JP2009038984A - Thermostable glutaminase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、耐熱性グルタミナーゼに関する。 The present invention relates to a thermostable glutaminase.
グルタミナーゼは、食品工業、特に蛋白質を酵素的に分解して調味食品を製造する場合に、重要な役割を果たすものとして知られている。また、グルタミナーゼは、生化学的、医学的分野においても、近年特に注目されているものであり、安定な酵素剤の製造が期待されている。高温で蛋白質を酵素的に分解し、アミノ酸調味食品を製造することは、蛋白質の分解速度を高め、雑菌による汚染を防止し、優良な調味食品を製造する手段として極めて有効な方法である。
このような条件を採用するためには、グルタミナーゼが耐熱性を有することが必要であることから、従来より耐熱性グルタミナーゼの開発が行われてきた（特許文献１参照）。しかし、従来公知のグルタミナーゼの耐熱性は不充分であった。
Glutaminase is known to play an important role in the food industry, particularly in the production of seasoned foods by enzymatically degrading proteins. In addition, glutaminase has attracted particular attention in recent years also in the biochemical and medical fields, and production of a stable enzyme agent is expected. Enzymatic degradation of proteins at high temperatures to produce amino acid seasoned foods is an extremely effective method for increasing the rate of protein degradation, preventing contamination by various bacteria, and producing excellent seasoned foods.
In order to employ such a condition, it is necessary for glutaminase to have heat resistance, and therefore, heat-resistant glutaminase has been conventionally developed (see Patent Document 1). However, the heat resistance of conventionally known glutaminase was insufficient.
一方、酵素の安定性を向上するための有効な手段として、酵素を固定化することが知られている。従来より知られている酵素の固定化方法としては、酵素を樹脂ビーズ等に直接固定させる方法、酵素を半透明のポリマー被膜により被覆するマイクロカプセル法、酵素蛋白質の表面をポリエチレングリコールや糖脂質で修飾して安定化させる表面修飾法等が提案されている。
また、例えばアクリルアミドやポリビニルアルコール、テトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）や有機基を有するシラン等のゾルないしはコロイド懸濁液を用い、そのゲル化反応を利用して酵素を固定化するゾルゲル法も提案されている（非特許文献１）。
On the other hand, it is known that the enzyme is immobilized as an effective means for improving the stability of the enzyme. Conventionally known enzyme immobilization methods include a method of directly immobilizing the enzyme on resin beads, a microcapsule method in which the enzyme is coated with a translucent polymer coating, and a surface of the enzyme protein with polyethylene glycol or glycolipid. There have been proposed surface modification methods for modification and stabilization.
Also proposed is a sol-gel method in which an enzyme is immobilized by using a sol or colloidal suspension of acrylamide, polyvinyl alcohol, tetramethoxysilane (TMOS), silane having an organic group, or the like, and utilizing its gelation reaction. (Non-Patent Document 1).
しかし、酵素の固定化に関する前記従来技術も、酵素を固定化担体の表面に露出状態で固定化したり、固定化用の構造ユニットの構造安定性が欠けていたりするため、酵素の安定性が不足し勝ちであった。又、前記川上らのゾルゲル法も、ある程度の酵素安定化効果は得られるが、十分とは言えなかった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、ナノ空孔材料の細孔内にグルタミナーゼを吸着させることにより、従来にない優れた耐熱性を有するグルタミナーゼを得ることにある。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to obtain a glutaminase having excellent heat resistance that has never been obtained by adsorbing glutaminase in the pores of a nanoporous material. .
上記課題を解決するための本発明は、次の通りである。
（１） 細孔径が８ｎｍより大きい細孔径を備えたシリカ多孔体と、グルタミナーゼとから成ることを特徴とする耐熱性グルタミナーゼ。
（２） 鋳型としてポリグリセリン脂肪酸エステルを用いて合成したシリカ多孔体を用いる（１）に記載の耐熱性グルタミナーゼ。
（３） ポリグリセリン脂肪酸エステルの分子中に親水基の占める割合が７０〜９０％の範囲にある（２）に記載の耐熱性グルタミナーゼ。
（４） シリカ多孔体が鋳型であるポリグリセリン脂肪酸エステルを焼成によって除去した後、アミノプロピルシランによって処理したものである（１）〜（３）のいずれかに記載の耐熱性グルタミナーゼ。
（５） グルタミナーゼの吸着率が８０〜１００％であることを特徴とする（１）に記載の耐熱性グルタミナーゼ。
The present invention for solving the above problems is as follows.
(1) A thermostable glutaminase comprising a porous silica having a pore diameter of greater than 8 nm and glutaminase.
(2) The heat-resistant glutaminase according to (1), wherein a porous silica material synthesized using a polyglycerol fatty acid ester is used as a template.
(3) The heat-resistant glutaminase according to (2), wherein the ratio of the hydrophilic group in the molecule of the polyglycerol fatty acid ester is in the range of 70 to 90%.
(4) The heat-resistant glutaminase according to any one of (1) to (3), wherein the polyglycerol fatty acid ester whose porous silica is a template is removed by baking and then treated with aminopropylsilane.
(5) The thermostable glutaminase according to (1), wherein the glutaminase adsorption rate is 80 to 100%.
本発明によれば、従来のグルタミナーゼの耐熱性を著しく向上させることが可能となり、調味食品等を製造する目的の上で極めて効率的にグルタミナーゼを作用させることができる。 According to the present invention, the heat resistance of conventional glutaminase can be remarkably improved, and glutaminase can be caused to act very efficiently for the purpose of producing seasoned foods and the like.
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
本発明におけるシリカ多孔体とは、多孔質構造を持つケイ素酸化物を主成分とする物質を意味する。
本発明におけるシリカ多孔体における細孔の平均細孔径は８ｎｍ未満であると、シリカ多孔体へのグルタミナーゼの吸着が十分でなく、２０ｎｍを超えるものは製造するのが実質的に困難である。従って、上記観点からすると、本発明における細孔の平均細孔径は、８〜２０ｎｍであり、好ましくは１０〜２０ｎｍである。
Next, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings. However, the technical scope of the present invention is not limited by these embodiments, and various forms are possible without changing the gist of the invention. Can be implemented. Further, the technical scope of the present invention extends to an equivalent range.
The porous silica in the present invention means a substance mainly composed of a silicon oxide having a porous structure.
When the average pore diameter of the pores in the porous silica material of the present invention is less than 8 nm, the glutaminase is not sufficiently adsorbed on the porous silica material, and those exceeding 20 nm are substantially difficult to produce. Therefore, from the above viewpoint, the average pore diameter of the pores in the present invention is 8 to 20 nm, preferably 10 to 20 nm.
本発明の平均細孔直径は公知の窒素吸脱着により算出した。すなわち、平均細孔直径は公知のＢＪＨ法により算出した。
本発明におけるシリカ多孔体の比表面積は１００ｍ２／ｇ未満であると、シリカ多孔体へのグルタミナーゼ担持の吸着が十分でない場合があり比表面積が２０００ｍ２／ｇより大きいものは、製造するのが実質的に困難である。従って、上記観点から、本発明におけるシリカ多孔体の比表面積は好ましくは１００ｍ２／ｇ〜１５００ｍ２／ｇ、より好ましくは３００ｍ２／ｇ〜１５００ｍ２／ｇ、最も好ましくは５００ｍ２／ｇ〜１５００ｍ２／ｇである。
本発明の多孔体の比表面積は公知の窒素脱吸着により算出することができる。
The average pore diameter of the present invention was calculated by known nitrogen adsorption / desorption. That is, the average pore diameter was calculated by a known BJH method.
When the specific surface area of the porous silica material in the present invention is less than 100 m 2 / g, the adsorption of glutaminase supported on the porous silica material may not be sufficient, and a specific surface area of more than 2000 m 2 / g is produced. It is practically difficult. Therefore, from the above viewpoint, the specific surface area of the porous silica material in the present invention is preferably 100m 2 / g~1500m 2 / g, more preferably 300m 2 / g~1500m 2 / g, most preferably 500m 2 / g~1500m it is a 2 / g.
The specific surface area of the porous body of the present invention can be calculated by known nitrogen desorption.
本発明におけるシリカ多孔体のｐＨ７におけるゼータ電位は＋５ｍV〜＋１５ｍVであることが好ましい。
ゼータ電位は、下記の方法によって測定することができる。
すなわち、０.５ｍｇ／ｍｌとなるようにｐH７のイオン交換水にシリカ多孔体を懸濁し１５分間超音波処理を行った後、ゼータ電位を測定した。ｐHは０.１Ｍ塩酸と０.１Ｍ水酸化ナトリウムにて調整した。
The zeta potential at pH 7 of the porous silica in the present invention is preferably +5 mV to +15 mV.
The zeta potential can be measured by the following method.
Specifically, the porous silica was suspended in pH 7 ion-exchanged water so as to be 0.5 mg / ml and subjected to ultrasonic treatment for 15 minutes, and then the zeta potential was measured. The pH was adjusted with 0.1M hydrochloric acid and 0.1M sodium hydroxide.
本発明におけるシリカ多孔体の製造方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、無機原料を有機原料と混合し、反応させることにより、有機物を鋳型としてそのまわりに無機物の骨格が形成された有機物と無機物の複合体を形成させた後、得られた複合体から、有機物を除去する方法が挙げられる。
無機原料は、珪素含有無機物であれば特に限定されるものではないが、例えば、層状珪酸塩、非層状珪酸塩等の珪酸塩を含む物質及び珪酸塩以外の珪素を含有する物質が挙げられる。層状珪酸塩としては、カネマイト（ＮａＨＳｉ２Ｏ５・３Ｈ２Ｏ）、ジ珪酸ナトリウム結晶（Ｎａ２Ｓｉ２Ｏ５）、マカタイト（ＮａＨＳｉ４Ｏ９・５Ｈ２Ｏ）、アイラアイト（ＮａＨＳｉ８Ｏ１７・ＸＨ２Ｏ）、マガディアイト（Ｎａ２ＨＳｉ１４Ｏ２９・ＸＨ２Ｏ）、ケニヤアイト（Ｎａ２ＨＳｉ２０Ｏ４１・ＸＨ２Ｏ）等が挙げられ、非層状珪酸塩としては、水ガラス（珪酸ソーダ）、ガラス、無定形珪酸ナトリウム、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、テトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）、テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡ）シリケート、テトラエチルオルトシリケート等のシリコンアルコキシド等が挙げられる。また、珪酸塩以外の珪素を含有する物質としては、シリカ、シリカ酸化物、シリカ−金属複合酸化物などが挙げられる。これらは、単独で又は２種以上を混合して用いて良い。
The method for producing a porous silica material in the present invention is not particularly limited. For example, an inorganic material is mixed with an organic material and reacted to form an inorganic material skeleton around the organic material as a template. A method of removing the organic substance from the obtained complex after forming a complex of the organic substance and the inorganic substance.
The inorganic raw material is not particularly limited as long as it is a silicon-containing inorganic substance. Examples thereof include substances containing silicates such as layered silicates and non-layered silicates, and substances containing silicon other than silicates. Examples of layered silicates include kanemite (NaHSi 2 O 5 · 3H 2 O), sodium disilicate crystal (Na 2 Si 2 O 5 ), macatite (NaHSi 4 O 9 · 5H 2 O), and Iraite (NaHSi 8 O 17 · XH 2 O), magadiite (Na 2 HSi 14 O 29 · XH 2 O), Kenyaite (Na 2 HSi 20 O 41 · XH 2 O) and the like. Non-layered silicates include water glass (sodium silicate). ), Glass, amorphous sodium silicate, tetraethoxysilane (TEOS), tetramethoxysilane (TMOS), tetramethylammonium (TMA) silicate, silicon alkoxide such as tetraethylorthosilicate, and the like. Examples of the substance containing silicon other than silicate include silica, silica oxide, and silica-metal composite oxide. These may be used alone or in admixture of two or more.
鋳型となる有機原料としては、特に限定されるものではないが、例えば界面活性剤が挙げられ、これは単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
界面活性剤としては特に限定されるものではないが、非イオン型界面活性剤が好ましい。
非イオン型界面活性剤としては、特に限定される物ではないが、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン２級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンステロールエーテル、ポリオキシエチレンラノリン酸誘導体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のエーテル型のものや、ポリオキシエチレンアルキルアミン等の含窒素型のものを使用することができるが、ポリグリセリンに脂肪酸をエステル化したポリグリセリン脂肪酸エステルが好ましい。これらは単独で又は２種以上を混合して用いてもよい。
Although it does not specifically limit as an organic raw material used as a casting_mold | template, For example, surfactant is mentioned, This can be used individually or in mixture of 2 or more types.
The surfactant is not particularly limited, but a nonionic surfactant is preferable.
The nonionic surfactant is not particularly limited, but examples thereof include polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene secondary alcohol ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether, polyoxyethylene sterol ether, polyoxyethylene. Lanolinic acid derivatives, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ethers, ether type compounds such as polypropylene glycol and polyethylene glycol, and nitrogen-containing compounds such as polyoxyethylene alkylamine can be used. Polyglycerin fatty acid ester obtained by esterifying is preferred. You may use these individually or in mixture of 2 or more types.
ポリグリセリン脂肪酸エステルはグルタミナーゼ吸着の観点から、ＨＬＢが１４.０〜１８.０であることが好ましい。ここで、ＨＬＢは分子中の親水基と親油基のバランスを表し、分子中の親水基が０％の時を０とし、１００％の時を２０として等分したものである。
無機原料と有機原料を混合する場合、適当な溶媒を用いても良い。溶媒としては、特に限定されるものではないが、水、アルコール等が挙げられる。
無機原料と有機原料の混合方法は、特に限定されるものではないが、界面活性剤を酸性溶液に溶解させた後、この溶液に塩基性物質と無機原料を添加し、２０℃〜６０℃で３時間〜２４時間混合することが好ましい。無機原料と界面活性剤の混合比（重量比）は特に限定されるものではないが、無機原料：界面活性剤＝１：０.５〜１：２が好ましい。無機原料と塩基性物質の混合比（重量比）は特に限定されるものではないが、無機原料：塩基性物質＝１００：０.１〜１００：１０が好ましい。
The polyglycerol fatty acid ester preferably has an HLB of 14.0 to 18.0 from the viewpoint of glutaminase adsorption. Here, HLB represents the balance between the hydrophilic group and the lipophilic group in the molecule, and is equally divided into 0 when the hydrophilic group in the molecule is 0% and 20 when the hydrophilic group is 100%.
When mixing an inorganic raw material and an organic raw material, an appropriate solvent may be used. Although it does not specifically limit as a solvent, Water, alcohol, etc. are mentioned.
The mixing method of the inorganic raw material and the organic raw material is not particularly limited, but after dissolving the surfactant in the acidic solution, the basic substance and the inorganic raw material are added to the solution, and the temperature is from 20 ° C to 60 ° C. It is preferable to mix for 3 hours to 24 hours. The mixing ratio (weight ratio) between the inorganic raw material and the surfactant is not particularly limited, but inorganic raw material: surfactant = 1: 0.5 to 1: 2 is preferable. The mixing ratio (weight ratio) between the inorganic raw material and the basic substance is not particularly limited, but is preferably inorganic raw material: basic substance = 100: 0.1 to 100: 10.
酸性溶液を調製するための酸性物質は特に限定されるものではなく、無機酸または有機酸を用いることができる。例えば、塩酸、臭化水素、ヨウ化水素、蟻酸、酢酸、硝酸、硫酸、燐酸等が挙げられる。
無機原料と有機原料を攪拌し反応させる際のｐＨ条件は、酸性条件であれば特に限定されるものではないが、ｐＨ３以下が好ましい。
有機物と無機物の複合体から有機物を除去する方法としては、複合体を濾取し、水等により洗浄、乾燥した後、４００℃〜６００℃で焼成する方法や、有機溶媒等により抽出する方法が挙げられる。
The acidic substance for preparing the acidic solution is not particularly limited, and an inorganic acid or an organic acid can be used. For example, hydrochloric acid, hydrogen bromide, hydrogen iodide, formic acid, acetic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like can be mentioned.
The pH condition when the inorganic raw material and the organic raw material are stirred and reacted is not particularly limited as long as it is acidic, but is preferably pH 3 or less.
As a method for removing the organic substance from the complex of the organic substance and the inorganic substance, there are a method in which the complex is filtered, washed with water and dried, then baked at 400 ° C. to 600 ° C., and extracted with an organic solvent or the like. Can be mentioned.
本発明におけるシリカ多孔体に対するグルタミナーゼの吸着率は８０〜１００％が好ましい。
シリカ多孔体に対するグルタミナーゼの吸着は、グルタミナーゼ溶液（４ｍｇ／ｍｌ）を２０ｍｇのシリカ多孔体に添加後、４℃で1日混合攪拌することにより行うことができる。
調製されたシリカ多孔体＝グルタミナーゼ複合体は、遠心分離により未吸着のグルタミナーゼと分離される。
グルタミナーゼ吸着率は、下記式１に示すように、添加グルタミナーゼ量とシリカ多孔体に吸着したグルタミナーゼから算出することができる。
The adsorption rate of glutaminase to the porous silica in the present invention is preferably 80 to 100%.
Adsorption of glutaminase to the porous silica can be carried out by adding a glutaminase solution (4 mg / ml) to 20 mg of porous silica and mixing and stirring at 4 ° C. for 1 day.
The prepared porous silica = glutaminase complex is separated from unadsorbed glutaminase by centrifugation.
The glutaminase adsorption rate can be calculated from the amount of added glutaminase and the glutaminase adsorbed on the porous silica as shown in the following formula 1.
本発明の耐熱性グルタミナーゼはシリカ多孔体とグルタミナーゼから成る。シリカ多孔体中のグルタミナーゼは１０質量％〜５０質量％が好ましく、２０質量％〜５０質量％がより好ましい。
本発明の耐熱性グルタミナーゼのグルタミナーゼ活性はヤマサＬ−グルタミン酸測定キット（ヤマサ醤油株式会社）によって測定することが出来る。すなわち、耐熱性グルタミナーゼを３７±０.２℃の恒温水槽に５分間放置した後、あらかじめ３７±０.２℃に保持した２％グルタミン酸１０ｍｌを添加し、試験管ミキサーで激しく攪拌する。３７±０.２℃の恒温水槽で正確に１０分間放置した後、０.７５ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸１０ｍｌを加え、試験管ミキサーで激しく攪拌してから、直ちに氷水につける。５分間放置した後、氷水から取り出し、０.７５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム１０ｍｌを加え、試験管ミキサーで激しく攪拌する（反応側の試験液）。
The thermostable glutaminase of the present invention comprises a porous silica and glutaminase. The glutaminase in the porous silica is preferably 10% by mass to 50% by mass, and more preferably 20% by mass to 50% by mass.
The glutaminase activity of the thermostable glutaminase of the present invention can be measured with a Yamasa L-glutamic acid measurement kit (Yamasa Shoyu Co., Ltd.). That is, after the thermostable glutaminase is left in a constant temperature water bath at 37 ± 0.2 ° C. for 5 minutes, 10 ml of 2% glutamic acid previously maintained at 37 ± 0.2 ° C. is added and vigorously stirred with a test tube mixer. After leaving in a constant temperature water bath at 37 ± 0.2 ° C. for exactly 10 minutes, add 10 ml of 0.75 mol / L perchloric acid, vigorously stir with a test tube mixer, and immediately put on ice water. After leaving it for 5 minutes, it is taken out from the ice water, 10 ml of 0.75 mol / L sodium hydroxide is added, and vigorously stirred with a test tube mixer (test solution on the reaction side).
別に５０ｍｌ容のプラチューブ（ファルコンチューブ）に０.７５ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸１０ｍｌを加え、試験管ミキサーで激しく攪拌する。３７±０.２℃の恒温水槽中に５分間放置した後、２％グルタミン溶液１０ｍｌを加えて、試験管ミキサーで激しく攪拌してから、氷水につける。５分間放置した後、氷水中から取り出し、０.７５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム１０ｍｌを加え、試験管ミキサーで激しく攪拌する（ブランク側の試験液）。
ヤマサＬ−グルタミン酸測定キット（ヤマサ醤油株式会社）の発色液３ｍｌを分注した試験管（反応側）、試験液（ブランク側）、グルタミン酸標準液（１００μｇ／ｍｌ）及び水を２００μＬずつ別々に加えて振り混ぜ、２５〜３０分間放置した後、波長６００ｎｍにおける吸光度を測定する。
Separately, 10 ml of 0.75 mol / L perchloric acid is added to a 50 ml plastic tube (Falcon tube), and vigorously stirred with a test tube mixer. After leaving in a constant temperature water bath at 37 ± 0.2 ° C. for 5 minutes, add 10 ml of 2% glutamine solution, vigorously stir with a test tube mixer, and then put on ice water. After leaving it for 5 minutes, it is taken out from ice water, added with 10 ml of 0.75 mol / L sodium hydroxide, and vigorously stirred with a test tube mixer (blank side test solution).
A test tube (reaction side), a test solution (blank side), a glutamic acid standard solution (100 μg / ml), and water (200 μL) separately added with 3 ml of the coloring solution of Yamasa L-glutamic acid measurement kit (Yamasa Shoyu Co., Ltd.) were added separately. The mixture is allowed to stand for 25 to 30 minutes, and then the absorbance at a wavelength of 600 nm is measured.
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
製造例１
ＨＬＢ１５．０のポリグリセリン脂肪酸エステル及び塩酸（１N）２００ｍｌを混合し、完全にポリグリセリン脂肪酸エステルを溶解させた後、ＴＥＯＳ（テトラエトキシシラン）９ｇ及びデカン２０ｍｌを添加した。密封系にてこの溶液（ｐＨ３以下）を２５℃で１２時間攪拌後、生じた沈殿物を濾過にて回収した。その後、イオン交換水にて水洗・濾過を３回繰り返し、エタノールにて洗浄・濾過後、この固形物を５０℃で２時間乾燥させ、さらに５５０℃で６時間焼成を行って、メソ多孔体１．８ｇを得た。
このメソ多孔体０.０５ｇにイソプロピルアルコール２ｇを添加し、３０℃で３０分間攪拌した。その後、水を０.０２ｇ添加し、さらに３０℃で３０分間攪拌した。次に３−アミノプロピルトリメトキシシラン５μｌを添加し、３０℃で２４時間攪拌し混合液をろ別した。エタノールで洗浄・ろ別し、６０℃で２４時間乾燥させ、本実施形態に使用するシリカ多孔体Ａを得た。
得られたシリカ多孔体Ａの細孔径分布を測定し、平均細孔径を求めたところ、１０ｎｍであった。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further more concretely, this invention is not limited to a following example.
Production Example 1
After mixing polyglycerin fatty acid ester of HLB 15.0 and 200 ml of hydrochloric acid (1N) to completely dissolve the polyglycerin fatty acid ester, 9 g of TEOS (tetraethoxysilane) and 20 ml of decane were added. This solution (pH 3 or lower) was stirred at 25 ° C. for 12 hours in a sealed system, and the resulting precipitate was collected by filtration. Thereafter, washing and filtration with ion-exchanged water were repeated three times, and after washing and filtration with ethanol, the solid was dried at 50 ° C. for 2 hours, and further calcined at 550 ° C. for 6 hours. .8 g was obtained.
To 0.05 g of this mesoporous material, 2 g of isopropyl alcohol was added and stirred at 30 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 0.02 g of water was added, and the mixture was further stirred at 30 ° C. for 30 minutes. Next, 5 μl of 3-aminopropyltrimethoxysilane was added and stirred at 30 ° C. for 24 hours, and the mixture was filtered. Washed with ethanol, filtered and dried at 60 ° C. for 24 hours to obtain a porous silica A used in the present embodiment.
When the pore diameter distribution of the obtained porous silica A was measured and the average pore diameter was determined, it was 10 nm.
比較例
トリブロックコポリマー（Ｅ２０ＰＯ７０ＥＯ２０）４ｇを３０ｇの水と１２０ｇの２Ｍ ＨＣｌに溶解させた。その後８.５ｇのテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）を添加し、５分間攪拌した後３５℃にて２０時間静置させ、８０℃にて４８時間静置させた。その後、水洗、乾燥後５４０℃にて焼成し、焼成物Ｘを得た。
Comparative Example 4 g of triblock copolymer (E 20 PO 70 EO 20 ) was dissolved in 30 g of water and 120 g of 2M HCl. Thereafter, 8.5 g of tetraethoxysilane (TEOS) was added, stirred for 5 minutes, allowed to stand at 35 ° C. for 20 hours, and allowed to stand at 80 ° C. for 48 hours. Then, it washed with water and dried, and it baked at 540 degreeC, and the baked product X was obtained.
比較品の製造例１
製造例１のメソ多孔体を使用する代わりに焼成物Ｘを使用する以外は製造例１と同様な方法で多孔体ａを得た。
得られた多孔体ａの細孔径分布を測定し、平均細孔径を求めたところ、多孔体ａの平均細孔経は１０ｎｍであった。
Comparative product production example 1
Porous material a was obtained in the same manner as in Production Example 1 except that the fired product X was used instead of the mesoporous material in Production Example 1.
When the pore diameter distribution of the obtained porous body a was measured and the average pore diameter was determined, the average pore diameter of the porous body a was 10 nm.
試験例１
製造例１および比較品の製造例１で得られたシリカ多孔体Ａ、多孔体ａを０.５ｍｇ／ｍｌとなるようにｐＨ７のイオン交換水にシリカ多孔体を懸濁し、１５分間超音波処理を行った後、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００ＨＳＡにてゼータ電位を測定した。結果を表１に示した。
Test example 1
The porous silica material A and porous material a obtained in Production Example 1 and Comparative Product Production Example 1 were suspended in ion-exchanged water at pH 7 so that the porous material a was 0.5 mg / ml, and sonicated for 15 minutes. Then, the zeta potential was measured with Malvern Zetasizer 3000HSA. The results are shown in Table 1.
実施例１
製造例１で得られたシリカ多孔体Ａの２０ｍｇに４.４ｍｇ／ｍｌのグルタミナーゼを１ｍｌ添加し、４℃で２４時間攪拌し、本発明の耐熱性グルタミナーゼＡ１を得た。
比較例１
シリカ多孔体Ａの代わりに、比較品の製造例１で得られた多孔体ａを用いた以外は実施例１と同様な方法でグルタミナーゼ多孔体混合物ａ１を得た。
Example 1
1 ml of 4.4 mg / ml glutaminase was added to 20 mg of the porous silica A obtained in Production Example 1, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 24 hours to obtain the thermostable glutaminase A1 of the present invention.
Comparative Example 1
Instead of the porous silica material A, a glutaminase porous material mixture a1 was obtained in the same manner as in Example 1 except that the porous material a obtained in Comparative Production Example 1 was used.
比較例２
シリカ多孔体Ａの代わりに、製造例１の焼成物Ｘを用いた以外は実施例１と同様な方法でグルタミナーゼ多孔体混合物ａ２を得た。
比較例３
シリカ多孔体Ａの代わりに、製造例１のメソ多孔体を用いた以外は実施例１と同様な方法でグルタミナーゼ多孔体混合物ｂ１を得た。
試験例２
実施例１で得られた耐熱性グルタミナーゼＡ１および比較例１、２、３で得られたグルタミナーゼ多孔体混合物ａ１、ａ２、ｂ１の酵素活性を、元のグルタミナーゼの酵素活性を１００とした時の酵素活性で算出した。結果を表２に示した。
Comparative Example 2
Instead of the porous silica material A, a glutaminase porous material mixture a2 was obtained in the same manner as in Example 1, except that the fired product X of Production Example 1 was used.
Comparative Example 3
A glutaminase porous material mixture b1 was obtained in the same manner as in Example 1 except that the mesoporous material of Production Example 1 was used instead of the silica porous material A.
Test example 2
The enzyme activity of the thermostable glutaminase A1 obtained in Example 1 and the glutaminase porous material mixtures a1, a2, and b1 obtained in Comparative Examples 1, 2, and 3 were set to be the enzyme activity of the original glutaminase as 100. Calculated by activity. The results are shown in Table 2.
試験例３
グルタミナーゼ、耐熱性グルタミナーゼＡ１、グルタミナーゼ多孔体混合物ａ１、ａ２、ｂ１を６０℃で３０分間加熱処理を行い、加熱処理前に対する加熱処理後の酵素活性残存率を算出した。結果を表３に示した。
Test example 3
Glutaminase, thermostable glutaminase A1, and glutaminase porous material mixture a1, a2, and b1 were heat-treated at 60 ° C. for 30 minutes, and the enzyme activity remaining rate after heat treatment with respect to before heat treatment was calculated. The results are shown in Table 3.
耐熱性グルタミナーゼＡ１は、加熱処理前の活性に比べて、９１.８％とほとんど変わらない活性を保持していた。一方、その他のグルタミナーゼ多孔体混合物ａ１、ａ２、ｂ１は、加熱処理によって、その活性が大きく減少した。
このように本実施形態によれば、従来のグルタミナーゼの耐熱性を著しく向上させた耐熱性グルタミナーゼを提供することができた。この耐熱性グルタミナーゼを用いることにより、調味食品等を製造する目的の上で、極めて効率的にグルタミナーゼを作用させることが可能となる。
The thermostable glutaminase A1 retained an activity that was almost the same as 91.8% of the activity before the heat treatment. On the other hand, the activity of other glutaminase porous material mixtures a1, a2, and b1 was greatly reduced by the heat treatment.
As described above, according to this embodiment, a thermostable glutaminase in which the thermostability of the conventional glutaminase is remarkably improved can be provided. By using this thermostable glutaminase, glutaminase can be made to act very efficiently for the purpose of producing seasoned foods and the like.
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