JP2009162901A

JP2009162901A - ミラーボトムチャンバー

Info

Publication number: JP2009162901A
Application number: JP2007340652A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Miyawaki; 敦史宮脇; Masahiko Hirano; 雅彦平野
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2009-07-23

Abstract

【課題】蛍光性又は発光性の生物学的試料を蛍光顕微鏡で観察するときの像のS/Nの改善。
【解決手段】生物学的試料を顕微鏡で観察するためのチャンバーであって、該チャンバーの底面の一部又は全体にミラーを含むことを特徴とする上記チャンバー。
【選択図】図１

Description

本発明は、生物学的試料を顕微鏡で観察するためのチャンバーに関する。具体的には、該チャンバーは、その底面にミラーを含むことを特徴とする。

通常、顕微鏡観察をするために試料となる細胞を配置させるチャンバーは、底面がガラスやプラスチックなど透明な素材のものが使われている。このようなチャンバーは、試料を透過照明系で観察するときに有用である(非特許文献１)。

一方で最近では、細胞の生理的活動の測定するために、蛍光色素を利用する蛍光顕微鏡による観察法も頻繁に行われるようになっている（非特許文献２）。蛍光や発光は色素分子から全方向に等しく放出される。しかし通常の顕微鏡では、試料の片側の面に対物レンズを配置するため、その反対側に放出された光は対物レンズに入らず、像を形成するために利用されていない。一般的に蛍光や発光の光量は少ないが、さらにそれらのうちの半分の光を失うことで、像のシグナル/ノイズ比（S/N）が低下している。

J. R. Swedlow et al., Live Cell Imaging, p.329-343, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press J. W. Lichtman & J.-A. Conchello, Nature Methods, Vol. 2, p.910-919, 2005

上記のとおり、蛍光性又は発光性の生物学的試料を蛍光顕微鏡で観察する場合の問題点の１つに、像のS/Nが低いという課題がある。

本発明は、上記課題を解決するための手段を提供するものであり、以下の特徴を有する。

すなわち、本発明は、その態様において、生物学的試料を顕微鏡で観察するためのチャンバーであって、該チャンバーの底面の一部又は全体にミラーを含むことを特徴とする前記チャンバーを提供する。

本発明の実施形態によれば、ミラーが、顕微鏡の対物レンズと反対側に放出された光を、対物レンズ側に反射させて対物レンズに捕らえられるようにする。

本発明の別の実施形態によれば、生物学的試料が組織又は細胞である。

本発明は、蛍光性又は発光性の生物学的試料を蛍光顕微鏡で観察する場合に、像のS/Nを改善する作用効果を有する。

本発明者らは、上記の課題を解決するために、チャンバーの底面の一部又は全部をミラーで形成したことを特徴とする、生物学的試料を顕微鏡で観察するためのチャンバーを作成した。

ここで、チャンバーの「底面の一部」とは、底面全体の面積よりは小さく、細胞のサイズよりは大きい面積をいう。この場合、ミラーは、好ましくはチャンバー底面の中央部に配置される。

本発明で使用されるミラーは、全反射ミラーであり、例えば、反射率99%以上の誘電体多層膜ミラーである。

本発明で使用される生物学的試料は、顕微鏡観察可能な組織、細胞及びその構成成分（例えば核、染色体、細胞壁、形質膜、小胞体、ミトコンドリア、微小管、核酸、蛋白質、糖など）などを含む。試料は、例えば生きた状態、死滅した状態、凍結された状態などの形態で、ミラー上に配置される。細胞は、原核細胞、真核細胞のいずれでもよい。原核細胞は、細菌類、藻類などの細胞であり、また、真核細胞は酵母、担子菌、真菌などの菌類の細胞、脊椎動物や無脊椎動物などの動物の細胞、植物の細胞などを含む。組織、細胞又はその構成成分は、励起光の照射によって光を放出するような蛍光色素又は発光性物質によって標識される。

蛍光の例は、シアン色素(Cy3、Cy5など)などの有機系蛍光色素、GFP（緑色蛍光蛋白質）などのオワンクラゲ由来の蛍光蛋白質、蛍光性の量子ドット、NADH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)などの細胞自体が持つ自家蛍光成分などである。また、発光の例は、ルシフェラーゼ/ルシフェリン系による生物発光系、ルミノール、ルシゲニンなどによる化学発光系などである。蛍光蛋白質又は発光性蛋白質をコードするDNAが発現可能なように、遺伝子組み換え技術を使用して細胞に組み込む。蛍光蛋白質及び発光性蛋白質は、特定の遺伝子との融合蛋白質の形態で発現されてもよい。発光性蛋白質は、発光基質と組み合わせる。

顕微鏡としては、蛍光顕微鏡、コンフォーカル顕微鏡、多光子励起顕微鏡などが使用可能である。

細胞はミラーと反対側の上方から対物レンズによって観察される。対物レンズとは反対側に放出された蛍光や発光は、ミラーによって対物レンズ側に反射される。反射された光は対物レンズに捕らえられるため、その光を像の形成に有効に利用することができる。

チャンバーは、顕微鏡用であれば特に制限されないものとし、例えばガラス製又はプラスチック（又はポリマー）製のものを使用することができる。その底面の一部を覆うようにミラーを固定してもよく、或いは、実用的に、より広い視野で観察が行えるように底面全体をミラーとしてもよい。

以下に、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって制限されないものとする。

本発明のチャンバーを顕微鏡での発光観察に使用する。試料として、発光反応に関わる蛋白質を発現させた細胞を使用し、これに発光基質を与える。顕微鏡は発光を試料の上方から観察できる正立型を使用する。試料からの発光は等方的に放出される。対物レンズ側に放出された発光は、そのまま対物レンズによって捕らえられる。また対物レンズと反対側に放出された発光は一旦ミラーで反射されてから、対物レンズによって捕らえられる（図１）。直接対物レンズに捕らえられた発光で形成された像と、ミラーで反射されてから対物レンズに捕らえられた発光で形成された像とでは、深さ方向にずれがあり、これらが重なった像として観察される。この場合、例えば対物レンズとして開口数が小さく、焦点深度の深いものを使えば、見た目の像のずれは小さくなり観察が容易になる。分解能的には乏しい像になるが、細胞からの総発光量を比較する場合などには利用できる。検出器にはカメラを使い、露光状態で画像を取得する。

本発明のチャンバーのミラー上で培養された細胞と、ガラス上に培養された細胞を同じ条件で観察し、発光強度及び背景光強度を比較する。この比較を通して、本発明のチャンバーを使用することによって発光像のS/N比が改善されることを確認する。

本発明のチャンバーを蛍光顕微鏡での蛍光観察に使用する。試料として、蛍光蛋白質を発現させた細胞を使用する。顕微鏡は試料の上方に配置された対物レンズを通して励起光の照射し、蛍光の観察が行える正立型を使用する。励起光が照射された試料からの蛍光は等方的に放出される。対物レンズ側に放出された蛍光は、そのまま対物レンズによって捕らえられる。また対物レンズと反対側に放出された蛍光は一旦ミラーで反射されてから、対物レンズによって捕らえられる。直接対物レンズに捕らえられた蛍光で形成された像と、ミラーで反射されてから対物レンズに捕らえられた蛍光で形成された像とでは、深さ方向にずれがあり、これらが重なった像として観察される。この場合、例えば対物レンズとして開口数が小さく、焦点深度の深いものを使えば、見た目の像のずれは小さくなり観察が容易になる。分解能的には乏しい像になるが、細胞からの総蛍光量を比較する場合などには利用できる。検出器にはカメラを使い、露光状態で画像を取得する。

本発明のチャンバーのミラー上で培養された細胞と、ガラス上に培養された細胞を同じ条件で観察し、蛍光強度及び背景光強度を比較する。この比較を通して、本発明のチャンバーを使用することによって蛍光像のS/N比が改善されることを確認する。

本発明のチャンバーを多光子励起顕微鏡での蛍光観察に使用する。試料として、蛍光蛋白質を発現させた細胞を使用する。顕微鏡は試料の上方に配置された対物レンズを通して励起光の照射し、蛍光の観察が行える正立型を使用する。多光子励起法では、蛍光色素に対して複数の光子を同時に照射することでその色素を励起する。通常、多光子励起には高繰り返しのフェムト秒パルスレーザーが光源として用いられるが、多光子励起現象が起こる確率は低く、励起光が収束する光子密度の高い焦点でのみ起こる。したがって、そのとき放出される蛍光は、すべてその点から出たものと考えられる。そのため、ミラーに反射されて対物レンズに入った光も、その点の像を形成する光として利用することができる。レーザーをガルバノミラーでX、Y方向にスキャンすることで、その面の蛍光像を取得する。このとき光源としてチタンサファイアレーザーを使用することができる。

本発明により、顕微鏡による組織又は細胞の像の精度が向上する。このことは、生体試料の分析の分野において寄与しうる。

この図は、ミラー上の生物学的試料（発光性又は蛍光性）に対し、その上方に配置された対物レンズを通して励起光を照射したときの光の放射を示す模式図である。実際には、発光又は蛍光が起こっているすべての点から光が放射されている。

符号の説明

1. 対物レンズ
2. ミラー
3. 発光又は蛍光
4. 試料

Claims

生物学的試料を顕微鏡で観察するためのチャンバーであって、該チャンバーの底面の一部又は全体にミラーを含むことを特徴とする前記チャンバー。
ミラーが、顕微鏡の対物レンズと反対側に放出された光を、対物レンズ側に反射させて対物レンズに捕らえられるようにする、請求項１に記載のチャンバー。
生物学的試料が、組織又は細胞である、請求項１又は２に記載のチャンバー。