JP2009184984A - New peptide - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、特定のアミノ酸配列を有する新規ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩に関する。さらに本発明は、これらの新規ペプチド等を含む組成物、これらの新規ペプチド等を利用する方法、これらの新規ペプチド等の使用、ならびにこれらの新規ペプチド等をコードするポリヌクレオチド等に関する。本発明の新規ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩は、細胞におけるコラーゲンの産生を促進させるために利用され得る。 The present invention relates to a novel peptide having a specific amino acid sequence or a derivative thereof or a salt thereof. Furthermore, the present invention relates to a composition containing these novel peptides and the like, a method of using these novel peptides and the like, use of these novel peptides and the like, and polynucleotides encoding these novel peptides and the like. The novel peptide of the present invention or a derivative thereof or a salt thereof can be used to promote the production of collagen in cells.
従来、動物の結合組織には、その主要成分として、コラーゲン、ヒアルロン酸、エラスチン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ラミニンなどが含まれていることが分かっている。なかでも、コラーゲンは、後述の通り、結合組織において重要な役割を果たしている。 Conventionally, it has been known that connective tissues of animals contain collagen, hyaluronic acid, elastin, chondroitin sulfate, heparan sulfate, dermatan sulfate, laminin and the like as main components. Among these, collagen plays an important role in connective tissue as described later.
即ち、コラーゲンは、動物の結合組織を構成する主要蛋白質であり、特にヒトの体の総蛋白質の３０％近くをコラーゲンが占める。コラーゲンの主たる機能は、生体組織の骨格構造の形成にあるので、動物の組織形態の骨格構造を構成する主成分として皮膚、軟骨組織、角膜、心臓、肝臓等に広く分布する。コラーゲンは、各種細胞の接着、細胞の分化や増殖に対して特異的に作用し、細胞機能の調節因子としての役割も持っているため、コラーゲンの減少は、角膜潰瘍等の角膜障害、リューマチ、関節炎、変形性関節炎、骨関節炎等の関節障害、炎症性疾患等の様々な疾患を引き起こすことがある。また近年コラーゲンには、消化器官での潰瘍の進行を抑制したり、血圧上昇を抑制したりする機能もあることが見出されてきている。 That is, collagen is a major protein constituting the connective tissue of animals, and collagen occupies nearly 30% of the total protein of the human body. Since the main function of collagen is in the formation of a skeletal structure of living tissue, it is widely distributed in skin, cartilage tissue, cornea, heart, liver, etc. as the main component constituting the skeletal structure of animal tissue form. Collagen acts specifically on cell adhesion, cell differentiation and proliferation, and also has a role as a regulator of cell function. Collagen reduction is caused by corneal disorders such as corneal ulcer, rheumatism, It may cause various diseases such as arthritis, osteoarthritis, joint disorders such as osteoarthritis, and inflammatory diseases. In recent years, it has been found that collagen also has a function of suppressing the progression of ulcers in the digestive organs and suppressing an increase in blood pressure.
皮膚真皮細胞外マトリックスでは、コラーゲン線維が網目状の束を形成することにより組織形態を維持している。コラーゲン線維は、成熟し増殖して架橋形成が進行すると太く直線的な線維束となり、若い皮膚での適度なハリを与えている。しかし、老化した皮膚では線維芽細胞の活性（例えば、コラーゲン産生活性等）が低下するのに伴い、真皮細胞外マトリックスのコラーゲン線維が著しく減少したり、異常な老化架橋が形成されるため硬直して、本来の弾力性に富むハリが失われてしまう。その結果、皮膚にはシワやタルミが形成される。光老化によるヘアレスマウスのコラーゲン線維束構造の変化が詳細に検討され（非特許文献１参照）、ＵＶＢを照射したヘアレスマウスには、シワが形成され、シワの形成と一致するようにコラーゲン線維束構造が崩壊し皮膚弾力性が低下していくことが示されている。また、コラーゲンは水分保持機能に優れていることも知られている。 In the cutaneous dermal extracellular matrix, collagen fibers maintain a network morphology by forming a network bundle. Collagen fibers become thick and linear fiber bundles when they mature and proliferate and crosslink formation proceeds, giving moderate elasticity in young skin. However, in aging skin, as fibroblast activity (for example, collagen production activity) decreases, collagen fibers in the dermal extracellular matrix are remarkably reduced or abnormal aging crosslinks are formed. As a result, the inherent elasticity is lost. As a result, wrinkles and tarmi are formed on the skin. Changes in the structure of collagen fiber bundles in hairless mice due to photoaging have been examined in detail (see Non-Patent Document 1). Collagen fiber bundles are formed so that wrinkles are formed in hairless mice irradiated with UVB and coincide with the formation of wrinkles. It has been shown that the structure collapses and skin elasticity decreases. It is also known that collagen is excellent in water retention function.
コラーゲンの減少による状態を改善するために、種々のコラーゲン合成促進物質が見出されている。例えば、レチノイン酸（例えば、非特許文献２参照）、グリシンおよびプロリンおよびアラニンからなる３種アミノ酸を含有する製剤（例えば、特許文献１参照）、カンゾウ、ソウハクヒ、アロエ、スギナ、キンギンカ、オウバク、ガイヨウまたはゲンチアナ等の植物抽出物（例えば、特許文献２参照）、ＴＧＦ−β、アスコルビン酸類等が知られている。また別のコラーゲン合成促進物質として、タイプIプロコラーゲンの１８２〜２４１残基のペプチド（例えば、非特許文献３参照）およびこのタイプIプロコラーゲンの１８２〜２４１残基のペプチドから選択されたＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒペプチド（例えば、非特許文献４参照）が知られている。さらに、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ等の特定配列を有するペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩（特許文献３参照）や、ダイズタンパク質のプロテアーゼ加水分解物（特許文献４参照）が、細胞におけるコラーゲン産生を促進し得ることも近年見出されている。 In order to improve the state caused by the decrease in collagen, various collagen synthesis promoting substances have been found. For example, a preparation containing three amino acids consisting of retinoic acid (see, for example, Non-patent Document 2), glycine, proline and alanine (see, for example, Patent Document 1), licorice, Sakuhaku, Aloe, Horsetail, Goldfish, Ogaku, Guiyo Alternatively, plant extracts such as gentian (see, for example, Patent Document 2), TGF-β, ascorbic acids and the like are known. As another collagen synthesis promoting substance, Lys − selected from a peptide of 182 to 241 residues of type I procollagen (see, for example, Non-Patent Document 3) and a peptide of 182 to 241 residues of this type I procollagen. Thr-Thr-Lys-Ser peptide (for example, refer nonpatent literature 4) is known. Furthermore, peptides having a specific sequence such as Leu-Glu-His or derivatives thereof or salts thereof (see Patent Document 3) or protease hydrolyzate of soybean protein (see Patent Document 4) promotes collagen production in cells. It has also been found in recent years.
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
しかし、安全でありかつ有意なコラーゲンの産生促進能を有する更なる有用な新規素材の開発が望まれていた。
本発明は、かかる従来の問題に鑑み、安全でありかつ有意なコラーゲンの産生促進能を有する新規素材を提供することを目的とする。
However, development of a further useful new material that is safe and has a significant ability to promote collagen production has been desired.
In view of such conventional problems, an object of the present invention is to provide a novel material that is safe and has significant ability to promote collagen production.
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定のアミノ酸配列を有する新規ペプチドが、安全でありかつ有意なコラーゲンの産生促進能を有する新規素材として利用され得ることを見出した。
具体的には、培養ヒト正常皮膚由来線維芽細胞に本願のペプチドを添加することで、該細胞のコラーゲン産生量が有意に増加することを明らかにした。さらに、本願ペプチドの誘導体を同様に添加した場合にも、培養ヒト正常皮膚由来線維芽細胞のコラーゲン産生量が増加することを明らかにし、これにより本発明を完成するに至った。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a novel peptide having a specific amino acid sequence can be used as a novel material that is safe and has a significant ability to promote collagen production. It was.
Specifically, it was clarified that the amount of collagen produced by the cells is significantly increased by adding the peptide of the present application to cultured human normal skin-derived fibroblasts. Furthermore, it has been clarified that the amount of collagen produced by cultured human normal skin-derived fibroblasts increases when a derivative of the peptide of the present application is added in the same manner, thereby completing the present invention.
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔１２〕を提供するものである。
〔１〕 式（Ｉ）：Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｓｎ
（式中Ｘａａは、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｒｇのいずれかで表される）
で表されるペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩。
〔２〕 〔１〕に記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩を含む組成物。
〔３〕 〔１〕に記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩を含有するコラーゲン産生を促進するための組成物。
〔４〕 産生を促進させるコラーゲンがI型コラーゲンおよび／またはIII型コラーゲンである事を特徴とする〔３〕に記載の組成物。
〔５〕 前記組成物が、医薬組成物、化粧料組成物、食品組成物又は飼料用組成物である、〔２〕〜〔４〕のいずれかに記載の組成物。
〔６〕前記〔１〕記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩、あるいは前記〔２〕記載の組成物を用いて、細胞におけるコラーゲンの産生を促進する方法。
〔７〕細胞におけるコラーゲンの産生を促進するための組成物の製造のための、前記〔１〕記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩の使用。
〔８〕前記〔１〕記載のペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
〔９〕前記〔１〕記載のペプチドをコードする塩基配列に対するアンチセンス配列からなるポリヌクレオチド。
〔１０〕前記〔８〕又は〔９〕記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミド。
〔１１〕前記〔８〕又は〔９〕記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
〔１２〕前記〔８〕又は〔９〕記載のポリヌクレオチドを含む、形質転換体。
More specifically, the present invention provides the following [1] to [12].
[1] Formula (I): Leu-Arg-Xaa-Asn
(Where Xaa is represented by any of His, Lys, or Arg)
Or a derivative thereof or a salt thereof.
[2] A composition comprising the peptide according to [1] or a derivative thereof or a salt thereof.
[3] A composition for promoting collagen production comprising the peptide according to [1] or a derivative thereof or a salt thereof.
[4] The composition according to [3], wherein the collagen that promotes production is type I collagen and / or type III collagen.
[5] The composition according to any one of [2] to [4], wherein the composition is a pharmaceutical composition, a cosmetic composition, a food composition, or a feed composition.
[6] A method of promoting collagen production in cells using the peptide or derivative thereof or the salt thereof according to [1], or the composition according to [2].
[7] Use of the peptide of [1] above or a derivative thereof or a salt thereof for the production of a composition for promoting collagen production in cells.
[8] A polynucleotide comprising a base sequence encoding the peptide of [1] above.
[9] A polynucleotide comprising an antisense sequence against the base sequence encoding the peptide of [1].
[10] A plasmid comprising the polynucleotide according to [8] or [9].
[11] An expression vector comprising the polynucleotide according to [8] or [9].
[12] A transformant comprising the polynucleotide according to [8] or [9].
本発明により、コラーゲンの産生促進能を有する新規素材が提供される。また本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩は、細胞に作用させても細胞数を有意に減少させないことが示されている。従って、本発明により、コラーゲンの産生促進能を有し、かつ細胞毒性を示さずに安全に使用され得る新規ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩が提供される。 The present invention provides a novel material having the ability to promote collagen production. Moreover, it has been shown that the peptide of the present invention or a derivative thereof or a salt thereof does not significantly reduce the number of cells even when it is acted on cells. Therefore, the present invention provides a novel peptide or derivative thereof, or a salt thereof that has the ability to promote collagen production and can be safely used without exhibiting cytotoxicity.
〔発明の実施の形態〕
本発明者らは、特定のアミノ酸配列を有する新規ペプチドを添加することにより、細胞におけるコラーゲンの産生促進能を有意に向上させることができることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
[Embodiment of the Invention]
The present inventors have found that the ability to promote collagen production in cells can be significantly improved by adding a novel peptide having a specific amino acid sequence. The present invention is based on these findings.
本発明は、下記式（Ｉ）で表されるペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩を提供する。
式（Ｉ）：Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｓｎ
（式中Ｘａａは、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｒｇのいずれかで表される）（一文字略記：ＬＲＸＮ、配列番号：１）
ここで、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇは、全て塩基性アミノ酸であり、これらの置換は所謂保存的置換に該当する。
The present invention provides a peptide represented by the following formula (I), a derivative thereof, or a salt thereof.
Formula (I): Leu-Arg-Xaa-Asn
(In the formula, Xaa is represented by any of His, Lys, or Arg) (one letter abbreviation: LRXN, SEQ ID NO: 1)
Here, His, Lys, and Arg are all basic amino acids, and these substitutions correspond to so-called conservative substitutions.
本明細書中において、「ペプチドの誘導体」とは、例えば、ペプチドをアセチル化、パルミトイル化、ミリスチル化、アミド化、アクリル化、ダンシル化、ビオチン化、リン酸化、サクシニル化、アニリド化、ベンジルオキシカルボニル化、ホルミル化、ニトロ化、スルフォン化、アルデヒド化、環状化、グリコシル化、モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化、グアニジル化、アミジン化、マレイル化、トリフルオロアセチル化、カルバミル化、トリニトロフェニル化、ニトロトロポニル化、またはアセトアセチル化した誘導体等をいう。この中でもパルミトイル化は、細胞への浸透性が高くなることが期待されるので好ましく、またN末端のアセチル化、C末端のアミド化、C末端のメチル化は、末端からペプチドを分解するエキソペプチダーゼに対する抵抗性が付与され、生体中における安定性が高くなることが期待されるので好ましい。 In the present specification, the “peptide derivative” means, for example, acetylation, palmitoylation, myristylation, amidation, acrylation, dansylation, biotinylation, phosphorylation, succinylation, anilideation, benzyloxylation of peptides. Carbonylation, formylation, nitration, sulfonation, aldehyde formation, cyclization, glycosylation, monomethylation, dimethylation, trimethylation, guanidylation, amidineation, maleylation, trifluoroacetylation, carbamylation, trinitrophenyl Derivatized, nitrotroponylated or acetoacetylated derivatives. Among these, palmitoylation is preferable because it is expected to have high permeability to cells, and N-terminal acetylation, C-terminal amidation, and C-terminal methylation are exopeptidases that degrade peptides from the terminal. It is preferable because it is expected to be resistant to, and to be stable in the living body.
本明細書において、「塩」とは、ペプチドまたはその誘導体の薬理学的に許容される任意の塩（無機塩および有機塩を含む）をいい、例えば、ペプチドまたはその誘導体のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、有機酸塩（酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、ピクリン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等）等が挙げられ、好ましくは、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩および酢酸塩であり、より好ましくはアンモニウム塩および酢酸塩である。 In the present specification, the “salt” refers to any pharmacologically acceptable salt (including inorganic salts and organic salts) of a peptide or a derivative thereof, such as a sodium salt or a potassium salt of a peptide or a derivative thereof. , Calcium salt, magnesium salt, ammonium salt, hydrochloride, sulfate, nitrate, organic acid salt (acetate, citrate, maleate, malate, oxalate, lactate, succinate, fumaric acid Salt, propionate, formate, benzoate, picrate, benzenesulfonate, etc.), preferably ammonium salts, hydrochlorides, sulfates and acetates, more preferably ammonium salts And acetate.
本発明のペプチドは、当該分野で公知の方法により作製され得る。例えば、本発明のペプチドは、化学合成方法（例えば、固相法（例えば、Ｆｍｏｃ法）、液相法等）により合成されてもよく、また遺伝子組換え発現等の方法により作製されてもよい。なお本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ−体であってもＤ−体であってもよいが、好ましくはＬ−体である。 The peptides of the present invention can be produced by methods known in the art. For example, the peptide of the present invention may be synthesized by a chemical synthesis method (eg, a solid phase method (eg, Fmoc method), a liquid phase method, etc.), or may be produced by a method such as gene recombinant expression. . The amino acid constituting the peptide of the present invention may be L-form or D-form, but is preferably L-form.
さらに本発明のペプチドは、目的のアミノ酸配列を含むタンパク質のアミノ酸配列中から、目的のアミノ酸配列からなるペプチドをプロテアーゼ処理等の公知の手段によって切り出すことによっても調製され得る。天然のタンパク質をプロテアーゼで加水分解して得られるペプチドは、化学合成方法で製造する場合よりもコスト面から有利となる。さらに、天然のタンパク質をプロテアーゼで加水分解して得られるペプチドは、生体に対してより安全であると考えられる。従って、このようにして得られたペプチドは、生体への適用に対しより高い安全性が求められる内服剤や食品、敏感肌用化粧料、飼料などに好適に使用され得る。 Furthermore, the peptide of the present invention can also be prepared by cutting out a peptide comprising the target amino acid sequence from the amino acid sequence of the protein containing the target amino acid sequence by a known means such as protease treatment. Peptides obtained by hydrolyzing natural proteins with proteases are more advantageous in terms of cost than those produced by chemical synthesis methods. Furthermore, it is considered that a peptide obtained by hydrolyzing a natural protein with a protease is safer for a living body. Therefore, the peptide thus obtained can be suitably used for internal preparations, foods, sensitive skin cosmetics, feeds, and the like that require higher safety for application to living bodies.
本発明のペプチドの誘導体は、当該分野で公知の方法により、作製され得る。
本発明のペプチドの塩もまた、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に作製され得る。
以上のようにして得られた本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩は、細胞におけるコラーゲンの産生を促進するために使用することができる。
Derivatives of the peptides of the present invention can be made by methods known in the art.
The salts of the peptides of the present invention can also be easily prepared by those skilled in the art by any method known in the art.
The peptide of the present invention or a derivative thereof or a salt thereof obtained as described above can be used for promoting collagen production in cells.
本明細書において用語「細胞におけるコラーゲンの産生促進能を有する」とは、目的のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩を細胞に作用させた場合に、当該目的のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩を細胞に作用させない場合と比較して、細胞におけるコラーゲンの産生量が増加することを意味する。例えば、この用語は、ヒト細胞の培養系試験において目的のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩を１０００μｇ／ｍｌの濃度で作用させた場合に、当該目的のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩を作用させない場合と比較して、細胞におけるコラーゲン産生量が、例えば約１１０％以上、より好ましくは約１２０％以上、さらに好ましくは約１３０％以上まで達することを意味する。また特定の態様では、当該用語における細胞とは線維芽細胞を意味し、さらに特定の態様では、皮膚線維芽細胞を意味する。 In this specification, the term “having the ability to promote collagen production in cells” means that when the target peptide or derivative thereof or a salt thereof is allowed to act on cells, the target peptide or derivative thereof or a salt thereof. This means that the amount of collagen produced in the cell is increased as compared with the case where it does not act on the cell. For example, this term does not cause the target peptide or derivative or salt thereof to act when the target peptide or derivative or salt thereof is allowed to act at a concentration of 1000 μg / ml in a culture system test of human cells. Compared to the case, it means that the amount of collagen production in the cell reaches, for example, about 110% or more, more preferably about 120% or more, and further preferably about 130% or more. In a specific aspect, the cell in the term means a fibroblast, and in a specific aspect, a skin fibroblast.
コラーゲンには２０数種類の異なった型、またそれらを構成する約２５種類のα鎖が存在することが知られており、それらをコードする遺伝子はそれぞれクローニングされ、塩基配列が解明されている（Connective Tissue and Its Heritable Disorders;, pp149-165, Weily-Liss Inc.発行 (1993)）。 It is known that there are about 20 different types of collagen and about 25 types of α chains constituting them, and the genes encoding them have been cloned and the nucleotide sequences have been elucidated (Connective Tissue and Its Heritable Disorders ;, pp149-165, published by Weily-Liss Inc. (1993)).
本発明のペプチドにより産生が促進されるコラーゲンの型は特に限定されないが、現在知られているタイプIからタイプXXIコラーゲンを含むすべてのコラーゲン、好ましくはタイプIコラーゲンまたはタイプIIIコラーゲンを挙げることができる。該コラーゲンの由来は特に制限されないが、好ましくは哺乳動物由来、より好ましくはヒト由来のコラーゲンを挙げることが出来る。本発明において産生が促進されるコラーゲンは、N末端およびC末端にプロペプチドが結合している、プロコラーゲン分子の状態であってもよいし、プロペプチドが除去された状態であってもよい。 The type of collagen whose production is promoted by the peptide of the present invention is not particularly limited, and all collagens including type I to type XXI collagen, preferably type I collagen or type III collagen can be mentioned. . The origin of the collagen is not particularly limited, but preferred is a mammal-derived collagen, more preferably a human-derived collagen. The collagen whose production is promoted in the present invention may be in the state of a procollagen molecule in which a propeptide is bound to the N-terminus and C-terminus, or may be in a state in which the propeptide has been removed.
具体的には、後述の実施例に示すように、本願のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩を添加した培養液で皮膚線維芽細胞を培養することにより、該細胞のコラーゲン産生量が増加する。 Specifically, as shown in Examples described later, culturing dermal fibroblasts in a culture solution to which the peptide of the present application or a derivative thereof or a salt thereof is added increases the amount of collagen produced by the cells.
本発明はまた、前記ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩を含むことを特徴とする組成物を提供する。かかる特徴を有することにより、該組成物は例えば、医薬組成物、食品組成物、化粧料組成物または飼料用組成物として、さらにコラーゲンに関連する生理状態の解明のための研究試薬として好適に使用され得る。 The present invention also provides a composition comprising the peptide or a derivative thereof or a salt thereof. By having such characteristics, the composition is suitably used, for example, as a pharmaceutical composition, a food composition, a cosmetic composition or a feed composition, and further as a research reagent for elucidating physiological states associated with collagen. Can be done.
本発明の医薬組成物には製剤上許容される担体、基剤、および／または添加剤等を本発明の目的を達成する範囲内で適宜配合することができる。
医薬組成物としては、例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物におけるコラーゲン量の低下やコラーゲンの変性などに起因する疾患の治療剤または予防剤が挙げられる。具体的には、本発明の医薬組成物は、慢性関節リウマチ、変形性関節症、骨関節炎等の関節疾患用の治療剤および/または予防剤として、角膜潰瘍などの角膜障害の治療剤および/または予防剤として、消化器官の潰瘍の治療剤および/または予防剤として、血圧上昇を抑制するための治療剤および/または予防剤として、また、紫外線曝露、加齢等による皮膚のシワもしくはタルミの予防剤および/または治療剤として、さらに皮膚の弾力性、保湿性、もしくはハリの低下に対する予防剤および/または治療剤として好適に使用され得る。
In the pharmaceutical composition of the present invention, a pharmaceutically acceptable carrier, base, and / or additive can be appropriately blended within the range of achieving the object of the present invention.
Examples of the pharmaceutical composition include a therapeutic or prophylactic agent for diseases caused by a decrease in collagen amount or collagen degeneration in mammals including humans. Specifically, the pharmaceutical composition of the present invention is a therapeutic and / or prophylactic agent for joint diseases such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoarthritis and the like, and a therapeutic agent for corneal disorders such as corneal ulcer and / or Or as a prophylactic agent, as a therapeutic agent and / or prophylactic agent for digestive ulcers, as a therapeutic agent and / or prophylactic agent to suppress an increase in blood pressure, and to prevent skin wrinkles or tarmi due to UV exposure, aging, etc. It can be suitably used as a prophylactic and / or therapeutic agent, and further as a prophylactic and / or therapeutic agent for skin elasticity, moisturization, or reduction of elasticity.
本発明の食品組成物には食品衛生上許容される配合物を本発明の目的を達成する範囲内で適宜混合して、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品等に加工して利用することができる。
これらの食品組成物は、例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物におけるコラーゲン量の低下やコラーゲンの変性などに起因する状態の改善用または予防用の食品として使用されうる。具体的には、本発明の食品組成物は、関節痛や高血圧などの症状に対する改善および/または予防のための食品として、または紫外線曝露、加齢等による皮膚のシワもしくはタルミの改善および/または予防のための食品として、さらに皮膚の弾力性、保湿性、もしくはハリの低下に対する改善および/または予防のための食品として好適に使用され得る。また、本発明の食品組成物は、コラーゲン量の低下やコラーゲンの変性などに起因する状態の改善および/または予防のために用いられるものである旨の表示を付した食品であることが好ましい。
The food composition of the present invention is appropriately mixed with a food hygiene-acceptable formulation within the scope of achieving the object of the present invention, for example, health food, functional food, food for specified health use, nutritional supplement, etc. Can be processed and used.
These food compositions can be used, for example, as foods for improving or preventing conditions caused by a decrease in the amount of collagen or degeneration of collagen in mammals including humans. Specifically, the food composition of the present invention is used as a food for improving and / or preventing symptoms such as joint pain and hypertension, and / or improving skin wrinkles or talmi due to UV exposure, aging, etc. It can be suitably used as a food for prevention, and further as a food for improvement and / or prevention of skin elasticity, moisturizing property, or reduction of elasticity. In addition, the food composition of the present invention is preferably a food with a label indicating that it is used for improving and / or preventing a condition caused by a decrease in collagen amount or collagen denaturation.
本発明の化粧料組成物には化粧料調製上許容される担体、基剤、および／または添加剤等を本発明の目的を達成する範囲内で適宜配合することができる。
化粧料組成物としては、例えば、紫外線曝露、加齢等による皮膚のシワもしくはタルミの予防および/または改善のための化粧料、皮膚の弾力性、保湿性、もしくはハリの低下に対する予防および/または改善のための化粧料が挙げられる。
In the cosmetic composition of the present invention, carriers, bases, and / or additives that are acceptable for cosmetic preparation can be appropriately blended within a range that achieves the object of the present invention.
Cosmetic compositions include, for example, cosmetics for preventing and / or improving skin wrinkles or talmi due to UV exposure, aging, etc., and preventing and / or preventing skin elasticity, moisturizing properties, and elasticity. Cosmetics for improvement are listed.
本発明の飼料用組成物には衛生上許容される配合物、添加物等を本発明の目的を達成する範囲内で適宜配合することができる。
飼料用組成物としては、例えば、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、ウマ等の家畜や、イヌ、ネコ等のペット動物におけるコラーゲン量の低下やコラーゲンの変性などに起因する状態の改善用および/または予防用の飼料が挙げられる。具体的には、本発明の組成物は、角膜潰瘍等の角膜障害、リューマチ、関節炎、変形性関節炎、骨関節炎等の関節障害、炎症性疾患等の様々なコラーゲン量の低下やコラーゲンの変性などに起因する疾患の改善用および/または予防用の飼料としても好適に用いられ得る。
In the feed composition of the present invention, sanitary acceptable blends, additives, and the like can be appropriately blended within the scope of achieving the object of the present invention.
As a composition for feed, for example, for improving a state caused by a decrease in collagen amount or degeneration of collagen in domestic animals such as cattle, pigs, chickens, sheep, horses, and pet animals such as dogs and cats, and / or Examples include preventive feed. Specifically, the composition of the present invention is used for corneal disorders such as corneal ulcers, rheumatism, arthritis, osteoarthritis, joint disorders such as osteoarthritis, various collagen levels such as inflammatory diseases, collagen degeneration, etc. It can also be suitably used as a feed for ameliorating and / or preventing diseases caused by.
本発明の組成物における前記ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩の含有量は、ペプチド等の種類、組成物の剤型等によっても異なるが、一般には、高いコラーゲン産生促進効果を得る観点から及び製剤化の観点から、好ましくは0.0001〜70重量％、より好ましくは0.001〜50重量％、さらに好ましくは0.001〜20重量％、さらにより好ましくは0.01〜10重量％、さらにより好ましくは0.05〜10重量％、さらにより好ましくは0.12〜10重量％である。
一態様において、本組成物は、前記ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩が、例えば0.05重量％以上、好ましくは0.08重量％以上、より好ましくは0.1重量％以上、さらに好ましくは0.12重量％以上となるようにいったん精製されたものを、前記含有量になるように配合することにより、調製され得る。
The content of the peptide or a derivative thereof or a salt thereof in the composition of the present invention varies depending on the type of peptide and the like, the dosage form of the composition, and the like. From the viewpoint of conversion, it is preferably 0.0001 to 70% by weight, more preferably 0.001 to 50% by weight, still more preferably 0.001 to 20% by weight, still more preferably 0.01 to 10% by weight, and even more preferably 0.05 to 10% by weight. Even more preferably, it is 0.12 to 10% by weight.
In one embodiment, in the present composition, the peptide or a derivative thereof or a salt thereof is, for example, 0.05% by weight or more, preferably 0.08% by weight or more, more preferably 0.1% by weight or more, and further preferably 0.12% by weight or more. Thus, once refine | purified, it may prepare by mix | blending so that it may become the said content.
担体としては、例えば、糖類(例えば、マンニトール、乳糖、デキストラン等)、セルロース類(例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、結晶性セルロース等)、水難溶性ガム類(例えば、アラビアガム、トラガントガム等)、架橋ビニル重合体、脂質類等が１種または２種以上組み合わせて用いられ得る。 Examples of the carrier include saccharides (e.g., mannitol, lactose, dextran, etc.), celluloses (e.g., hydroxypropylcellulose, methylcellulose, crystalline cellulose, etc.), poorly water-soluble gums (e.g., gum arabic, tragacanth, etc.), cross-linking, etc. Vinyl polymers, lipids and the like can be used alone or in combination of two or more.
基剤としては、例えば、水、油脂類、鉱物油類、ロウ類、脂肪酸類、シリコーン油類、ステロール類、エステル類、金属石鹸類、アルコール等が１種または２種以上組み合わせて用いられ得る。 As the base, for example, water, fats and oils, mineral oils, waxes, fatty acids, silicone oils, sterols, esters, metal soaps, alcohols and the like can be used alone or in combination of two or more. .
添加剤としては、例えば、界面活性剤、可溶化成分、乳化剤、油分、安定化剤、増粘剤、防腐剤、結合剤、滑沢剤、分散剤、ｐＨ調整剤、保湿剤、紫外線吸収剤、キレート剤、経皮吸収促進剤、抗酸化剤、崩壊剤、可塑剤、緩衝剤、ビタミン類、アミノ酸類、着色剤、香料等が１種または２種以上組み合わせて用いられ得る。 Examples of additives include surfactants, solubilizing components, emulsifiers, oils, stabilizers, thickeners, preservatives, binders, lubricants, dispersants, pH adjusters, humectants, UV absorbers. Chelating agents, percutaneous absorption accelerators, antioxidants, disintegrating agents, plasticizers, buffering agents, vitamins, amino acids, coloring agents, fragrances and the like may be used alone or in combination.
さらに本発明の組成物には、必要に応じて他の有用な作用を付加するために、美白成分、抗炎症成分、抗菌成分、細胞賦活化成分、収斂成分、抗酸化成分、ニキビ改善成分、コラーゲン等の生体成分合成促進成分、血行促進成分、保湿成分、老化防止成分等の各種成分を１種または２種以上組み合わせて配合されてもよい。 Furthermore, in order to add other useful actions as necessary, the composition of the present invention includes a whitening component, an anti-inflammatory component, an antibacterial component, a cell activation component, an astringent component, an antioxidant component, an acne improving component, Various components such as a biocomponent synthesis promoting component such as collagen, a blood circulation promoting component, a moisturizing component, and an anti-aging component may be used alone or in combination.
本発明の組成物は、外用剤(外用に供される、医薬組成物および化粧料組成物を含む)、内服剤（内服に供される、医薬組成物、食品組成物および飼料用組成物を含む）等の任意の剤型であり得、好ましくは外用剤として使用され得る。 The composition of the present invention comprises an external preparation (including a pharmaceutical composition and a cosmetic composition provided for external use), an internal preparation (a pharmaceutical composition, a food composition and a feed composition provided for internal use). And the like, and preferably can be used as an external preparation.
外用剤としては、例えば、液状、乳液状、クリーム状、ローション状、ペースト状、ムース状、ジェル状、シート状(基材担持)、エアゾール状、スプレー状等の任意の形態で使用され得る。
化粧料組成物としては、例えば、ローション、乳液、クリーム、オイル、パック等の基礎化粧料、またファンデーション、頬紅、口紅等のメーキャップ化粧料、さらに洗顔料、クレンジング、ボディ洗浄料等の洗浄料、入浴剤等の任意の形態で使用され得る。
As an external preparation, for example, it can be used in any form such as liquid, emulsion, cream, lotion, paste, mousse, gel, sheet (substrate-supported), aerosol or spray.
As cosmetic compositions, for example, basic cosmetics such as lotions, emulsions, creams, oils, packs, makeup cosmetics such as foundations, blushers, lipsticks, and other cleansing agents such as facial cleansers, cleansings, body cleansers, etc. It can be used in any form such as a bath agent.
内服剤としては、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤(ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む)、ゲル剤、リポソーム剤、エキス剤、チンキ剤、レモネード剤、ゼリー剤等の任意の形態で使用され得る。
また食品組成物とする場合には、パン、麺、惣菜、食肉加工食品（例えば、ハム、ソーセージなど）、水産加工食品、調味料（例えば、ドレッシングなど）、乳製品、菓子（例えば、ビスケット、キャンディー、ゼリー、アイスクリームなど）、スープ、ジュースなどの任意の一般の食品形態としても提供され得る。このような形態にする場合、本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩は、目的とする食品の性質等に依存して、当業者に公知の方法により適宜配合され得る。
飼料用組成物としては、任意の形態で使用され得るため、特に限定は無い。
Examples of the internal medicine include tablets, pills, granules, fine granules, powders, hard capsules, soft capsules, dry syrups, liquids (including drinks, suspensions, syrups), gels, It can be used in any form such as liposomal agent, extract agent, tincture agent, lemonade agent, jelly agent and the like.
In the case of a food composition, bread, noodles, prepared dishes, processed meat foods (eg, ham, sausage, etc.), processed fishery products, seasonings (eg, dressing, etc.), dairy products, confectionery (eg, biscuits, Candy, jelly, ice cream, etc.), soups, juices and any other common food form. When making it into such a form, the peptide of this invention, its derivative (s), or those salts can be mix | blended suitably by the method well-known to those skilled in the art depending on the property etc. of the target foodstuff.
The feed composition is not particularly limited because it can be used in any form.
本発明の組成物は、前記ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩が細胞におけるコラーゲン産生促進能を有することを利用して、使用対象におけるコラーゲンの産生を促進するために使用され得る。
本発明はさらに、前記ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩、あるいは前記組成物を用いることを特徴とする、細胞におけるコラーゲンの産生を促進する方法を提供する。
The composition of the present invention can be used to promote the production of collagen in a subject of use by utilizing the ability of the peptide or derivative thereof or a salt thereof to promote collagen production in cells.
The present invention further provides a method for promoting collagen production in cells, characterized by using the peptide or derivative thereof or a salt thereof, or the composition.
本発明の方法においては、前記ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩をコラーゲンの産生促進効果が得られる有効量以上用いればよい。
すなわち、本発明の方法における前記ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩の使用量は通常、外用剤の場合には、成人１人体重約50kgあたり好ましくは約0.1μg〜２g/日である。また、内服剤の場合における当該使用量は通常、成人1人体重約50kgあたり好ましくは約0.001〜10000mg/日、より好ましくは約0.1〜1000mg/日、さらに好ましくは約1〜100mg/日である。
In the method of the present invention, the peptide or a derivative thereof or a salt thereof may be used in an effective amount or more that can obtain an effect of promoting collagen production.
That is, the amount of the peptide or derivative or salt thereof used in the method of the present invention is usually about 0.1 μg to 2 g / day per adult body weight of about 50 kg in the case of an external preparation. In addition, the amount used in the case of internal use is usually preferably about 0.001 to 10000 mg / day, more preferably about 0.1 to 1000 mg / day, more preferably about 1 to 100 mg / day per adult body weight of about 50 kg. .
本発明の方法は、さらに前記ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩、あるいは前記組成物を、皮膚に適用する工程を含んでいてもよい。この場合の前記ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩の皮膚への適用量は、好ましくは約1ng〜500μg/cm2、より好ましくは約0.01〜50μg/cm2、さらに好ましくは約0.1〜10μg/cm2である。 The method of the present invention may further comprise a step of applying the peptide or derivative thereof or a salt thereof, or the composition to the skin. In this case, the amount of the peptide or derivative thereof or salt thereof applied to the skin is preferably about 1 ng to 500 μg / cm 2 , more preferably about 0.01 to 50 μg / cm 2 , and still more preferably about 0.1 to 10 μg / cm 2. 2 .
本発明はさらに、細胞におけるコラーゲンの産生を促進するための組成物、好ましくは外用剤として使用され得る組成物の製造のための、前記ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩の使用を提供する。
前記ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩の使用量は、前記組成物中の含有量となるように使用すればよい。
The present invention further provides use of the peptide or a derivative thereof or a salt thereof for the production of a composition for promoting collagen production in cells, preferably a composition that can be used as an external preparation.
What is necessary is just to use it so that the usage-amount of the said peptide or its derivative (s), or those salts may become content in the said composition.
本発明はさらに、前記ペプチドをコードする塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドを提供する。
本発明のポリヌクレオチドは、前記ペプチドをコードする限り、特に限定されない。例えば、ＬＲＸＮをコードするポリヌクレオチドとしては、遺伝暗号表に従いＬＲＸＮコードすることが明らかな任意の配列が、コドン使用頻度等に応じて適宜使用され得る。好ましくは、例えば下記配列：
ＣＴＴ ＣＧＣ ＣＡＣ ＡＡＣ （配列番号：５、ＬＲＨＮをコード）
ＣＴＣ ＣＧＣ ＡＡＧ ＡＡＴ （配列番号：６、ＬＲＫＮをコード）
ＣＴＴ ＣＧＣ ＣＧＣ ＡＡＣ （配列番号：７、ＬＲＲＮをコード）
が挙げられる。
The present invention further provides a polynucleotide comprising a base sequence encoding the peptide.
The polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it encodes the peptide. For example, as a polynucleotide encoding LRXN, any sequence that is apparently LRXN-encoded according to the genetic code table can be appropriately used depending on the codon usage frequency and the like. Preferably, for example, the following sequence:
CTT CGC CAC AAC (SEQ ID NO: 5, encoding LRHN)
CTC CGC AAG AAT (SEQ ID NO: 6, coding for LRKN)
CTT CGC CGC AAC (SEQ ID NO: 7, encoding LRRN)
Is mentioned.
本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の方法により作製され得る。例えば、市販のDNA合成機(例えばApplied Biosystems3400DNA合成機、Applied Biosystems社製)を用いて作製することができる。 The polynucleotide of the present invention can be prepared by methods known in the art. For example, it can be prepared using a commercially available DNA synthesizer (for example, Applied Biosystems 3400 DNA synthesizer, manufactured by Applied Biosystems).
本発明はさらに、前記ペプチドをコードする塩基配列に対するアンチセンス配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドを提供する。かかるポリヌクレオチドもまた、前述と同様にして作製することができる。 The present invention further provides a polynucleotide comprising an antisense sequence for the base sequence encoding the peptide. Such a polynucleotide can also be produced in the same manner as described above.
本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子組換え技術により前記ペプチドを発現させるために、または遺伝子治療等において、あるいはコラーゲンに関連する生理状態の解明のための研究試薬として利用することができる。
さらに、かかるポリヌクレオチドを使用することにより、以下に述べる本発明のプラスミドまたは発現ベクターを作製することができる。
The polynucleotide of the present invention can be used as a research reagent for expressing the peptide by gene recombination techniques, in gene therapy, or for elucidating physiological states associated with collagen.
Furthermore, by using such a polynucleotide, the plasmid or expression vector of the present invention described below can be prepared.
本発明はさらに、前記ポリヌクレオチドを含むことを特徴とするプラスミドを提供する。
本発明のプラスミドは、特に限定されないが、例えばpBR系プラスミド、pUC系プラスミド等の公知のプラスミドに、一般的な分子生物学的実験手法を使用して本発明のポリヌクレオチドを組込んで作製できる。
The present invention further provides a plasmid comprising the polynucleotide.
The plasmid of the present invention is not particularly limited. For example, the plasmid of the present invention can be prepared by incorporating the polynucleotide of the present invention into a known plasmid such as a pBR plasmid or a pUC plasmid using a general molecular biological experiment technique. .
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクターを提供する。
本発明の発現ベクターは、特に限定されないが、例えばpcDNA3、pSD64、λファージベクター等の公知のベクターに、一般的な分子生物学的実験手法を使用して本発明のポリヌクレオチドを発現可能な状態で組込んで作製できる。
The present invention further provides an expression vector comprising the polynucleotide of the present invention.
The expression vector of the present invention is not particularly limited. For example, the expression vector of the present invention can be expressed in a known vector such as pcDNA3, pSD64, and λ phage vector using a general molecular biological experimental technique. Can be built in.
以上のようにして得られたプラスミドまたは発現ベクターを使用することにより、以下に述べる形質転換体を作製することができる。
本発明はさらに、前記ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする形質転換体を提供する。
By using the plasmid or expression vector obtained as described above, the transformant described below can be prepared.
The present invention further provides a transformant comprising the polynucleotide.
本発明の形質転換体は、前記プラスミドまたは発現ベクターを所望の宿主に導入すること、または前記ポリヌクレオチドを直接宿主の染色体に組込むこと等により得ることができる。宿主としては特に限定されず、例えば大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等を使用することができる。発現ベクターを宿主へ導入する方法としては、例えばカルシウム処理法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法を用いればよい。
以上のようにして得られた形質転換体を適当な条件下で培養して前記ペプチドを発現させ、これを精製することにより、前記ペプチドを得ることもできる。
The transformant of the present invention can be obtained by introducing the plasmid or expression vector into a desired host, or integrating the polynucleotide directly into the host chromosome. The host is not particularly limited, and for example, Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells and the like can be used. As a method for introducing an expression vector into a host, a known method such as a calcium treatment method, a protoplast method, an electroporation method, a DEAE dextran method or the like may be used.
The transformant obtained as described above is cultured under appropriate conditions to express the peptide, and the peptide can be obtained by purifying it.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕 ペプチド（１）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ（一文字略記：ＬＲＫＮ、配列番号：３）の調製
１）ペプチドの合成
ペプチドを、ペプチド自動合成装置(アプライドバイオ社製：Ｍｏｄｅｌ ４３３Ａ)を用いて、Ｆｍｏｃ法による固相合成法により合成した。具体的な手順は以下の通りである：まず固相合成用樹脂にＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨのＣ末端を結合させてから、保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、次いでこの樹脂を洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ(ｔＢｏｃ)−ＯＨをＡｓｎのＮ末端に導入する。次いで保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｍｃ)−ＯＨをＬｙｓのＮ末端に導入する。次いで保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨをＡｒｇのＮ末端に導入した。次いで、保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去した後、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）により、ペプチドのＣ末端と樹脂との結合、ＡｓｎのＴｒｔ基、ＬｙｓのｔＢｏｃ基とＡｒｇのＰｍｃ基を切断することにより脱保護した。最後に、分取ＨＰＬＣで未反応物を除去して精製することによりＬＲＫＮを得た。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] Preparation of peptide (1) Leu-Arg-Lys-Asn (one letter abbreviation: LRKN, SEQ ID NO: 3) 1) Peptide synthesis Peptide is synthesized by an automatic peptide synthesizer (manufactured by Applied Bio: Model 433A). Was synthesized by a solid phase synthesis method by the Fmoc method. The specific procedure is as follows: First, the C-terminus of Fmoc-Asn (Trt) -OH is bound to a resin for solid phase synthesis, and then the protecting group (Fmoc) is removed by piperidine treatment, and then this resin After washing, Fmoc-Lys (tBoc) -OH is introduced into the N-terminus of Asn. Next, the protecting group (Fmoc) is removed by piperidine treatment, and this resin is washed again, and then Fmoc-Arg (Pmc) -OH is introduced into the N-terminus of Lys. Next, the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, the resin was washed again, and Fmoc-Leu-OH was introduced into the N-terminus of Arg. Next, the protecting group (Fmoc) is removed by piperidine treatment, and then the peptide C-terminus is bound to the resin by TFA (trifluoroacetic acid), the Ast Trt group, the Lys tBoc group, and the Arg Pmc group. Was deprotected. Finally, LRKN was obtained by purification by removing unreacted substances by preparative HPLC.
２）合成ペプチドの純度検定
得られた精製物を分析用逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３ (内径： ４．６mm、長さ： ２５０mm) 、ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、；移動相：溶媒Ａ（0.１％トリフルオロ酢酸）および溶媒Ｂ（0.１％トリフルオロ酢酸、１００％アセトニトリル）のグラジエント（０分（溶媒Ｂ＝０％）〜４０分（溶媒Ｂ＝６０％））；流速：１．２ ml／分；検出法：波長 ２２０ｎｍにおける吸光度］に付したところ、１０．８分に単一の鋭いピークが示され、純度は９９．２％であった。
2) Synthetic peptide purity test The obtained purified product was analyzed by reversed-phase high performance liquid chromatography [column: Inertsil ODS-3 (inner diameter: 4.6 mm, length: 250 mm), manufactured by GL Sciences, Inc .; mobile phase: Gradient of solvent A (0.1% trifluoroacetic acid) and solvent B (0.1% trifluoroacetic acid, 100% acetonitrile) (0 min (solvent B = 0%) to 40 min (solvent B = 60%)) Flow rate: 1.2 ml / min; detection method: absorbance at a wavelength of 220 nm] showed a single sharp peak at 10.8 minutes with a purity of 99.2%.
〔実施例２〕ペプチド（２）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ（一文字略記：ＬＲＨＮ、配列番号：２）の調製
ＬＲＨＮペプチドを実施例１に示した方法と同様に合成し、精製した。得られた精製物を分析用逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３ (内径： ４．６mm、長さ： ２５０mm) 、ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、；移動相：溶媒Ａ（0.１％トリフルオロ酢酸）および溶媒Ｂ（0.１％トリフルオロ酢酸、１００％アセトニトリル）のグラジエント（０分（溶媒Ｂ＝０％）〜４０分（溶媒Ｂ＝６０％））；流速：１．２ ml／分；検出法：波長 ２２０nmにおける吸光度］に付したところ、１０．４分に単一の鋭いピークが示され、純度は９９．４％であった。
[Example 2] Preparation of peptide (2) Leu-Arg-His-Asn (single letter abbreviation: LRHN, SEQ ID NO: 2) The LRHN peptide was synthesized and purified in the same manner as in Example 1. The obtained purified product was subjected to analytical reverse phase high performance liquid chromatography [column: Inertsil ODS-3 (inner diameter: 4.6 mm, length: 250 mm), manufactured by GL Sciences, Inc .; mobile phase: solvent A (0.1% Trifluoroacetic acid) and solvent B (0.1% trifluoroacetic acid, 100% acetonitrile) gradient (0 min (solvent B = 0%) to 40 min (solvent B = 60%)); flow rate: 1.2 ml / Min; detection method: absorbance at a wavelength of 220 nm] showed a single sharp peak at 10.4 minutes, and the purity was 99.4%.
〔実施例３〕ペプチド（３）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（一文字略記：ＬＲＲＮ、配列番号：４）の調製
ＬＲＲＮペプチドを実施例１に示した方法と同様に合成し、精製した。得られた精製物を分析用逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３ (内径： ４．６mm、長さ： ２５０mm) 、ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、；移動相：溶媒Ａ（0.１％トリフルオロ酢酸）および溶媒Ｂ（0.１％トリフルオロ酢酸、１００％アセトニトリル）のグラジエント（０分（溶媒Ｂ＝０％）〜４０分（溶媒Ｂ＝６０％））；流速：１．２ ml／分；検出法：波長 ２２０ｎｍにおける吸光度］に付したところ、１０．６分に単一の鋭いピークが示され、純度は９８．７％であった。
Example 3 Preparation of Peptide (3) Leu-Arg-Arg-Asn (One letter abbreviation: LRRN, SEQ ID NO: 4) The LRRN peptide was synthesized and purified in the same manner as in Example 1. The obtained purified product was subjected to analytical reverse phase high performance liquid chromatography [column: Inertsil ODS-3 (inner diameter: 4.6 mm, length: 250 mm), manufactured by GL Sciences, Inc .; mobile phase: solvent A (0.1% Trifluoroacetic acid) and solvent B (0.1% trifluoroacetic acid, 100% acetonitrile) gradient (0 min (solvent B = 0%) to 40 min (solvent B = 60%)); flow rate: 1.2 ml / Min; detection method: absorbance at a wavelength of 220 nm] showed a single sharp peak at 10.6 minutes, and the purity was 98.7%.
〔実施例４〕ペプチド誘導体（１）-１ Ｃ末端アミド化ＬＲＫＮの調製
Ｆｍｏｃ法による固相合成法（L.A.Carpino, G.Y.Han, J.Am.Chem.Soc., 92, 5748 (1970)）に従い、ＬＲＫＮペプチドのＣ末端アミド化誘導体を作製した。まず、４-メチルベンズヒドリルアミン樹脂にＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨのC末端を結合させてから、保護基（Ｆｍｏｃ）をピペリジン処理で除去した。次いで、この樹脂を洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ(ｔＢｏｃ)−ＯＨをＡｓｎのN末端に導入した。次いで、保護基（Ｆｍｏｃ）をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｍｃ)−ＯＨをＬｙｓのN末端に導入した。次いで、保護基（Ｆｍｏｃ）をピペリジン処理で除去し、この樹脂を洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨをＡｒｇのN末端に導入した。次いで、保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去した後、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）により、ペプチドのＣ末端と樹脂との結合、ＡｓｎのＴｒｔ基、ＬｙｓのｔＢｏｃ基とＡｒｇのＰｍｃ基を切断することにより脱保護した。最後に、分取HPLCで未反応物を除去して精製することにより、C末端をアミド化したＬＲＫＮを得た。なお、得られた精製物を実施例１に示した方法と同様の純度検定に付したところ、得られた精製物の純度は９８．５％であった。
[Example 4] Preparation of peptide derivative (1) -1 C-terminal amidated LRKN According to the solid phase synthesis method by Fmoc method (LACarpino, GYHan, J. Am. Chem. Soc., 92, 5748 (1970)), LRKN C-terminal amidated derivatives of peptides were made. First, the C-terminus of Fmoc-Asn (Trt) -OH was bound to 4-methylbenzhydrylamine resin, and then the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment. Next, after washing the resin, Fmoc-Lys (tBoc) -OH was introduced into the N-terminus of Asn. Next, the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, the resin was washed again, and Fmoc-Arg (Pmc) -OH was introduced into the N-terminus of Lys. Next, the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, and after washing the resin, Fmoc-Leu-OH was introduced into the N-terminus of Arg. Next, the protecting group (Fmoc) is removed by piperidine treatment, and then the peptide C-terminus is bound to the resin by TFA (trifluoroacetic acid), the Ast Trt group, the Lys tBoc group, and the Arg Pmc group. Was deprotected. Finally, the unreacted product was removed by purification by preparative HPLC to obtain LRKN having an amidated C-terminus. In addition, when the obtained purified product was subjected to the same purity test as the method shown in Example 1, the purity of the obtained purified product was 98.5%.
〔実施例５〕ペプチド誘導体（２）-１ Ｎ末端アセチル化ＬＲＨＮの調製
Ｆｍｏｃ法による固相合成法（L.A.Carpino, G.Y.Han, J.Am.Chem.Soc., 92, 5748 (1970)）に従い、ＬＲＨＮペプチドのＮ末端アセチル化誘導体を作製した。まず、固相合成用樹脂にＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨのC末端を結合させてから、保護基（Ｆｍｏｃ）をピペリジン処理で除去し、次いで、この樹脂を洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨをＡｓｎのN末端に導入した。次いで、保護基（Ｆｍｏｃ）をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｍｃ)−ＯＨをＨｉｓのN末端に導入した。次いで、保護基（Ｆｍｏｃ）をピペリジン処理で除去し、この樹脂を洗浄後、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ＬｅｕｃｉｎｅをＡｒｇのＮ末端に導入した。次いで、この樹脂を洗浄後、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）により、ペプチドのＣ末端と樹脂との結合、ＡｓｎおよびＨｉｓのＴｒｔ基とＡｒｇのＰｍｃ基を切断することにより脱保護した。最後に、分取HPLCで未反応物を除去して精製することにより、N末端をアセチル化したＬＲＨＮを得た。なお、得られた精製物を実施例１に示した方法と同様の純度検定に付したところ、得られた精製物の純度は９７．２％であった。
[Example 5] Peptide derivative (2) -1 Preparation of N-terminal acetylated LRHN According to the solid phase synthesis method by Fmoc method (LACarpino, GYHan, J. Am. Chem. Soc., 92, 5748 (1970)), LRHN N-terminal acetylated derivatives of peptides were made. First, the C-terminus of Fmoc-Asn (Trt) -OH was bound to a solid phase synthesis resin, and then the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment. Next, after washing the resin, Fmoc-His (Trt ) -OH was introduced at the N-terminus of Asn. Next, the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, the resin was washed again, and Fmoc-Arg (Pmc) -OH was introduced into the N-terminus of His. Next, the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, and after washing the resin, N-acetyl-Lucine was introduced into the N-terminus of Arg. Next, the resin was washed and then deprotected by TFA (trifluoroacetic acid) by cleaving the bond between the C-terminus of the peptide and the resin, and cleaving the Ast and His Trt groups and the Arg Pmc group. Finally, unreacted substances were removed and purified by preparative HPLC to obtain LRN N-terminally acetylated. In addition, when the obtained purified product was subjected to the same purity test as the method shown in Example 1, the purity of the obtained purified product was 97.2%.
〔実施例６〕ペプチド誘導体（２）-２ Ｃ末端アミド化ＬＲＨＮの調製
Ｃ末端アミド化ＬＲＨＮを、実施例４と同様に合成及び精製することにより得た。なお得られた精製物を実施例１に示した方法と同様の純度検定に付したところ、得られた精製物の純度は９８．４％であった。
[Example 6] Peptide derivative (2) -2 Preparation of C-terminal amidated LRHN C-terminal amidated LRHN was obtained by synthesis and purification in the same manner as in Example 4. The purified product thus obtained was subjected to a purity test similar to the method shown in Example 1. As a result, the purity of the obtained purified product was 98.4%.
〔実施例７〕ＬＲＸＮペプチドのI型コラーゲン産生促進能の検討
ペプチド（１）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ（一文字略記：ＬＲＫＮ、配列番号：３）
ペプチド（２）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ（一文字略記：ＬＲＨＮ、配列番号：２）
ペプチド（３）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（一文字略記：ＬＲＲＮ、配列番号：４）
70歳女性由来ヒト正常皮膚由来線維芽細胞を、４８ウェルカルチャープレート中で培養した。より詳細には、１．０×１０４細胞／ウェルの密度でプレートに播種し、３７℃で、５％炭酸ガスおよび９５％空気の環境下で４８時間培養を行った。培養液は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）に牛胎仔血清（ＦＢＳ）を１０重量％の濃度で含有した培地を各ウェル４００μｌずつ使用した。次いで、上記培養液からＦＢＳを抜いた無血清培地に交換し、さらに２４時間培養した。その後、培養液を除去して、合成したＬＲＫＮ、ＬＲＨＮ又はＬＲＲＮペプチドをそれぞれ1000μg/mL濃度で溶解させた培地に交換した。７２時間培養した後、培養液を採取し、培養液中に分泌されたI型コラーゲン濃度を、酵素結合免疫測定法（Anti-Human Procollagen typeI C-peptide EIA Kit；タカラバイオ株式会社製）で定量した。ここで、被験ペプチドを添加しない培地を４００μｌ添加したものをコントロールとして用い、それぞれの定量結果をもとに、コントロール培養液中のI型コラーゲン量を１００％として各被験培養液中のI型コラーゲン量を算出した。
[Example 7] Examination of the ability of LRXN peptide to promote type I collagen production Peptide (1) Leu-Arg-Lys-Asn (abbreviation: LRKN, SEQ ID NO: 3)
Peptide (2) Leu-Arg-His-Asn (one letter abbreviation: LRHN, SEQ ID NO: 2)
Peptide (3) Leu-Arg-Arg-Asn (one letter abbreviation: LRRN, SEQ ID NO: 4)
Human normal skin-derived fibroblasts from a 70-year-old woman were cultured in 48-well culture plates. More specifically, the cells were seeded at a density of 1.0 × 10 4 cells / well and cultured at 37 ° C. in an environment of 5% carbon dioxide gas and 95% air for 48 hours. As a culture solution, a medium containing 10% by weight of fetal bovine serum (FBS) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) at a concentration of 10% by weight was used in 400 μl per well. Subsequently, the culture medium was replaced with a serum-free medium from which FBS was removed, and further cultured for 24 hours. Thereafter, the culture medium was removed, and the synthesized LRKN, LRHN, or LRRN peptide was replaced with a medium in which each was dissolved at a concentration of 1000 μg / mL. After culturing for 72 hours, the culture solution is collected, and the concentration of type I collagen secreted in the culture solution is quantified by an enzyme-linked immunoassay (Anti-Human Procollagen type I C-peptide EIA Kit; manufactured by Takara Bio Inc.) did. Here, a medium to which 400 μl of the test peptide was not added was used as a control, and based on the respective quantification results, the amount of type I collagen in the control culture medium was taken as 100%, and type I collagen in each test culture medium was used. The amount was calculated.
さらに、培養液を採取した後の細胞についてWST-8法により生細胞数を計測した。より詳細には、400μl培地中40μlの割合でWST-8試薬（Cell Counting Kit-8（同人化学研究所製））を添加したものに培地交換し、次いで2時間培養後、その上清を100μl分取し吸光度を測定した。その結果、本願ペプチドを添加した培養液で培養されることによる生細胞数の有意な減少は認められず、生体に対して安全に使用できるものであることが確認された。
Furthermore, the number of viable cells was counted by WST-8 method for the cells after collecting the culture solution. More specifically, the medium was changed to that added with WST-8 reagent (Cell Counting Kit-8 (manufactured by Dojin Chemical Laboratories)) at a rate of 40 μl in 400 μl medium, and then cultured for 2 hours. The fraction was collected and the absorbance was measured. As a result, it was confirmed that the number of viable cells was not significantly decreased by culturing in the culture solution to which the peptide of the present application was added, and that it can be safely used for a living body.
〔実施例８〕ＬＲＸＮペプチド誘導体のI型コラーゲン産生促進能の検討
ペプチド（１）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ（一文字略記：ＬＲＫＮ、配列番号：３）
ペプチド誘導体（１）-１；Ｃ末端アミド化ＬＲＫＮ
ペプチド（２）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ（一文字略記：ＬＲＨＮ、配列番号：２）
ペプチド誘導体（２）-１；Ｎ末端アセチル化ＬＲＨＮ
ペプチド誘導体（２）-２；Ｃ末端アミド化ＬＲＨＮ
70歳女性由来ヒト正常皮膚由来線維芽細胞を、４８ウェルカルチャープレート中で培養した。より詳細には、１．０×１０５細胞／ウェルの密度でプレートに播種し、３７℃で、５％炭酸ガスおよび９５％空気の環境下で４８時間培養を行った。培養液は、Dulbecco’s Modified Eagle Medium（Ｄ−ＭＥＭ）に牛胎仔血清（ＦＢＳ）を１０重量％の濃度で含有した培地を各ウェル４００μｌずつ使用した。次いで、上記培養液からＦＢＳを抜いた無血清培地に交換し、さらに２４時間培養した。その後、培養液を除去して、下記の表に記載したペプチド誘導体を1000μg/ｍL濃度で溶解させた培地に交換した。７２時間培養した後、培養液を採取し、培養液中に分泌されたI型コラーゲン濃度を、酵素結合免疫測定法（Anti-Human Procollagen typeI C-peptide EIA Kit；タカラバイオ株式会社製）で定量した。ここで、被験ペプチド誘導体を添加しない培地を４００μｌ添加したものをコントロールとして用い、それぞれの定量結果をもとに、コントロール培養液中のI型コラーゲン量を１００％として各被験培養液中のI型コラーゲン量を算出した。
[Example 8] Examination of type I collagen production promoting ability of LRXN peptide derivative Peptide (1) Leu-Arg-Lys-Asn (Single letter abbreviation: LRKN, SEQ ID NO: 3)
Peptide derivative (1) -1; C-terminal amidated LRKN
Peptide (2) Leu-Arg-His-Asn (one letter abbreviation: LRHN, SEQ ID NO: 2)
Peptide derivative (2) -1; N-terminal acetylated LRHN
Peptide derivative (2) -2; C-terminal amidated LRHN
Human normal skin-derived fibroblasts from a 70-year-old woman were cultured in 48-well culture plates. More specifically, the cells were seeded at a density of 1.0 × 10 5 cells / well and cultured at 37 ° C. in an environment of 5% carbon dioxide gas and 95% air for 48 hours. As a culture solution, 400 μl each of a medium containing 10% by weight of fetal bovine serum (FBS) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) was used. Subsequently, the culture medium was replaced with a serum-free medium from which FBS was removed, and further cultured for 24 hours. Thereafter, the culture solution was removed, and the medium was replaced with a medium in which the peptide derivatives described in the following table were dissolved at a concentration of 1000 μg / mL. After culturing for 72 hours, the culture solution is collected, and the concentration of type I collagen secreted in the culture solution is quantified by an enzyme-linked immunoassay (Anti-Human Procollagen type I C-peptide EIA Kit; manufactured by Takara Bio Inc.) did. Here, a medium to which 400 μl of a medium to which the test peptide derivative is not added is added is used as a control, and based on the respective quantification results, the type I collagen content in the control culture medium is defined as 100%. The amount of collagen was calculated.
また実施例７に示したものと同様のWST-8法に供して生細胞数への影響を調べたところ、生細胞数の有意な減少は認められず、本願ペプチド誘導体も生体に対して安全に使用できるものであることが確認された。
Further, when the influence on the number of living cells was examined by subjecting to the same WST-8 method as that shown in Example 7, no significant decrease in the number of living cells was observed, and the peptide derivative of the present application was also safe for the living body. It was confirmed that it can be used.
〔実施例９〕ＬＲＸＮペプチドのIII型コラーゲン産生促進能の検討
ペプチド（１）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ（一文字略記：ＬＲＫＮ、配列番号：３）
ペプチド（２）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ（一文字略記：ＬＲＨＮ、配列番号：２）
70歳女性由来ヒト正常皮膚由来線維芽細胞を、４８ウェルカルチャープレート中で培養した。より詳細には、１．０×１０５細胞／ウェルの密度でプレートに播種し、３７℃で、５％炭酸ガスおよび９５％空気の環境下で４８時間培養を行った。培養液は、Dulbecco’s Modified Eagle Medium（Ｄ−ＭＥＭ）に牛胎仔血清（ＦＢＳ）を１０重量％の濃度で含有した培地を各ウェル４００μｌずつ使用した。次いで、上記培養液からＦＢＳを抜いた無血清培地に交換し、さらに２４時間培養した。その後、培養液を除去して、下記の表に記載したペプチドをそれぞれの濃度で溶解させた培地に交換した。７２時間培養した後、培養液を採取し、培養液中に分泌されたIII型コラーゲン濃度を、酵素結合免疫測定法で定量した（一次抗体としてGoat Anti-Type III collagen-BIOT（Southern Biotech社製）を使用；二次抗体としてMAB1343 MS X Hu collagen Type III（CHEMICON international社製）を使用）。ここで、被験ペプチドを添加しない培地を４００μｌ添加したものをコントロールとして用い、それぞれの定量結果をもとに、コントロール培養液中のIII型コラーゲン量を１００％として各被験培養液中のIII型コラーゲン量を算出した。
[Example 9] Examination of the ability of LRXN peptide to promote type III collagen production Peptide (1) Leu-Arg-Lys-Asn (abbreviation: LRKN, SEQ ID NO: 3)
Peptide (2) Leu-Arg-His-Asn (one letter abbreviation: LRHN, SEQ ID NO: 2)
Human normal skin-derived fibroblasts from a 70-year-old woman were cultured in 48-well culture plates. More specifically, the cells were seeded at a density of 1.0 × 10 5 cells / well and cultured at 37 ° C. in an environment of 5% carbon dioxide gas and 95% air for 48 hours. As a culture solution, 400 μl each of a medium containing 10% by weight of fetal bovine serum (FBS) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) was used. Subsequently, the culture medium was replaced with a serum-free medium from which FBS was removed, and further cultured for 24 hours. Thereafter, the culture broth was removed and replaced with a medium in which the peptides listed in the table below were dissolved at respective concentrations. After culturing for 72 hours, the culture solution was collected, and the concentration of type III collagen secreted in the culture solution was quantified by enzyme-linked immunoassay (Goat Anti-Type III collagen-BIOT (produced by Southern Biotech) as the primary antibody) ); MAB1343 MS X Hu collagen Type III (manufactured by CHEMICON international) was used as the secondary antibody). Here, a medium to which 400 μl of a test peptide was not added was used as a control, and based on the respective quantification results, the amount of type III collagen in the control culture medium was taken as 100%, and the type III collagen in each test culture medium was used. The amount was calculated.
〔実施例１０〕ＬＲＸＮペプチドのIII型コラーゲン産生促進能の検討
ペプチド（３）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（一文字略記：ＬＲＲＮ、配列番号：４）
18歳女性由来ヒト正常皮膚由来線維芽細胞を、４８ウェルカルチャープレート中で培養した。より詳細には、１．０×１０５細胞／ウェルの密度でプレートに播種し、３７℃で、５％炭酸ガスおよび９５％空気の環境下で４８時間培養を行った。培養液は、Dulbecco’s Modified Eagle Medium（Ｄ−ＭＥＭ）に牛胎仔血清（ＦＢＳ）を１０重量％の濃度で含有した培地を各ウェル４００μｌずつ使用した。次いで、上記培養液からＦＢＳを抜いた無血清培地に交換し、さらに２４時間培養した。その後、培養液を除去して、上記ペプチド（３）を1000μg／mL濃度で溶解させた培地に交換した。７２時間培養した後、培養液を採取し、培養液中に分泌されたIII型コラーゲン濃度を、酵素結合免疫測定法で定量した（一次抗体としてGoat Anti-Type III collagen-BIOT（Southern Biotech社製）を使用；二次抗体としてMAB1343 MS X Hu collagen Type III（CHEMICON international社製）を使用）。ここで、被験ペプチドを添加しない培地を400μｌ添加したものをコントロールとして用い、それぞれの定量結果をもとに、コントロール培養液中のIII型コラーゲン量を100％として各被験培養液中のIII型コラーゲン量を算出した。
[Example 10] Examination of type III collagen production promoting ability of LRXN peptide Peptide (3) Leu-Arg-Arg-Asn (abbreviated to one letter: LRRN, SEQ ID NO: 4)
Human normal skin-derived fibroblasts derived from 18-year-old women were cultured in 48-well culture plates. More specifically, the cells were seeded at a density of 1.0 × 10 5 cells / well and cultured at 37 ° C. in an environment of 5% carbon dioxide gas and 95% air for 48 hours. As a culture solution, 400 μl each of a medium containing 10% by weight of fetal bovine serum (FBS) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) was used. Subsequently, the culture medium was replaced with a serum-free medium from which FBS was removed, and further cultured for 24 hours. Thereafter, the culture solution was removed, and the medium was replaced with a medium in which the peptide (3) was dissolved at a concentration of 1000 μg / mL. After culturing for 72 hours, the culture solution was collected, and the concentration of type III collagen secreted in the culture solution was quantified by enzyme-linked immunoassay (Goat Anti-Type III collagen-BIOT (produced by Southern Biotech) as the primary antibody) ); MAB1343 MS X Hu collagen Type III (manufactured by CHEMICON international) was used as the secondary antibody). Here, a medium to which 400 μl of a test peptide was not added was used as a control, and based on the respective quantification results, the amount of type III collagen in the control culture medium was taken as 100%, and the type III collagen in each test culture medium was used. The amount was calculated.
Claims (2)
（式中Ｘａａは、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｒｇのいずれかで表される）
で表されるペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩。 Formula (I): Leu-Arg-Xaa-Asn
(Where Xaa is represented by any of His, Lys, or Arg)
Or a derivative thereof or a salt thereof.
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