JP2009109489A - 腫瘍形成を診断するための方法及びキット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】血液、血奬、血清、唾液、尿、及び他の生物液中のGP88濃度を測定することによる腫瘍形成診断方法及びキット。該方法及びキットは、1ミリリットルあたり約0.1〜10ナノグラムの低さの濃度で生物液中のGP88を検出し、患者の血清又は他の生物液中のGP88濃度を測定することによって、患者が腫瘍形成状態を有するか、患者が抗腫瘍形成治療に反応性である可能性が高いか、治療した患者が抗腫瘍形成治療に反応するかの判定に有用である。
【選択図】なし
Description
いくつかの公表物を括弧内のアラビア数字によって本明細書中で参照する。特許請求の範囲の直前の本明細書の最後にこれらの参照の全ての引用を見ることができる。
多細胞生物における細胞の増殖及び分化は、高度に調節されたプロセスを受ける。癌細胞を区別する特徴はこのプロセスに対する制御が無いことであって、増殖及び分化が調節されなくなり、結果として制御されない増殖が生じる。正常細胞及び腫瘍細胞の間のこの違いをより理解することに対して多大な研究努力が向けられてきた。焦点が当てられている研究の一領域は成長因子であり、より具体的にはオートクリン増殖刺激である。
本発明者は、正常細胞では厳格に調節された形式で発現される糖タンパク質(GP88)が正常な細胞由来の腫瘍形成能の高い細胞では過剰発現され、かつ、調節されないこと、腫瘍形成細胞に厳格に(stringently)必要とされる増殖刺激物質としてGP88が作用すること、及び腫瘍形成細胞でのGP88の発現又は作用を阻害することによって過剰産生細胞の腫瘍形成特性が阻害されることを今、予想外にも発見した。
ここで、以下の実施例とともに本発明の要点を説明するのに役立つ現在好ましい本発明の実施態様について詳細に参照する。
本発明は、GP88の変化した(増加した)発現に関連した疾患の治療及び診断に有用なGP88並びに抗腫瘍及び抗ウイルス組成物に関する。あるいは、本発明は、GP88に対する増加した反応に関連した疾患の治療及び診断に用いられる。3つの細胞系からなるマウスモデル系を用いて、本発明者によって、GP88を過剰発現する細胞が腫瘍を形成することが示された。親細胞系1246は、合成(defined)培地中でインスリンによる厳格な調節下で増殖して脂肪細胞へと分化するC3Hマウス脂肪生成細胞系である。1246細胞は、高い細胞密度で注射したときでさえ、同系の動物(C3Hマウス)で腫瘍を形成することはできない。インスリン非依存性細胞系1246−3Aを、インスリンなしの培地で維持された1246細胞から単離した。106個を同系マウスに皮下注射したとき、1246−3A細胞は分化する能力を失って腫瘍を形成した。in vitro- in vivoシャトル技術により、腫瘍形成能の高い細胞系PCが1246−3A細胞から生成された。104個の細胞を同系マウスに注射したときに、PC細胞は腫瘍を形成した。
P−14:空のベクターでトランスフェクションした対照PC細胞
ASGP88:GP88アンチセンスcDNAを含有する発現ベクターでトランスフェクションしたPC細胞
45日目に腫瘍を切除し、重量測定した。−−−は、腫瘍形成がなかったことを示す。
本発明は、GP88の増加した発現に関連する疾患の治療及び予防用組成物を提供する。これは、GP88の増加した反応に関連する疾患の治療及び診断にも適用される。本発明の組成物には、GP88の生物活性を中和する抗GP88抗体が含まれる。
本発明の好ましい実施態様は、生物液中のGP88を検出する方法及びキットに関する。上記の通り、癌細胞は高いレベルのGP88を発現する。本発明は、GP88を約0.1ng/mlの低さの濃度において生物液中で検出することができることを実証している。上記の通り、GP88は癌細胞中で過剰発現し、高いレベルのGP88は腫瘍形成を示している。典型的には、腫瘍マーカーの存在を検出するためには組織試料又は生検が必要である。例えば、乳癌患者には、特定の腫瘍マーカーが存在しているかの決定の検査のために乳房組織試料を取り出すため、しばしば針生検手順が施される。生検手順は、任意の外科手術手順と同様に、患者への増加した危険性と関連している。生検手順は、特に、腫瘍形成の増加した危険性に関連している。
本発明は、GP88アンチセンス成分も提供する。細胞中でのアンチセンスRNAの構成性発現は20種より多くの遺伝子の発現を阻害することが示され、列記は増え続けている。アンチセンス効果の可能な機構は翻訳の遮断又はスプライシングの妨害であり、双方ともin vitroで観察されている。スプライシングの妨害によって、保存性が低いイントロン配列が使用されることとなり、したがってより大きな特異性が生じ、ある種の遺伝子産物の発現は阻害されるが別の種ではそのホモログは阻害されないこととなる。
本発明は、他の哺乳動物DNA配列を実質的に有さない組換えGP88ポリペプチド又はその機能性誘導体を発現するためのDNA発現系にも関する。そのようなDNAは、二重鎖又は一本鎖であることができる。DNA配列は、好ましくは、別のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを可能とするために約20個以上のヌクレオチドを有しなければならない。GP88タンパク質又はその同族体若しくは機能性誘導体をコードする配列以外の配列とのハイブリダイゼーションが無いことによって特徴付けられるより高い特異性のハイブリダイゼーションを達成するためには、長さが少なくとも50個のヌクレオチドが好ましい。
17人の正常かつ健康なヒトボランティアから血清試料を得た。ヒト血清試料中のGP88濃度を酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって3つ組で測定した。30%グリセロール及び1%ミルク−PBSの溶液に希釈した組換えGP88から0、0.1、0.25、0.5、1、3、10、及び20ng/mlの濃度で標準のGP88試料を調製した。マイクロタイタープレート上の100マイクロリットルのウェルを1ミリリットルあたり10マイクログラムの抗ヒトGP88モノクローナル抗体6B3(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の0.78mg/mlの6B3抗体)でコーティングし、4℃で一晩インキュベーションした。ウェルをPBSで洗浄し、続いて抗ヒトPCDGFポリクローナル(IgG分画)を各ウェルに3マイクログラム/mlの濃度で37℃で1.5時間添加した。各ウェルへの検出抗体(セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)−ヤギ−ウサギ−IgG)の添加前に、ウェルをPBS中で洗浄した。TMB(基質)を添加し、試料とともに1時間インキュベーションした。620ナノメートルの波長で設定したELISA分光計読み取り器を用いて試料の光学濃度を決定した。各試料中のGP88量(x軸)に対して標準のGP88試料の光学濃度(y軸)をプロットし、標準曲線を作成した(図16)。未知試料中のGP88の濃度は、光学濃度を測定し、標準曲線(図16)を用いてGP88濃度を決定することによって決定した。表3は、17人の健康なヒトボランティアの各人のGP88血清試料濃度を提供するものである。
Claims (24)
- 生物試料中のPCDGF濃度を抗PCDGF抗体又はその抗原結合フラグメントを用いて測定することを含み、前記生物試料中の1ミリリットル当たり約23ナノグラム以上のPCDGFの存在が癌を示す、癌を診断する方法。
- 前記抗体がポリクローナル又はモノクローナルである請求項1記載の方法。
- 前記抗体又はフラグメントがキメラ化されている請求項1記載の方法。
- 前記抗体又はフラグメントがヒト化されている請求項1記載の方法。
- 前記フラグメントが、Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fd’、Fv及びscFvから選択される請求項1記載の方法。
- 前記抗PCDGF抗体がATCC受託番号PTA−5262(6B3)、ATCC受託番号PTA−5261(6B2)、ATCC番号PTA−5589(2A5)、ATCC番号PTA−5593(4D1)、ATCC番号PTA−5259(3F5)、ATCC番号PTA−5260(5B4)、及びATCC番号PTA−5591(3F8)からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞株から産生される請求項1記載の方法。
- 前記生物試料が、血液、髄液、血清、血奬、尿、乳頭吸引液(nipple aspirate)、組織溶解物、凍結組織、組織洗浄液及び組織馴化培地からなる群から選択される請求項1記載の方法。
- 生物試料中のPCDGF濃度の測定が、生物試料を固体の支持体上に固定化されている第1の抗PCDGF抗体又はその抗原結合フラグメントと該第1の抗PCDGF抗体によって前記試料中のPCDGFが結合するように接触させることと、結合したPCDGFを第2の抗PCDGF抗体と該第2の抗体が前記結合したPCDGFに結合するように接触させることと、結合した第2の抗体を検出することとを含み、第1又は第2の抗体の少なくとも1つが全長のPCDGFタンパク質に対して産生されたものである請求項1記載の方法。
- 生物試料中のPCDGF濃度を抗PCDGF抗体又はその抗原結合フラグメントを用いて測定することを含み、前記生物試料中の1ミリリットル当たり約40ナノグラム以上のPCDGFの存在が癌を示す、癌を診断する方法。
- 前記抗体がポリクローナル又はモノクローナルである請求項9記載の方法。
- 前記抗体又はフラグメントがキメラ化されている請求項9記載の方法。
- 前記抗体又はフラグメントがヒト化されている請求項9記載の方法。
- 前記フラグメントが、Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fd’、Fv及びscFvから選択される請求項9記載の方法。
- 前記抗PCDGF抗体がATCC受託番号PTA−5262(6B3)、ATCC受託番号PTA−5261(6B2)、ATCC番号PTA−5589(2A5)、ATCC番号PTA−5593(4D1)、ATCC番号PTA−5259(3F5)、ATCC番号PTA−5260(5B4)、及びATCC番号PTA−5591(3F8)からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞株から産生される請求項9記載の方法。
- 前記生物試料が、血液、髄液、血清、血奬、尿、乳頭吸引液(nipple aspirate)、組織溶解物、凍結組織、組織洗浄液及び組織馴化培地からなる群から選択される請求項9記載の方法。
- 生物試料中のPCDGF濃度の測定が、生物試料を固体の支持体上に固定化されている第1の抗PCDGF抗体又はその抗原結合フラグメントと該第1の抗PCDGF抗体によって前記試料中のPCDGFが結合するように接触させることと、結合したPCDGFを第2の抗PCDGF抗体と該第2の抗体が前記結合したPCDGFに結合するように接触させることと、結合した第2の抗体を検出することとを含み、第1又は第2の抗体の少なくとも1つが全長のPCDGFタンパク質に対して産生されたものである請求項9記載の方法。
- 患者が抗腫瘍形成治療に対して反応性であるか、又は反応しているかどうかを判定する方法であって、
抗腫瘍形成治療を受ける患者から得られた生物試料中のPCDGF濃度を抗PCDGF抗体又はその抗原結合フラグメントを用いて測定することを含み、1ミリリットル当たり約100ナノグラムのPCDGFの濃度が、患者が抗腫瘍形成治療に対して反応していないことを示す、前記判定方法。 - 前記抗体がポリクローナル又はモノクローナルである請求項17記載の方法。
- 前記抗体又はフラグメントがキメラ化されている請求項17記載の方法。
- 前記抗体又はフラグメントがヒト化されている請求項17記載の方法。
- 前記フラグメントが、Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fd’、Fv及びscFvから選択される請求項17記載の方法。
- 前記抗PCDGF抗体がATCC受託番号PTA−5262(6B3)、ATCC受託番号PTA−5261(6B2)、ATCC番号PTA−5589(2A5)、ATCC番号PTA−5593(4D1)、ATCC番号PTA−5259(3F5)、ATCC番号PTA−5260(5B4)、及びATCC番号PTA−5591(3F8)からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞株から産生される請求項17記載の方法。
- 前記生物試料が、血液、髄液、血清、血奬、尿、乳頭吸引液(nipple aspirate)、組織溶解物、凍結組織、組織洗浄液及び組織馴化培地からなる群から選択される請求項17記載の方法。
- 生物試料中のPCDGF濃度の測定が、生物試料を固体の支持体上に固定化されている第1の抗PCDGF抗体又はその抗原結合フラグメントと該第1の抗PCDGF抗体によって前記試料中のPCDGFが結合するように接触させることと、結合したPCDGFを第2の抗PCDGF抗体と該第2の抗体が前記結合したPCDGFに結合するように接触させることと、結合した第2の抗体を検出することとを含み、第1又は第2の抗体の少なくとも1つが全長のPCDGFタンパク質に対して産生されたものである請求項17記載の方法。
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