solution for HPLC analysis. The amount of 4-OH-Ile was measured by a precolumn method using an amino acid derivatization reagent OPA using HPLC (1100 series manufactured by Agilent). The water content of the milled product was measured by separately weighing out about 2 g of the milled product (precise weighing) and drying at 105 ° C. for 16 hours. From the concentration of the 4-OH-Ile standard product, the 4-OH-Ile concentration in the 70% ethanol extract was calculated, and then the amount of 4-OH-Ile in the precisely weighed sample was calculated. Then, the amount of 4-OH-Ile per dry weight of fenugreek sprout was calculated from the amount of water in the ground product. Also, the isoleucine amount per dry weight is similar to the structure of isoleucine and 4-OH-Ile, so the 4-OH-Ile calibration curve was used, and the HPLC analysis area value of isoleucine was 4-OH. Substituted into the -Ile calibration curve, and calculated as 4-OH-Ile amount.

スプラウトの長さは20本のスプラウトの(胚軸+根)の長さの平均値であり、生重量は10本あたり(N=5)の平均値で示してある。   The length of the sprout is the average value of the lengths of (hypocotyl + root) of the 20 sprout, and the raw weight is shown as an average value per 10 (N = 5).

(結果)
4-OH-Ile量の結果を図4に示す。実験条件(1)では168時間後の乾燥重量あたりの4-OH-Ile量が36 mg/gであるのに対して、実験条件(2)において、96時間後の乾燥重量あたりの4-OH-Ile量は45 mg/gで、168時間後の量は63 m/gであった。(1)の水栽培区では96時間後以降、4-OH-Ile量の増加スピードが落ちた。一方、50 mMイソロイシン水溶液を用いた条件(2)および(4)の実験区では、96時間後以降も4-OH-Ile量が大きく増加した。条件(2)でも条件(4)でも、96時間後以降の4-OH-Ile量に差はほとんど無かった。4-OH-Ileの合成が止まる96時間後以降に、イソロイシンを供給しても、(1)の水栽培の場合の4-OH-Ile増加量と変わらなかった(図5)。これより、播種後24時間〜96時間までイソロイシンを供給するのと、24時間〜168時間まで供給するのと同量の4-OH-Ileが合成されることが確認できた。播種120時間後以降において、条件(3)ではイソロイシンが十分存在するが、4-OH-Ile量は(1)の水供給区とほぼ同じ量であったことより、水栽培で4-OH-Ile量の増加が止まる時期にイソロイシンを供給しても、4-OH-Ileの増加はないことが確認できた (図5)。図6では、スプラウトの長さ(胚軸+根)、図7では、生重量の経時変化を示している。図6の結果から、4-OH-Ile増加量とスプラウトの長さに相関があることが分かり、イソロイシンの添加時期はスプラウトの長さで規定できることが確認できた。即ち、スプラウトの長さが1cm〜6 cmの間に50 mMイソロイシンを供給すればよいことになる。一方、生重量と4-OH-Ileの間には相関関係はなかった。
(result)
The result of 4-OH-Ile amount is shown in FIG. In experimental condition (1), the amount of 4-OH-Ile per 168 hours after dry weight is 36 mg / g, whereas in experimental condition (2), 4-OH per 96 hours after dry weight. The amount of -Ile was 45 mg / g, and the amount after 168 hours was 63 m / g. In the hydroponics section of (1), the increase rate of 4-OH-Ile decreased after 96 hours. On the other hand, in the experimental groups under the conditions (2) and (4) using a 50 mM isoleucine aqueous solution, the amount of 4-OH-Ile greatly increased after 96 hours. Under conditions (2) and (4), there was almost no difference in the amount of 4-OH-Ile after 96 hours. Even after 96 hours after the synthesis of 4-OH-Ile stopped, even if isoleucine was supplied, the amount of 4-OH-Ile increased in the case of hydroponics in (1) was not changed (FIG. 5). From this, it was confirmed that the same amount of 4-OH-Ile was synthesized as when isoleucine was supplied from 24 hours to 96 hours after seeding and when it was supplied from 24 hours to 168 hours. After 120 hours after sowing, there is sufficient isoleucine under condition (3), but the amount of 4-OH-Ile was almost the same as the water supply area of (1). It was confirmed that even when isoleucine was supplied when the increase in the amount stopped, 4-OH-Ile did not increase (Fig. 5). FIG. 6 shows the sprout length (hypocotyl + root), and FIG. From the results of FIG. 6, it was found that there was a correlation between the 4-OH-Ile increase and the length of the sprout, and it was confirmed that the addition time of isoleucine could be defined by the length of the sprout. That is, 50 mM isoleucine may be supplied when the length of the sprout is 1 cm to 6 cm. On the other hand, there was no correlation between fresh weight and 4-OH-Ile.

スプラウト栽培専用装置の写真である。It is a photograph of an apparatus dedicated to sprout cultivation. イソロイシン水溶液濃度と、スプラウト中の4-OH-Ile量及びイソロイシン(Ile)量との関係を示す図である。It is a figure which shows the relationship between isoleucine aqueous solution density | concentration, the amount of 4-OH-Ile in a sprout, and the amount of isoleucine (Ile). イソロイシン水溶液の添加時期と、スプラウト中の4-OH-Ile量との関係を示す図である。It is a figure which shows the relationship between the addition time of isoleucine aqueous solution, and the amount of 4-OH-Ile in a sprout. イソロイシン水溶液の添加時期と、スプラウト中の4-OH-Ile量の経時変化との関係を示す図である。It is a figure which shows the relationship between the addition time of isoleucine aqueous solution, and the time-dependent change of the 4-OH-Ile amount in a sprout. イソロイシン水溶液の添加時期と、スプラウト中の4-OH-Ile量の経時変化との関係を示す図である。It is a figure which shows the relationship between the addition time of isoleucine aqueous solution, and the time-dependent change of the amount of 4-OH-Ile in a sprout. イソロイシン水溶液の添加時期と、スプラウト中の4-OH-Ile量の経時変化との関係を示す図である。It is a figure which shows the relationship between the addition time of isoleucine aqueous solution, and the time-dependent change of the 4-OH-Ile amount in a sprout. スプラウトの長さの経時変化を示す図である。It is a figure which shows the time-dependent change of the length of a sprout. スプラウトの生重量の経時変化を示す図である。It is a figure which shows the time-dependent change of the raw weight of a sprout.

Claims (7)

フェヌグリーク種子から水栽培により、4−ヒドロキシイソロイシン(4-OH-Ile)が富化されたフェヌグリークスプラウトを製造する方法であって、前記水栽培においてイソロイシンを供給することを特徴とする方法。   A method of producing fenugreek sprout enriched with 4-hydroxyisoleucine (4-OH-Ile) by hydroponics from fenugreek seed, wherein isoleucine is supplied in the hydroponics. イソロイシンの供給が、前記水栽培における、生長するスプラウトの単位乾燥重量あたりの4-OH-Ile量の増加速度が最大となる時点を中心とした48時間の期間を含む、72時間以上の期間行われることを特徴とする、請求項1記載の方法。   The supply of isoleucine is performed for a period of 72 hours or more, including a period of 48 hours centering on the point at which the rate of increase of 4-OH-Ile amount per unit dry weight of the growing sprout is maximized in the hydroponics. The method according to claim 1, wherein: イソロイシンの供給が、前記水栽培においてスプラウトの胚軸部分と根部分との合計長が1cmとなる時点から6cmとなる時点までの期間少なくとも行われることを特徴とする、請求項1記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the supply of isoleucine is performed at least during a period from the time when the total length of the hypocotyl part and the root part of the sprout is 1 cm to 6 cm in the hydroponics. イソロイシンの供給が、水栽培開始24時間後の時点から96時間後の時点までの期間行われることを特徴とする、請求項1記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the supply of isoleucine is performed for a period from a time point 24 hours after the start of hydroponics to a time point 96 hours later. イソロイシンが水溶液の形態で供給されることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。   The method according to claim 1, wherein isoleucine is supplied in the form of an aqueous solution. イソロイシン水溶液の濃度が10〜100mMであることを特徴とする請求項5記載の方法。   6. The method according to claim 5, wherein the concentration of the isoleucine aqueous solution is 10 to 100 mM. 請求項1〜6のいずれか1項記載の方法で作られたフェヌグリークスプラウトであって、4-OH-Ile含量が40〜70mg/g(乾燥重量基準)であるフェヌグリークスプラウト。   A fenugreek sprout produced by the method according to any one of claims 1 to 6, wherein the 4-OH-Ile content is 40 to 70 mg / g (dry weight basis).
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