JP2009165418A - Method for producing ammonium carboxylate - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いて、ニトリル化合物から製造されたカルボン酸又はカルボン酸アンモニウム水溶液を精製する方法に関する。その中でも、本発明は、生体触媒由来のタンパク質を精製除去する実用的な工業的方法を提供する。とりわけ、本発明は、グリコロニトリルを原料として用いた時には、グリコール酸又はグリコール酸アンモニウムを精製する実用的な工業的方法を提供する。 The present invention relates to a method for purifying a carboxylic acid produced from a nitrile compound or an aqueous solution of ammonium carboxylate using a biocatalyst having nitrilase activity. Among them, the present invention provides a practical industrial method for purifying and removing a protein derived from a biocatalyst. In particular, the present invention provides a practical industrial method for purifying glycolic acid or ammonium glycolate when glycolonitrile is used as a raw material.
酵素活性を有する生体触媒を利用して目的の化合物を合成する方法は、反応条件が穏和であるため反応プロセスが簡略化できること、あるいは副生成物が少なく高純度の反応生成物を取得できる等の利点があるため、近年、様々な化合物の製造に用いられている。中でもニトリル化合物をカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムに変換する活性を持つニトリラーゼやニトリル化合物をカルボン酸アミドに変換する活性を持つニトリルヒドラターゼ等の加水分解酵素は、その特異的な反応挙動から、様々なカルボン酸又はカルボン酸アンモニウム、あるいはカルボン酸アミドの製造に用いる検討がなされている。 The method of synthesizing a target compound using a biocatalyst having enzyme activity can simplify the reaction process because the reaction conditions are mild, or can obtain a high-purity reaction product with few byproducts. Due to its advantages, it has recently been used in the production of various compounds. Among them, hydrolyzing enzymes such as nitrilase, which has the activity of converting nitrile compounds into carboxylic acids or ammonium carboxylates, and nitrile hydratase, which has the activity of converting nitrile compounds into carboxylic acid amides, have various reaction behaviors. Studies have been made on the production of carboxylic acids or ammonium carboxylates or carboxylic acid amides.
それらの中で、ニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いて、ニトリル化合物をカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムに変換するカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法も数多く検討されている。例えばCorynebacterium属を用いてグリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献１)、或いはRhodococcus属またはGordona属を用いてグリコール酸を製造する方法(特許文献２)、或いはAcidovorax属を用いてグリコール酸、２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献３)、或いはBrevibacterium属を用いて乳酸を製造する方法(特許文献４)、或いはPseudomonas属またはArthrobacter属またはAspergillus属またはPenicillium属またはCochliobolus属またはFusarium属を用いて乳酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシ−２−フェニルプロピオン酸、マンデル酸、を製造する方法(特許文献５)、或いはAcidovorax属 由来のNitrilaseを遺伝子工学的手法で大腸菌等に発現させたものを用いてグリコール酸を製造する方法(特許文献６)等が開示されている。また本発明者らも既にAcinetobacter属を用いてグリコール酸を製造する方法(特許文献７)について報告している。 Among them, many methods for producing carboxylic acid or ammonium carboxylate, in which a nitrile compound is converted into carboxylic acid or ammonium carboxylate using a biocatalyst having nitrilase activity, have been studied. For example, a method for producing glycolic acid, lactic acid, 2-hydroxyisobutyric acid using Corynebacterium genus (Patent Document 1), a method for producing glycolic acid using Rhodococcus genus or Gordona genus (Patent Document 2), or Acidovorax genus A method for producing glycolic acid, 2-hydroxyisobutyric acid using Pt (patent document 3), a method for producing lactic acid using Brevibacterium genus (patent document 4), Pseudomonas genus, Arthrobacter genus, Aspergillus genus or Penicillium genus Alternatively, a method for producing lactic acid, 2-hydroxyisobutyric acid, 2-hydroxy-2-phenylpropionic acid, mandelic acid using Cochliobolus or Fusarium (Patent Document 5), or Nitrilase derived from Acidovorax is genetically engineered. A method of producing glycolic acid using what is expressed in E. coli or the like by a technique (Patent Document 6) is disclosed. The present inventors have already reported a method (Patent Document 7) for producing glycolic acid using the genus Acinetobacter.
前述の従来の技術の中には、生体触媒として用いるニトリラーゼやニトリラーゼ活性を有する菌体等を懸濁液の状態で用いて反応を行う場合がある。その場合、反応液中に存在する菌体及びまたは菌体由来のタンパク質を除去し、最終製品への混入を防止する必要があるため、通常、菌体を除去する場合は遠心分離法や精密濾過膜（Microfiltlation Membrane；ＭＦ膜とも称する）等の分離膜を用いる方法を行い、該菌体由来のタンパク質を除去する場合は限外濾過膜（Ultrafiltlation Membrane；ＵＦ膜とも称する）等の分離膜を用いる方法を行っていた。 Among the above-mentioned conventional techniques, there are cases where the reaction is carried out using a nitrilase used as a biocatalyst, a microbial cell having nitrilase activity, or the like in a suspension state. In that case, it is necessary to remove the bacterial cells and / or proteins derived from the bacterial cells present in the reaction solution to prevent contamination in the final product. Therefore, when removing bacterial cells, centrifugation or microfiltration is usually used. When a method using a separation membrane such as a membrane (Microfiltlation Membrane; also referred to as MF membrane) is performed, and a protein derived from the cells is removed, a separation membrane such as an ultrafiltration membrane (also referred to as UF membrane) is used. Had gone the way.
遠心分離法により溶液中に懸濁したタンパク質を上清と完全に分離させるためには、高い遠心力を長時間かけて遠心分離を行わなくてはならない。この遠心力と時間の設定条件は、遠心分離機の種類や、分離しようとするタンパクの種類によって異なるが、一般的な設定値としては10000〜15000Gで20〜30分間程度が必要である。更に、遠心分離法においては上清中のタンパク質を完全に除去することは不可能なので、その他の方法と組み合わせる必要があり、非常に煩雑な操作となる欠点がある。 In order to completely separate the protein suspended in the solution from the supernatant by centrifugation, high centrifugal force must be applied for a long time. The setting conditions of the centrifugal force and the time vary depending on the type of the centrifuge and the type of protein to be separated, but a general set value is about 10,000 to 15000 G and requires about 20 to 30 minutes. Furthermore, since it is impossible to completely remove proteins in the supernatant in the centrifugal separation method, it is necessary to combine with other methods, and there is a drawback that it is a very complicated operation.
一方、分離膜を用いる方法においても、まず精密濾過膜（MF膜、通常の細孔径は0.01〜2μm）を用いて菌体を除去した後、限外濾過膜（UF膜、通常の細孔径は0.001〜0.01μm）を用いて該菌体由来のタンパク質を除去する方法が一般的な方法であり、非常に煩雑な操作を必要としていた。例えばMF膜による除菌体を省いて、菌体とともに該菌体由来のタンパクを一気に除去する方法もあるが、通常UF膜は細孔径が非常に小さいため、タンパクによる目詰まりが発生すると、一旦アルカリ薬液による逆洗操作等の目詰まりを解消する操作が必要となり、単位時間当たりの濾過処理量が低減され、それを補うだけの膜面積が必要となり、設備費がかかる等の問題を生じていた。 On the other hand, in the method using a separation membrane, first, after removing cells using a microfiltration membrane (MF membrane, normal pore size is 0.01 to 2 μm), ultrafiltration membrane (UF membrane, normal pore size is A method of removing proteins derived from the cells using 0.001 to 0.01 μm) is a general method, and requires a very complicated operation. For example, there is a method that eliminates the sterilized body by the MF membrane and removes the protein derived from the microbial cell together with the microbial cell, but since the UF membrane usually has a very small pore size, once clogging by the protein occurs, Operation that eliminates clogging such as backwashing with alkaline chemicals is necessary, the amount of filtration processing per unit time is reduced, membrane area is necessary to compensate for it, and there are problems such as high equipment costs It was.
本発明の課題は、ニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いて、ニトリル化合物からカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムを製造する際、該反応によって合成されたカルボン酸アンモニウム水溶液を精製する方法を提供することにある。とりわけ、本発明の課題は、該生体触媒から漏出してくるタンパク等の不純物を効率よく除去できる、工業的に有利なカルボン酸又はカルボン酸アンモニウム水溶液の精製法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method for purifying an aqueous solution of ammonium carboxylate synthesized by the reaction when producing a carboxylic acid or ammonium carboxylate from a nitrile compound using a biocatalyst having nitrilase activity. . In particular, an object of the present invention is to provide an industrially advantageous method for purifying an aqueous solution of carboxylic acid or ammonium carboxylate that can efficiently remove impurities such as proteins leaking from the biocatalyst.
本発明者らは、ニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いて、ニトリル化合物を原料にカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムを製造するに当たって、該生体触媒から漏出してくるタンパク質等の不純物を効率よく除去できる、工業的に有利なカルボン酸又はカルボン酸アンモニウム水溶液の精製法について鋭意検討を行ったところ、驚くべきことに、高濃度のカルボン酸アンモニウム水溶液の場合、通常は菌体の除去に用いられるMF膜（通常の細孔径が0.01〜2μm）等の分離膜を用いて精製処理を行うだけで、該菌体由来のタンパク質についても精製除去ができる現象を見出した。即ち、ある一定濃度以上のカルボン酸アンモニウム水溶液であれば、あるいはニトリラーゼ活性を有する生体触媒が高濃度までカルボン酸アンモニウムを蓄積できれば、該反応液中にある該生体触媒由来のタンパク等の不純物をMF膜等の分離膜を用いて精製処理を行うだけ除去できることを発見し、本発明を完成させるに至った。尚、通常漏出タンパクのサイズではMF膜の細孔径での除去分離は不可能であるにも拘わらず、本発明において除去分離が可能となっているメカニズムについては、恐らくニトリラーゼの作用によって生成されたカルボン酸アンモニウムによる塩析効果で漏出タンパク同士の凝集、あるいは漏出タンパクの菌体細胞表面への凝集が起こっているために、タンパク凝集物としてあるいは菌体と共にMF膜で除去分離されているものと推定されるが、本メカニズムだけで本現象が起こっているかどうかは不明である。 When the present inventors produce a carboxylic acid or ammonium carboxylate from a nitrile compound as a raw material using a biocatalyst having nitrilase activity, impurities such as proteins leaking from the biocatalyst can be efficiently removed. As a result of intensive investigations on the industrially advantageous purification method of carboxylic acid or ammonium carboxylate aqueous solution, surprisingly, in the case of a high concentration ammonium carboxylate aqueous solution, an MF membrane (usually used for removing bacterial cells) It was found that the protein derived from the cells can be purified and removed only by performing purification using a separation membrane having a normal pore size of 0.01 to 2 μm. That is, if the ammonium carboxylate aqueous solution has a certain concentration or more, or if the biocatalyst having nitrilase activity can accumulate ammonium carboxylate to a high concentration, impurities such as protein derived from the biocatalyst in the reaction solution The present inventors have found that it can be removed only by purification using a separation membrane such as a membrane, and the present invention has been completed. In addition, although the removal and separation at the pore size of the MF membrane is impossible with the size of the normally leaked protein, the mechanism that enables the removal and separation in the present invention is probably generated by the action of nitrilase. Because the salting-out effect of ammonium carboxylate causes aggregation of leaked proteins, or aggregation of leaked proteins on the cell surface of the cells, it is removed and separated by the MF membrane as protein aggregates or with the cells. It is estimated, but it is unclear whether this phenomenon occurs only with this mechanism.
即ち、本発明は以下に記載する通りの構成を有する。
（１） ニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いたニトリル化合物の加水分解反応によって得られた３０重量%より高い濃度のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウム水溶液を精密濾過膜を用いてフィルター処理することによって生体触媒由来の漏出タンパク質を除去することを特徴とする、カルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
（２） カルボン酸又はカルボン酸アンモニウム水溶液の濃度が３５重量％以上である、（１）に記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
（３） ニトリル化合物がα−ヒドロキシニトリルである、（１）又は（２）に記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
（４） ニトリル化合物がグリコロニトリルである、（１）から（３）の何れかに記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
（５） 生体触媒が、微生物菌体又はその処理物、あるいは微生物菌体由来のニトリラーゼの固定化物又は懸濁液である、（１）から（４）の何れかに記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
（６） ニトリラーゼが、Acinetobacter sp.AK226（受託番号FERM BP-08590）由来のニトリラーゼ、又はAcinetobacter sp.AK226（受託番号FERM BP-08590）のニトリラーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質酵素である、（１）から（５）の何れかに記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
（７） 生体触媒が、グラム陰性菌及び／またはその処理物の、固定化物及び／または懸濁液である、（１）から（６）の何れかに記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
（８） 生体触媒が、Acinetobacter属の菌体及びまたはその処理物の、固定化物及びまたは懸濁液である、（１）から（７）の何れかに記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
（９） 生体触媒が、Acinetobacter sp.AK226（受託番号FERM BP-08590）の菌体及びまたはその処理物の、固定化物及びまたは懸濁液である、（１）から（８）の何れかに記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
That is, the present invention has a configuration as described below.
(1) A biocatalyst by filtering a carboxylic acid or ammonium carboxylate aqueous solution having a concentration higher than 30% by weight obtained by hydrolysis reaction of a nitrile compound using a biocatalyst having nitrilase activity using a microfiltration membrane A method for producing a carboxylic acid or ammonium carboxylate, characterized by removing a leaked protein derived therefrom.
(2) The manufacturing method of carboxylic acid or ammonium carboxylate as described in (1) whose density | concentration of carboxylic acid or ammonium carboxylate aqueous solution is 35 weight% or more.
(3) The method for producing carboxylic acid or ammonium carboxylate according to (1) or (2), wherein the nitrile compound is α-hydroxynitrile.
(4) The method for producing carboxylic acid or ammonium carboxylate according to any one of (1) to (3), wherein the nitrile compound is glycolonitrile.
(5) The carboxylic acid or carboxylic acid according to any one of (1) to (4), wherein the biocatalyst is a microbial cell or a processed product thereof, or an immobilized product or suspension of nitrilase derived from the microbial cell. A method for producing ammonium.
(6) The nitrilase is a protein enzyme encoded by a nitrilase derived from Acinetobacter sp. AK226 (accession number FERM BP-08590) or a nitrilase gene of Acinetobacter sp. AK226 (accession number FERM BP-08590), (1) To 5. The method for producing a carboxylic acid or ammonium carboxylate according to any one of (5).
(7) Production of carboxylic acid or ammonium carboxylate according to any one of (1) to (6), wherein the biocatalyst is an immobilized product and / or suspension of gram-negative bacteria and / or processed product thereof Method.
(8) Production of carboxylic acid or ammonium carboxylate according to any one of (1) to (7), wherein the biocatalyst is an immobilized product and / or a suspension of cells of the genus Acinetobacter and / or processed products thereof Method.
(9) The biocatalyst is an immobilized product and / or a suspension of a microbial cell of Acinetobacter sp. AK226 (Accession No. FERM BP-08590) and / or its treated product, according to any one of (1) to (8) The manufacturing method of carboxylic acid or ammonium carboxylate of description.
本発明は、ニトリラーゼを有する生体触媒を用いて、ニトリル化合物からカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムを製造するに当たり、該生体触媒から漏出してくるタンパク質等の不純物を効率よく除去できる、工業的に有利なカルボン酸アンモニウム水溶液の精製方法を提供できる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY In the production of carboxylic acid or ammonium carboxylate from a nitrile compound using a nitrilase-containing biocatalyst, impurities such as proteins leaking from the biocatalyst can be efficiently removed, which is industrially advantageous. A method for purifying an aqueous ammonium carboxylate solution can be provided.
以下本発明について具体的に説明する。
本発明における「カルボン酸又はカルボン酸アンモニウム」という表記についてまず説明する。ニトリラーゼを用いてニトリル化合物を加水分解した場合、ニトリル化合物中のＮはアンモニアに変換され、通常、ニトリラーゼを用いる加水分解反応条件においては、該アンモニアが同時に生成されるカルボン酸と瞬時にアンモニウム塩を形成するので最終的にはカルボン酸アンモニウムが生成されることとなる。しかしながら、反応機構的にはカルボン酸を合成する課程を経ているため、本発明においては、カルボン酸あるいはカルボン酸アンモニウムの両方を意味する方法として、カルボン酸又はカルボン酸アンモニウムという表記を採っている。
The present invention will be specifically described below.
The notation “carboxylic acid or ammonium carboxylate” in the present invention will be described first. When the nitrile compound is hydrolyzed using nitrilase, N in the nitrile compound is converted to ammonia. Usually, under the hydrolysis reaction conditions using nitrilase, the ammonium salt is instantaneously formed with the carboxylic acid produced simultaneously with the ammonia. As a result, ammonium carboxylate is finally produced. However, since the process of synthesizing a carboxylic acid has passed through the reaction mechanism, in the present invention, the notation of carboxylic acid or ammonium carboxylate is used as a method meaning both carboxylic acid and ammonium carboxylate.
本発明で用いるニトリル化合物は、ニトリル基（−ＣＮ）を有する化合物であれば特に限定されないが、好ましくはα−ヒドロキシニトリルである。本発明で言うα−ヒドロキシニトリルとは、一般式[I]：RCH(OH)CN（式中Rは水素原子、置換基を有してもよいC1〜C6のアルキル基、置換基を有してもよいC2〜C6のアルケニル基、置換基を有してよいC1〜C6アルコキシル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアリールオキシ基又は置換基を有してもよい複素環基を示す。）で表されるα−ヒドロキシニトリルを言い、例えば、マンデロニトリル、アセトンシアンヒドリン、グリコロニトリル、ラクトニトリル、２−ヒドロキシ４−メチルチオイソブチロニトリル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記の中でも特に好ましくは、グリコロニトリルを用いることができる。 Although the nitrile compound used by this invention will not be specifically limited if it is a compound which has a nitrile group (-CN), Preferably it is (alpha) -hydroxy nitrile. Α-Hydroxynitrile as referred to in the present invention is represented by the general formula [I]: RCH (OH) CN (wherein R has a hydrogen atom, a C1-C6 alkyl group which may have a substituent, or a substituent. C2-C6 alkenyl group which may have, C1-C6 alkoxyl group which may have a substituent, aryl group which may have a substituent, aryloxy group which may have a substituent or a substituent An α-hydroxynitrile represented by the following formula: for example, mandelonitrile, acetone cyanohydrin, glycolonitrile, lactonitrile, 2-hydroxy-4-methylthioisobutyronitrile However, it is not limited to these. Among these, glycolonitrile can be particularly preferably used.
本発明で言うニトリラーゼを有する生体触媒とは、ニトリル基をカルボン酸又はカルボン酸アンモニウム基へ直接変換する能力を有する酵素、ニトリラーゼを保有する触媒であれば如何なる形態のものでもよい。 The biocatalyst having a nitrilase referred to in the present invention may be in any form as long as it is an enzyme having the ability to directly convert a nitrile group into a carboxylic acid or an ammonium carboxylate group, or a catalyst having a nitrilase.
生体触媒の形態としては微生物細胞を休眠状態でそのまま使用しても構わないし、或いは破砕処理したもの、または該微生物細胞から必要なニトリラーゼ酵素を取り出したものをそのまま使用しても構わないし、一般的な包括法、架橋法、担体結合法等で固定化したものを使用してもよい。尚、固定化担体の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸、光架橋樹脂等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 As a form of the biocatalyst, microbial cells may be used as they are in a dormant state, or those obtained by crushing treatment, or those obtained by removing the necessary nitrilase enzyme from the microbial cells may be used as they are. Those fixed by a comprehensive method, a crosslinking method, a carrier binding method or the like may be used. Examples of the immobilization carrier include, but are not limited to, glass beads, silica gel, polyurethane, polyacrylamide, polyvinyl alcohol, carrageenan, alginic acid, and photocrosslinking resin.
ニトリラーゼの起源となる微生物種としては多くのものが知られているが、例えばニトリラーゼ高活性を有するものとして、Rhodococcus属、Acinetobacter属、Alcaligenes属、Pseudomonas属、Corynebacterium属等が挙げられる。本発明においてはこれらの中でも、特にグラム陰性菌であるAcinetobacter属、Alcaligenes属が好ましく、更に好ましくはAcinetobacte属がよい。具体的にはAcinetobacter sp.AK226(FERM BP-08590)、Acinetobacter sp.AK227(FERM- BP-08591)である。これらの菌株は、特開2007-289-62、特開2005-176639、特開2004-305066、特開2004-305058、特開2004-305062、特開2001-299378、特開平11-180971、特開平06-303991、特開昭63-209592、特公昭63-2596号公報等に記載されている。 Many microbial species that are the origin of nitrilase are known. Examples of those having high nitrilase activity include Rhodococcus genus, Acinetobacter genus, Alcaligenes genus, Pseudomonas genus, and Corynebacterium genus. Of these, the genus Acinetobacter and Alcaligenes, which are gram-negative bacteria, are particularly preferred in the present invention, and more preferably the genus Acinetobacte. Specifically, Acinetobacter sp. AK226 (FERM BP-08590) and Acinetobacter sp. AK227 (FERM-BP-08591). These strains are disclosed in JP 2007-289-62, JP 2005-176639, JP 2004-305066, JP 2004-305058, JP 2004-305062, JP 2001-299378, JP 11-180971, JP It is described in Kaihei 06-303991, Japanese Patent Laid-Open No. 63-209592, Japanese Patent Publication No. 63-2596, and the like.
また例えば、天然の或いは人為的に改良したニトリラーゼ遺伝子を遺伝子工学的手法によって組み込んだ微生物、或いはそこから取り出したニトリラーゼ酵素であっても構わないが、ニトリラーゼの発現量が少ない微生物或いはニトリル化合物からカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムへの変換活性の低いニトリラーゼを発現した微生物を少量用いてカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムを製造するには、より多くの反応時間を要するため、可能な限りニトリラーゼを高発現した微生物、及びまたは変換活性の高いニトリラーゼを発現した微生物、或いはそこから取り出したニトリラーゼ酵素を用いることが望ましい。 In addition, for example, a microorganism in which a natural or artificially improved nitrilase gene is incorporated by genetic engineering techniques, or a nitrilase enzyme extracted from the microorganism may be used. Production of carboxylic acid or ammonium carboxylate using a small amount of a microorganism expressing nitrilase having a low activity for conversion to acid or ammonium carboxylate requires a longer reaction time. Therefore, a microorganism that highly expresses nitrilase as much as possible. It is desirable to use a microorganism expressing a nitrilase having high conversion activity and / or a nitrilase enzyme extracted therefrom.
本発明における生体触媒由来の漏出タンパク質とは、ニトリラーゼ酵素タンパクであっても構わないし、その他のタンパクであっても構わない。また、漏出が生体触媒を保存している間に起こったものであっても、或いは反応中に起こったものであっても構わない。通常、カルボン酸アンモニウム塩濃度が高くなると浸透圧の関係から菌体の破砕が起こりやすくなり、タンパク質の漏出が促進される可能性が高いので、ニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いて、蓄積濃度の高い条件まで反応を行うと漏出タンパク質が多くなることが予想される。 The leaking protein derived from the biocatalyst in the present invention may be a nitrilase enzyme protein or other protein. Further, the leakage may occur during storage of the biocatalyst, or may occur during the reaction. In general, when the concentration of ammonium carboxylate salt increases, bacterial cells are more likely to be crushed due to osmotic pressure, and protein leakage is likely to be accelerated.Therefore, using a biocatalyst having nitrilase activity, When the reaction is carried out to a high condition, it is expected that the amount of leaked protein will increase.
本発明における精密濾過膜（MF膜）とは、特に限定されないが、通常細孔径が0.1〜2μmであり、除菌、除濁、清澄化等の用途に用いられる。材質についても様々なものが市販されており、例えばポリエチレン製、ポリフッ化ビニリデン製、セラミック製のもの等がある。形状については膜の目詰まり防止の観点からクロスフロー運転を行う中空糸型モジュールが一般的であるが、平膜形状であっても構わない。 Although it does not specifically limit with the microfiltration membrane (MF membrane) in this invention, Usually, a pore diameter is 0.1-2 micrometers, and is used for uses, such as disinfection, turbidity, and clarification. Various materials are commercially available, such as those made of polyethylene, polyvinylidene fluoride, and ceramics. The shape is generally a hollow fiber type module that performs a cross-flow operation from the viewpoint of preventing clogging of the membrane, but may be a flat membrane shape.
本明細書で言う限外濾過膜（UF）とは、特に限定されないが、通常細孔径が0.001〜0.01μmであり、高分子分画、清澄・濃縮等の用途に用いられる。材質については様々なものが市販されており、例えばポリアクリロニトリル製、ポリスルフォン製、セラミック製のものがある。形状についてはMFと同様に、膜の目詰まり防止の観点からクロスフロー運転を行う中空糸型モジュールが一般的であるが、平膜形状であっても構わない。 Although it does not specifically limit with the ultrafiltration membrane (UF) said by this specification, Usually, a pore diameter is 0.001-0.01 micrometer, and it is used for uses, such as a polymer fraction, clarification, concentration. Various materials are commercially available, such as those made of polyacrylonitrile, polysulfone, or ceramic. The shape is generally a hollow fiber type module that performs a cross-flow operation from the viewpoint of preventing clogging of the membrane, as in the case of MF, but may be a flat membrane shape.
本発明におけるカルボン酸又はカルボン酸アンモニウム水溶液の濃度については、漏出しているタンパク質の種類や液性によって適正な濃度が変わってくるが、塩析効果を示す領域であればいかなる値であってもよく特に限定されないが、通常は30重量%より高い濃度で本発明の効果が現れ、好ましくは35重量%以上、より好ましくは40重量％以上、最も好ましくは50重量%以上がよい。 Regarding the concentration of the carboxylic acid or ammonium carboxylate aqueous solution in the present invention, the appropriate concentration varies depending on the type and liquidity of the leaking protein, but any value can be used as long as it is a region showing the salting-out effect. Although not particularly limited, the effect of the present invention usually appears at a concentration higher than 30% by weight, preferably 35% by weight or more, more preferably 40% by weight or more, and most preferably 50% by weight or more.
フィルター処理する反応液のpHは、使用するニトリラーゼ活性を有する生体触媒由来のタンパク質が塩析効果を示す領域であればいかなる値であってもよく特に限定されないが、通常はニトリラーゼ反応の至適pHで反応を行わせ、そのままフィルター処理を行うと都合がよいので、本発明においては反応液のpHは好ましくは6〜8であり、より好ましくは6.5〜7である。 The pH of the reaction solution to be filtered is not particularly limited as long as the protein derived from the biocatalyst having nitrilase activity exhibits a salting-out effect, and is not particularly limited, but usually the optimum pH for the nitrilase reaction. In the present invention, the pH of the reaction solution is preferably 6-8, more preferably 6.5-7.
フィルター処理の温度については、使用するニトリラーゼ活性を有する生体触媒由来のタンパク質が塩析効果を示す領域であればいかなる値であってもよく特に限定されないが、ニトリラーゼ反応の至適温度で反応を行わせ、そのままフィルター処理を行うと都合がよいので、本発明においては、温度は好ましくは30〜60℃であり、より好ましくは40〜50℃である。 The temperature of the filter treatment is not particularly limited as long as the protein derived from the biocatalyst having the nitrilase activity to be used exhibits a salting-out effect, but is not particularly limited, but the reaction is performed at the optimum temperature for the nitrilase reaction. In the present invention, the temperature is preferably 30 to 60 ° C, more preferably 40 to 50 ° C.
ニトリル化合物の加水分解反応の条件は、pHは好ましくは6〜8であり、より好ましくは6.5〜7である。反応温度については、反応温度が低すぎると反応活性が低くなり、高濃度のカルボン酸アンモニウムを製造する場合、より多くの反応時間を要する。一方、反応温度が高すぎるとニトリラーゼ酵素の熱劣化で、目的とする最終カルボン酸アンモニウム濃度が高い場合、該濃度まで到達させることが困難となり、結果として新たなニトリラーゼ酵素を持つ生体触媒を追添する等の処置が必要となり触媒コストが高くなる。よって、通常、反応温度は好ましくは30〜60℃であり、より好ましくは40〜50℃である。 The conditions for the hydrolysis reaction of the nitrile compound are preferably pH 6 to 8, more preferably 6.5 to 7. As for the reaction temperature, if the reaction temperature is too low, the reaction activity becomes low, and more reaction time is required when producing a high concentration of ammonium carboxylate. On the other hand, if the reaction temperature is too high, thermal degradation of the nitrilase enzyme makes it difficult to reach the final ammonium carboxylate concentration, resulting in the addition of a biocatalyst having a new nitrilase enzyme. Therefore, the cost of the catalyst becomes high. Therefore, usually, the reaction temperature is preferably 30 to 60 ° C, more preferably 40 to 50 ° C.
カルボン酸又はカルボン酸アンモニウムを製造する反応方法は、固定床、移動層、流動層、撹拌槽等、いずれでもよく、また連続反応でも半回分反応でもよいが、特に固定化されていない微生物菌体を用いる場合、反応の容易性から攪拌槽を用いた半回分反応がよい。その場合、反応効率の観点から、適切な攪拌を行うのがよい。また、半回分反応を行う場合、ニトリラーゼを持つ生体触媒は１バッチ使い捨てでもよいし、繰り返し反応を行ってもよい。但し、繰り返し反応を行う場合、該生体触媒をカルボン酸アンモニウム高濃度から低濃度へ急激に変化させるため、浸透圧の影響等で比活性が低下する場合があるので注意を要する。 The reaction method for producing the carboxylic acid or ammonium carboxylate may be any of a fixed bed, moving bed, fluidized bed, stirring tank, etc., and may be a continuous reaction or a half-batch reaction. When is used, a half-batch reaction using a stirring tank is preferable because of the ease of reaction. In that case, it is good to perform appropriate stirring from the viewpoint of reaction efficiency. In addition, when a half-batch reaction is performed, the biocatalyst having nitrilase may be used in a single batch or repeatedly. However, when the reaction is repeated, the biocatalyst is rapidly changed from a high concentration of ammonium carboxylate to a low concentration, so that the specific activity may be reduced due to the influence of osmotic pressure, etc., so care must be taken.
反応基質であるニトリル化合物の反応中の定常濃度については、2重量％以下が好ましく、より好ましくは0.1〜1.5重量％、更に好ましくは0.1〜1.0重量％、最も好ましくは0.2〜0.5重量％にコントロールするのがよい。ニトリル化合物の濃度が高すぎると、生成物阻害及びまたは失活、或いは高生成物蓄積濃度で初めて顕著となる基質阻害及びまたは失活の影響が急激に大きくなり、それまで進行していた反応が停止してしまう場合がある。また、ニトリル化合物の濃度が低すぎると反応速度を低下させることとなり、効率的にカルボン酸又はカルボン酸を製造できないので不利である。 The steady concentration during the reaction of the nitrile compound as the reaction substrate is preferably 2% by weight or less, more preferably 0.1 to 1.5% by weight, still more preferably 0.1 to 1.0% by weight, and most preferably 0.2 to 0.5% by weight. It is good to do. If the concentration of the nitrile compound is too high, product inhibition and / or deactivation, or substrate inhibition and / or deactivation that become noticeable only at high product accumulation concentrations will rapidly increase, and the reaction that has progressed until then will be It may stop. Moreover, when the density | concentration of a nitrile compound is too low, it will reduce reaction rate, and since it cannot manufacture carboxylic acid or carboxylic acid efficiently, it is disadvantageous.
製造されるカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムに対する使用乾燥生体触媒重量比は１／１００以下がよく、好ましくは１／１００〜１／２００、より好ましくは１／２００〜１／３００、更に好ましくは１／３００〜１／５００である。製造されるカルボン酸アンモニウムに対する使用乾燥生体触媒重量が多すぎると該生体触媒懸濁液由来の不純物が反応液中に多く同伴されるため精製コストが上がり、製品品質が低下するので好ましくない。逆に、製造されるカルボン酸アンモニウムに対する使用乾燥生体触媒重量が少なすぎるとリアクターボリューム当たりの生産性が低下し、大きなリアクターサイズが必要となり経済的に不利となる。 The dry biocatalyst weight ratio to the carboxylic acid or ammonium carboxylate produced is preferably 1/100 or less, preferably 1/100 to 1/200, more preferably 1/200 to 1/300, and even more preferably 1/100. 300 to 1/500. If the weight of the dry biocatalyst used relative to the ammonium carboxylate produced is too large, a large amount of impurities derived from the biocatalyst suspension is entrained in the reaction solution, which increases the purification cost and decreases the product quality. Conversely, if the weight of the dry biocatalyst used for the ammonium carboxylate produced is too small, the productivity per reactor volume is reduced, and a large reactor size is required, which is economically disadvantageous.
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。尚、本発明はこれらの実施例により必ずしも限定されるものではなく、その要旨を超えない限り、様々な変更、修飾が可能である。特に実施例においては、グリコロニトリル（HO-CH2-CN）を用いた実験のみを示すが、本発明の主旨を考慮すると、ニトリラーゼの作用により生成したカルボン酸アンモニウムが塩析効果を示すことが重要なので、グリコロニトリル以外のニトリル化合物についても同様の現象と結果が得られることは容易に類推できるものである。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. In addition, this invention is not necessarily limited by these Examples, A various change and modification are possible unless it exceeds the summary. In particular, in the examples, only experiments using glycolonitrile (HO—CH 2 —CN) are shown, but in view of the gist of the present invention, ammonium carboxylate produced by the action of nitrilase shows a salting out effect. Therefore, it can be easily estimated that the same phenomenon and result can be obtained for nitrile compounds other than glycolonitrile.
本発明に使用する生体触媒であるAcinetobacter sp.AK226は、本発明者らが独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに国際寄託したものであり、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５９０の国際寄託番号を有するものである。 Acinetobacter sp. AK226, which is a biocatalyst used in the present invention, was internationally deposited by the present inventors at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and has an international deposit number of FERM BP-08590. Is.
生体触媒懸濁液中の乾燥生体触媒重量の測定法は、以下のごとく実施した。まず、適当な濃度の生体触媒懸濁液を適量取り、−80℃まで冷却した後、凍結乾燥機を用いて完全に乾燥し、その重量値から前記生体触媒懸濁液の濃度を算出した。固定化物については固定化時における既知となった生体触懸濁液の使用量と架橋剤や固定化担体の使用量から乾燥生体触媒重量を算出した。 The method for measuring the weight of the dried biocatalyst in the biocatalyst suspension was performed as follows. First, an appropriate amount of a biocatalyst suspension having an appropriate concentration was taken, cooled to −80 ° C., completely dried using a freeze dryer, and the concentration of the biocatalyst suspension was calculated from the weight value. For the immobilized product, the dry biocatalyst weight was calculated from the amount of the biocatalyst suspension that was known at the time of immobilization and the amount of the crosslinking agent and the immobilized carrier.
反応液及び処理液の分析は、以下のごとく実施した。基質であるグリコロニトリル及び生成物であるグリコール酸（アンモニウム）は、高速液体クロマトグラフィーで測定した。反応液及び処理液を2M塩酸水溶液で希釈することで反応を停止し、0.2μmフィルター処理で菌体を除いた後、高速液体クロマトグラフィー分析を実施した。カラムはイオン排除カラム（島津Shim-pack SCR-101H）、カラム温度は40℃、移動相はリン酸水溶液（ｐＨ=2.3）、流速は0.7mL/min、検出器はＵＶ（島津SPD-10AV vp、210nm）及びＲＩ（島津RID-6A）、注入量は10μLで実施した。また、菌体由来のタンパクの定量は、GPCで測定した。装置は島津LC-10Vp、カラムは水系GPCカラム（Shodex Asahipak GS320HQ,7.6mmI.D.×300mm）、カラム温度は40℃、移動相は30mMリン酸ナトリウム緩衝液+0.15M Na2SO4(pH=6.87)、流速は0.8mL/min、検出器はUV(280nm)、注入量は100μLで実施した。タンパクの定量は、標準物質としてシグマ社製アルブミン（ALBUMIN HUMAN Sigma A-3782）を使用し、同アルブミン換算で濃度を決定した。 The analysis of the reaction solution and the treatment solution was performed as follows. The substrate, glycolonitrile, and the product, glycolic acid (ammonium), were measured by high performance liquid chromatography. The reaction was stopped by diluting the reaction solution and the treatment solution with 2M aqueous hydrochloric acid, and after removing the cells by 0.2 μm filter treatment, high performance liquid chromatography analysis was performed. The column is an ion exclusion column (Shimadzu Shim-pack SCR-101H), the column temperature is 40 ° C, the mobile phase is phosphoric acid aqueous solution (pH = 2.3), the flow rate is 0.7 mL / min, and the detector is UV (Shimadzu SPD-10AV vp 210 nm) and RI (Shimadzu RID-6A), the injection volume was 10 μL. Moreover, the quantification of the protein derived from a microbial cell was measured by GPC. The equipment is Shimadzu LC-10Vp, the column is an aqueous GPC column (Shodex Asahipak GS320HQ, 7.6 mm I.D. × 300 mm), the column temperature is 40 ° C., the mobile phase is 30 mM sodium phosphate buffer +0.15 M Na 2 SO 4 (pH = 6.87), the flow rate was 0.8 mL / min, the detector was UV (280 nm), and the injection volume was 100 μL. For protein quantification, Sigma albumin (ALBUMIN HUMAN Sigma A-3782) was used as a standard substance, and the concentration was determined in terms of albumin.
[生体触媒の調製]
塩化ナトリウム0.1重量%、リン酸二水素カリウム0.1重量%、硫酸マグネシウム七水和物0.05重量%、硫酸第一鉄七水和物0.005重量%、硫酸アンモニウム0.1重量%、硝酸カリウム0.1重量%硫酸マンガン五水和物0.005重量%を含む培養液250mlを三角フラスコに仕込み、pHが7になるように水酸化ナトリウムで調整し、121℃で20分間滅菌した後、アセトニトリル0.5重量%を添加した。これにAcinetobacter sp.AK226を接種して30℃で振とう培養した(前培養)。ミーストパウダー0.3重量%、グルタミン酸ナトリウム0.5重量%、硫酸アンモニウム0.5重量%、リン酸水素二カリウム0.2重量%、リン酸ニ水素カリウム0.15重量％、塩化ナトリウム0.1重量%、硫酸マグネシウム七水和物0.18重量%、塩化マンガン4水和物0.02重量%、塩化カルシウム二水和物0.01重量%、硫酸鉄7水和物0.003重量%、硫酸亜鉛7水和物0.002重量%、硫酸銅5水和物0.002重量%、大豆油2重量%を含む培養液3Lを5Lジャーファーメンターに仕込み、121℃で20分間滅菌した後、前記の前培養液を接種して30℃で通気攪拌を行った。培養開始10時間後から大豆油のフィードを開始した。PHは7になるようにリン酸及びアンモニア水でコントロールし、最終的に約5重量%のAcinetobacter sp.AK226懸濁液を得た。更に0.06Mリン酸バッファーを用いて2回洗浄を行い、最終的にリン酸バッファーに懸濁されたAcinetobacter sp.AK226懸濁液(乾燥菌体濃度１０重量%)を得た。
[Preparation of biocatalyst]
Sodium chloride 0.1 wt%, potassium dihydrogen phosphate 0.1 wt%, magnesium sulfate heptahydrate 0.05 wt%, ferrous sulfate heptahydrate 0.005 wt%, ammonium sulfate 0.1 wt%, potassium nitrate 0.1 wt% manganese sulfate pentahydrate 250 ml of a culture solution containing 0.005% by weight of the Japanese product was charged into an Erlenmeyer flask, adjusted with sodium hydroxide to a pH of 7, sterilized at 121 ° C. for 20 minutes, and then 0.5% by weight of acetonitrile was added. This was inoculated with Acinetobacter sp. AK226 and cultured with shaking at 30 ° C. (preculture). Mist powder 0.3% by weight, sodium glutamate 0.5% by weight, ammonium sulfate 0.5% by weight, dipotassium hydrogen phosphate 0.2% by weight, potassium dihydrogen phosphate 0.15% by weight, sodium chloride 0.1% by weight, magnesium sulfate heptahydrate 0.18% by weight %, Manganese chloride tetrahydrate 0.02%, calcium chloride dihydrate 0.01%, iron sulfate heptahydrate 0.003%, zinc sulfate heptahydrate 0.002%, copper sulfate pentahydrate 0.002% A 5 L jar fermenter was charged with 3 L of a broth containing 2% by weight and 2% soybean oil, sterilized at 121 ° C. for 20 minutes, inoculated with the pre-culture solution, and aerated and stirred at 30 ° C. Soybean oil feed was started 10 hours after the start of the culture. The pH was controlled with phosphoric acid and aqueous ammonia so that the pH was 7, and finally a suspension of about 5% by weight of Acinetobacter sp. AK226 was obtained. Furthermore, it was washed twice with 0.06M phosphate buffer, and finally, Acinetobacter sp. AK226 suspension (
[原料グリコロニトリル]
原料グリコロニトリルは東京化成製55重量%グリコロニトリル水溶液をそのまま用いた。
[Raw glycolonitrile]
As the raw material glycolonitrile, a 55 wt% aqueous solution of glycolonitrile manufactured by Tokyo Chemical Industry was used as it was.
[実施例Ａ]
上記の55重量％グリコロニトリルを原料に、前記の生体触媒懸濁液を用いて加水分解反応を行った。まず0.06Mリン酸バッファーに懸濁した状態で保存された既知菌体濃度（乾燥菌体濃度10重量％）のAcinetobacter sp.AK226懸濁液を菌体濃度が約6900重量ppmとなるように3L四つ口フラスコに蒸留水とともに仕込み全液量を260gに調製(pH=6.94)した。該フラスコを恒温水槽に入れて攪拌(150rpm)を実施し、内温が50℃になるまでしばらく保持した。次に原料の55重量％グリコロニトリル水溶液を、チューブポンプを用いて0.50g/minで連続フィードを開始した。同時に、1.5重量%アンモニア水をpH計に連動させながらチューブポンプでフィードし、反応液のpHを6.8〜7.0に保った。反応液のサンプリングは30分間隔で実施し、反応液中のグリコロニトリルとグリコール酸の濃度を前出の高速液体クロマトグラフィーで定量した。反応系内のグリコロニトリル定常濃度は0.2〜0.3重量％を保つようにグリコロニトリルフィード速度をコントロールしながら反応を継続し、最終的に1083gの反応液を得た。組成はグリコール酸アンモニウム：52.4重量％、グリコロニトリル：NDであった。本液を冷却式高速遠心分離機(KUBOTA7700)を使って、菌体を遠心分離(18000G×10min)除去した上清を採取した。前出のGPC分析の結果、タンパク濃度は、6.5μg/mLであった。同液をペンシル型MFモジュール(旭化成製PSP-003)で濾過処理を行ったところ、タンパク濃度はND(<1μg/mL)であった。また、同液を実験用メンブレンフィルター(MILIIPORE JAWP04700、孔径：1.0μm)で濾過処理を行っても、タンパク濃度はND(<1μg/mL)であった。
[Example A]
A hydrolysis reaction was carried out using the above-mentioned biocatalyst suspension from the above 55 wt% glycolonitrile. First, 3L of Acinetobacter sp. AK226 suspension with a known cell concentration (dried
[実施例１〜２、比較例１〜５]
0.06Mリン酸バッファーに懸濁した状態で保存された既知菌体濃度（乾燥菌体濃度10重量％）のAcinetobacter sp.AK226懸濁液を菌体濃度が約9900重量ppmとなるように、500ml四つ口フラスコに蒸留水とともに仕込み、全液量を16.3gに調製(pH=6.89)した。該フラスコを恒温水槽に入れてスターラー攪拌を実施し、内温が50℃になるまでしばらく保持した。次に原料の55重量％グリコロニトリル水溶液を、チューブポンプを用いて0.04g/minで連続フィードを開始した。同時に、1.5重量%アンモニア水をpH計に連動させながらチューブポンプでフィードし、反応液のpHを6.8〜7.0に保った。反応液のサンプリングは30分間隔で実施し、反応液中のグリコロニトリルとグリコール酸の濃度を前出の高速液体クロマトグラフィーで定量した。反応系内のグリコロニトリル定常濃度は0.2〜0.3重量％を保つようにグリコロニトリルフィード速度をコントロールしながら反応を継続し、最終的に111.9gの反応液を得た。組成はグリコール酸アンモニウム：57.3重量％、グリコロニトリル：NDであった。本実験に使用したAcinetobacter sp.AK226懸濁液中のタンパク濃度はGPC分析の結果5600μg/mLであったので、本最終反応液中のタンパク濃度は約70μg/mLになると計算される。本反応液111.9gを数日間静置し、懸濁菌体を自然沈降させた後、デカンテーションで上清、約100gを分離し、菌体懸濁濃縮液11.9gを得た。本上清のタンパク濃度はGPC分析の結果ND(<1μg/mL)であったので、全タンパクが該菌体懸濁濃縮液中に存在すると仮定すると、タンパクは約660μg/mLと計算される。得られた菌体懸濁濃縮液に適当量の蒸留水を加えて、グリコール酸アンモニウム濃度が2.5、5、10、20、30、40、50重量%となるように7種類の菌体懸濁液を調製し、実験用メンブレンフィルター(MILIIPORE JAWP04700、孔径：1.0μm)で濾過処理を行い、GPCでタンパク濃度を定量した。結果を表１及び図１に示す。また、比較例３〜５、実施例１についてGPCチャートを図２に示す。
[Examples 1-2, Comparative Examples 1-5]
500 ml of a suspension of Acinetobacter sp. AK226 with a known cell concentration (
本発明によれば、ニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いて、ニトリル化合物からカルボン酸（アンモニウム）を製造するに当たり、該生体触媒から漏出してくるタンパク等の不純物を効率よく除去できる、工業的に有利なカルボン酸アンモニウム水溶液の精製方法を提供できる。 According to the present invention, when a carboxylic acid (ammonium) is produced from a nitrile compound using a biocatalyst having nitrilase activity, impurities such as proteins leaking from the biocatalyst can be efficiently removed. An advantageous method for purifying an aqueous ammonium carboxylate solution can be provided.
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