JP2009148170A - Monoclonal antibody specific to mytilus coruscus larva in adhesion period - Google Patents
Monoclonal antibody specific to mytilus coruscus larva in adhesion period Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009148170A JP2009148170A JP2007326553A JP2007326553A JP2009148170A JP 2009148170 A JP2009148170 A JP 2009148170A JP 2007326553 A JP2007326553 A JP 2007326553A JP 2007326553 A JP2007326553 A JP 2007326553A JP 2009148170 A JP2009148170 A JP 2009148170A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- larvae
- mussel
- monoclonal antibody
- fragment
- hybridoma
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000143233 Mytilus coruscus Species 0.000 title abstract description 7
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 69
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 241000237536 Mytilus edulis Species 0.000 claims description 96
- 235000020638 mussel Nutrition 0.000 claims description 93
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 22
- 241001072261 Musculista senhousia Species 0.000 claims description 16
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 claims description 6
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 claims description 6
- 241000238586 Cirripedia Species 0.000 claims description 5
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 241000269851 Sarda sarda Species 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 24
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 abstract description 13
- 241001147138 Mytilus galloprovincialis Species 0.000 abstract description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 12
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 8
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 8
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 7
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 7
- 241000237519 Bivalvia Species 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000020639 clam Nutrition 0.000 description 6
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- -1 etc.) Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 5
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 4
- KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N Phalloidin Chemical compound N1C(=O)[C@@H]([C@@H](O)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C[C@@](C)(O)CO)NC(=O)[C@H](C2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](O)CN3C(=O)[C@@H]1CSC1=C2C2=CC=CC=C2N1 KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 241001537210 Perna Species 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 239000008001 CAPS buffer Substances 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000237524 Mytilus Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010009711 Phalloidine Proteins 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000036103 Chthamalus challengeri Species 0.000 description 1
- 241001195836 Cypris Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000270 Ficain Proteins 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001501873 Isochrysis galbana Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241001245601 Perna viridis Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000001467 acupuncture Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- XAHAOEIIQYSRHJ-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N.NC1=CC=CC=C1N XAHAOEIIQYSRHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000004568 cement Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 235000019836 ficin Nutrition 0.000 description 1
- POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N ficin Chemical compound FI=CI=N POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N gold(1+) Chemical compound [Au+] ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000012784 inorganic fiber Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N naproxen Chemical compound C1=C([C@H](C)C(O)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L nitro blue tetrazolium dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical class [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
本発明は、イガイ付着期幼生（ペディベリジャー幼生）に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ又はその作製方法、イガイ付着期幼生に特異的なモノクローナル抗体又はそのフラグメント、並びに、イガイ付着期幼生の検出用試薬、検出方法、検出キット、及び検出器に関する。 The present invention relates to a hybridoma that produces a monoclonal antibody specific for mussel-attached larvae (Pediber larvae) or a method for producing the same, a monoclonal antibody or fragment thereof specific to mussel-attached larvae, and detection of mussel-attached larvae The present invention relates to a reagent for use, a detection method, a detection kit, and a detector.
二枚貝類の一種であるムラサキイガイは、受精後1〜2日目に無摂餌のままムラサキイガイD型幼生になり、その後、約3週〜約1ヶ月間摂餌しながらムラサキイガイ付着期幼生（ペディベリジャー幼生）に成長する。 The mussel, a kind of bivalve, turns into a mussel D-type larva without feeding on the first or second day after fertilization, and then feeds for about three weeks to about one month while feeding on the mussel Larvae).
現在までに、ムラサキイガイの幼生を同定する方法として、特異的なモノクローナル抗体が利用されているが、これまで、付着期幼生とD型幼生の両方に反応するモノクローナル抗体しか得られていなかった（例えば、非特許文献1参照）。従って、捕獲したムラサキイガイ幼生の中から、付着期幼生を迅速かつ簡便に同定することができなかった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、イガイ付着期幼生に反応し、イガイD型幼生に反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、その抗体及びそのフラグメント、並びに、その利用方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a hybridoma that produces a monoclonal antibody that reacts with mussel adherent-stage larvae but does not react with mussel D-type larvae, its antibodies and fragments thereof, and methods of use thereof The purpose is to do.
これまで、ムラサキイガイ付着期幼生とD型幼生の両方に反応するモノクローナル抗体しか得られておらず、当業者にとっても、ムラサキイガイ付着期幼生に特異的に反応する抗体が得られるかどうか、不明であった。まして、同じイガイ科であっても、Mytilus属に属するイガイとPerna属に属するイガイの両方の属の付着期幼生に特異的に反応し、両方のD型幼生には反応しないモノクローナル抗体が得られるかどうかは全くわからなかった。 So far, only monoclonal antibodies that react with both mussel-adherent larvae and D-type larvae have been obtained, and it is unclear for those skilled in the art whether antibodies that specifically react with mussel-adherent larvae can be obtained. It was. Furthermore, even in the same mussel family, a monoclonal antibody that reacts specifically with the adherent larvae of both the genus Mytilus and the mussel belonging to the genus Perna and does not react with both D-type larvae is obtained. I didn't know at all.
本発明者らは、ムラサキイガイ付着期幼生を抗原とすることで、Mytilus属に属するイガイの付着期幼生だけでなく、Perna属に属するイガイの付着期幼生をも認識し、両者のD型幼生は認識しないモノクローナル抗体が得られることを見出し、本発明に至った。 The present inventors recognize not only the mussel adhesion stage larva belonging to the genus Mytilus but also the mussel adhesion stage larva belonging to the genus Perna, by using the mussel adhesion stage larva as an antigen. The inventors have found that monoclonal antibodies that do not recognize can be obtained, and have reached the present invention.
すなわち、本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントは、イガイ付着期幼生に反応し、イガイD型幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントである。ここで、前記イガイは、ムラサキイガイ又はミドリイガイであることが好ましい。前記モノクローナル抗体又はそのフラグメントは、イガイ付着期幼生の足に反応することが好ましく、マガキ付着期幼生、アサリ付着期幼生、及びバカガイ付着期幼生にも反応しないことが好ましく、甲殻類プランクトンやフジツボ付着期幼生にも反応しないことが好ましい。なお、前記モノクローナル抗体又はそのフラグメントとしては、例えば、受託番号FERM P-21416で寄託されているハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体又はそのフラグメント等が挙げられる。 That is, the monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention is a monoclonal antibody or fragment thereof that reacts with mussel-attached larvae but does not react with mussel D-type larvae. Here, the mussels are preferably mussels or green mussels. The monoclonal antibody or fragment thereof preferably reacts with mussel-adhering larvae feet, preferably does not react with oyster-adherent larvae, clams-adherent larvae, and snail-adherent larvae, and adheres to crustacean plankton or barnacles It is preferable that the larvae do not react. Examples of the monoclonal antibody or a fragment thereof include a monoclonal antibody produced from a hybridoma deposited under accession number FERM P-21416 or a fragment thereof.
また、本発明にかかる検出用試薬は、イガイ付着期幼生を特異的に検出する検出用試薬であって、前記いずれかに記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを有効成分として含有する。 The detection reagent according to the present invention is a detection reagent for specifically detecting mussel-adherent larvae, and contains any one of the monoclonal antibodies or fragments thereof as an active ingredient.
さらに、本発明にかかる検出方法は、イガイ付着期幼生を特異的に検出する検出方法であって、試料に、前記いずれかに記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを添加することを特徴とする。 Furthermore, the detection method according to the present invention is a detection method for specifically detecting mussel-adherent larvae, wherein the monoclonal antibody or fragment thereof described above is added to a sample.
また、本発明にかかる検出キットは、イガイ付着期幼生を特異的に検出する検出キットであって、前記いずれかに記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含む。 The detection kit according to the present invention is a detection kit for specifically detecting mussel-adherent larvae, and includes the monoclonal antibody or a fragment thereof described above.
さらに、本発明にかかる検出器は、イガイ付着期幼生を特異的に検出する検出器であって、前記いずれかに記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントが固定化されていることを特徴とする。 Furthermore, the detector according to the present invention is a detector that specifically detects mussel-adherent larvae, and is characterized in that the monoclonal antibody or fragment thereof described above is immobilized.
また、本発明にかかるハイブリドーマ作製方法は、前記いずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製する方法であって、ムラサキイガイ付着期幼生で免疫したヒト以外の哺乳類動物由来の脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合したハイブリドーマから、イガイ付着期幼生に反応するが、D型幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選定する工程を含む。 The hybridoma production method according to the present invention is a method for producing a hybridoma producing the monoclonal antibody according to any one of the above, wherein the spleen cells and myeloma cells derived from mammals other than humans immunized with mussel-adherent larvae And a step of selecting a hybridoma that produces a monoclonal antibody that reacts with mussel-adherent larvae but does not react with D-type larvae.
さらに、本発明にかかるハイブリドーマは、前記いずれかに記載のモノクローナル抗体モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。このようなハイブリドーマとしては、例えば、受託番号FERM P-21416で寄託されているハイブリドーマ等が挙げられる。 Furthermore, the hybridoma according to the present invention is a hybridoma that produces any one of the monoclonal antibodies described above. Examples of such a hybridoma include a hybridoma deposited under the accession number FERM P-21416.
なお、本明細書において、ペディベリジャー幼生とは、付着期幼生とも称し、足を有する幼生のことをいう。 In addition, in this specification, a pediberger larva is also called an attachment stage larva and means a larva having a foot.
本発明によれば、イガイ付着期幼生に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、その抗体及びそのフラグメント、並びに、その利用方法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the hybridoma which produces the monoclonal antibody specific to a mussel adhesion stage larva, its antibody, its fragment, and its utilization method can be provided.
上記知見に基づき完成した本発明を実施するための形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。 An embodiment for carrying out the present invention completed based on the above knowledge will be described in detail with reference to examples. Unless otherwise stated in the embodiments and examples, J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Standard Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. The method described in the protocol collection, or a modified or modified method thereof is used. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them are used.
＝＝モノクローナル抗体又はそのフラグメント＝＝
本発明にかかるモノクローナル抗体は、イガイ付着期幼生に反応するが、イガイD型幼生に反応しないことを特徴とする。ここで、イガイは二枚貝類のイガイ目イガイ科に属する貝の総称であって、イガイ（Mytilus coruscus）、ムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）、ミドリイガイ（Perna viridis）、モエギイガイ（Perna canaliculatus）等を含む。なお、モノクローナル抗体が幼生に反応するというとき、その幼生の形状は、whole-mountであっても、組織切片であっても、粗抽出液（超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物）であっても、当業者が抗体反応に用いる形状であれば、特に限定されない。また、その幼生に対して行う処理（固定、溶解、抽出等）も、当業者が抗体反応に用いるために通常行う処理であれば、特に限定されない。
== Monoclonal antibody or fragment thereof ==
The monoclonal antibody according to the present invention is characterized in that it reacts with mussel adhesion stage larvae but does not react with mussel D-type larvae. Here, mussels are a collective term for clams belonging to the mussel family of mussels, and include mussels (Mytilus coruscus), mussels (Mytilus galloprovincialis), green mussels (Perna viridis), Moena mussels (Perna canaliculatus) and the like. When the monoclonal antibody reacts with larvae, the shape of the larvae may be whole-mount, tissue section, or crude extract (lysate treated with an ultrasonic device, homogenizer, etc.). Even if it exists, it will not specifically limit if it is a shape which those skilled in the art use for an antibody reaction. Also, the treatment (fixation, dissolution, extraction, etc.) performed on the larvae is not particularly limited as long as it is a treatment that is usually performed by those skilled in the art for use in antibody reactions.
この抗体は、イガイ以外の二枚貝類（特に、マガキ、アサリ、及びバカガイ）付着期幼生には反応しない方が好ましく、甲殻類プランクトンやフジツボ付着期幼生にも反応しない方が好ましい。それによって、捕獲したプランクトンの中に、多種類の水生動物が混在していても、イガイ付着期幼生のみを同定できる。 The antibody preferably does not react with larvae of bivalves (especially oysters, clams, and snails) other than mussels, and preferably does not react with crustacean plankton or barnacles. Thereby, even if many kinds of aquatic animals are mixed in the captured plankton, only the mussel attachment stage larvae can be identified.
本発明にかかるフラグメントとしては、前述のモノクローナル抗体の一部からなり、可変領域を含む抗原結合部位であれば特に制限されるものではないが、例えば、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント等を用いることができる。これらのフラグメントは、例えば、前述のモノクローナル抗体をタンパク質分解酵素によって部分消化することにより得ることができる。なお、タンパク質分解酵素としては、FabフラグメントやF(ab’)2フラグメントを得ることができるものであればどのようなものであってもよいが、例えば、ペプシン、フィシン等の分解酵素を用いることができる。 The fragment according to the present invention is not particularly limited as long as it is an antigen-binding site comprising a part of the above-mentioned monoclonal antibody and including a variable region. For example, Fab fragment, F (ab ′) 2 fragment, etc. Can be used. These fragments can be obtained, for example, by partially digesting the aforementioned monoclonal antibody with a proteolytic enzyme. The proteolytic enzyme may be any as long as it can obtain Fab fragments and F (ab ′) 2 fragments. For example, a protease such as pepsin or ficin should be used. Can do.
＝＝モノクローナル抗体の製造方法＝＝
本発明のモノクローナル抗体は、イガイ付着期幼生に反応するが、イガイD型幼生に反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（以下、「本発明にかかるハイブリドーマ」と称する。）から得ることができる。
== Method for producing monoclonal antibody ==
The monoclonal antibody of the present invention can be obtained from a hybridoma that produces a monoclonal antibody that reacts with mussel-attached larvae but does not react with mussel D-type larvae (hereinafter referred to as “hybridoma according to the present invention”).
本発明にかかるハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の製造は、常法に従って行うことができる。例えば、該ハイブリドーマを適当な培養培地で培養し、培養上清を回収することにより行ってもよいが、前述のハイブリドーマを哺乳類動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サル等）の腹腔内に投与し、腹水を回収することにより行ってもよい。なお、モノクローナル抗体の精製は、前述のハイブリドーマの培養上清又は培養したハイブリドーマを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物、又は前述のハイブリドーマを腹腔内に投与した哺乳類動物から採取した腹水を、常法、例えば、硫安塩析、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィー等）、ゲル濾過等の方法、又はこれらの方法を適宜組み合わせた方法により行うことができる。 Production of a monoclonal antibody using the hybridoma according to the present invention can be carried out according to a conventional method. For example, the hybridoma may be cultured in an appropriate culture medium, and the culture supernatant may be collected. The hybridoma described above may be used in mammals (eg, mouse, rat, hamster, rabbit, pig, cow, horse, It may be carried out by intraperitoneal administration of dogs, monkeys, etc.) and collecting ascites. The purification of the monoclonal antibody was performed by using the culture supernatant of the hybridoma or the lysate obtained by treating the cultured hybridoma with an ultrasonic device, a homogenizer, or the ascites collected from a mammal administered intraperitoneally with the hybridoma. It can be carried out by a conventional method, for example, ammonium sulfate salting out, chromatography (for example, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc.), gel filtration, or a combination of these methods.
前述のハイブリドーマとしては、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおいて受託番号FERM P-21416で寄託されている細胞株N12-1-2bを用いることができる。 As the above hybridoma, for example, the cell line N12-1-2b deposited under the accession number FERM P-21416 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology can be used.
＝＝＝ハイブリドーマの作製＝＝＝
本発明にかかるハイブリドーマは、常法により作製することができる。以下に一例を示す。
=== Production of Hybridoma ===
The hybridoma according to the present invention can be prepared by a conventional method. An example is shown below.
まず、ムラサキイガイ付着期幼生を集める。具体的には、ムラサキイガイ付着期幼生が含まれているムラサキイガイ幼生集団を飼育ビーカーから取り出し、顕微鏡観察によって、眼点及び足が形成されている個体を選別し、収集を行なう。 First, collect larvae that are attached to the mussel. Specifically, the mussel larvae group containing the mussel adhesion stage larvae is taken out from the breeding beaker, and individuals with eye points and feet formed are selected and collected by microscopic observation.
次に、ムラサキイガイ付着期幼生又はその粗抽出液等を抗原として用い、適当な量の抗原（アジュバントを使用してもよい。）を哺乳類動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サル等）の静脈内、皮下、腹腔内等に（1〜複数回）投与して免疫する。 Next, the mussel adhesion stage larvae or a crude extract thereof is used as an antigen, and an appropriate amount of antigen (adjuvant may be used) is used as a mammal (eg, mouse, rat, hamster, rabbit, pig, cow). , Horses, dogs, monkeys, etc.) intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, etc. (one to several times) and immunized.
その後、免疫した動物から抗体産生細胞を採取し、採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）と融合させてハイブリドーマを作製する。得られたハイブリドーマの中で、ムラサキイガイやミドリイガイ等のイガイD型幼生には反応性を示さないが、ムラサキイガイやミドリイガイ等のイガイ付着期幼生には反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選定することにより、本発明のハイブリドーマを得ることができる。 Thereafter, antibody-producing cells are collected from the immunized animal, and the collected antibody-producing cells and myeloma cells (myeloma cells) are fused to produce a hybridoma. Among hybridomas obtained, select a hybridoma that produces a monoclonal antibody that does not react to mussel D-type larvae such as mussels and green mussels, but is reactive to mussel-adapted larvae such as mussels and green mussels Thus, the hybridoma of the present invention can be obtained.
前記抗体産生細胞とミエローマ細胞は、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等の細胞融合促進剤を用いて細胞融合することができるが、エレクトロポレーション等の電気刺激を利用して細胞融合することもできる。なお、細胞融合の効率を高めるために、ジメチルスルホキシドやレシチン等の補助剤を細胞融合促進剤に含ませてもよい。 The antibody-producing cells and myeloma cells can be fused with a cell fusion promoter such as polyethylene glycol (PEG) or Sendai virus (HVJ), but using electrical stimulation such as electroporation. Cell fusion is also possible. In order to increase the efficiency of cell fusion, adjuvants such as dimethyl sulfoxide and lecithin may be included in the cell fusion promoter.
前記抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等を用いることができる。これらの細胞は、動物から脾臓、リンパ節、胸腺、又は末梢血を摘出し、摘出した組織を破砕、濾過、遠心分離等することにより得ることができる。また、前記ミエローマ細胞としては、各種動物由来の細胞株を用いてもよいが、それ自身薬剤に対して抵抗性を示さないが、融合すると薬剤に対して抵抗性を示す細胞株を用いることが好ましい。これにより、細胞融合した後、薬剤を添加した培養培地（例えば、HAT培地等）で培養することにより、細胞融合によって得られたハイブリドーマの選択が容易となる。なお、融合させる抗体産生細胞とミエローマ細胞は、同種の動物由来の細胞を用いることが望ましいが、異なる種の動物由来の細胞を用いてもよい。 Examples of the antibody-producing cells that can be used include spleen cells, lymph node cells, thymocytes, and peripheral blood cells. These cells can be obtained by removing spleen, lymph nodes, thymus, or peripheral blood from an animal, and crushing, filtering, centrifuging, etc. the removed tissue. In addition, as the myeloma cells, cell lines derived from various animals may be used. However, cell lines that do not themselves show resistance to drugs but that are resistant to drugs when fused may be used. preferable. This facilitates selection of hybridomas obtained by cell fusion by culturing in a culture medium (for example, HAT medium) containing a drug after cell fusion. The antibody-producing cells and myeloma cells to be fused are preferably cells derived from the same species, but cells derived from animals of different species may be used.
前述のハイブリドーマの選定は、常法のスクリーニングやクローニングにより行うことができる。ハイブリドーマのスクリーニングには、例えば、酵素免疫測定法（EIA：Enzyme ImmunoAssay、ELISA：Enzyme-Linked Immunosorbent Assays）、放射線免疫測定法（RIA：Radio Immuno Assay）、ウエスタンブロッティング等を用いることができ、ハイブリドーマのクローニングには、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等を用いることができる。本発明にかかるハイブリドーマの選定において、上記スクリーニング及びクローニングを繰り返し行うことにより、イガイ付着期幼生又はその粗抽出液に対して特異性の高いモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することが可能となる。 The aforementioned hybridoma can be selected by routine screening or cloning. For screening of hybridomas, for example, enzyme immunoassay (EIA: Enzyme ImmunoAssay, ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assays), radioimmunoassay (RIA: Radio Immuno Assay), Western blotting, etc. can be used. For cloning, for example, a limiting dilution method, a soft agar method, a fibrin gel method, a fluorescence excitation cell sorter method, or the like can be used. In selecting a hybridoma according to the present invention, it is possible to select a hybridoma that produces a monoclonal antibody with high specificity for mussel-adhered larvae or a crude extract thereof by repeating the above screening and cloning.
なお、前述のハイブリドーマのスクリーニングでは、最低限ムラサキイガイ幼生（ペディベリジャー幼生、D型幼生）及びミドリイガイ幼生（ペディベリジャー幼生、D型幼生）との反応性を調べればよいが、さらに、他の二枚貝類の付着期幼生、フジツボ付着期幼生（キプリス幼生）、甲殻類プランクトン等の他の幼生若しくはプランクトンとの反応性を調べることがより好ましい。これにより、イガイ付着期幼生に対してより特異性の高いモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができ、このハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いることにより、様々な幼生又はプランクトンを含む試料（例えば、海水等）中からイガイ付着期幼生を特異的に検出することが可能となり、また、様々な幼生又はプランクトンを含む試料（例えば、海水等）中からイガイ付着期幼生を特異的に検出することが可能になる。すなわち、イガイ付着期幼生の存在の有無の確認、イガイ付着期幼生の同定、イガイ付着期幼生の量の測定等を行うことができるようになる。 In the above hybridoma screening, at least the reactivity with mussel larvae (pediberger larvae, D-type larvae) and green mussel larvae (pediberger larvae, D-type larvae) may be examined, but other bivalves It is more preferable to examine the reactivity with other larvae such as larvae, barnacle adhesion larvae (Cyprus larvae), crustacean plankton, or plankton. This makes it possible to obtain a hybridoma that produces a monoclonal antibody with higher specificity for mussel-attached larvae. By using a monoclonal antibody produced from this hybridoma, samples containing various larvae or plankton (for example, It is possible to specifically detect mussel adhesion stage larvae from seawater, etc., and to detect mussel adhesion stage larvae specifically from samples containing various larvae or plankton (eg seawater etc.). Is possible. That is, it is possible to confirm the presence or absence of mussel-attached larvae, identify mussel-attached larvae, and measure the amount of mussel-attached larvae.
＝＝モノクローナル抗体又はそのフラグメントの使用＝＝
本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントは、イガイD型幼生には反応性を示さないが、イガイ付着期幼生に対して特異的に反応性を示す。従って、二枚貝であるイガイの発生段階特異的な検出に有用であると考えられる。
== Use of monoclonal antibodies or fragments thereof ==
The monoclonal antibody according to the present invention or a fragment thereof does not react with mussel D-type larvae but specifically reacts with mussel-adherent larvae. Therefore, it is considered useful for the stage-specific detection of mussels that are bivalves.
また、本発明にかかるモノクローナル抗体は、イガイ以外の二枚貝類（特に、マガキ、アサリ、及びバカガイ）の付着期幼生には反応性を示さない方が好ましい。このようなモノクローナル抗体又はそのフラグメントは、類似の生物間におけるイガイ付着期幼生の特異的な検出にも有用であると考えられる。 Moreover, it is preferable that the monoclonal antibody according to the present invention does not show reactivity to the attachment larvae of bivalves (especially oysters, clams, and snails) other than mussels. Such monoclonal antibodies or fragments thereof are considered useful for the specific detection of mussel adherent larvae between similar organisms.
さらに、本発明にかかるモノクローナル抗体又はフラグメントは、イガイ付着期幼生を効率的に選択して回収するのに有用であると考えられる。イガイ付着期幼生の回収は、モノクローナル抗体又はそのフラグメントとの親和性を利用して行うことができる。例えば、磁性体を結合させた本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントをイガイ付着期幼生に作用させ、その後、磁石を用いて本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを回収することにより行うことができる。なお、前記磁性体としては、例えば、鉄、酸化鉄等を用いることができる。その他、イガイ付着期幼生の回収において、FACS（Fluorescence Activated Cell sort）、panning等の方法を用いてもよい。 Furthermore, it is considered that the monoclonal antibody or fragment according to the present invention is useful for efficiently selecting and recovering mussel attachment stage larvae. Recovery of mussel-adherent larvae can be performed by utilizing the affinity with monoclonal antibodies or fragments thereof. For example, it can be carried out by allowing the monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention to which a magnetic substance has been bound to act on the mussel adherent stage larvae, and then recovering the monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention using a magnet. . In addition, as said magnetic body, iron, iron oxide, etc. can be used, for example. In addition, methods such as FACS (Fluorescence Activated Cell sort) and panning may be used for collecting mussel-adherent larvae.
本発明にかかるイガイ付着期幼生の検出は、試料（例えば、海水若しくは川水又はそれを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物等）に、本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを加えて試料中のイガイ付着期幼生由来の抗原と反応させることにより、その抗原を同定することにより行うことができる。 The detection of mussel adhesion stage larvae according to the present invention is performed by adding the monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention to a sample (for example, seawater or river water or a lysate obtained by treating it with an ultrasonic device, a homogenizer, etc.). By reacting with an antigen derived from a mussel adhesion stage larva in a sample, the antigen can be identified.
従って、イガイ付着期幼生に特異的に反応し、イガイD型幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントは、イガイ付着期幼生の検出用試薬、検出キット、及び検出器として利用可能である。 Therefore, a monoclonal antibody or a fragment thereof that specifically reacts with mussel adhesion stage larvae but does not react with mussel D-type larvae can be used as a detection reagent, detection kit, and detector for mussel adhesion stage larvae.
なお、本発明にかかるイガイ付着期幼生の検出用試薬は、本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含むものであればどのようなものでもよく、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりイガイ付着期幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質等）、安定剤（例えば、BSA、ヤギ血清等）等の、抗体又はそのフラグメント以外に抗原の検出用試薬に含ませる一般的な物質が1又は2以上、さらに含まれていてもよい。 Note that the detection reagent for mussel adhesion stage larvae according to the present invention may be any reagent as long as it contains the monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention, for example, a buffer solution (for example, phosphate, carbonate, etc.). Salt, salt solution such as hydrochloride), preservatives (for example, sodium azide, etc.), substances for suppressing non-specific reactions (for example, block ace, gelatin, skim milk, etc.), immunological techniques Commonly included in antigen detection reagents other than antibodies or fragments thereof, such as substances (eg, labeling substances) and stabilizers (eg, BSA, goat serum) necessary to detect mussel adherent larvae 1 or 2 or more of these substances may be further contained.
本発明にかかるイガイ付着期幼生の検出器は、本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントが媒体（例えば、濾紙等の紙、ガラス、繊維、ニトロセルロース等の変性セルロース、ナイロン、プラスチック等から成るフィルター、メンブレン、プレート、ディッシュ等）に固定化されているものを含めばどのようなものでもよく、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりイガイ付着期幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質、発色基質、二次抗体、発色増強剤等）、安定剤（例えば、BSA、ヤギ血清等）等の、抗体又はそのフラグメント以外に抗原の検出器に含ませる一般的な物質が1又は2以上、さらに含まれていてもよい。 The mussel adhesion stage larva detector according to the present invention is a filter in which the monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention comprises a medium (for example, paper such as filter paper, glass, fiber, modified cellulose such as nitrocellulose, nylon, plastic, etc. , Membranes, plates, dishes, etc.) and any other materials such as buffers (eg, solutions of salts such as phosphates, carbonates, hydrochlorides), preservatives (For example, sodium azide, etc.), substances for suppressing non-specific reactions (for example, block ace, gelatin, skim milk, etc.), substances necessary for detecting mussel adherent stage larvae by immunological techniques ( For example, labeling substances, chromogenic substrates, secondary antibodies, chromogenic enhancers, etc.), stabilizers (eg, BSA, goat serum, etc.), etc. Common materials for inclusion in the detector of the antigen in addition to cement is 1 or 2 or more may be further included.
本発明にかかるイガイ付着期幼生の検出器の一例としては、試料を滴下する部分又は試料を浸す第一の部分と、本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントが固定化された第二の部分と、本発明にかかるモノクローナル抗体が産生されたホストの動物種の免疫グロブリンに特異的に反応する抗免疫グロブリン抗体等が固定化された第三の部分を有し、第二の部分が第一の部分と第三の部分との間に備えられ、第一の部分には、金属コロイド粒子（例えば、金コロイド粒子等）、重金属（例えば、金、白金等）、蛍光物質（例えば、FITC（フルオレセインイソチオシアネート）、ローダミン、ファロイジン等）、着色ラテックス粒子等の標識物質で標識された、本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含むクロマトグラフ媒体を挙げることができる。前記クロマトグラフ媒体としては、例えば、ガラスやシリカ等の無機繊維からなる濾紙、ニトロセルロース等の変性セルロース等を用いることができる。このようなクロマトグラフ媒体を用いることにより、試料中にイガイ付着期幼生が存在するかどうかを検出することが可能になる。 As an example of the detector of the mussel adhesion stage larva according to the present invention, there are a part where the sample is dropped or a first part where the sample is immersed, and a second part where the monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention is immobilized. An anti-immunoglobulin antibody that specifically reacts with the immunoglobulin of the host animal species from which the monoclonal antibody according to the present invention was produced has a third part immobilized thereon, and the second part comprises the first part The first part includes a metal colloidal particle (eg, gold colloidal particle), a heavy metal (eg, gold, platinum, etc.), a fluorescent material (eg, FITC (fluorescein). Chroma containing the monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention labeled with a labeling substance such as isothiocyanate), rhodamine, phalloidin, etc.), colored latex particles, etc. A graph medium. Examples of the chromatographic medium include filter paper made of inorganic fibers such as glass and silica, and modified cellulose such as nitrocellulose. By using such a chromatographic medium, it is possible to detect whether mussel adherent stage larvae are present in the sample.
その原理としては、イガイ付着期幼生又はその溶解物を含む試料をクロマトグラフ媒体の第一の部分に滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、試料中のイガイ付着期幼生又はその溶解物は、第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体又はそのフラグメントと反応して複合体を形成し、液が媒体中を広がるのを利用して、その複合体は第二の部分へと移動し、第二の部分において固定化された前述のモノクローナル抗体又はそのフラグメントに捕捉されてその位置で標識物質によりイガイ付着期幼生の検出が可能となる。第一の部分からくるフリーの抗体は、第三の部分へと移動し、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分で発色が生じる。この第三の部分での発色は、検出のポジティブコントロールとなる。これに対して、イガイ付着期幼生由来の抗原を含まない試料を第一の部分に滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体又はそのフラグメントが、第二の部分を素通りして第三の部分へと移動し、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分でのみ発色が生じる。このように、第二の部分にシグナルが現れたか否かによって、試料中にイガイ付着期幼生が存在するかどうかを判定することが可能となる。 The principle is that when a sample containing mussel-adhered larvae or a lysate thereof is dropped on the first part of the chromatographic medium or the first part is immersed in the sample, the mussel-adherent larvae in the sample or its The lysate reacts with the labeled monoclonal antibody or fragment thereof contained in the first part to form a complex, and the complex spreads into the medium by utilizing the spread of the liquid in the medium. And captured by the aforementioned monoclonal antibody or fragment thereof immobilized in the second portion, and the larvae-attached larvae can be detected by the labeling substance at that position. The free antibody coming from the first part moves to the third part and is captured by the anti-immunoglobulin antibody immobilized in the third part, and color development occurs in the third part. This color development in the third part serves as a positive control for detection. In contrast, when a sample not containing an antigen derived from the mussel adhesion stage larva is dropped on the first part or the first part is immersed in the sample, the labeled monoclonal antibody contained in the first part or The fragment passes through the second part and moves to the third part and is captured by the anti-immunoglobulin antibody immobilized in the third part, and color development occurs only in the third part. As described above, it is possible to determine whether or not mussel adhesion stage larvae exist in the sample depending on whether or not a signal appears in the second portion.
一方、本発明にかかるイガイ付着期幼生の検出キットは、本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含むものであればどのようなものでもよく、本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメント以外に、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりイガイ付着期幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質、発色基質、二次抗体、発色増強剤等）、安定剤（例えば、BSA、ヤギ血清等）等の抗原の検出キットに含ませる一般的な物質、若しくは前述のような本発明にかかるモノクローナル抗体又はそのフラグメントが媒体に固定化されている検出器、又はこれらのうち2以上を組み合わせたものが含まれていてもよい。 On the other hand, the detection kit for the mussel adhesion stage larvae according to the present invention may be any one as long as it contains the monoclonal antibody according to the present invention or a fragment thereof. , Buffers (eg, solutions of salts such as phosphate, carbonate, hydrochloride, etc.), preservatives (eg, sodium azide, etc.), substances for suppressing non-specific reactions (eg, block ace, Gelatin, skim milk, etc.), substances necessary for detecting mussel adhesion stage larvae by immunological techniques (eg, labeling substances, chromogenic substrates, secondary antibodies, chromogenic enhancers, etc.), stabilizers (eg, BSA, goats) General substances to be included in antigen detection kits such as serum, etc., or monoclonal antibodies or fragments thereof according to the present invention as described above are used as a medium. Joka has been and detectors, or may include a combination of two or more of these.
なお、標識物質としては、例えば、蛍光物質（例えば、FITC、ローダミン、ファロイジン等）、金等のコロイド粒子、重金属（例えば、金、白金等）、色素タンパク質（例えば、フィコエリトリン（PE）、フィコシアニン（PC）等）、放射性同位元素（例えば、3H、32P、35S、125I、131I等）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジン等の物質を用いることができるがこれらに制限されるものではなく、公知の標識物質を用いてもよい。また、発色基質としては、前述の酵素に対する発色基質であれば特に制限されるものではなく、例えば、ジアミノベンジジン（DAB）、o-フェニレンジアミン(o-Phenylenediamine)、過酸化水素水、BCIP/Nitro-TB（5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/Nitrotetrazolium blue）、pNPP（para-nitorophenylphosphate）等を用いることができる。発色増強剤としては、前述の基質の発色を増強させることができるものであればどのようなものでもよく、例えば、硫酸等を用いることができ、二次抗体としては、例えば、本発明にかかるモノクローナル抗体が産生されたホストの動物種の免疫グロブリンに特異的に反応する抗免疫グロブリン抗体、抗Ig(H+L)、抗Ig(Fc)等を用いることができる。 Examples of labeling substances include fluorescent substances (for example, FITC, rhodamine, phalloidin, etc.), colloidal particles such as gold, heavy metals (for example, gold, platinum, etc.), chromoproteins (for example, phycoerythrin (PE), phycocyanin ( PC) etc.), radioisotopes (eg 3 H, 32 P, 35 S, 125 I, 131 I etc.), enzymes (eg peroxidase, alkaline phosphatase etc.), biotin, streptavidin etc. However, it is not limited to these, and a known labeling substance may be used. Further, the chromogenic substrate is not particularly limited as long as it is a chromogenic substrate for the above-mentioned enzyme. For example, diaminobenzidine (DAB), o-phenylenediamine (o-Phenylenediamine), hydrogen peroxide solution, BCIP / Nitro -TB (5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate / Nitrotetrazolium blue), pNPP (para-nitorophenylphosphate), etc. can be used. As the color development enhancer, any one can be used as long as it can enhance the color development of the aforementioned substrate. For example, sulfuric acid or the like can be used. As the secondary antibody, for example, the present invention is applied. Anti-immunoglobulin antibodies, anti-Ig (H + L), anti-Ig (Fc), etc. that specifically react with the immunoglobulin of the host animal species from which the monoclonal antibody was produced can be used.
また、前述の免疫学的手法としては、EIA（Enzyme Immunoassay）、蛍光免疫測定法、ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）、RIA（Radioimmuno assay）、ウエスタンブロッティング、ラテックス凝集法、イムノクロマト法、サンドイッチ法等の公知の方法を用いることができる。 The immunological methods described above include EIA (Enzyme Immunoassay), fluorescence immunoassay, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), RIA (Radioimmuno assay), Western blotting, latex agglutination, immunochromatography, sandwich method, etc. These known methods can be used.
以上のように、本発明にかかるイガイ付着期幼生の検出方法を用いることにより、イガイ付着期幼生の同定やイガイ付着期幼生の分離及び量の測定が可能となるが、検出キットや検出器を用いることにより、より容易にイガイ付着期幼生を同定することができるようになる。 As described above, by using the method for detecting mussel adhesion stage larvae according to the present invention, it becomes possible to identify mussel adhesion stage larvae and to separate and measure the amount of mussel adhesion stage larvae. By using it, it becomes possible to identify the mussel adhesion stage larvae more easily.
以下に本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. These examples are for explaining the present invention, and do not limit the scope of the present invention.
＜実施例１＞
本発明のモノクローナル抗体を得るために、以下の飼育方法により得られたムラサキイガイ付着期幼生（ペディベリジャー幼生）を抗原として用いた。
<Example 1>
In order to obtain the monoclonal antibody of the present invention, mussel-adherent larvae (Pediberger larvae) obtained by the following breeding method were used as antigens.
[ムラサキイガイ付着期幼生の飼育方法]
ムラサキイガイ親貝を水槽内で維持し、親貝の放卵・放精によって受精した卵を回収した。受精卵をろ過海水にて洗浄後、ろ過海水を満たしたビーカー等の容器に収容し、エアレーションを行なった。ろ過海水には抗生物質（終濃度ペニシリン3mg/L ストレプトマイシン 6.6mg/L）を添加し、餌として植物プランクトン（ハプト藻 Isochrysis galbana）を与えた。成長初期は飼育容器内の海水を毎日交換して給餌し、その後、2〜3日に1回の頻度で海水の交換を行った。約3週〜約1ヶ月後、顕微鏡観察によって、眼点及び足が形成されている個体を選別し、付着期幼生（ペディベリジャー幼生）の収集を行ない、以下のように抗原として用いた。
[How to rear larvae that adhere to the blue mussel]
The mussel parent shell was maintained in the aquarium, and the fertilized eggs were collected by the egg release and fertilization of the parent shell. The fertilized egg was washed with filtered seawater, then housed in a container such as a beaker filled with filtered seawater, and aerated. Antibiotics (final concentration penicillin 3 mg / L streptomycin 6.6 mg / L) were added to the filtered seawater, and phytoplankton (haptophyte Isochrysis galbana) was given as food. In the initial stage of growth, the seawater in the breeding container was changed and fed every day, and then the seawater was changed once every 2-3 days. After about 3 weeks to about 1 month, individuals with eye points and feet formed were selected by microscopic observation, and adherent larvae (Pediberger larvae) were collected and used as antigens as follows.
7週齢のBALB/cマウスの腹腔内に上記抗原を6回注射し（1〜5回目の注射：幼生300個/100〜150μl PBS、6回目の注射（最終免疫）：幼生1000個/200μl PBS；1回目の投与から22日目に2回目の投与を、2回目の投与から24日目に3回目の投与を、3回目の投与からおよそ半年後に4回目の投与を、4回目の投与から半月後に5回目の投与を、5回目の投与からおよそ80日目に6回目の投与を行った。）、マウスを免疫した。 The above antigen was injected into the abdominal cavity of 7-week-old BALB / c mice 6 times (1-5th injection: 300 larvae / 100-150 μl PBS, 6th injection (final immunization): 1000 larvae / 200 μl PBS; second dose on day 22 from the first dose, third dose on day 24 from the second dose, fourth dose approximately half a year after the third dose, fourth dose Half a month later, the fifth dose was given, and the sixth dose was given approximately 80 days after the fifth dose.) The mice were immunized.
最終免疫から3日後に抗体価が上がったマウスを解剖して脾臓を摘出し、摘出した脾臓を10％のFBS（Fetal Bovine Serum；GIBCO）及び1％の抗生物質（Antibiotic-Antimycotic；GIBCO）を含むRPMI1640（GIBCO）培地中で滅菌ステンレスメッシュにより裏漉した後、分散・懸濁することにより浮遊細胞を得た。この浮遊細胞を10％のFBS を含むRPMI1640培地（FBS+培地）で洗浄・遠心した後、RPMI1640培地（FBS-培地）で3回遠心・洗浄し、脾臓細胞（108個程度）を回収した。 Three days after the final immunization, dissect mice whose antibody titers increased and removed the spleen. The removed spleen was treated with 10% FBS (Fetal Bovine Serum; GIBCO) and 1% antibiotic (Antibiotic-Antimycotic; GIBCO). Suspended cells were obtained by dispersing and suspending in a RPMI1640 (GIBCO) medium containing sterilized stainless steel mesh. The suspension cells were washed and centrifuged with RPMI1640 medium (FBS + medium) containing 10% FBS, and then centrifuged and washed three times with RPMI1640 medium (FBS - medium) to collect spleen cells (about 10 8 cells). .
次に、ミエローマ細胞株P3U1（5×107個）と脾臓細胞（108個程度）を混合し、その後遠心して上清を除去し、細胞ペレット（沈殿）を作製した。これに1gのPEG4000（ポリエチレングリコール；MERCK社Article No.9727）とFBS-培地1mlとを混合した溶液を1分間かけてゆっくりと添加しながら撹拌し、さらに１分間緩やかに撹拌した。その後、FBS-培地2mlをゆっくり加えながら１分間撹拌して、細胞融合を行った。 Next, the myeloma cell line P3U1 (5 × 10 7 cells) and spleen cells (about 10 8 cells) were mixed, and then centrifuged to remove the supernatant to prepare a cell pellet (precipitate). A solution prepared by mixing 1 g of PEG4000 (polyethylene glycol; Article No. 9727 of MERCK) and 1 ml of FBS - medium was slowly added over 1 minute, followed by further stirring for 1 minute. Thereafter, 2 ml of FBS - medium was slowly added and stirred for 1 minute to perform cell fusion.
細胞融合処理後、さらにFBS-培地（37℃）8mlを1分間かけてゆっくりと添加し、続いて遠心分離（1000rpm×5分間）して上澄みを吸引除去した。これにFBS+培地10mlを添加して懸濁し、FBS+HAT培地（10％のFBS、1％の抗生物質、及びHAT supplement medium（SIGMA；粉末1バイアルを50倍に希釈したものを使用）×0.5を含むRPMI1640培地（GIBCO））が入った分室シャーレ5枚にそれぞれ2ml播種し、37 ℃，5% CO2の条件下で5日間培養した。 After the cell fusion treatment, 8 ml of FBS - medium (37 ° C.) was slowly added over 1 minute, followed by centrifugation (1000 rpm × 5 minutes), and the supernatant was removed by suction. Add 10 ml of FBS + medium and suspend it, then add FBS + HAT medium (10% FBS, 1% antibiotics, and HAT supplement medium (SIGMA; use 1 vial of powder diluted 50 times) x 2 ml of each of the 5 laboratory petri dishes containing RPMI1640 medium (GIBCO) containing 0.5 was inoculated and cultured for 5 days under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
各セル内で明瞭な増殖が確認されたハイブリドーマ細胞のコロニーをピックアップし、HT培地（10％の細胞増殖因子（conditioned medium from J774A.1 cells，HYBRIMAX；SIGMA）、100μMヒポキサンチン及び16μMチミジンを含むRPMI1640培地）の入った96穴ウェルプレートに移し、ハイブリドーマの培養を行った。その後、明瞭なハイブリドーマの増殖が確認されたウェルについて、その培養上清を採取し、ELISA法により抗体の産生を確認した。なお、特に記載がない過程については室温にて処理（反応を含む）を行った。 Pick up colonies of hybridoma cells that have been clearly proliferated in each cell, and contain HT medium (10% conditioned medium from J774A.1 cells, HYBRIMAX; SIGMA), 100 μM hypoxanthine and 16 μM thymidine. The cells were transferred to a 96-well plate containing RPMI1640 medium), and hybridomas were cultured. Thereafter, the culture supernatant was collected from wells in which the growth of clear hybridoma was confirmed, and antibody production was confirmed by ELISA. In addition, about the process which is not described in particular, it processed at room temperature (a reaction was included).
（１）上記「室内飼育方法」によって得られたムラサキイガイ付着期幼生30000個体に600μlの50mM Tris-HCl（pH 7.5）を加え、氷中でホモジナイズ・超音波（数秒×5回）処理を行い、5000rpm×20分間遠心することにより、ムラサキイガイ付着期幼生粗抽出液（タンパク質濃度：39.5mg/ml）を調製した。
（２）（１）で得られたムラサキイガイ付着期幼生粗抽出液（100μg/ml）50μlを、96穴イワキELISAプレートの各ウェルに加え、4℃で抗原をウェル底面に吸着させた。
（３）（２）で吸着処理した各ウェルをTBS（0.5 M NaCl及び20 mM Tris-HCl（pH7.5））200μlで洗浄した。
（４）各ウェルを1％ BSAを含むTBS 100μlで1時間ブロッキングした。
（５）各ウェルをTTBS（0.05％ Tween20を含むTBS）200μlで3回洗浄した。
（６）ハイブリドーマを培養することにより得られた培養上清（1次抗体）50μlを各ウェルに加え、1時間反応させた。
（７）各ウェルをTTBS 200μlで4回洗浄した。
（８）各ウェルに2次抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG（H+L）ヤギ抗体；ZYMED laboratory）溶液（TBSで1000倍に希釈した溶液）50μlを加えて1時間反応させた。
（９）各ウェルをTTBS 200μlで5回洗浄した。
（10）各ウェルに基質（アルカリフォスファターゼ基質キット；BIO-RAD）溶液 100μlを加え、1時間振盪することにより発色させた。
（11）マイクロプレートリーダー（BIO-RAD Model550；405nm）を用いて、各ウェルの溶液の吸光度を測定した。
(1) Add 600 μl of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) to 30000 mussel adhering larvae obtained by the “indoor breeding method” above, and perform homogenization and ultrasonic treatment (several seconds × 5 times) in ice. By centrifuging at 5000 rpm for 20 minutes, a mussel coarse-phase larvae crude extract (protein concentration: 39.5 mg / ml) was prepared.
(2) 50 μl of the mussel crude larvae extract (100 μg / ml) obtained in (1) was added to each well of a 96-well Iwaki ELISA plate, and the antigen was adsorbed to the bottom of the well at 4 ° C.
(3) Each well subjected to the adsorption treatment in (2) was washed with 200 μl of TBS (0.5 M NaCl and 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)).
(4) Each well was blocked with 100 μl of TBS containing 1% BSA for 1 hour.
(5) Each well was washed 3 times with 200 μl of TTBS (TBS containing 0.05% Tween20).
(6) 50 μl of the culture supernatant (primary antibody) obtained by culturing the hybridoma was added to each well and allowed to react for 1 hour.
(7) Each well was washed 4 times with 200 μl of TTBS.
(8) To each well was added 50 μl of a secondary antibody (alkaline phosphatase-labeled anti-mouse IgG (H + L) goat antibody; ZYMED laboratory) solution (1000-fold diluted with TBS) and allowed to react for 1 hour.
(9) Each well was washed 5 times with 200 μl of TTBS.
(10) 100 μl of substrate (alkaline phosphatase substrate kit; BIO-RAD) solution was added to each well, and color was developed by shaking for 1 hour.
(11) The absorbance of the solution in each well was measured using a microplate reader (BIO-RAD Model 550; 405 nm).
前述のELISA法により高い抗体産生能が確認されたハイブリドーマについて、段階的に希釈した培養液をさらにELISA法により抗体価を測定し、抗体産生能が高いハイブリドーマをピックアップするという操作を3回繰り返して行い（2回目及び3回目の培養は、HTを含まない、10％ FBS、1％ 抗生物質、及び10％ 細胞増殖促進成分（conditioned medium from J774A.1 cells, HYBRIMAX, SIGMA）を含むRPMI1640を用いた。）、ムラサキイガイ付着期幼生粗抽出液に対してより高い抗体産生能を示すハイブリドーマクローン（N12-1-2b）を得た。 For the hybridoma whose high antibody-producing ability was confirmed by the above-mentioned ELISA method, the antibody titer of the culture solution diluted stepwise was further measured by ELISA method, and the operation of picking up the hybridoma having high antibody-producing ability was repeated three times. (The second and third cultures use RPMI1640 with HT-free, 10% FBS, 1% antibiotics, and 10% conditioned medium from J774A.1 cells, HYBRIMAX, SIGMA) ), A hybridoma clone (N12-1-2b) showing higher antibody-producing ability to the mussel crude larvae extract.
＜実施例２＞
次に、実施例１により得られた1つのハイブリドーマの培養上清に含まれるモノクローナル抗体が、ムラサキイガイ付着期幼生（ペディベリジャー幼生）に対して特異的に反応するか否かを調べるため、ムラサキイガイ幼生（付着期幼生、D型幼生）、ミドリイガイD型幼生、ムラサキイガイ以外の二枚貝類（アサリ、バカガイ、マガキ等）の付着期幼生（ペディベリジャー幼生）、甲殻類プランクトン（コペポーダ類、アルテミア（Artemia salina）ノープリウス幼生）、イワフジツボ（Chthamalus challengeri Hoek）キプリス幼生、アカフジツボキプリス幼生の粗抽出液（タンパク質の濃度；100μg/ml）との反応性を、実施例１に記載のELISA法と同様に確認した。なお、各粗抽出液は、各幼生又はプランクトンを50mM Tris-HCl（PH7.5）に加えてホモジナイズ・超音波（数秒×5回）処理し、5000rpm×20分間の遠心を行うことにより調製した。
<Example 2>
Next, in order to examine whether or not the monoclonal antibody contained in the culture supernatant of one hybridoma obtained in Example 1 specifically reacts with the mussel adhesion stage larvae (pediberger larvae), the mussel larvae are examined. (Adhesion stage larvae, D-type larvae), green mussel D-type larvae, bivalves (clams, snails, oysters, etc.) other than bivalves (clams, snails, oysters, etc.) The reactivity of Naprius larvae), Chthamalus challengeri Hoek cypris larvae, and Akafuji acupuncture larvae with crude extracts (protein concentration: 100 μg / ml) was confirmed in the same manner as in the ELISA method described in Example 1. Each crude extract was prepared by adding each larvae or plankton to 50 mM Tris-HCl (PH7.5), homogenizing and sonicating (several seconds × 5 times), and centrifuging at 5000 rpm × 20 minutes. .
ELISAの結果（OD405値）を表１及び表２に示す。
まず、表１では、ムラサキイガイ付着期幼生と他種の二枚貝やプランクトンとの間で、抗体反応性を比較した。ハイブリドーマN12-1-2bの上清は、ムラサキイガイ付着期幼生（ペディベリジャー幼生）の粗抽出液に対して非常に強い反応性を示したが、形態学的に非常に似ているマガキ、アサリ、バカガイ等のムラサキイガイ以外の二枚貝類のペディベリジャー幼生の粗抽出液や、二枚貝類以外の幼生（イワフジツボキプリス幼生、及びアカフジツボキプリス幼生）や甲殻類プランクトン（コペポーダ類、アルテミア（Artemia salina）ノープリウス幼生）の粗抽出液に対しては反応性を示さなかった。
表２では、ムラサキイガイ付着期幼生と、他の発生段階のイガイ幼生との間で、抗体反応性を比較した。ハイブリドーマN12-1-2bの上清は、ムラサキイガイ付着期幼生（ペディベリジャー幼生）の粗抽出液に対して非常に強い反応性を示したが、発生段階が異なるムラサキイガイD型幼生や、同じイガイ科のミドリイガイD型幼生の粗抽出液に対しては反応性を示さなかった。 In Table 2, antibody reactivity was compared between mussel larvae at different stages of development and mussel larvae at other developmental stages. The supernatant of hybridoma N12-1-2b showed a very strong reactivity to the crude extract of mussel larvae (Pedeberger larvae), but the mussel D-type larvae with different developmental stages and the same mussel family It did not show any reactivity to the crude extract of green mussel D-type larvae.
＜実施例３＞
次に、実施例１により得られたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体がムラサキイガイ付着期幼生をwhole-mountで認識するかどうかを調べるために、ハイブリドーマN12-1-2bのモノクローナル抗体を用いて、ムラサキイガイ幼生（付着期幼生、D型幼生）及びミドリイガイ（付着期幼生、D型幼生）に対する免疫染色を以下のように行った。また、以下において、特に記載がない過程については室温にて処理（反応を含む）を行った。
<Example 3>
Next, in order to investigate whether the monoclonal antibody produced by the hybridoma obtained in Example 1 recognizes the mussel adhesion stage larvae through whole-mount, the mussel larvae larvae were used using the hybridoma N12-1-2b monoclonal antibody. Immunostaining for (adherent larvae, D-type larvae) and green mussels (adherent larvae, D-type larvae) was performed as follows. In addition, in the following, processes (including reactions) were performed at room temperature for processes not specifically described.
（１）ムラサキイガイ（付着期幼生、D型幼生）及びミドリイガイ（付着期幼生、D型幼生）をそれぞれ96穴プレートに入れ、5％ ホルマリンを用いて固定した。
（２）各ウェルをPBS 200μlで洗浄した後、PBST（0.05％ Tween20を含むPBS）200μlにてさらに洗浄した。
（３）各ウェルに1％ BSAを含むPBST200μlを注入し、4℃で8時間ブロッキングした。
(1) Blue mussels (adhesion stage larvae, D-type larvae) and green mussels (adhesion stage larvae, D-type larvae) were each placed in a 96-well plate and fixed with 5% formalin.
(2) Each well was washed with 200 μl of PBS, and further washed with 200 μl of PBST (PBS containing 0.05% Tween20).
(3) 200 μl of PBST containing 1% BSA was injected into each well and blocked at 4 ° C. for 8 hours.
（４）各ウェルにN12-1-2bのモノクローナル抗体（1次抗体；1％ BSAを含むPBSTで8倍に希釈した溶液）200μlを加え、4℃で一晩反応させた。なお、コントロールには、一次抗体としてマウス抗アカフジツボ付着期幼生抗体（特開2006-246820に記載のハイブリドーマKF1-6a4(1)6P-3（受託番号FERM P-20279）の培養上清）を用いた。 (4) 200 μl of N12-1-2b monoclonal antibody (primary antibody; solution diluted 8 times with PBST containing 1% BSA) was added to each well and reacted at 4 ° C. overnight. As a control, mouse anti-red barnacle adhesion stage larva antibody (culture supernatant of hybridoma KF1-6a4 (1) 6P-3 (accession number FERM P-20279) described in JP-A-2006-246820) is used as a primary antibody. It was.
（５）各ウェルをPBST 200μlで4回洗浄した。
（６）各ウェルに2次抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG（H+L）ヤギ抗体；1％ BSAを含むPBSTで400倍に希釈した溶液）200μlを加えて4℃で8時間反応させた。
(5) Each well was washed 4 times with 200 μl of PBST.
(6) A secondary antibody (alkaline phosphatase-labeled anti-mouse IgG (H + L) goat antibody; solution diluted 400 times with PBST containing 1% BSA) 200 μl was added to each well and reacted at 4 ° C. for 8 hours. .
（７）各ウェルをPBST 200μlで4回洗浄した。
（８）各ウェルに基質（アルカリフォスファターゼ基質キット；BIO-RAD）溶液 200μlを加えて発色させた。
(7) Each well was washed 4 times with 200 μl of PBST.
(8) 200 μl of substrate (alkaline phosphatase substrate kit; BIO-RAD) solution was added to each well for color development.
図１及び図２に示すように、ハイブリドーマN12-1-2bが産生するモノクローナル抗体は、ムラサキイガイ付着期幼生の足及びミドリイガイ付着期幼生（ペディベリジャー幼生）の面盤根元及び足に反応したが、ムラサキイガイD型幼生及びミドリイガイD型幼生には反応しなかった。 As shown in FIG. 1 and FIG. 2, the monoclonal antibody produced by the hybridoma N12-1-2b reacted to the roots and feet of the mussel-adhered larvae and the green mussel-adherent larvae (pediberger larvae). It did not react to mussel D-type larvae and green mussel D-type larvae.
＜実施例４＞
次に、ハイブリドーマN12-1-2bから産生されたモノクローナル抗体が、ムラサキイガイ付着期幼生のどの抗原に特異的に反応するのかを確認するため、ムラサキイガイ付着期幼生の各粗抽出液に対し、ハイブリドーマN12-1-2bから産生されたモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。また、ムラサキイガイ付着期幼生に類似した他の幼生に発現している抗原には、反応性を示さないことを確認するため、ムラサキイガイD型幼生、ミドリイガイD型幼生、アカフジツボ付着期幼生の粗抽出液についてもウエスタンブロッティングを行った。
<Example 4>
Next, in order to confirm which antigen of the mussel adherent stage larva specifically reacts with the monoclonal antibody produced from the hybridoma N12-1-2b, hybridoma N12 Western blotting was performed using the monoclonal antibody produced from -1-2b. In addition, in order to confirm that there is no reactivity with antigens expressed in other larvae similar to mussel-adhered larvae, crude extract of mussel D-type larvae, green mussel D-type larvae, and red-oranged larvae-attached larvae Western blotting was also performed.
（１）タンパク量を5μgに調整した各種抽出液にてSDS電気泳動（ポリアクリルアミド7．5％）を行った。
（２）PVDF膜を電気泳動ゲルと同様の大きさに切り、100％メタノールに数秒、次に10ｍMCAPS緩衝液を浸透させて親水化処理を行った。
（３）セミドライ式ブロッティング装置に10ｍMCAPS緩衝液を浸透させたろ紙、メンブレン及びSDS電気泳動後のゲルをセットし、2ｍA/cm2で2時間通電した。
（４）ブロッティング済みのPVDF膜をTBSで10分間洗浄した。
（５）PVDF膜を3％スキムミルク入りのTBSで室温にて1時間ブロッキングした。
（６）TBSで洗浄後、ハイブリドーマN12-1-bを培養することによって得られた培養上清（一次抗体）を1％スキムミルク入りのTBSで2倍希釈し、室温で1時間又は4℃で一晩反応させた。
（７）蒸留水で洗浄後、TTBS中に10分間、2回置いた。
（８）PVDF膜を二次抗体（アルカリフォスファターゼ標識坑マウスIgG ヤギ抗体：BioRAD）溶液（1％スキムミルク入りのTBSで3000倍希釈）と1時間反応させた。
（９）蒸留水で洗浄後、TTBS中に10分間、2回置いた。
（10）蒸留水で洗浄後、BCIP/NBT アルカリフォスファターゼ基質溶液（SIGMA）にて染色を行った。
(1) SDS electrophoresis (polyacrylamide 7.5%) was performed with various extracts adjusted to a protein amount of 5 μg.
(2) The PVDF membrane was cut to the same size as the electrophoresis gel and hydrophilized by impregnating with 100% methanol for several seconds and then with 10 mM CAPS buffer.
(3) A filter paper, a membrane and a gel after SDS electrophoresis in which 10 mM CAPS buffer was permeated were set in a semi-dry blotting apparatus, and energized at 2 mA / cm 2 for 2 hours.
(4) The blotted PVDF membrane was washed with TBS for 10 minutes.
(5) The PVDF membrane was blocked with TBS containing 3% skim milk for 1 hour at room temperature.
(6) After washing with TBS, the culture supernatant (primary antibody) obtained by culturing hybridoma N12-1-b is diluted 2 times with TBS containing 1% skim milk, and then at room temperature for 1 hour or at 4 ° C. Reacted overnight.
(7) After washing with distilled water, it was placed twice in TTBS for 10 minutes.
(8) The PVDF membrane was reacted with a secondary antibody (alkaline phosphatase-labeled anti-mouse IgG goat antibody: BioRAD) solution (diluted 3000 times with TBS containing 1% skim milk) for 1 hour.
(9) After washing with distilled water, it was placed twice in TTBS for 10 minutes.
(10) After washing with distilled water, staining was performed with BCIP / NBT alkaline phosphatase substrate solution (SIGMA).
図３に示すように、ハイブリドーマN12-1-2bが産生するモノクローナル抗体は、ムラサキイガイ付着期幼生における約125kDa、約120kDa、約118kDaのタンパク質に特異的に反応した。一方、このモノクローナル抗体は、ムラサキイガイD型幼生、ミドリイガイD型幼生、及びアカフジツボ付着期幼生由来の抗原には反応しなかった。 As shown in FIG. 3, the monoclonal antibody produced by the hybridoma N12-1-2b specifically reacted with proteins of about 125 kDa, about 120 kDa, and about 118 kDa in the mussel larvae. On the other hand, this monoclonal antibody did not react with antigens derived from mussel D-type larvae, green mussel D-type larvae, and red larvae-adherent larvae.
以上のことから、ハイブリドーマN12-1-2bは、イガイ付着期幼生（ペディベリジャー幼生）に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生することが明らかになり、このハイブリドーマ細胞株が産生するモノクローナル抗体を用いることにより、イガイ付着期幼生を特異的に検出したり、回収したりすることができることが明らかになった。そこで、このハイブリドーマ細胞株を独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した（N12-1-2b：受託番号FERM P-21416）。 From the above, it has been clarified that the hybridoma N12-1-2b produces a monoclonal antibody that reacts specifically with mussel adhesion larvae (Pediber larvae) and uses the monoclonal antibody produced by this hybridoma cell line. As a result, it was revealed that mussel-adherent larvae can be specifically detected and recovered. Therefore, this hybridoma cell line was deposited with the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (N12-1-2b: accession number FERM P-21416).
Claims (13)
請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを有効成分として含有する検出用試薬。 A detection reagent that specifically detects mussel-attached larvae,
A detection reagent containing the monoclonal antibody or fragment thereof according to any one of claims 1 to 6 as an active ingredient.
試料に、請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを添加することを特徴とする検出方法。 A detection method that specifically detects mussel-attached larvae,
A monoclonal antibody or fragment thereof according to any one of claims 1 to 6 is added to a sample.
請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含むことを特徴とする検出キット。 A detection kit that specifically detects mussel-attached larvae,
A detection kit comprising the monoclonal antibody or fragment thereof according to claim 1.
請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントが固定化されていることを特徴とする検出器。 A detector that specifically detects mussel-attached larvae,
A detector, wherein the monoclonal antibody or fragment thereof according to any one of claims 1 to 6 is immobilized.
ムラサキイガイ付着期幼生で免疫したヒト以外の哺乳類動物由来の脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合したハイブリドーマから、イガイ付着期幼生に反応するが、Ｄ型幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選定する工程を含むことを特徴とするハイブリドーマの作製方法。 A method for producing a hybridoma that produces the monoclonal antibody according to claim 1,
Select hybridomas that produce monoclonal antibodies that react with mussel-attached larvae but not D-type larvae from hybridomas fused with spleen cells derived from non-human mammals and myeloma cells immunized with mussel-attached larvae A method for producing a hybridoma comprising the step of:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007326553A JP5577018B2 (en) | 2007-12-18 | 2007-12-18 | Monoclonal antibodies specific for mussel larvae |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007326553A JP5577018B2 (en) | 2007-12-18 | 2007-12-18 | Monoclonal antibodies specific for mussel larvae |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009148170A true JP2009148170A (en) | 2009-07-09 |
| JP5577018B2 JP5577018B2 (en) | 2014-08-20 |
Family
ID=40918125
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007326553A Active JP5577018B2 (en) | 2007-12-18 | 2007-12-18 | Monoclonal antibodies specific for mussel larvae |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5577018B2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012037386A (en) * | 2010-08-06 | 2012-02-23 | Chugoku Electric Power Co Inc:The | Monochronal antibody peculiar to tubularia mesembryanthemum actinula larva |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006246822A (en) * | 2005-03-11 | 2006-09-21 | Chugoku Electric Power Co Inc:The | Monoclonal antibody specific to larva in adhesion period of soletelina diphos |
-
2007
- 2007-12-18 JP JP2007326553A patent/JP5577018B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006246822A (en) * | 2005-03-11 | 2006-09-21 | Chugoku Electric Power Co Inc:The | Monoclonal antibody specific to larva in adhesion period of soletelina diphos |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012037386A (en) * | 2010-08-06 | 2012-02-23 | Chugoku Electric Power Co Inc:The | Monochronal antibody peculiar to tubularia mesembryanthemum actinula larva |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5577018B2 (en) | 2014-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10429386B2 (en) | Antibodies to the surface of Toxoplasma gondii oocysts and methods of use thereof | |
| JP4139818B2 (en) | Monoclonal antibody specific for mussel larvae | |
| JP4084808B2 (en) | Monoclonal antibodies specific for red larvae adhering larvae | |
| WO2008035527A1 (en) | ANTI-C1q MONOCLONAL ANTIBODY | |
| JP5269136B2 (en) | How to identify jellyfish planula larvae | |
| CN114134123A (en) | Monoclonal antibody of pregnancy-associated glycoprotein and application of monoclonal antibody in early pregnancy detection of cattle | |
| JP3932320B2 (en) | Detection method of larvae adhering to oyster | |
| JP5577018B2 (en) | Monoclonal antibodies specific for mussel larvae | |
| JP5007321B2 (en) | Monoclonal antibody specific for mussel larva belonging to the genus Perna | |
| JP2009149533A (en) | Monoclonal antibody specific to larva of blue sea mussel belonging to genus mytilus | |
| JP2009073783A (en) | Method for producing fish-derived antibody | |
| JP6033894B2 (en) | Monoclonal antibody specific for mussel larva belonging to the genus Mytilus | |
| JP4194570B2 (en) | Monoclonal antibodies specific for barnacles' adherent larvae | |
| JP5425832B2 (en) | How to identify Tamami Hydra Planula larvae | |
| JP2017186262A (en) | Test monoclonal antibody, and diagnosis kit using this | |
| KR20120132227A (en) | Monoclonal antibody for detecting multiple type Foot and Mouth Disease Virus and method for detecting Foot and Mouth Disease Virus using the same | |
| JP2913026B1 (en) | Clam floating larva specific monoclonal antibody | |
| JP5474860B2 (en) | Monoclonal antibodies specific to Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae | |
| JP6026718B2 (en) | Monoclonal antibody specific for venicida hydra actinula larvae | |
| JP5781804B2 (en) | Monoclonal antibodies specific for Benicum hydra actinula larvae and Tamami hydraplanula larvae. | |
| JPH04502363A (en) | Detection of basement membrane components for diagnosis of cancer and other diseases | |
| JP2022501615A (en) | Methods, devices, kits, and compositions for detecting tapeworms | |
| CN1307237A (en) | Immunoassay of human medullarin and diagnosis of multiple sclerosis using the same | |
| US7368256B2 (en) | Antibodies against Stachybotrys chartarum and methods for their use | |
| CN115166241B (en) | Efficient screening technology for simultaneously screening memory B cells and plasma cells and application |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090612 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111129 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120306 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140407 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140529 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140707 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5577018 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |