JP2009058334A - 電気化学測定用反応装置及び電気化学測定システム - Google Patents
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Abstract
【課題】微量の検体から被検物質を迅速、簡便且つ高感度に測定できる新規な電気化学的測定手段を提供すること。
【解決手段】本発明の電気化学測定用反応装置は、基板本体と、基板本体内部に設けられた流路と、前記流路に設けられた少なくとも2つの流路開口部と、前記流路の一部に設けられた反応部であって、被検物質と反応する少なくとも1種の物質を担持した粒子状の担体を流路内部に含む反応部と、前記反応部の下流において該反応部で生じた反応生成物を測定するための電極であって、前記基板本体に設けられ前記反応部の下流の流路内面に露出する少なくとも1つの電極と、前記流路の少なくとも一部の幅及び/又は高さを前記担体が通過できないサイズにすることにより形成され、前記反応部に前記担体を保持するせき止め構造とを具備する。
【選択図】図1
【解決手段】本発明の電気化学測定用反応装置は、基板本体と、基板本体内部に設けられた流路と、前記流路に設けられた少なくとも2つの流路開口部と、前記流路の一部に設けられた反応部であって、被検物質と反応する少なくとも1種の物質を担持した粒子状の担体を流路内部に含む反応部と、前記反応部の下流において該反応部で生じた反応生成物を測定するための電極であって、前記基板本体に設けられ前記反応部の下流の流路内面に露出する少なくとも1つの電極と、前記流路の少なくとも一部の幅及び/又は高さを前記担体が通過できないサイズにすることにより形成され、前記反応部に前記担体を保持するせき止め構造とを具備する。
【選択図】図1
Description
本発明は、電気化学測定用反応装置及び該装置を含む電気化学測定システムに関する。
化学分析、環境分析、生化学分析、臨床検査あるいはPOCT(Point of Care Testing)においては、微量の検体から被検物質を迅速且つ簡便に測定できる手段が望まれており、これまでに様々な測定装置が開発されている。
そのような測定装置としては、電極表面に酵素等の触媒を固定化した電極を用いて検体中の被検物質を電気化学的に測定する一体型のセンサーが知られている。被検物質を電気化学的に測定する方法によれば、高感度で高速な計測が可能であり、特に一体型センサーは構造も簡単なため、既に、メタンセンサーや血糖値センサー、乳酸値センサーなどのバイオセンサーで商用化されている(特許文献1、2)。
一体型の電気化学センサーでは、電極の表面に酵素を固定化し、反応により生じた物質を電極上で酸化もしくは還元する方法 (特許文献3、4)、生成した物質によりイオン感応性トランジスタの電極間電位が変化することを利用した方法(特許文献5、6)が開示されている。しかしながら、これらの方法では、センサーを小型化できるが測定に必要な検体量が多く必要であり、バッチ式の測定となる。そこで、微小空間中に酵素を固定化した電極を閉じ込めることで検体量を削減しオンラインで測定できるようなセンサが開発されているが(特許文献7、8)、酵素を固定化した後に封をするために作製技術が難しいなどの問題がある。
また、一体型センサーでは触媒反応で生成した反応生成物、例えば酵素電極を用いるバイオセンサーでは酵素反応により生成された酸素や過酸化水素を検出するが、これらの生成物は電極に到達するまでに拡散するため、定量性が低いという問題がある。また、電極に触媒を被覆するため、触媒量は電極サイズに制約され、小型化と精度を両立することが難しいという欠点もある。
一方、フロースルー式の電気化学センサーも開発されている。例えば、特許文献9には、被検物質に対する抗体を充填材に担持させたカラム電極を用いて、カラム電極内で酵素反応を行なわせ、被検物質を電気化学的に測定する装置が記載されている。しかしながら、特許文献9の装置では、充填材自体が電極として機能するものであるため、構造は一体型と考えられる。また、該装置ではカラムの容量を削減できず、小型化、集積化は困難である。
従って、本発明は、微量の検体から被検物質を迅速、簡便且つ高感度に測定できる新規な電気化学的測定手段を提供することを目的とする。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、微小流路を有する基板の流路の一部に被検物質と選択的に反応する触媒等を担持させた粒子状の担体を充填して被検物質の反応場とし、反応生成物を測定する電極を該反応場と分離して流路の下流に設けることにより、従来の酵素電極のような一体型電気化学センサーよりも被検物質を高感度且つ高精度に測定できることを見出し、本願発明を完成した。
すなわち、本発明は、基板本体と、基板本体内部に設けられた流路と、前記流路に設けられた少なくとも2つの流路開口部と、前記流路の一部に設けられた反応部であって、被検物質と反応する少なくとも1種の物質を担持した粒子状の担体を流路内部に含む反応部と、前記反応部の下流において該反応部で生じた反応生成物を測定するための電極であって、前記基板本体に設けられ前記反応部の下流の流路内面に露出する少なくとも1つの電極と、前記流路の少なくとも一部の幅及び/又は高さを前記担体が通過できないサイズにすることにより形成され、前記反応部に前記担体を保持するせき止め構造とを具備する電気化学測定用反応装置を提供する。また、本発明は、上記本発明の反応装置と、前記流路開口部のうち上流側の流路開口部に接続された送液装置と、前記電極の端子領域に接続された電気化学測定装置とを含む電気化学測定システムを提供する。
本発明により、微少量の検体から被検物質を高感度、高精度に測定することができる新規な電気化学測定用反応装置が提供された。本発明の装置では、被検物質と反応する触媒等の物質が粒子状の担体に担持される。粒子状担体は、単位体積当たりの全表面積が大きいため、被検物質の測定に必要な酵素等の所望の物質を微小空間内に多量に保持することができる。従って、本発明の装置によれば、小型化と高感度を両立できる。また、この粒子状担体は自由に交換できるので、上記した被検物質の反応に必要な物質の種類や量を使用目的に応じて自由に選択することができる。そのため、本発明の反応装置は汎用性が高く、実用上有利である。また、本発明の装置では、被検物質が反応する部位と電極により反応生成物を測定する部位とが分離した構造となっているので、被検物質の反応が電極表面での反応生成物の酸化還元反応に悪影響を及ぼすおそれがなく、高精度な測定が可能になる。また、該反応装置はフォトリソグラフィーにより容易に製造することができ、樹脂基板で作製すれば樹脂成型により容易に量産できるため、安価に提供することができる。さらに、該反応装置は、従来のカラムを用いたフロースルー式の装置よりも小型化でき、流路の形状設計次第で多段反応も容易に行うことができるため、集積化が可能であり、多種目の同時測定等にも極めて有利である。
本発明を、図面に基づいて詳細に説明する。図1は、本発明の電気化学測定用反応装置の好ましい1態様を表すものである。図1中の(ア)は上面図、(イ)は担体を充填した反応部近傍の流路の拡大図、(ウ)は反応部近傍の流路の縦断面である。
本発明の反応装置は、基板本体1と、該基板本体1の内部に設けられた流路4とを具備する。流路4の一部には、被検物質と反応する物質を担持した粒子状担体8が充填され、反応部12が形成される。反応部12の下流には、流路内面に露出する電極が少なくとも1つ設けられる。図1中では、作用電極5、対向電極6、及び参照電極7の3つの電極が設けられている。粒子状担体8は、せき止め構造9により反応部12内に保持される。流路4には検体の導入や廃液の排出等を行なうための流路開口部が少なくとも2つ設けられる。図1中では、上流側の流路開口部10が導入口、下流側の流路開口部11が排出口となる。
基板本体は、製造の容易さから、下部基板1aと上部基板1bとから構成されることが好ましい。該基板本体は、好ましくは絶縁性材料から成る。該絶縁性材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、合成樹脂等が挙げられる。合成樹脂としては、転写、インジェクションなどの成型が可能な、アクリル、スチレン、ポリエステル若しくはポリカーボネート又はこれらの共重合体、熱成型可能な熱可塑性樹脂又は熱若しくは光重合可能な硬化性樹脂などの合成樹脂が好ましい。合成樹脂から成る基板の場合には、一旦形成した流路パターンからマスター型を成型し、該マスター型から転写型を作製することで、該転写型を利用した樹脂成型を行なうことができるので、同一の流路パターンを有する基板本体を低コストで量産することができる。
流路4は、フォトリソグラフィーやレーザー加工、ドリル加工等の公知の微細加工技術を用いて容易に作製することができる。基板本体が上部基板及び下部基板より構成される場合には、例えば少なくとも一方の基板の表面を微細加工して所望の形状の溝を作製し、もう一方の基板と張り合わせることで、基板内部に流路を形成することができる。また、下部基板と上部基板の少なくともいずれか一方に基板本体とは異なる材料から成る層を設け、該材料層を微細加工した後に上下基板を張り合わせることによっても、基板内部に流路を形成することができる。該材料層として感光性有機材料層を適用した場合には、フォトリソグラフィーにより容易に微細加工をすることができる。図1に示す例では、感光性有機材料層3が下部基板1aと上部基板1bとの間に設けられ、該感光性有機材料層3をフォトリソグラフィーにより加工して流路4が形成されている。
流路の幅は好ましくは200μm〜1mmである。1mmを超えると流路ギャップの精度を保つのが困難であり、200μm未満では内部コンダクタンスが高くなって検体液の流量制御が阻害される。流路の高さは5μm〜500μmであることが好ましい。ただし、せき止め構造9の構築態様によっては、流路の幅及び高さはこの限りではなく、例えば図1に示すように、反応部より下流側の流路の高さを全て反応部よりも低く設計してせき止め構造9を設ける場合には、反応部より下流側の流路の高さは上記範囲よりも小さいサイズになり得る。流路の幅に関しても同様に、せき止め構造9の構築態様により、上記範囲よりも小さいサイズになり得る。
流路の形状や長さは特に限定されず、使用方法や被検物質の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、図1中に示すように直線状に一本作製してもよいし、全長を長く設計したい場合には曲線状にしてもよく、また、必要に応じて分枝構造にしてもよい。例えば、被検物質が測定までに多段階の反応を必要とする物質である場合には、流路を所望の分枝構造に設計したり、反応部12を複数箇所に設けるなどして、所望の多段反応が可能な構造にすることができる。反応部と電極を具備する流路を同一基板内に並列に配置すれば、多種目の同時測定が可能である。あるいは、せき止め構造よりも上流側に分枝流路を形成してその末端を開口部とし、固定化担体8を反応部12内に出し入れするための担体導入路として利用してもよい。ただし、担体8はせき止め構造9より上流側にある流路開口部10から出し入れすることもできるため、そのような担体導入路は必須ではない。
流路開口部10及び11のサイズと形状は特に限定されないが、担体8の出し入れや検体の導入・排出を円滑に行なう観点から、通常、直径が流路幅と同一サイズ〜1mm程度の円形に形成される。
担体8の形状は粒子状である。特に、流路内部における検体の流動を良好に保ち、少量の体積でより多くの担持面積を確保する観点から、実質的に球状であることが好ましい。ここで、「実質的に球状」とは、担体粒子の平均長径と平均短径の比が1:0.90程度〜1:1であることをいう。担体の材質は、検体液に不溶性で担持すべき物質の固定化が可能なものであればいかなるものであってもよく、例えば、ガラス、セラミック、合成樹脂(ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン等)、シリカ及びキトサン等を挙げることができるが、これらに限定されない。担体のサイズは、特に限定されないが、通常、平均短径が5μm〜200μm、好ましくは50μm〜120μmであり、平均長径が平均短径以上200μm以下である。なお、本発明において、担体が実質的に球状の場合は、短径と長径はほぼ等しいため、「平均短径」及び「平均長径」という語は平均粒径(平均直径)を意味するものとする。反応部12の容積、すなわち、担体8が充填される流路空間の体積は、特に限定されないが、通常0.01μL〜20μL程度、特に0.05μL〜5μL程度である。
担体8には、被検物質と反応する物質が担持される。ここで、「被検物質と反応する物質」(以下、便宜的に「反応物質」と呼ぶ)という語は、その物質自身は反応の前後で変化せず、被検物質の化学反応を促進し又は選択的に進行させる物質も包含する意味で用いており、具体的には被検物質が関与する反応の触媒や抗体等も包含する意味で用いている。反応物質は、被検物質との反応により、電極を用いて電気化学的に測定可能な生成物を生成できるものであればいかなるものであってもよく、特に限定されないが、測定精度を高める観点からは、被検物質と選択的に反応する物質であることが好ましい。ここで、「選択的に反応する」とは、検体中に含まれ得る被検物質以外の物質とは反応せず、複数の物質が存在する条件下でも実質的に特定の被検物質とのみ反応する(すなわち、他の物質とは全く反応しないか、反応したとしても被検物質の測定に影響しないレベルでしか反応しない)ことをいう。そのような好ましい反応物質としては、例えば抗体若しくは抗原、リガンド若しくはレセプター、触媒等を挙げることができ、中でも触媒が好ましい。触媒としては、特に限定されないが、例えば金、白金及び金属錯体などの金属触媒や、グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ及びメタンモノオキシゲナーゼなどの酵素等を挙げることができる。反応部12に含まれる担体8には、1種類の反応物質が固定化されていてもよく、また、2種類以上の反応物質が固定化されていてもよい。
担体への上記反応物質の固定化は、担体の材質及び固定化すべき反応物質の種類に応じ、この分野で周知の常法を用いて行なうことができる。例えば、グルタルアルデヒド等を用いる架橋法、多孔性担体への物理的吸着法、イオン交換樹脂担体へのイオン結合法、共有結合法等を用いることができるが、これらに限定されない。
担体8は、せき止め構造9により反応部12内に保持される。せき止め構造9は、反応部12より下流側の流路の幅及び/又は高さを反応部12の流路よりも狭く構成して担体8が通過できないサイズにすることにより形成される。流路の幅及び高さの両者を反応部12の流路より狭くしてもよいし、いずれか一方のみを狭くしてもよい。また、反応部12の下流側の流路のうち、一部を反応部12の流路より狭くしてもよいし、全てを狭くしてもよい。図1に示すせき止め構造9は、反応部12よりも下流側の流路の高さを全て小さくすることにより形成されている。このようなせき止め構造は、図2に示すように、下部基板1aの上面側に流路全長の床側を構成する溝を形成させ、一方で上部基板1bの下面側にせき止め構造9より上流側の流路の天井側を構成する溝を形成させ、両基板を張り合わせることにより、容易に形成することができる。
ただし、せき止め構造部位の流路があまりに狭くなりすぎると、検体液の流量制御が困難になるおそれがある。従って、せき止め構造9は、流路の幅及び高さのいずれか一方を担体8よりも十分に大きいサイズとし、他方を担体8が通過できない小さいサイズとして構築することが望ましい。具体的には、流路の幅及び高さのいずれか一方のサイズが、担体粒子8の平均長径(担体粒子が実質的に球状の場合は平均直径)の1.2倍〜100倍、特に1.5倍〜20倍であることが好ましい。例えば、図1に示す反応装置の場合、せき止め構造9が存在する部位の流路の幅が、粒状担体8の平均直径の1.2倍〜100倍、特に1.5倍〜20倍となるように構成するのが好ましい。
反応部12に導入される液体の流速は特に限定されず、流路の幅や高さに応じて適宜選択することができるが、通常0.1μL/分から50μL/分程度である。流速が遅くなりすぎると反応物質が検出部に到達するまでに時間がかかると共に、反応生成物が変化し易い場合には、適切な応答を得ることができない。流速が早すぎると、流路内のコンダクタンスが大きくなるために一定の供給が困難となる。そのため、図1に例示されるサイズの流路を具備する反応装置に対しては、1μL/分から20μL/分の流速が好ましい。
反応部12の下流には少なくとも1つの電極が設けられ、反応部12において反応物質と被検物質との反応により生じた反応生成物が電気化学的に測定される。電極は、基板本体1に設けられ、反応部12の下流の流路内面に露出するようにして形成される。図1では下部基板1aの上面上に電極が設けられているが、上部基板1bの下面上に設けてもよい。電極としては、作用電極5と対向電極6を含むことが好ましく、測定精度を高める観点からは、さらに参照電極7を含むことがより好ましい。配線を容易にするために、電極にはリード領域(5a、6a、7a)及び端子領域(5b、6b、7b)が形成されていることが好ましい。電極は金属等の導電性材料から成り、通常、作用電極5及び対向電極6は金または白金、参照電極7は銀または銀/塩化銀で構成されるが、これらに限定されない。このような電極は周知の常法により容易に作製でき、例えば、基板上に導電性材料を蒸着して導電性材料の薄膜を形成後、フォトリソグラフィーにより所望の形状にパターニングすることで、容易に作製することができる。微小空間においては、送液される液体の電気的な抵抗が大きくなるため測定精度を高めるためには電極は流路上流から下流に向けて作用電極、参照電極、対向電極の順番に配置されることが好ましい。
図1に示す反応装置は、例えば図2に示す工程で製造することができる。まず、下部基板1aの上面上に真空蒸着法により金薄膜を形成し、フォトリソグラフ技術により電極のパターニングを行なって作用電極5及び対向電極6を作製する。次いで、同一面上に真空蒸着法により銀薄膜を形成し、フォトリソグラフ技術によりパターニングして参照電極7を作製する。電極を形成した下部基板1aに対し、感光性有機材料層3を形成し、フォトリソグラフ技術により流路となる溝を作製して、各電極を露出させる。ここで作製する溝は、流路の全長の床側部分を形成するものである。一方、上部基板1bには、検体導入口及び排出口となる流路開口部10及び11を形成した後、感光性有機材料層3を形成し、フォトリソグラフ技術により溝を作製する。上部基板1b側に作製される溝は、せき止め構造9部位よりも上流側の流路の天井側部分を形成するものである。以上のように加工した下部基板1a及び上部基板1bを張り合わせることにより図1の反応装置が得られる。基板同士の張り合わせは、接着剤を用いる方法や融着による方法等のような周知の常法により容易に行うことができる。
本発明の反応装置では、反応部12において反応物質と被検物質との反応で生じた生成物が、反応部12の下流の電極により電気化学的に測定される。検体は、シリンジポンプ等を用いて、導入口となる流路開口部10から流路4内に送液される。検体中に含まれる被検物質は、反応部12において、担体8に担持される反応物質と反応し、反応生成物を生じる。該反応生成物は、せき止め構造9を越えて下流へと流れ、作用電極5の表面で酸化又は還元される。このときの電気化学的な変化量を、作用電極5の端子領域5bと接続した電気化学測定装置を用いて測定することにより、反応生成物が測定される。該反応生成物は、検体中の被検物質の存在量に応じて生成されるため、濃度既知の被検物質溶液を用いて検量線を作成することで、検体中の被検物質を測定することができる。例えば、検体中のグルコースを測定する場合、担体8に固定化する反応物質としては、グルコースオキシダーゼを適用することができる。反応部12では、担体8に固定化されたグルコースオキシダーゼによりグルコースが酸化され、検体中のグルコース濃度に応じた量の過酸化水素及びグルコノラクトンが生じる。この過酸化水素が反応部12の下流の電極において測定され、予め作成した検量線に基づいて検体中のグルコースが測定される。なお、本発明において、「測定」という語には検出と定量の両者が包含される。
本発明の反応装置によれば、担体8に多量の反応物質を固定化できるため、被検物質の測定において、従来のグルコース電極のような一体型電極よりも多量の反応物質を利用することができる。また、電極と反応物質が分離した構造となっているので、反応物質と被検物質との反応が電極における反応生成物の測定に悪影響を及ぼすおそれがない。そのため、本発明によれば、従来の一体型電極よりも高感度な測定が可能になる。本発明の反応装置の感度は、下記実施例及び比較例に具体的に示されている通りであり、従来の一体型電極では1mM以上の濃度範囲でしか被検物質を測定することができないが、本発明の測定装置によれば、1μM〜1mMの濃度範囲であっても、被検物質濃度と電流量との間に比例関係が認められ、μMオーダーの被検物質をも好ましく測定することができる。
本発明の反応装置で測定される被検物質は、上記反応物質との反応により電気化学的に測定可能な生成物を生じる物質であればいかなるものであってもよく、特に限定されないが、例えば抗原及び抗体、レセプター及びリガンド、各種触媒の基質等が挙げられる。検体は、被検物質を含有し得る液体状の試料であり、例えば血液、血漿、尿等の体液由来の試料等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の反応装置を用いて検体中の被検物質を測定するシステムを図3に例示する。本発明の反応装置24の検体導入口には、検体を送液するための送液装置22が接続される。該送液装置22は、シリンジポンプ16を具備しており、さらにインジェクションバルブ18を具備し得る。インジェクションバルブ18を用いることで、微量の検体を一定速度で連続的に反応装置24内に送液することができるため好ましい。本発明の反応装置24への検体の送液速度は、上述した通り、通常0.1μL/分〜50μL/分であり、反応装置24が図1に例示されるサイズの流路を具備する場合には1μL/分〜20μL/分が好ましい。反応装置24が具備する電極の端子領域には電気化学測定装置26が接続され、反応装置24の反応部内で生じた反応生成物が周知のサイクリックボルタンメトリー又はクロノアンペロメトリー等により電気化学的に測定される。電気化学測定装置26は特に限定されず、市販の各種電気化学測定装置を好ましく用いることができる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例1 電気化学測定用反応装置の作製
図1に示される反応装置を以下のとおりに作製した。基板本体として厚さ500μmのガラス板(水戸理科ガラス社製)を用いた。下部基板1aのサイズは長さ28mm、幅8 mm、上部基板1bのサイズは長さ25 mm、幅8 mmであった。下部基板1a上に真空蒸着法により金薄膜を形成し(金膜厚:約100 nm)、フォトリソグラフ技術により電極のパターニングを行なった。この際、金はガラス基板への接着力が弱いために、クロム薄膜(クロム膜厚:約20 nm)を密着増強層として金薄膜を形成する前に真空蒸着法により形成した。金薄膜のパターニングにより、作用電極5及び対向電極6を形成した。なお、図1に示すリード領域(5a、6a)及び端子領域(5b、6b)も各電極と一体に同時形成した。続いて、下部基板1aには参照電極となる銀電極(銀膜厚:約100 nm)を、上記金電極と同様にクロム薄膜を密着増強層として使用し、真空蒸着法とフォトリソグラフ技術を利用して、リード領域(7a)及び端子領域(7b)と一体に形成した。電極を形成した下部基板1aに対して、各電極の端子領域が露出するようにしてドライフィルムレジスト(厚さ約25μm)をラミネータ装置により圧着し、フォトリソグラフ法によりパターニングして流路となる溝(幅300μm、長さ15 mm)を形成し、ガラス基板表面と各電極部を溝内部に露出させた。流路内面に露出する作用電極の電極部のサイズは300μm × 0.5 mmとなった。
図1に示される反応装置を以下のとおりに作製した。基板本体として厚さ500μmのガラス板(水戸理科ガラス社製)を用いた。下部基板1aのサイズは長さ28mm、幅8 mm、上部基板1bのサイズは長さ25 mm、幅8 mmであった。下部基板1a上に真空蒸着法により金薄膜を形成し(金膜厚:約100 nm)、フォトリソグラフ技術により電極のパターニングを行なった。この際、金はガラス基板への接着力が弱いために、クロム薄膜(クロム膜厚:約20 nm)を密着増強層として金薄膜を形成する前に真空蒸着法により形成した。金薄膜のパターニングにより、作用電極5及び対向電極6を形成した。なお、図1に示すリード領域(5a、6a)及び端子領域(5b、6b)も各電極と一体に同時形成した。続いて、下部基板1aには参照電極となる銀電極(銀膜厚:約100 nm)を、上記金電極と同様にクロム薄膜を密着増強層として使用し、真空蒸着法とフォトリソグラフ技術を利用して、リード領域(7a)及び端子領域(7b)と一体に形成した。電極を形成した下部基板1aに対して、各電極の端子領域が露出するようにしてドライフィルムレジスト(厚さ約25μm)をラミネータ装置により圧着し、フォトリソグラフ法によりパターニングして流路となる溝(幅300μm、長さ15 mm)を形成し、ガラス基板表面と各電極部を溝内部に露出させた。流路内面に露出する作用電極の電極部のサイズは300μm × 0.5 mmとなった。
上部基板1bには、液状検体の導入口10及び排出口11をマイクロドリルにより半径1 mmで形成した。続いて、ドライフィルムレジスト(厚さ約50μm)をラミネータ装置により2枚を連続して圧着し厚みを約100μmとし、フォトリソグラフ法によりパターニングしてダム構造(せき止め構造9)より上流部の流路となる溝を作製した。
下部基板1a及び上部基板1bを流路が一致するように位置合わせし、ラミネータ装置により圧着し、160℃のオーブン中に1時間保持することで基板同士の接着を行った。
グルコースを測定するために担体に固定化する反応物質として、グルコースオキシダーゼを用いた。また、グルコースオキシダーゼを固定化する担体として、平均粒径70μm〜100μmのキトサンビーズを用いた。グルコースオキシダーゼを0.5 U/μLの濃度でリン酸バッファー中に溶かした酵素溶液400μLに少量のキトサンビーズ(約10μL)を混合し、4℃下で72時間放置し吸着させた。その後、グルタルアルデヒド溶液(4 wt%)を添加することで固定化を行なった。リン酸バッファーによる洗浄を十分に行なった後、上記で接着した基板の導入口10からビーズを導入し、本発明の反応装置を得た。ビーズを導入した空間の体積はおおよそ0.5μLであった。
実施例2 グルコースの測定
実施例1で作製した反応装置を送液系と接続して図3に示す測定システムを構築し、グルコース溶液の濃度測定を行なった。マイクロシリンジにリン酸バッファー(pH 7)を導入し、マイクロシリンジポンプに接続した。シリンジの先端からマイクロインジェクションバルブ(Upchurch Scientific社製)までガラス製キャピラリーを接続し、インジェクションバルブから反応装置までを同じくキャピラリーで接続した。サンプルのインジェクションにはポリマー製のサンプルループ(サンプル容量:0.32μL)を接続した。
実施例1で作製した反応装置を送液系と接続して図3に示す測定システムを構築し、グルコース溶液の濃度測定を行なった。マイクロシリンジにリン酸バッファー(pH 7)を導入し、マイクロシリンジポンプに接続した。シリンジの先端からマイクロインジェクションバルブ(Upchurch Scientific社製)までガラス製キャピラリーを接続し、インジェクションバルブから反応装置までを同じくキャピラリーで接続した。サンプルのインジェクションにはポリマー製のサンプルループ(サンプル容量:0.32μL)を接続した。
リン酸バッファーにグルコースを溶かし、1μM、10μM、100μM、1mM、10mMに調製してサンプルとした。マイクロシリンジポンプの流量を5μL/分に設定し、上記サンプルをインジェクションバルブを用いて反応装置に導入した。担体にはグルコースオキシダーゼを固定化しているため、グルコースと酸素存在下で過酸化水素とグルコノラクトンが生成する。下流の電気化学検出用電極において上記の過程を得て生成した過酸化水素を酸化する際に発生する電流を読み取ることで間接的にグルコースの濃度測定を行った。それぞれの電極を電気化学測定装置(ALS社製)と接続し、作用極電位は参照極に対して+0.7 Vに設定してアンペロメトリー法により測定を行った。
それぞれの濃度に調製したサンプルを連続的に導入し、測定を行った結果を図4に示す。1μMから10mMまで連続的に電流が増加することが観測された。インジェクションから最大電流値を示す時間まではわずか30秒程度と短時間であった。この結果から検量線を作成すると図5のように1μMから10mMの範囲で線形的に電流が増加していることがわかった。このように、本発明の反応装置及び測定システムを用いると、担体導入量、検体導入量をμL以下に抑えることが可能であり、短時間で高感度の検出が可能であることがわかった。
実施例3 担体の交換回数に対する出力の比較
反応部内の酵素固定化担体を交換して使用した場合の、本発明の反応装置の測定精度を検討した。グルコースオキシダーゼを固定化した担体の交換は5回まで行い、流速5μL/分でグルコース濃度100μMのサンプルを測定した。その結果、図6に示すように、反応部内に導入する担体を交換して用いてもピーク電流値(Ip)はほぼ安定しており、本発明の反応装置が担体を交換して繰り返し使用可能であることが示された。
反応部内の酵素固定化担体を交換して使用した場合の、本発明の反応装置の測定精度を検討した。グルコースオキシダーゼを固定化した担体の交換は5回まで行い、流速5μL/分でグルコース濃度100μMのサンプルを測定した。その結果、図6に示すように、反応部内に導入する担体を交換して用いてもピーク電流値(Ip)はほぼ安定しており、本発明の反応装置が担体を交換して繰り返し使用可能であることが示された。
比較例1 グルコース電極によるグルコースの測定
グルコースオキシダーゼを電極上に固定化した一体型のグルコース電極を用いて、グルコース溶液の濃度を測定した。該グルコース電極は、上記実施例と同様の手法により、微小流路基板の流路上に3つの電極を配置し、常法により作用電極の表面にグルコースオキシダーゼとオスミウムポリマーを固定化して作製したものであり、電極部分のサイズは300μm×1.0 mmであった。
グルコースオキシダーゼを電極上に固定化した一体型のグルコース電極を用いて、グルコース溶液の濃度を測定した。該グルコース電極は、上記実施例と同様の手法により、微小流路基板の流路上に3つの電極を配置し、常法により作用電極の表面にグルコースオキシダーゼとオスミウムポリマーを固定化して作製したものであり、電極部分のサイズは300μm×1.0 mmであった。
このグルコース電極を用いて、流速5μL/分にて上記実施例で用いたグルコース溶液サンプル(1μM〜10mM)のグルコース濃度を測定した。その結果、図7に示される通り、該グルコース電極により測定可能なグルコース濃度は1mM以上であり、μMオーダーの測定はできなかった。これにより、本発明の反応装置は、従来のグルコース電極よりも測定範囲が広く、より高感度な測定が可能であることが示された。
1 基板本体
1a 下部基板
1b 上部基板
3 感光性有機材料層
4 流路
5 作用電極
5a リード領域
5b 端子領域
6 対向電極
6a リード領域
6b 端子領域
7 参照電極
7a リード領域
7b 端子領域
8 反応物質固定化担体
9 せき止め構造
10 流路開口部(導入口)
11 流路開口部(排出口)
12 反応部
14 シリンジ
16 シリンジポンプ
18 インジェクションバルブ
20 サンプルループ
22 送液装置
24 本発明の電気化学測定用反応装置
26 電気化学測定装置
28 廃液
30 廃液
1a 下部基板
1b 上部基板
3 感光性有機材料層
4 流路
5 作用電極
5a リード領域
5b 端子領域
6 対向電極
6a リード領域
6b 端子領域
7 参照電極
7a リード領域
7b 端子領域
8 反応物質固定化担体
9 せき止め構造
10 流路開口部(導入口)
11 流路開口部(排出口)
12 反応部
14 シリンジ
16 シリンジポンプ
18 インジェクションバルブ
20 サンプルループ
22 送液装置
24 本発明の電気化学測定用反応装置
26 電気化学測定装置
28 廃液
30 廃液
Claims (18)
- 基板本体と、
基板本体内部に設けられた流路と、
前記流路に設けられた少なくとも2つの流路開口部と、
前記流路の一部に設けられた反応部であって、被検物質と反応する少なくとも1種の物質を担持した粒子状の担体を流路内部に含む反応部と、
前記反応部の下流において該反応部で生じた反応生成物を測定するための電極であって、前記基板本体に設けられ前記反応部の下流の流路内面に露出する少なくとも1つの電極と、
前記流路の少なくとも一部の幅及び/又は高さを前記担体が通過できないサイズにすることにより形成され、前記反応部に前記担体を保持するせき止め構造と
を具備する電気化学測定用反応装置。 - 前記被検物質と反応する前記少なくとも1種の物質は、前記被検物質が関与する反応の触媒である請求項1記載の反応装置。
- 前記触媒が酵素である請求項2記載の反応装置。
- 前記担体の平均短径が5μm〜200μmである請求項1ないし3のいずれか1項に記載の反応装置。
- 前記担体は実質的に球状である請求項1ないし4のいずれか1項に記載の反応装置。
- 前記担体は、ガラス、セラミック、合成樹脂、シリカ又はキトサンから成る請求項1ないし5のいずれか1項に記載の反応装置。
- 前記反応部の容積が0.01μL〜20μLである請求項1ないし6のいずれか1項に記載の反応装置。
- 前記せき止め構造部位の流路の幅及び高さのうち、一方のサイズが前記担体の平均長径の1.2倍〜100倍のサイズである請求項1ないし7のいずれか1項に記載の反応装置。
- 少なくとも前記せき止め構造の上流側において、前記流路の幅が200μm〜1mmであり、高さが5μm〜500μmである請求項1ないし8のいずれか1項に記載の反応装置。
- 前記反応装置に供給される検体中の被検物質濃度が1μM〜1000μMの範囲において、前記電極で測定される電流量と被検物質濃度とが比例関係を示す請求項1ないし9のいずれか1項に記載の反応装置。
- 前記基板本体が絶縁性材料から成る請求項1ないし10のいずれか1項に記載の反応装置。
- 前記電極は作用電極及び対向電極を含む請求項1ないし11のいずれか1項に記載の反応装置。
- 前記電極は参照電極をさらに含む請求項12記載の反応装置。
- 前記電極は上流から下流の順に作用電極、参照電極及び対向電極が配置される請求項13記載の反応装置。
- 前記基板本体は、上部基板と下部基板から構成され、前記電極は、前記上部基板の下面上又は下部基板の上面上に設けられた薄膜状の導電性材料により形成され、前記流路及びせき止め構造は、前記上部基板と前記下部基板との間に設けられた感光性有機材料層により形成される請求項1ないし14のいずれか1項に記載の反応装置。
- 前記感光性有機材料層は、フォトリソグラフィーにより前記流路及び/又はせき止め構造がパターニングされたものである請求項15記載の反応装置。
- 請求項1ないし16のいずれか1項に記載の反応装置と、前記流路開口部のうち上流側の流路開口部に接続された送液装置と、前記電極の端子領域に接続された電気化学測定装置とを含む電気化学測定システム。
- 前記送液装置により前記反応装置へ供給される検体の送液速度が0.1μL/分〜50μL/分である請求項17記載の電気化学測定システム。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007225168A JP2009058334A (ja) | 2007-08-31 | 2007-08-31 | 電気化学測定用反応装置及び電気化学測定システム |
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JP2007225168A JP2009058334A (ja) | 2007-08-31 | 2007-08-31 | 電気化学測定用反応装置及び電気化学測定システム |
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JP2009058334A true JP2009058334A (ja) | 2009-03-19 |
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ID=40554207
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP2007225168A Pending JP2009058334A (ja) | 2007-08-31 | 2007-08-31 | 電気化学測定用反応装置及び電気化学測定システム |
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Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2009058334A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016530527A (ja) * | 2013-08-29 | 2016-09-29 | ノースイースタン ユニバーシティ | 病原菌用マトリクスによって強化された電気化学検出器 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58189549A (ja) * | 1982-04-28 | 1983-11-05 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 酵素反応測定セル |
WO2003062823A1 (fr) * | 2002-01-24 | 2003-07-31 | Kanagawa Academy Of Science And Technology | Puce et procede d'analyse de l'activite enzymatique |
JP2003285298A (ja) * | 2002-03-26 | 2003-10-07 | Seiko Instruments Inc | マイクロ流路デバイスおよびマイクロ流路デバイスの作製法 |
JP2006337221A (ja) * | 2005-06-03 | 2006-12-14 | Sharp Corp | 電気化学検出装置 |
-
2007
- 2007-08-31 JP JP2007225168A patent/JP2009058334A/ja active Pending
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