JP2009232716A - New lactic acid bacterium - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）菌種に属する新規乳酸菌、該乳酸菌を含有する菌末、医薬用組成物及び整腸剤、及び、該乳酸菌を用いるビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌の生育・生残性促進方法に関する。 The present invention relates to a novel lactic acid bacterium belonging to the species of Lactococcus lactis subsp. Cremoris, a bacterial powder containing the lactic acid bacterium, a pharmaceutical composition and an intestinal preparation, and a bifido using the lactic acid bacterium. The present invention relates to a method for promoting the growth and survival of bacteria belonging to the genus Bifidobacterium.
ラクトコッカス属菌やビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌等の乳酸菌は、腸内細菌のバランスを回復する整腸作用や、免疫増強作用、発ガン抑制作用等を有することが知られている。このため、近年、生活者の健康志向の高まりと共に、乳酸菌の食品への利用が盛んになってきている。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガム等のビフィドバクテリウム属菌は、ヒトの腸管内で形成される腸内菌叢の優勢菌種の一つであり、生きているビフィドバクテリウム属菌を含む発酵乳等の食品への需要が高まっている。 Lactic acid bacteria such as Lactococcus spp. And Bifidobacterium spp. Are known to have an intestinal action that restores the balance of intestinal bacteria, an immune enhancing action, a carcinogenesis suppressing action, and the like. For this reason, in recent years, the use of lactic acid bacteria in foods has become active along with an increase in the health orientation of consumers. In particular, Bifidobacterium spp. Such as Bifidobacterium longum are one of the dominant species of intestinal flora formed in the human intestinal tract, and live Bifidobacterium spp. Demand for foods such as fermented milk is increasing.
ビフィドバクテリウム属菌は、乳性培地における増殖性が悪い。このため、発酵乳中に一定量の、例えば１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのビフィドバクテリウム属菌を含有させるために、通常、様々な生育促進物質を添加することが行われている。しかし、該生育促進物質は一般的に高価であり、かつ、風味が損なわれるおそれもある。また、ビフィドバクテリウム属菌は、酸性条件下での保存が難しく、死滅し易い。このため、発酵乳製品等が流通する過程で、発酵乳製品中の生きているビフィドバクテリウム属菌量は加速度的に減少してしまう。
そこで、ビフィドバクテリウム属菌の生育性や保存生残性を改善することにより、生きているビフィドバクテリウム属菌を多く含有する発酵乳を製造し得るばかりではなく、生きているビフィドバクテリウム属菌が、製造直後と同様に、消費者が摂食する時点においても豊富に含有されている発酵乳を製造し得ることが期待できる。
Bifidobacterium spp. Have poor growth in milky media. For this reason, in order to contain a certain amount of, for example, 1 × 10 7 CFU / mL of Bifidobacterium in fermented milk, various growth promoting substances are usually added. However, the growth promoting substance is generally expensive and the flavor may be impaired. In addition, Bifidobacterium is difficult to preserve under acidic conditions and is likely to die. For this reason, the amount of living Bifidobacterium spp. In the fermented dairy product decreases at an accelerated rate in the process of circulating the fermented dairy product and the like.
Therefore, by improving the viability and preservation viability of Bifidobacterium, not only can we produce fermented milk containing a lot of Bifidobacterium, but also Bifido It can be expected that bacterial bacteria can produce fermented milk that is abundantly contained at the time of consumption by consumers as well as immediately after production.
ビフィドバクテリウム属菌以外の乳酸菌と混合発酵をさせることにより、該生育促進物質等を添加することなく、ビフィドバクテリウム属菌の生育性や保存生残性を改善する種々の方法が開示されている。発酵乳製造におけるビフィドバクテリウム属菌の生育性を改善させる方法については、例えば、（１）ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）およびビフィドバクテリウム属菌を含有することを特徴とするヨーグルト及びその製造方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。 Disclosed are various methods for improving the viability and storage viability of Bifidobacterium by adding mixed fermentation with lactic acid bacteria other than Bifidobacterium, without adding the growth-promoting substance, etc. Has been. For example, (1) Lactococcus lactis subsp. Lactis, Lactococcus lactis subspices, Lactococcus lactis subsp. A yogurt characterized by containing cremolith (Lactococcus lactis subsp. Cremoris) and a genus Bifidobacterium and a method for producing the same are disclosed (for example, see Patent Document 1).
その他、発酵乳のビフィドバクテリウム属菌の保存生残性を改善させる方法については、例えば、（２）乳を主成分とする培地で、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、並びにダイアセチル及びアセトインを生成しないラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスを混合培養することを特徴とするビフィドバクテリウム属菌発酵乳の製造方法が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。
しかしながら、上記（１）の方法では、特定のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス菌種と特定のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種が存在する条件下で、ビフィドバクテリウム属菌の生育が促進され、発酵時間を短縮することができるものの、これらのラクトコッカス属菌によるビフィドバクテリウム属菌の生育促進効果や発酵時間短縮効果は、十分なものではなかった。また、特許文献１には、ビフィドバクテリウム属菌の保存生残性については一切記載がない。
一方、上記（２）の方法では、特定のビフィドバクテリウム属菌と特定の乳酸菌とからなる混合菌を用いることにより、増殖促進効果と生残性改善効果の両方が認められるものの、ビフィドバクテリウム・ブレーベ以外のビフィドバクテリウム属菌、例えば食品に汎用されているビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）については、一切記載がない。
However, in the method of (1) above, a Bifidobacterium genus bacterium is present under the condition where a specific Lactococcus lactis subspecies Lactis species and a specific Lactococcus lactis subspice species Cremoris species are present. However, the effect of promoting the growth of Bifidobacterium and the shortening of the fermentation time by these Lactococcus spp. Were not sufficient. In addition, Patent Document 1 does not describe any storage viability of Bifidobacterium.
On the other hand, in the above method (2), although both a growth promoting effect and a survival improving effect are recognized by using a mixed bacterium comprising a specific Bifidobacterium genus and a specific lactic acid bacterium, Bifidobacterium other than bacteria breve, for example, Bifidobacterium longum, which is widely used in foods, is not described at all.
本発明は、ビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善させ得る乳酸菌を提供することを目的とする。
また、本発明は、該乳酸菌を含有する菌末、医薬用組成物及び整腸剤、及び、該乳酸菌を用いるビフィズス菌の生育・生残性促進方法を提供することを目的とする。
An object of this invention is to provide the lactic acid bacteria which can improve the growth property and preservation | save survival property of bifidobacteria.
Another object of the present invention is to provide a bacterial powder containing the lactic acid bacterium, a pharmaceutical composition and an intestinal regulating agent, and a method for promoting the growth and survival of bifidobacteria using the lactic acid bacterium.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地における発酵性に優れた乳酸菌の菌株について、ビフィドバクテリウム属菌との混合培養による発酵試験を行い、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム属菌の菌数を５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム属菌の生育促進性や、発酵終了後に急冷して１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム属菌の生菌数を１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム属菌の保存生残性促進性を有する乳酸菌を見出し、本発明を完成させた。 As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted culturing of lactic acid bacteria excellent in fermentability in 10% (W / W) reduced skim milk medium by mixed culture with Bifidobacterium. When the fermentation test is performed and the pH reaches 4.4 to 4.6, the number of Bifidobacterium is 5 × 10 8 CFU / g or more, and the growth promotion of Bifidobacterium In addition, the viable count of Bifidobacterium is 1 × 10 7 CFU / g or more when rapidly cooled after the fermentation and kept at 10 ° C. for 2 weeks. The present invention was completed by finding a lactic acid bacterium having sex promoting properties.
すなわち、本発明は、下記の菌学的性質を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）菌種を提供するものである。
（１）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３０℃の温度範囲で１６時間培養した場合に、培地が凝固する発酵性、
（２）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生育促進性、
（３）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して、１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生菌数を１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの保存生残性促進性。
また、本発明は、キシロース資化性を有さず、かつ、ダイアセチル及びアセトインを生成しないことを特徴とする前記記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を提供するものである。
また、本発明は、菌株が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４９０）である、前記いずれか記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を含有する菌末を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を含有する医薬用組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を含有する整腸剤を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種と、ビフィドバクテリウム属菌とを混合培養することを特徴とする、ビフィドバクテリウム属菌の生育・生残性促進方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベである、前記記載のビフィドバクテリウム属菌の生育・生残性促進方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属菌の菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ−９９９及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベＡＴＣＣ１５７００である、前記記載のビフィドバクテリウム属菌の生育・生残性促進方法を提供するものである。
That is, the present invention provides a Lactococcus lactis subsp. Cremoris strain having the following mycological properties.
(1) Fermentability with which the medium solidifies when cultured in a 10% (W / W) reduced skim milk medium for 16 hours in a temperature range of 25-30 ° C.,
(2) When mixed with Bifidobacterium longum in 10% (W / W) reduced nonfat dry milk medium, when pH reaches 4.4 to 4.6, Bifidobacterium longum Growth promotion of Bifidobacterium longum, wherein the number of bacteria is 5 × 10 8 CFU / g or more,
(3) When mixed with Bifidobacterium longum in a 10% (W / W) reduced nonfat dry milk medium, when the pH reaches 4.4 to 4.6, the mixture is rapidly cooled at 2 ° C. Bifidobacterium longum preservation viability promoting ability when viable bacteria longum is 1 × 10 7 CFU / g or more when kept for a week.
The present invention also provides the aforementioned Lactococcus lactis subsp. Cremolith species, which does not have xylose utilization and does not produce diacetyl and acetoin.
In addition, the present invention provides a strain of Lactococcus lactis subspecies Cremolis according to any one of the above, wherein the strain is Lactococcus lactis subspecies cremolith MCC-876 (FERM P-21490). It is.
The present invention also provides a bacterial powder containing any of the aforementioned Lactococcus lactis subspecies Cremolis species.
The present invention also provides a pharmaceutical composition containing any of the aforementioned Lactococcus lactis subspecies Cremolis species.
In addition, the present invention provides an intestinal preparation containing any of the aforementioned Lactococcus lactis subspecies Cremolis species.
Further, the present invention provides a growth and growth of a Bifidobacterium genus characterized in that the Lactococcus lactis subspecies Cremolis species described above and a Bifidobacterium genus are mixed and cultured. A method for promoting survival is provided.
Further, the present invention provides the method for promoting the growth and survival of the Bifidobacterium as described above, wherein the Bifidobacterium is Bifidobacterium longum and / or Bifidobacterium breve Is to provide.
Further, the present invention provides the growth of Bifidobacterium as described above, wherein the strain of Bifidobacterium is Bifidobacterium longum ATCCBAA-999 and / or Bifidobacterium breve ATCC 15700.・ Provide survival promotion methods.
本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種、及び、本発明のビフィドバクテリウム属菌の生育・生残性促進方法により、ビフィドバクテリウム属菌の生育性や保存生残性を顕著に改善することができるため、従来に無くビフィドバクテリウム属菌を多く含有する発酵乳製品を、効率よく製造することができる。また、発酵乳製品中の生きているビフィドバクテリウム属菌含有量が、流通過程においても充分に維持されるため、より整腸効果の高い発酵乳製品を提供することができ、健康管理上も有用である。 By virtue of the Lactococcus lactis subspecies Cremolis species of the present invention and the method for promoting the growth and survival of Bifidobacterium of the present invention, the viability and preservation survival of the Bifidobacterium Can be remarkably improved, so that a fermented dairy product containing a large amount of Bifidobacterium unprecedented can be efficiently produced. In addition, the living Bifidobacterium content in the fermented dairy product is sufficiently maintained in the distribution process, so it is possible to provide a fermented dairy product with a higher intestinal effect, Is also useful.
本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種は、上記（１）、（２）、及び（３）の特性を有するものである。
（１）は、発酵性に関するものである。１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３０℃の温度範囲で１６時間培養した時に、培地を凝固させることができるほど増殖が早く、強い発酵性を有する乳酸菌であれば、発酵乳製造時に、ビフィドバクテリウム属菌（以下、ビフィズス菌ということがある。）の生育性等をより効果的に改善することができるためである。
The species of Lactococcus lactis subspecies Cremolis according to the present invention has the characteristics (1), (2), and (3).
(1) relates to fermentability. If it is a lactic acid bacterium that grows fast enough to solidify the medium when cultured in a 10% (W / W) reduced nonfat dry milk medium at a temperature range of 25-30 ° C. for 16 hours, it is fermentable. This is because the viability of the genus Bifidobacterium (hereinafter sometimes referred to as bifidobacteria) can be more effectively improved during milk production.
通常、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種に適した発酵温度範囲は、２０〜３０℃であるが、本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種は、２５〜３０℃の温度範囲で強い発酵性を有する菌である。 Usually, the fermentation temperature range suitable for Lactococcus lactis subspecies Cremolis species is 20 to 30 ° C, but the Lactococcus lactis subspice species Cremoris species of the present invention is 25 to 30 ° C. It is a fungus with strong fermentability in the temperature range.
（２）は、ビフィズス菌の生育促進性に関するものである。１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地等の乳性培地は、ｐＨが４．６付近になると、通常、含有されるカゼイン等が沈殿し、培地全体が凝固し、風味、食感及び外観が優れたものになる。このため、発酵乳製品を製造する場合には、一般に、ｐＨが４．６付近に達した時に、急冷等をすることにより発酵を停止する。したがって、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上という高濃度にすることができるような生育促進性を有する乳酸菌であれば、発酵乳製造時に、発酵乳中のビフィズス菌含有量をより効果的に改善することができるためである。 (2) relates to the growth promoting property of bifidobacteria. 10% (W / W) reduced skim milk medium and other dairy media usually have a casein content that precipitates when the pH reaches around 4.6, and the entire medium coagulates, resulting in flavor, texture and appearance. Will be excellent. For this reason, when manufacturing fermented milk products, generally, when pH reaches around 4.6, fermentation is stopped by quenching or the like. Therefore, when mixed with Bifidobacterium longum in 10% (W / W) reduced nonfat dry milk medium, when the pH reaches 4.4 to 4.6, bacteria of Bifidobacterium longum If it is a lactic acid bacterium having growth promoting properties that can increase the number to a high concentration of 5 × 10 8 CFU / g or more, the content of bifidobacteria in the fermented milk can be more effectively improved during the production of fermented milk. Because it can.
（３）は、ビフィズス菌の保存生残性促進性に関するものである。発酵乳製品の品質保持期限は、一般に、１０℃以下の保存条件で２週間程度である。したがって、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生菌数を１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上とすることができるような保存生残性促進性を有する乳酸菌であれば、品質保持期限終了間際においても充分量のビフィズス菌を含有し得る発酵乳を製造することができるためである。
本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種においては、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生残率を、本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種と混合培養しなかった場合の生残率の３倍以上、好ましくは４．５倍以上とすることができるような保存生残性促進性を有する乳酸菌であることが好ましい。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して、１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生残率を３０％以上、好ましくは４５％以上とすることができるような保存生残性促進性を有する乳酸菌であることがより好ましい。
(3) relates to the preservation viability of bifidobacteria. The shelf life of fermented dairy products is generally about two weeks under storage conditions of 10 ° C. or lower. Therefore, when mixed culture with Bifidobacterium longum in 10% (W / W) reduced nonfat dry milk medium, when pH reaches 4.4 to 4.6, it is rapidly cooled and held at 10 ° C for 2 weeks If the lactic acid bacterium has a storage viability promoting ability so that the viable count of Bifidobacterium longum can be 1 × 10 7 CFU / g or more, the quality retention period is about to end This is because fermented milk that can contain a sufficient amount of bifidobacteria can be produced.
In the Lactococcus lactis subspecies Cremolis species of the present invention, the pH is 4.4 to 4 when mixed culture with Bifidobacterium longum in 10% (W / W) reduced skim milk medium. The survival rate of Bifidobacterium longum was not mixed with the Lactococcus lactis subspices cremolith species of the present invention when rapidly cooled to 10 and kept at 10 ° C for 2 weeks. It is preferable that the lactic acid bacterium has a storage survival promoting property that can be 3 times or more, preferably 4.5 times or more of the survival rate in the case of the above. In particular, in the case of mixed culture with Bifidobacterium longum, when Bifidobacterium longum was rapidly cooled when the pH reached 4.4 to 4.6 and kept at 10 ° C for 2 weeks, It is more preferable that the lactic acid bacteria have a storage survival promoting ability so that the residual rate can be 30% or more, preferably 45% or more.
本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種は、例えば以下の方法により得ることができる。まず、各種の試料から菌株を分離し、この中から１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地での発酵性が優れたもの、すなわち、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３０℃の温度範囲で１６時間培養した時に、培地を凝固させることができる発酵性を有するものを選択する。次いで、選択された菌とビフィドバクテリウム・ロンガムとの混合培養試験を行い、優れたビフィズス菌の生育促進性及び保存生残性促進性を有する菌株を選択することにより得ることができる。 The Lactococcus lactis subspecies Cremolis species of the present invention can be obtained, for example, by the following method. First, strains were isolated from various samples, and 10% (W / W) reduced nonfat dry milk medium had excellent fermentability, that is, 10% (W / W) reduced nonfat dry milk medium. When culturing for 16 hours in a temperature range of ˜30 ° C., a fermentable substance capable of coagulating the medium is selected. Subsequently, it can obtain by performing the mixed culture test of the selected microbe and Bifidobacterium longum, and selecting the strain which has the growth promotion property and preservation | save survival promotion property of the outstanding bifidobacterium.
以下、さらに詳細に説明する。
１．菌株の取得
本発明者らは、前記の性質を有する菌株を自然界から取得すべく、日本国内の自然界から採集したサンプルを嫌気性希釈液（１９８０年叢文社発行、光岡知足著「腸内菌の世界」３２２ページ。以下、参考文献１と記載する。）で希釈し、Ｂｒｉｇｇｓ ｌｉｖｅｒ ｂｒｏｔｈ（前記参考文献１、３１９ページ）の平板に塗布し、３０℃で嫌気培養した。そして得られたコロニーの中で連鎖球菌の形態を示し、かつ塗布標本の顕微鏡観察によりグラム陽性である菌を釣菌した。該釣菌した菌を、ＢＬ寒天培地平板に画線塗布し、前記と同様の方法で嫌気培養を反復し、純粋単離された菌株を得た。これらの菌株を下記の方法を用いて、まず、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地中での発酵試験を行い、優れた発酵性を有する菌株を２０株得た。続いて、ビフィドバクテリウム・ロンガムとの混合培養試験を行い、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上とすることのできる生育促進性と、１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生菌数を１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上とすることのできる保存生残性促進性を有する菌株を２株取得した。該２菌株はそれぞれ、ＭＣＣ−８７６、ＭＣＣ−８８０と名付けられた。
This will be described in more detail below.
1. Acquisition of strains In order to acquire strains having the above-mentioned properties from the natural world, the present inventors collected anaerobic diluents from the natural world in Japan (published in 1980 by Tomonori Mitsuoka, “The World of Enteric Bacteria”. 322. (hereinafter referred to as “Reference 1”), and applied to a plate of Briggs liver broth (Reference 1, page 319) and anaerobically cultured at 30 ° C. And the bacteria which showed the form of streptococci in the obtained colony and were gram-positive by microscopic observation of the coated specimen were caught. The fish strains were streaked on a BL agar plate, and anaerobic culture was repeated in the same manner as described above to obtain a purely isolated strain. These strains were first subjected to a fermentation test in a 10% (W / W) reduced nonfat dry milk medium using the following method to obtain 20 strains having excellent fermentability. Subsequently, a mixed culture test with Bifidobacterium longum was conducted, and when the pH reached 4.4 to 4.6, the number of Bifidobacterium longum was 5 × 10 8 CFU / g or more. Growth promotion that can be carried out, and preservation viability promotion that allows the viable count of Bifidobacterium longum to be 1 × 10 7 CFU / g or more when kept at 10 ° C. for 2 weeks. Two strains were obtained. The two strains were named MCC-876 and MCC-880, respectively.
２．菌学的性質
前記２菌株の菌学的性質を、表１及び表２に示す。比較対象として、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５（＝ＮＣＩＢ８１３９）株、及び特許文献２に記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株の菌学的性質も示した。なお、菌学的性質を測定するための試験は、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、Peter H. A. Sneath編、第２巻、Williams and Wilkins Company、１９８６年）にほぼ従って行った。また、糖の発酵性は、光岡の糖発酵性用培地（１９７４年、光岡知足著「乳酸菌の細菌学」、臨床検査１８、１１６３〜１１７２ページ）を用いて、２８種類の糖について試験を行った。
2. Mycological properties Tables 1 and 2 show the mycological properties of the two strains. As comparative objects, the mycological properties of the Lactococcus lactis subspecies Cremolis ATCC9625 (= NCIB8139) strain and the Lactococcus lactis subspecies lactis type strain ATCC19435 described in Patent Document 2 were also shown. Tests for measuring mycological properties are described in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, edited by Peter HA Sneath, Volume 2, Williams and Wilkins Company, 1986). Almost done so. In addition, the fermentability of sugar was tested on 28 kinds of sugars using Mitsuoka's medium for sugar fermentability (1974, Tomochitsu Mitsuoka, “Bacteriology of Lactic Acid Bacteria”, Clinical Examination 18, pages 1163-1172). It was.
上記１〜１５に示す菌学的性質は、前記２菌株にほぼ共通しており、かつ、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５とも共通していた。一方で、糖の発酵性については、表２より明らかであるように、各菌株で異なる性質を示した。 The bacteriological properties shown in the above 1 to 15 were almost common to the two strains, and also common to Lactococcus lactis subspecies Cremolis ATCC9625. On the other hand, as is apparent from Table 2, the fermentability of sugar showed different properties for each strain.
以上の結果から、前記２菌株は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の菌学的性質を共通して有していることが明らかである。すなわち、前記２菌株は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種であることが確認された。一方、糖の発酵性から、前記２菌株は、公知のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスとは異なる性質を有することが明らかである。 From the above results, it is clear that the two strains share the bacteriological properties of Lactococcus lactis subspecies Cremolis species. That is, it was confirmed that the two strains were Lactococcus lactis subspecies Cremoris species. On the other hand, it is clear from the fermentability of sugar that the two strains have different properties from the known Lactococcus lactis subspecies cremolith.
そこで、出願人は、前記２菌株を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター 中央第６）に新規菌株として寄託した。このうち、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株の受託番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−２１４９０である（寄託日：平成２０年１月２４日）。 Therefore, the applicant deposited the two strains as new strains at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary (Tsukuba Center Central 6-1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture). Among these, the deposit number of Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-876 strain is FERM P-21490 (Deposit date: January 24, 2008).
３．１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地での発酵性試験
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９５℃で３０分間殺菌し、各菌株のスターターを３％接種し、２５及び３０℃の各温度で１６時間培養した。得られた培養液を急冷し、凝固状況、ｐＨ、及び含有される乳酸菌数を測定した。乳酸菌数の測定は、市販されているＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研機材社製）平板で行った。測定結果を表３に示す。
なお、対照株として、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス タイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた。
3. Fermentability test on 10% (W / W) reduced skim milk medium 10% (W / W) reduced skim milk medium was sterilized at 95 ° C. for 30 minutes, inoculated with 3% starter of each strain, 25 and The cells were cultured at each temperature of 30 ° C. for 16 hours. The obtained culture solution was rapidly cooled, and the coagulation state, pH, and the number of contained lactic acid bacteria were measured. The number of lactic acid bacteria was measured with a commercially available BCP-added plate count agar plate (manufactured by Eiken Kikai Co., Ltd.). Table 3 shows the measurement results.
As control strains, Lactococcus lactis subspecies Cremolis ATCC9625 strain and Lactococcus lactis subspecies lactis type strain ATCC19435 strain were used.
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株又はＭＣＣ−８８０株、すなわち、本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を用いた場合には、何れの温度条件においても、ｐＨが４．４〜４．６まで低下して培地が凝固した。また、含有される乳酸菌数も５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上であり、非常に増殖・発酵性の良いことが分かった。
一方、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株又はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス タイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた場合には、何れの温度条件においても、ｐＨが５．５以上であり、培地は凝固しなかった。また、本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種と比較して、特に３０℃において、乳酸菌数が顕著に少なかった。
When the Lactococcus lactis subspecies Cremolis strain MCC-876 or MCC-880 strain, that is, the Lactococcus lactis subspice species Cremoris strain of the present invention is used, the pH can be adjusted at any temperature condition. Decreased to 4.4 to 4.6, and the medium was solidified. Further, the number of lactic acid bacteria contained was 5 × 10 8 CFU / g or more, and it was found that the growth and fermentation properties were very good.
On the other hand, when Lactococcus lactis subspecies Cremolis ATCC9625 strain or Lactococcus lactis subspecies lactis type strain ATCC19435 strain is used, the pH is 5.5 or more at any temperature condition. The medium did not clot. Moreover, the number of lactic acid bacteria was remarkably small especially at 30 degreeC compared with the Lactococcus * lactis * subspecies Cremolis species of this invention.
４．ビフィズス菌との混合培養試験
（１）ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株との混合培養試験
本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の、ビフィズス菌に対する生育促進性及び保存生残性促進性を、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株を用いて確認した。
対照株として、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス タイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた。
まず、後記実施例１に記載の方法で、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株及び８８０株のカルチャー、及び、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャーを調製した。
また、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）入り１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株のカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃で１６時間培養して、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株のカルチャーを調製した。ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス タイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株のカルチャーも同様に調製した。
4). Mixed culture test with bifidobacteria (1) Mixed culture test with Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain Growth promotion and preservation of bifidobacteria species of Lactococcus lactis subsp. Survivability was confirmed using Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain.
As a control strain, Lactococcus lactis subspecies Cremolis ATCC9625 strain and Lactococcus lactis subspecies lactis type strain ATCC19435 strain were used.
First, the culture of Lactococcus lactis subspecies Cremoris MCC-876 strain and 880 strain and the culture of Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain were prepared by the method described in Example 1 below.
Further, 1000 mL of 10% (W / W) reduced skim milk medium containing 0.2% (W / W) yeast extract (manufactured by Difco) was sterilized at 90 ° C. for 30 minutes, and Lactococcus lactis subspecies cremolith ATCC9625. 30 mL of the culture of the strain was inoculated and cultured at 25 ° C. for 16 hours to prepare a culture of Lactococcus lactis subspecies Cremolis ATCC9625 strain. A culture of Lactococcus lactis subspecies lactis type strain ATCC 19435 was prepared in the same manner.
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したラクトコッカス属菌の各菌株のカルチャー１％と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー１％を接種し、３７℃で１６時間培養して発酵乳を得た。該発酵乳を急冷し、ｐＨ及び含有されるビフィズス菌数を測定した。さらに、１０℃で２週間保存し、保存後１週間及び２週間におけるビフィズス菌数を測定した。ビフィズス菌数の測定は、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業社製）平板で行なった。測定結果を表４に示す。 10% (W / W) reduced skim milk medium was sterilized at 90 ° C. for 10 minutes, 1% culture of each strain of Lactococcus prepared as described above, Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain 1% of the culture was inoculated and cultured at 37 ° C. for 16 hours to obtain fermented milk. The fermented milk was quenched and the pH and the number of Bifidobacterium contained were measured. Further, it was stored at 10 ° C. for 2 weeks, and the number of bifidobacteria was measured for 1 week and 2 weeks after the storage. The number of bifidobacteria was measured on a TOS propionate agar medium (Yakult Pharmaceutical Co., Ltd.) plate. Table 4 shows the measurement results.
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株又は８８０株をそれぞれ用いた発酵乳は、発酵後ｐＨがおよそ４．６であり、ビフィズス菌数が５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上に達した。また、該発酵乳を１０℃で２週間保存した場合のビフィズス菌生残率は、何れも４５％以上であった。
一方、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株又はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス タイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた発酵乳は、発酵が進まず、発酵後ｐＨが５．０以上であり、１０℃での保存試験が不可能であった。また、発酵終了直後のビフィズス菌数もおよそ１×１０８ＣＦＵ／ｇであり、本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種と比較して、顕著に少なかった。
Fermented milk using Lactococcus lactis subspecies Cremoris MCC-876 strain or 880 strain, respectively, had a pH of about 4.6 after fermentation, and the Bifidobacterium count reached 5 × 10 8 CFU / g or more. . Moreover, the bifidobacteria survival rate when the fermented milk was stored at 10 ° C. for 2 weeks was 45% or more.
On the other hand, fermented milk using Lactococcus lactis subspecies Cremolis ATCC 9625 strain or Lactococcus lactis subspecies lactis type strain ATCC 19435 strain does not proceed with fermentation, and the pH after fermentation is 5.0 or more, A storage test at 10 ° C. was not possible. In addition, the number of bifidobacteria immediately after the end of fermentation was about 1 × 10 8 CFU / g, which was significantly less than that of the Lactococcus lactis subspecies Cremolis species of the present invention.
すなわち、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株及び８８０株は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの公知の他の菌株よりも、ビフィズス菌に対する生育促進性及び保存生残性促進性が優れていることが明らかである。 That is, Lactococcus lactis subspecies Cremolis strains MCC-876 and 880 are more vigorous for promoting growth and preservation of bifidobacteria than other known strains of Lactococcus lactis subspices cremolith. It is clear that the properties are excellent.
（２）ビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株との混合培養試験
本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の、ビフィズス菌に対する生育促進性及び保存生残性促進性を、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株とビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株を用いて確認した。
まず、後記実施例１に記載の方法で、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のカルチャー、及び、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャーを調製した。
また、後記実施例９に記載の方法で、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）の混合カルチャーを調製した。
さらに、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス入り１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳培地を９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株のスターターを１０％接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して、ビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株のカルチャーを調製した。
(2) Mixed culture test with Bifidobacterium breve type strain ATCC15700 strain The Lactococcus lactis subspecies Cremolis sp. This was confirmed using the Fidobacterium longum ATCC BAA-999 strain and the Bifidobacterium breve type strain ATCC 15700 strain.
First, the culture of Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-876 strain and the culture of Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain were prepared by the method described in Example 1 below.
Moreover, the mixed culture of Streptococcus thermophilus (Streptococcus thermophilus) and Lactobacillus bulgaricus (Lactobacillus bulgaricus) was prepared by the method as described in Example 9 below.
Furthermore, 11% (W / W) nonfat dry milk medium containing 0.2% (W / W) yeast extract is sterilized at 90 ° C for 30 minutes and inoculated with 10% starter of Bifidobacterium breve type strain ATCC15700 strain. The culture of Bifidobacterium breve type strain ATCC15700 was prepared by culturing at 37 ° C. until the pH reached 4.6.
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のカルチャー１％と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー１％又はビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株のカルチャー１％と、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー０．０１％を接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して発酵乳を得た。該発酵乳を急冷し、含有されるビフィズス菌数を測定した。さらに、１０℃で２週間保存し、保存後１週間及び２週間におけるビフィズス菌数を測定した。
一方、対照として、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー１．５％又はビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株のカルチャー１．５％と、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー０．４％を接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して得た発酵乳のビフィズス菌数を同様に測定した。測定結果を表５に示す。
10% (W / W) reduced skim milk medium was sterilized at 90 ° C. for 10 minutes, and the culture of Lactococcus lactis subspecies Cremoris MCC-876 strain prepared as described above, Bifidobacterium Inoculated with 1% longum ATCC BAA-999 culture or 1% Bifidobacterium breve type strain ATCC15700 culture and 0.01% mixed culture of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus, 37 ° C And fermented milk was obtained by culturing until the pH reached 4.6. The fermented milk was rapidly cooled, and the number of bifidobacteria contained therein was measured. Further, it was stored at 10 ° C. for 2 weeks, and the number of bifidobacteria was measured for 1 week and 2 weeks after the storage.
On the other hand, as a control, a 10% (W / W) reduced skim milk medium was sterilized at 90 ° C. for 10 minutes, and the Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 culture 1.5% or B Inoculate a culture of 1.5% of F. breve type strain ATCC15700 and 0.4% of a mixed culture of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus and culture at 37 ° C. until pH is 4.6. The number of bifidobacteria in the fermented milk thus obtained was measured in the same manner. Table 5 shows the measurement results.
ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株と、ビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株の両株とも、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養することにより、発酵乳中のビフィズス菌数は顕著に増大した。
また、１０℃で２週間保存後のビフィズス菌生残率は、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株の場合、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養しなかった場合には約１３％であったのに対して、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養した場合には約６０％であった。つまり、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養することにより、１０℃で２週間保存後のビフィズス菌生残率は４．５倍以上改善された。
一方、ビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株の場合には、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養しなかった場合の１０℃で２週間保存後のビフィズス菌生残率は約０．０２％であったのに対して、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養した場合には約５％であり、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養することにより、１０℃で２週間保存後のビフィズス菌生残率は著しく改善されていた。
なお、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株に代えて、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８８０株を用いた場合にも同様の結果が得られた。
Both Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain and Bifidobacterium breve type strain ATCC 15700 strain are mixed and cultured with Lactococcus lactis subspices cremolith MCC-876 strain to produce fermented milk. The number of bifidobacteria in it increased significantly.
In addition, the bifidobacteria survival rate after storage at 10 ° C. for 2 weeks was not mixed and cultured with Lactococcus lactis subspices Cremoris MCC-876 in the case of Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain. In some cases, it was about 13%, whereas in the case of mixed culture with Lactococcus lactis subspecies Cremoris MCC-876, it was about 60%. That is, by virtue of mixed culture with Lactococcus lactis subspecies Cremoris MCC-876 strain, the survival rate of bifidobacteria after storage at 10 ° C. for 2 weeks was improved by 4.5 times or more.
On the other hand, in the case of Bifidobacterium breve type strain ATCC 15700 strain, Bifidobacterium survival after storage for 2 weeks at 10 ° C. when not mixed culture with Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-876 strain The rate was about 0.02%, whereas it was about 5% when mixed with Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-876 strain, and Lactococcus lactis subspecies cremolith By virtue of mixed culture with the MCC-876 strain, the survival rate of bifidobacteria after storage at 10 ° C. for 2 weeks was remarkably improved.
Similar results were obtained when the Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-880 strain was used instead of the Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-876 strain.
すなわち、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株及びＭＣＣ−８８０株は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ等の、ビフィドバクテリウム・ロンガム以外のビフィズス菌に対しても、優れた生育促進性及び保存生残性促進性を有することが明らかである。 That is, Lactococcus lactis subspecies Cremolis strains MCC-876 and MCC-880 are excellent in promoting growth against Bifidobacterium other than Bifidobacterium longum such as Bifidobacterium breve. It is clear that it has the ability to promote survival and preservation survival.
５．特許文献１記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの混合物との比較試験
まず、上記４（２）記載の方法で、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のカルチャー、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー、及び、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャーを調製した。
5. Comparative test of Lactococcus lactis subspecies lactis and a mixture of Lactococcus lactis subspecies cremolith described in Patent Document 1 First, in the method described in 4 (2) above, Lactococcus lactis subspecies A culture of Cremolis MCC-876 strain, a culture of Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain, and a mixed culture of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus were prepared.
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のカルチャー１％と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー１％と、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー０．０１％を接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して発酵乳を得た。該発酵乳を急冷し、含有されるビフィズス菌数を測定した。
一方、対照として、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー１％と、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの混合物「ＥＺＡＬ ＭＡ１４」（Ｒｈｏｄｉａ社製）２％を接種し、３８℃でｐＨが４．６になるまで培養して得た発酵乳のビフィズス菌数を同様に測定した。なお、「ＥＺＡＬ ＭＡ１４」は、特許文献１に記載の「ＥＺＡＬ ＭＲ０１４」（Ｒｈｏｄｉａ社製）に相当する混合物である。
10% (W / W) reduced skim milk medium was sterilized at 90 ° C. for 10 minutes, and the culture of Lactococcus lactis subspecies Cremoris MCC-876 strain prepared as described above, Bifidobacterium Inoculated with 1% longum ATCC BAA-999 culture and 0.01% mixed culture of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus and cultured at 37 ° C until pH becomes 4.6. Obtained. The fermented milk was rapidly cooled, and the number of bifidobacteria contained therein was measured.
On the other hand, 10% (W / W) reduced nonfat dry milk medium was sterilized at 90 ° C. for 10 minutes, Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain 1% prepared as described above, and lactococcus -Inoculated with 2% EZAL MA14 (Rhodia) mixture of Lactis subspecies Lactis and Lactococcus lactis subspecies Cremolis, and cultured at 38 ° C until pH reached 4.6. The number of bifidobacteria in fermented milk was similarly measured. “EZAL MA14” is a mixture corresponding to “EZAL MR014” (manufactured by Rhodia) described in Patent Document 1.
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株を用いた発酵乳では、ビフィズス菌数は５．７×１０８ＣＦＵ／ｇであった。これに対し、「ＥＺＡＬ ＭＡ１４」を用いた発酵乳を１０６倍に希釈した希釈溶液からは、ビフィズス菌が全く検出されず、該発酵乳に含有されるビフィズス菌数は１×１０６ＣＦＵ／ｇ以下であることが判明した。 In fermented milk using Lactococcus lactis subspecies Cremoris MCC-876 strain, the Bifidobacterium count was 5.7 × 10 8 CFU / g. On the other hand, no bifidobacteria were detected in the diluted solution obtained by diluting fermented milk using “EZAL MA14” 10 6 times, and the number of bifidobacteria contained in the fermented milk was 1 × 10 6 CFU / It was found to be g or less.
すなわち、特許文献１記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスを、ビフィドバクテリウム・ロンガムとを、混合培養した場合には、特許文献１に記載されているようなビフィズス菌の生育促進及び発酵時間の短縮という効果を得ることができないことが明らかである。 That is, when Lactococcus lactis subspecies lactis and Lactococcus lactis subspecies cremolith described in Patent Document 1 are mixed and cultured with Bifidobacterium longum, it is described in Patent Document 1. It is clear that the effects of promoting the growth of Bifidobacterium and shortening the fermentation time cannot be obtained.
以上のように、本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種、特に、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株及び８８０株の２菌株は、ビフィズス菌に適した発酵温度範囲における１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、強い発酵性を示し、さらに、ビフィズス菌と混合培養した場合に、ビフィズス菌の生育及び保存生残に対し、優れた促進効果を示すことから、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの公知の菌株にみられなかった性質を持っていることは明らかである。 As described above, the Lactococcus lactis subspecies Cremolis species, particularly the Lactococcus lactis subsp. Cremolith strains MCC-876 and 880, are suitable for the fermentation temperature suitable for Bifidobacterium. 10% (W / W) reduced nonfat dry milk medium in the range, exhibiting strong fermentability, and, when mixed culture with bifidobacteria, exhibits an excellent promoting effect on the growth and storage survival of bifidobacteria From the above, it is clear that the strain has properties not found in known strains of Lactococcus lactis subspecies Cremoris.
本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種は、自然界から分離した乳酸菌の中から、発酵性、ビフィズス菌の生育促進性及び保存生残性促進性を有するものを選び出し得られたものである。したがって、本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種は、発酵性食品等をはじめとする様々な飲食物に、安全に利用することが可能である。非常に強い発酵性を有するため、効率よく発酵乳等の発酵物を製造することができる。ダイアセチル及びアセトインを生成しないため、風味の良い発酵物を製造することも期待できる。 The Lactococcus lactis subspecies Cremolis species of the present invention can be selected from lactic acid bacteria isolated from nature and having fermentability, growth promotion of bifidobacteria and storage survival promotion. It is. Therefore, the Lactococcus lactis subspecies Cremolis species of the present invention can be safely used for various foods and drinks including fermented foods. Since it has very strong fermentability, fermented products such as fermented milk can be produced efficiently. Since it does not produce diacetyl and acetoin, it can be expected to produce a fermented product with a good flavor.
本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種は、他の乳酸菌と同様に、菌末の形態で用いることもできる。該菌末は、例えば、食品や飼料に添加して用いることもできる。
また、本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種は、整腸剤等の医薬品組成物としても好ましい。整腸剤として用いる場合において、本発明のラクトコッカス属菌の、整腸剤中の含有量や１日あたりの摂取量等は、整腸効果が期待できる量であれば、特に限定されるものではない。例えば、１日あたり、１×１０９ＣＦＵ程度のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を摂取することが好ましい。
The Lactococcus lactis subspecies Cremolis species of the present invention can also be used in the form of a bacterial powder, like other lactic acid bacteria. The bacterial powder can be used by adding to food or feed, for example.
In addition, the Lactococcus lactis subspecies Cremolis species of the present invention is also preferable as a pharmaceutical composition such as an intestinal adjuster. When used as an intestinal adjuster, the content of the Lactococcus spp. Of the present invention in the intestinal adjuster, the daily intake, etc. are not particularly limited as long as the intestinal effect can be expected. For example, it is preferable to ingest about 1 × 10 9 CFU of Lactococcus lactis subspecies Cremolis species per day.
本発明において、ビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の前培養に用いられる培地は、通常用いられる培地であれば、特に限定されるものではないが、乳性培地であることが好ましい。取り扱いが簡便であるため、還元脱脂粉乳培地が特に好ましい。該還元脱脂粉乳培地の濃度は、３％（Ｗ／Ｗ）以上が好ましく、８％（Ｗ／Ｗ）以上が特に好ましい。その他、前培養に用いられる培地には、酵母エキス等の生育促進物質や、Ｌ−システイン等の還元剤等を添加することができる。特にビフィズス菌は乳性培地での増殖性が低いため、生育促進物質を添加した培地を用いることが好ましい。例えば、０．１〜１％（Ｗ／Ｗ）の酵母エキスを含有した培地を用いることができる。また、前培養に用いられる培地は、殺菌処理をしたものを用いる。該殺菌処理は、通常用いられる方法で行うことができ、例えば、８０〜１２２℃で５〜４０分間、好ましくは８５〜９５℃で５〜３５分間の加熱処理により行うことができる。 In the present invention, the medium used for preculture of Bifidobacteria and Lactococcus lactis subspecies Cremolis species is not particularly limited as long as it is a commonly used medium, but is a milky medium. Is preferred. A reduced skim milk medium is particularly preferred because of easy handling. The concentration of the reduced skim milk medium is preferably 3% (W / W) or more, particularly preferably 8% (W / W) or more. In addition, growth promoting substances such as yeast extract, reducing agents such as L-cysteine, and the like can be added to the medium used for preculture. In particular, since bifidobacteria have a low growth ability in a milky medium, it is preferable to use a medium to which a growth promoting substance is added. For example, a medium containing 0.1 to 1% (W / W) yeast extract can be used. Moreover, the culture medium used for preculture uses what sterilized. The sterilization treatment can be performed by a commonly used method, for example, by heat treatment at 80 to 122 ° C. for 5 to 40 minutes, preferably 85 to 95 ° C. for 5 to 35 minutes.
本発明のビフィズス菌の生育・生残性促進方法により、簡便かつ効率よく、ビフィズス菌の生育と保存生残性を改善させることができる。該方法は、具体的には、本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種とビフィズス菌を混合培養することにより行われる。混合培養の際の、ビフィズス菌と本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種のスターターの混合培養用ベースへの接種比率は、特に限定されるものではないが、１００：１〜１：１０が好ましく、１０：１〜１：１が特に好ましい。また、該ベースへ添加する量も、特に限定されるものではないが、ビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を合わせた添加量が、該ベースに対して０．０１〜１０（Ｖ／Ｖ）％が好ましく、０．１〜５（Ｖ／Ｖ）％が特に好ましい。なお、該方法が供されるビフィズス菌としては、ビフィドバクテリウム・ロンガムやビフィドバクテリウム・ブレーベであることが好ましく、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ−９９９やビフィドバクテリウム・ブレーベＡＴＣＣ１５７００であることがより好ましい。 By the method for promoting the growth and survival of bifidobacteria of the present invention, the growth and storage viability of bifidobacteria can be improved simply and efficiently. Specifically, this method is carried out by culturing a mixture of Lactococcus lactis subspecies Cremolis species and Bifidobacterium of the present invention. The inoculation ratio of the bifidobacteria and the starter of the Lactococcus lactis subspecies Cremolis species starter in the mixed culture to the base for mixed culture is not particularly limited, but is 100: 1 to 1 : 10 is preferable, and 10: 1 to 1: 1 is particularly preferable. The amount to be added to the base is not particularly limited, but the combined amount of the bifidobacteria and the species of Lactococcus lactis subspecies Cremolis is 0.01 to 10 with respect to the base. (V / V)% is preferable, and 0.1 to 5 (V / V)% is particularly preferable. The Bifidobacterium to which the method is applied is preferably Bifidobacterium longum or Bifidobacterium breve, such as Bifidobacterium longum ATCCBAA-999 or Bifidobacterium breve ATCC 15700. More preferably.
該ベースは、ビフィズス菌と乳酸菌の混合培養に通常用いられるベースであれば、特に限定されるものではないが、乳を主成分とするベースであることが好ましい。本発明のビフィズス菌の生育・生残性促進方法により、ビフィズス菌の生育にあまり適さない乳性培地においても、ビフィズス菌の生育・生残性を改善することができるためである。該ベースは、例えば、牛乳、脱脂乳、生クリーム、バター、全粉乳、脱脂粉乳等に、必要に応じて蔗糖等の甘味料、ペクチン、果実、フルーツジュース、寒天、ゼラチン、油脂、香料、着色料、安定剤、還元剤等を配合し、常法に従って殺菌、均質化、冷却等することにより調製することができる。特にビフィズス菌を含有する発酵乳等の製造に用いられることが好ましい。 The base is not particularly limited as long as it is a base usually used for mixed culture of bifidobacteria and lactic acid bacteria, but is preferably a base mainly composed of milk. This is because the growth / survival property of bifidobacteria can be improved even in a dairy medium that is not very suitable for the growth of bifidobacteria by the method for promoting the growth / survival property of bifidobacteria of the present invention. The base is, for example, milk, skim milk, fresh cream, butter, whole milk powder, skim milk powder, sweetener such as sucrose, pectin, fruit, fruit juice, agar, gelatin, oil, fat, flavor, coloring It can be prepared by blending a material, a stabilizer, a reducing agent, etc., and sterilizing, homogenizing, cooling and the like according to a conventional method. In particular, it is preferably used for producing fermented milk containing bifidobacteria.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
［実施例１］
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃１６時間培養した。一方、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス入り１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃６時間培養した。
これとは別に、脱脂粉乳、全粉乳及び蔗糖等の原料を混合溶解し、乳脂肪０．５％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分８．０％（Ｗ／Ｗ）、蔗糖５．０％（Ｗ／Ｗ）、ペクチン０．２％（Ｗ／Ｗ）からなるベース５０Ｌを、９０℃で１０分間殺菌し，４０℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のカルチャー５０ｍＬとビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー５００ｍＬを接種し、３７℃１６時間培養して発酵乳を得た。該発酵乳を直ちに攪拌冷却し、冷却発酵乳を１５ＭＰａの圧力で均質化し、２００ｍＬ容のガラス容器に充填し、密封し、ドリンクヨーグルトを得た。得られたドリンクヨーグルトはｐＨ４．６であり、６．０×１０８ＣＦＵ／ｇのビフィズス菌を含有していた。このドリンクヨーグルトを１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は５．０×１０８ＣＦＵ／ｇであり、生残率は８３％であった。
[Example 1]
1000 mL of 10% (W / W) reduced skim milk medium was sterilized at 90 ° C. for 30 minutes, and 30 mL of seed culture of Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-876 strain was inoculated and cultured at 25 ° C. for 16 hours. On the other hand, 1000 mL of 11% (W / W) skim milk medium containing 0.2% (W / W) yeast extract was sterilized at 90 ° C. for 30 minutes, and 100 mL of the seed culture of Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain was obtained. Inoculated and incubated at 37 ° C. for 6 hours.
Separately, raw materials such as skim milk powder, whole milk powder, and sucrose are mixed and dissolved to obtain 0.5% (W / W) milk fat, 8.0% non-fat milk solid content (W / W), and sucrose. A base 50L composed of 0% (W / W) and pectin 0.2% (W / W) was sterilized at 90 ° C. for 10 minutes and cooled to 40 ° C. The sterilized base was inoculated with 50 mL of the culture of Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-876 strain and 500 mL of the culture of Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain which had been precultured as described above, and 37 Fermented milk was obtained by culturing at 16 ° C. for 16 hours. The fermented milk was immediately stirred and cooled, and the cooled fermented milk was homogenized at a pressure of 15 MPa, filled in a 200 mL glass container and sealed to obtain a drink yogurt. The drink yogurt obtained had a pH of 4.6 and contained 6.0 × 10 8 CFU / g bifidobacteria. When this drink yogurt was stored at 10 ° C. for 14 days, the number of bifidobacteria was 5.0 × 10 8 CFU / g, and the survival rate was 83%.
［実施例２］
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株の代わりにラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８８０株を用いた以外は、実施例１と同様にしてドリンクヨーグルトを得た。得られたドリンクヨーグルトはｐＨ４．５６であり、７．１×１０８ＣＦＵ／ｇのビフィズス菌を含有していた。このドリンクヨーグルトを１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は５．７×１０８ＣＦＵ／ｇであり、生残率は８０％であった。
[Example 2]
A drink yogurt was obtained in the same manner as in Example 1 except that Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-880 was used instead of Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-876. The drink yogurt obtained had a pH of 4.56 and contained 7.1 × 10 8 CFU / g bifidobacteria. When this drink yogurt was stored at 10 ° C. for 14 days, the number of bifidobacteria was 5.7 × 10 8 CFU / g, and the survival rate was 80%.
［実施例３］
肉エキス５０ｇ、酵母エキス１００ｇ、ペプトン１００ｇ、乳糖２００ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ５０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １０ｇ、シスチン４ｇ及び水９．５Ｌの組成からなる培地で２５℃１６時間前培養したラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のシードカルチャー５００ｍＬを、前記培地と同一組成の培地１０Ｌに接種し、２５℃１６時間培養した。更に、９０℃で３０分間殺菌した前記培地と同一組成の培地２００Ｌに、前記培養液全量（１０．５Ｌ）を接種し、２５℃１６時間培養した。培養後の生菌数は２．９×１０９ＣＦＵ／ｍＬであった。
次いで、シャープレス型遠心分離機を用いて、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ）により菌体を集め、培地と同量の生理食塩水（９０℃３０分間殺菌済）に再懸濁し、前記と同様遠心分離して再度集菌した。集めた菌体を、脱脂粉乳１０％（Ｗ／Ｗ）、蔗糖１％（Ｗ／Ｗ）、グルタミン酸ソーダ１％（Ｗ／Ｗ）からなる溶液（９０℃３０分間殺菌済）２０Ｌに懸濁し、常法に従って凍結乾燥し、８．４×１０10ＣＦＵ／ｇのラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６を含む粉末約２．２ｋｇを得た。
[Example 3]
Lactococcus lactis pre-cultured at 25 ° C. for 16 hours in a medium comprising 50 g of meat extract, 100 g of yeast extract, 100 g of peptone, 200 g of lactose, 50 g of K 2 HPO 4 , 10 g of KH 2 PO 4 , 4 g of cystine and 9.5 L of water. -500 mL of seed culture of Subspecies Cremoris MCC-876 strain was inoculated into 10 L of medium having the same composition as the above medium and cultured at 25 ° C for 16 hours. Further, 200 L of the medium having the same composition as the medium sterilized at 90 ° C. for 30 minutes was inoculated with the whole culture solution (10.5 L) and cultured at 25 ° C. for 16 hours. The viable cell count after culture was 2.9 × 10 9 CFU / mL.
Next, using a sharpless centrifuge, the cells are collected by centrifugation (15,000 rpm), resuspended in the same amount of physiological saline (sterilized at 90 ° C. for 30 minutes) as the medium, and centrifuged as described above. Separated and collected again. The collected bacterial cells are suspended in 20 L of a solution (sterilized at 90 ° C. for 30 minutes) composed of skim milk powder 10% (W / W), sucrose 1% (W / W), sodium glutamate 1% (W / W), It was freeze-dried according to a conventional method to obtain about 2.2 kg of powder containing 8.4 × 10 10 CFU / g of Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-876.
［実施例４］
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株の代わりにラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８８０株を用いた以外は、実施例３と同様にして、８．０×１０10ＣＦＵ／ｇのラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８８０を含む粉末約２．２ｋｇを得た。
[Example 4]
8.0 × 10 10 CFU in the same manner as in Example 3, except that Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-880 strain was used instead of Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-876 strain. About 2.2 kg of powder containing / g Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-880 was obtained.
［実施例５］
乾燥殺菌した澱粉１４ｋｇ及び乳糖６ｋｇに、実施例３で得られたラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６を含む粉末２０ｇを加えて均一に混合し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６の菌末を含有する整腸剤約２０ｋｇを得た。
[Example 5]
To 14 kg of dried pasteurized starch and 6 kg of lactose, 20 g of powder containing Lactococcus lactis subspecies cremolith MCC-876 obtained in Example 3 was added and mixed uniformly, and Lactococcus lactis subspices cremolith was mixed. About 20 kg of an intestinal regulating agent containing MCC-876 bacterial powder was obtained.
［実施例６］
乾燥殺菌した澱粉１４ｋｇ及び乳糖６ｋｇに、実施例４で得られたラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８８０を含む粉末２０ｇを加えて均一に混合し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８８０の菌末を含有する整腸剤約２０ｋｇを得た。
[Example 6]
To 14 kg of dry sterilized starch and 6 kg of lactose, 20 g of powder containing Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-880 obtained in Example 4 was added and mixed uniformly, and Lactococcus lactis subspecies cremolith was mixed. About 20 kg of an intestinal regulating agent containing MCC-880 bacterial powder was obtained.
［実施例７］
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃１６時間培養した。
これとは別に、乳脂肪３．０％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分９．５％（Ｗ／Ｗ）からなる生乳５０Ｌを７０℃に加温し、１５ＭＰａの圧力で均質化した後、９０℃で１０分間殺菌し，４０℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のカルチャー５００ｍＬを接種し、５００ｍＬ容の樹脂容器に充填し、密封し、２５℃１６時間培養した後、直ちに冷却した。得られた発酵乳はｐＨ４．７０であり、１．３×１０９ＣＦＵ／ｇの乳酸菌を含有していた。
[Example 7]
1000 mL of 10% (W / W) reduced skim milk medium was sterilized at 90 ° C. for 30 minutes, and 30 mL of seed culture of Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-876 strain was inoculated and cultured at 25 ° C. for 16 hours.
Separately, 50 L of raw milk consisting of milk fat 3.0% (W / W) and non-fat milk solid content 9.5% (W / W) was heated to 70 ° C. and homogenized at a pressure of 15 MPa. Then, it sterilized at 90 degreeC for 10 minutes, and cooled to 40 degreeC. The sterilized base was inoculated with 500 mL of the culture of Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-876 strain that had been pre-cultured as described above, filled into a 500 mL resin container, sealed, and sealed at 25 ° C. for 16 hours. Immediately after incubation, it was cooled. The obtained fermented milk had a pH of 4.70 and contained 1.3 × 10 9 CFU / g lactic acid bacteria.
［実施例８］
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株の代わりにラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８８０株を用いた以外は、実施例７と同様にして、発酵乳を得た。得られた発酵乳はｐＨ４．６５であり、１．４×１０９ＣＦＵ／ｇの乳酸菌を含有していた。
[Example 8]
Fermented milk was obtained in the same manner as in Example 7, except that the Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-880 strain was used instead of the Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-876 strain. The obtained fermented milk had a pH of 4.65 and contained 1.4 × 10 9 CFU / g lactic acid bacteria.
［実施例９］
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃１６時間培養した。また、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１５００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ハンゼン社製）とラクトバチルス・ブルガリクス（ハンゼン社製）の混合カルチャー５０ｍＬを接種し、３７℃５時間培養した。
これとは別に、乳脂肪３．０％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分９．０％（Ｗ／Ｗ）からなる生乳５０Ｌを７０℃に加温し、１５ＭＰａの圧力で均質化した後、９０℃で１０分間殺菌し，４０℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のカルチャー５００ｍＬ、及びストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー５０ｍＬを接種し、５００ｍＬ容の樹脂容器に充填し、密封し、３７℃７時間培養した後、直ちに冷却した。得られた発酵乳はｐＨ４．７５であり、９．８×１０８ＣＦＵ／ｇの乳酸菌を含有していた。
[Example 9]
1000 mL of 10% (W / W) reduced skim milk medium was sterilized at 90 ° C. for 30 minutes, and 30 mL of seed culture of Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-876 strain was inoculated and cultured at 25 ° C. for 16 hours. Moreover, 1500 mL of 10% (W / W) reduced skim milk medium is sterilized at 90 ° C. for 30 minutes, and 50 mL of a mixed culture of Streptococcus thermophilus (manufactured by Hansen) and Lactobacillus bulgaricus (manufactured by Hansen) is inoculated. And cultured at 37 ° C. for 5 hours.
Separately, 50 L of raw milk consisting of milk fat 3.0% (W / W) and non-fat milk solid content 9.0% (W / W) was heated to 70 ° C. and homogenized at a pressure of 15 MPa. Then, it sterilized at 90 degreeC for 10 minutes, and cooled to 40 degreeC. The sterilized base is inoculated with 500 mL of the culture of Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-876 strain previously cultured as described above, and 50 mL of a mixed culture of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus, A 500 mL resin container was filled, sealed, incubated at 37 ° C. for 7 hours, and then immediately cooled. The obtained fermented milk had a pH of 4.75 and contained 9.8 × 10 8 CFU / g lactic acid bacteria.
［実施例１０］
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株の代わりにラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８８０株を用いた以外は、実施例９と同様にして、発酵乳を得た。得られた発酵乳はｐＨ４．７０であり、１．６×１０９ＣＦＵ／ｇの乳酸菌を含有していた。
[Example 10]
Fermented milk was obtained in the same manner as in Example 9 except that Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-880 was used instead of Lactococcus lactis subspecies Cremolis MCC-876. The obtained fermented milk had a pH of 4.70 and contained 1.6 × 10 9 CFU / g lactic acid bacteria.
本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種は、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、酸性乳飲料等の発酵乳製品中でのビフィズス菌の菌数及び保存生残性を高く維持できるため、健康管理上及び発酵乳製品の製造上有用であり、発酵乳製品等の製造分野で利用が可能である。 The Lactococcus lactis subspecies Cremolis species of the present invention can maintain a high number of bifidobacteria and preserved viability in fermented dairy products such as yogurt, drink yogurt, and acidic milk beverages. It is useful for the production of fermented dairy products and can be used in the field of production of fermented dairy products and the like.
Claims (9)
（１）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３０℃の温度範囲で１６時間培養した場合に、培地が凝固する発酵性、
（２）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）と混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生育促進性、
（３）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して、１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生菌数を１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの保存生残性促進性。 A species of Lactococcus lactis subsp. Cremoris having the following mycological properties: Lactococcus lactis subsp.
(1) Fermentability with which the medium solidifies when cultured in a 10% (W / W) reduced skim milk medium for 16 hours in a temperature range of 25-30 ° C.,
(2) When mixed with Bifidobacterium longum in a 10% (W / W) reduced nonfat dry milk medium, when the pH reaches 4.4 to 4.6, the Bifidobacterium The growth promoting ability of Bifidobacterium longum, wherein the number of Um longum is 5 × 10 8 CFU / g or more,
(3) When mixed with Bifidobacterium longum in a 10% (W / W) reduced nonfat dry milk medium, when the pH reaches 4.4 to 4.6, the mixture is rapidly cooled at 2 ° C. Bifidobacterium longum preservation viability promoting ability when viable bacteria longum is 1 × 10 7 CFU / g or more when kept for a week.
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