JP2009000109A - 苦味を阻止する化合物を同定するための特異的t2r味覚受容体の使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】苦味化合物と特異的に結合する受容体、hT2R4、hT2R44及び/またはhT2R61の活性化に関係する化合物を同定するアッセイ方法。
【効果】このアッセイにより同定される化合物は、キニーネ、6−ニトロサッカリン、サッカリン及び/またはデナトニウムを含む苦味化合物による苦味を調節、例えば、抑制するはずであり、これらの化合物は苦味を持つ食品、飲料または医薬製品への有用な添加物である。
【選択図】なし
Description
本出願は、2001年7月10日出願の仮出願米国出願番号60/303,811及び2002年4月15日出願の仮出願米国出願番号60/372,089の優先権を主張し、その両者の全体を引用してここに取り入れる。
本発明は、すでに報告されている味覚に関係するヒトG−タンパク共役受容体(GPCR)の一部を活性化する苦味化合物を解明することを含んでいる。特に本発明は、T2Rファミリーの特定の味覚受容体が、苦味化合物により特異的に活性化されるとの発見を含む。すなわち、ヒトT2R4味受容体が苦味アルカロイドであるキニーネによって特異的に活性化されること、ヒトT2R61味受容体がサッカリンの苦味誘導体である6−ニトロサッカリンによって特異的に活性化されること、並びにヒトT2R44受容体がデナトニウムによって特異的に活性化されるが6−ニトロサッカリンによって弱く活性化されることに関する発見を含むものである。これらの発見に基づき、そのオーソログ、スプライス変異体、一塩基多形(SNP)、及び遺伝子操作による突然変異体を含む、これらのヒト味覚受容体、フラグメントまたはそれらの変異体若しくはキメラは、キニーネ、6−ニトロサッカリンおよびデナトニウム、および構造的に関連する化合物、並びにこれらの受容体を活性化する他の化合物による苦味を阻止する化合物を同定するアッセイ、望ましくは細胞を使用するハイスループットアッセイに有用である。このアッセイを使用して同定される化合物は、食品、飲料または医薬品の添加物としてそれらの味を改善するために使用することができる。
ヒトが認識することができる基本的な味の種類の一つは、苦味である。苦味の生理学はごく最近までほとんど理解されていなかった。最近の研究は、味の生物学に光を注ぎ始めた(Lindemann, Nature (2001))。苦味化合物の多くは、細胞表面受容体と相互作用することにより苦味を生じることが今では認められている。これらの受容体は、細胞内Gタンパクと相互作用する7回膜貫通ドメイン受容体のファミリーに属する。T2Rと呼ばれるGPCRの新規なファミリーが、ヒト及びげっ歯類において同定されている(Adler et al., Cell 100(6): 693-702 (2000); Chandrashekar et al., Cell 100(6): 703-711 (2000); Matsunami H, Montmayeur JP, Buck LB. Nature 404(6778): 601-4 (2000))。いくつかの証拠は、T2Rが、苦味化合物に対する応答を仲介していることを示唆している。第一に、T2R遺伝子は、舌及び口蓋上皮細胞上の味覚受容体のサブセット中で特異的に発現する。第二に、ヒトT2Rの一つ(hT2R1)についての遺伝子は、ヒトにおける苦味化合物である6-n-プロピル-2-チオウラシルに対する感受性に関連する染色体遺伝子座に存在している (Adler et al., (前出)(2000))。第三に、マウスのT2Rの一つ(mT2R5)は、マウスにおける苦味化合物であるシクロヘキシミドに対する感受性に関連する染色体遺伝子座に存在している。また、mT2R5が、味覚細胞で特異的に発現し苦味刺激伝達に関連するGタンパクであるガストジューシンを、活性化できることが示された(Wong et al., Nature 381: 796-800 (1996))。mT2R5によるガストジューシンの活性化は、シクロヘキシミドに応答したときにのみ生じる(Chandrashekar et al.,(前出)(2000))。したがって、mT2Rファミリーは、マウスにおける苦味応答を仲介し、hT2Rファミリーは、ヒトにおける苦味応答を仲介すると考えられている。唯一のヒトT2Rについて、同定された苦味リガンドを持つことが示唆された。即ち、hT2R4が、デナトニウムにより活性化されることが示された(Chandrashekar et al.,(前出)2000)。しかし、その試験に使用した有効なデナトニウム濃度(1.5 mM)は、異常に高かった、すなわち、ヒトで報告されているデナトニウムについての苦味閾値よりも105倍高かった(Saroli, Naturwissenschaften 71:428-429 (1984))。したがって、hT2Rに充分に適合する特異的苦味リガンドはなかった。各hT2Rが複数の苦味リガンドに結合できるという提案もなされていた。この仮説は、hT2Rファミリーはわずか24の同定されたメンバーから構成されるが、ヒトは数百の異なる化合物を苦いと認識することができるという事実に基づいている。hT2Rの配列は既に報告されており、Zukerら(WO 01/18050 A2,(2001))及びAdlerら(WO 01/77676 A1(2001))により公開PCT出願に開示されている。その両者の全体を、引用して本明細書に取り入れる。
結論的に、本発明は、T2Rファミリーにおける幾つかの味覚受容体、特にhT2R4, hT2R61及びhT2R44は、それぞれ、苦味化合物である、キニーネ、6−ニトロサッカリン、及びデナトニウム(及び6−ニトロサッカリンには弱く)によって特異的に活性化されるという発見に関する。
本発明の一つの目的は、キニーネまたはキニーネに構造的に関連するhT2R4を活性化する化合物によるhT2R4、またはそのフラグメント、変異体、オーソログ若しくはキメラの活性化を阻害する化合物を同定することである。
本発明を具体的に記述する前に、以下の定義を提示する。
(1)以下及び引用したZuker(前出)(2001)およびAdler(前出)(2001)に開示されているT2Rに対して、約25アミノ酸、最も適するのは50−100アミノ酸の枠に亘って、約30−40%のアミノ酸配列が相同、より具体的にいうと約40,50,60,70,75,80,85,90,95,96,97,98,または99%のアミノ酸配列が相同である;
(2)以下に開示するT2R配列及びその保存的に修飾された変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む免疫原に対して作成される抗体に特異的に結合する;
(3)以下に開示するT2R DNA配列及びその保存的に修飾された変異体からなる群から選択された配列にストリンジェントなハイブリッド形成条件の下に(少なくとも約100、任意に少なくとも約500-1000ヌクレオチドのサイズで)特異的にハイブリッド形成する;
(4)以下に開示するT2Rアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列に少なくとも約40%相同な配列を含む;または
(5)記述されたT2Rとストリンジェントなハイブリッド形成条件下に特異的にハイブリッド形成するプライマーにより増幅される
多形変異体、アレル、突然変異体、及び同属体を含む。
ポリペプチド擬似構成物は、非天然の構造成分のいずれかの組み合わせを含むことができ、それは典型的に以下の3つの構造基に由来する;a)天然アミド結合(「ペプチド結合」)以外の残基連結基;b)天然に存在するアミノ酸残基に代わる非天然残基;c)二次構造擬態を誘導する残基、すなわち、例えば、βターン、γターン、βシート、αへリックスなどの二次構造を誘導または安定化する残基。
ポリペプチドは、その残基の全てまたは一部が天然ペプチド結合以外の化学的方法により結合している場合に、擬似体として特徴付けることができる。個々のペプチド擬似残基は、ペプチド結合、そのほかの化学的結合またはカップリング手段、例えば、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、2価マレイミド、N,N'−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)またはN,N'−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、により結合することができる。伝統的アミド結合(「ペプチド結合」)に代わりうる結合基には、例えば、ケトメチレン(例えば、-C(=O)-NH-の代わりに−C(=O)-CH2-)、アミノメチレン(CH2-NH)、エチレン、オレフィン(CH=CH)、エーテル(CH2-O)、チオエーテル(CH2-S)、テトラゾール(CN4)、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルがある(例えば、Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, 267-357, Marcell Dekker, Peptide Backbone Modifications, NY (1983)参照)。天然に存在するアミノ酸残基に代わって、全部または一部が非天然残基を含む場合にも、ポリペプチドは、擬似体に分類される(非天然残基は、科学文献及び特許文献に詳しく記述されている)。
(a)定常領域またはその一部が改変され、置換され、または交換され、その結果、抗原結合部位(可変領域)が、異なるまたは改変されたクラス、エフェクター機能及び/または種の定常領域と連結しているか、或いはキメラ抗体に新しい性質を付与する全く異なる分子、例えば、酵素、トキシン、ホルモン、成長因子、薬物などと連結している抗体分子;或いは
(b)可変領域またはその一部が、異なるまたは改変された抗原特異性を持つ可変領域により改変、置換または交換されている抗体分子。
本発明のT2R、またはそのフラグメント若しくは変異体の単離及び発現は、本出願に開示されたT2R核酸配列に基づいて構築されたプローブまたはプライマーを使用して、充分に確立されたクローニング方法により行うことができる。関連T2R配列は、本明細書で開示した配列及び既知のコンピューター支援探索技術、例えば、BLAST配列探索を使用して、ヒトまたは他の種のゲノムデータベースから同定することもできる。特別な態様において、本明細書で開示した偽遺伝子を、機能的アレルまたは関係遺伝子を同定するために使用することができる。
次いで、相補鎖を合成して適当な条件下に鎖をアニーリングするか、または適当なプライマー配列とともにDNAポリメラーゼを使用して相補的鎖を加えることにより二本鎖DNAフラグメントを得ることができる。
インビトロ及びインビボにおいて、試験化合物が、本発明のT2Rポリペプチドに特異的に結合するか否かを測定する方法及び成分を以下に記述する。細胞生理の多くの局面を監視して、天然に存在するかまたはキメラのT2Rに対するリガンド結合による効果を評価することができる。これらのアッセイを、T2Rポリペプチドを発現する完全な細胞、透過性細胞、または標準的方法により作製された膜フラクションで行うことができる。
インビトロ及びインビボにおいて、試験化合物が、本発明のT2R受容体に特異的に結合するか否かを調べるための成分及び方法を以下に記述する。細胞生理の多くの面をモニターして、本発明のT2Rポリペプチドへのリガンド結合による効果を評価することができる。これらのアッセイは、化学感受性受容体を発現する完全な細胞、透過性細胞、または標準的方法により若しくは新たに合成されたタンパクをインビトロで使用して作製した膜フラクションで、実施することができる。
味覚変換も、本発明のT2Rポリペプチドを使用して、可溶相若しくは固相の反応で、インビトロにおいて試験することができる。特別な態様において、T2Rリガンド結合ドメインを、可溶相若しくは固相の反応において、インビトロで使用して、リガンド結合についてアッセイすることができる。
他の態様において、リガンド結合を検出及び監視するために蛍光偏光(「FP」)によるアッセイを使用することができる。蛍光偏光は、結合平衡、核酸ハイブリダイゼーション、及び酵素活性を測定するために広い用途で適用される技術である。蛍光偏光アッセイは、均質系であり、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、沈殿、または電気泳動などの分離操作を必要としない。このアッセイは、リアルタイムで、溶液中で直接行われ、固相を必要としない。偏光の測定は、迅速であり、検体を破壊しないので、偏光値は、繰り返し且つ試薬の添加後に測定することができる。一般的に、この技術は、ピコモルからマイクロモルの低レベルの蛍光の偏光値を測定するために使用することができる。本発明のT2Rポリペプチドに対するリガンドの結合を測定するための簡単にして定量的な方法において、どのように蛍光偏光を使用しうるかを、このセクションでは記述する。
[式中、IntΠは、励起光面に平行な放射光の強度、Int⊥は、励起光面に垂直な放射光の強度である。Pは、光の強度の比であり、無次元の数である。]。
例えば、BeaconTM及びBeacon 2000TMシステムをこのアッセイに関して使用することができる。そのシステムでは典型的に偏光をミリ偏光単位(1偏光単位=1000 mP単位)で示している。
さらに他の態様において、本発明は、T2Rポリペプチド;またはT2Rポリペプチドを発現する細胞または組織を使用する可溶相アッセイを提供する。他の態様において、本発明は、固相を使用するハイスループット方式のインビトロアッセイを提供する。その方式において、T2RポリペプチドまたはT2Rポリペプチドを発現する細胞若しくは組織は、固相基質に付着され、味覚刺激化合物をT2R受容体と接触させ、結合を、適当なタグまたはT2Rに対して作製した抗体を使用して検出する。
基質にタグバインダーを固定する非化学的方法には、例えば、熱、UV照射による架橋結合のような他の一般的方法がある。
望ましい一の態様において、T2Rタンパクは、非修飾の形態において、或いは異種の、分泌経路による成熟化及び標的化を促進するシャペロン配列を持つかまたは望ましくは持たないキメラ、変異体または短縮された受容体として、真核細胞中で発現する。そのT2Rポリペプチドは、HEK-293細胞のような真核細胞で発現することができる。望ましくは、細胞は、細胞内シグナリング経路またはホスフォリパーゼCのようなシグナリングタンパクに、キメラ受容体を連結させることができる、機能的Gタンパク、例えばGα15を含む。その細胞内におけるT2R受容体の活性化は、例えば、細胞内のFURA-2による蛍光を検出することによる細胞内カルシウムの変化を検出する、標準的な方法を使用して検出することができる。そのようなアッセイが、本出願に示した実験的知見の基礎になっている。
一つまたはそれ以上の本発明の味覚受容体配列を発現する非ヒト動物も、また受容体アッセイに使用することができる。そのような発現を利用して、安定的にまたは一過性に化学感受性受容体またはそのリガンド結合領域をコードする核酸を導入した非ヒト動物を、試験化合物と接触させ、受容体ポリペプチド複合体に特異的に結合することで、試験化合物に動物が反応するか否かを測定することにより、試験化合物が哺乳動物膜貫通味覚受容体複合体に特異的に結合するか否かを測定することができる。
T2Rファミリーメンバーの調節物質として試験される化合物は、小さな化合物、またはタンパク、糖、核酸若しくは脂質のような生化学物質のいずれでも良い。また、調節物質は、T2Rファミリーメンバーの遺伝的改変体でも良い。典型的には、試験化合物は小さな化学分子及びペプチドである。通常は、水または有機溶媒(特にDMSOを含む)に溶解しうる化合物が使用されるが、本質的に如何なる化合物も、本発明の潜在的調節物質またはリガンドとして使用することができる。アッセイは、アッセイ段階を自動化し、アッセイのために簡便な資源から化合物を供給することにより、大規模な化合物ライブラリーをスクリーニングするように設計することができ、典型的には、並行して稼動する(例えば、マイクロタイタープレート上で自動的にアッセイするマイクロタイター方式)。Sigma(St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Switzerland)などを含めて多数の化合物供給業者が存在することは認識されているであろう。
味覚試験においてhT2R4, hT2R44またはhT2R61の活性化により誘発される苦味を調節する、望ましくは阻止するために、本発明により同定された化合物を食品、飲料または医薬組成物に加えることができる。具体的には、キニーネまたは関連化合物によるhT2R4の活性化を阻害する化合物は、苦味を誘発する食品、飲料または医薬品への添加物として使用することができる。例えば、これらの化合物を、苦味を阻止する有効量で、キニーネまたは関連化合物を含む医薬製剤に加えるとよい。
T2R遺伝子及びその同属体は、味覚受容体細胞の同定のために、法医学または父子確認のために、及び味覚伝導の試験にとって、有用な道具である。T2R核酸に特異的にハイブリッド形成するT2Rファミリーメンバー特異的試薬、例えばT2Rプローブ及びプライマー、並びにT2Rタンパクに特異的に結合するT2R特異的試薬、例えば、T2R抗体は、味覚細胞発現及び味覚伝導調節を試験するために使用される。
この実施例において、キニーネ(苦味アルカロイド)が、本出願のSEQ ID NO:2に含まれるDNA配列を有するヒト苦味受容体、hT2R4を、特異的に活性化することを示す。
潜在的hT2R4アンタゴニストを発見するためのハイスループットスクリーニングアッセイにも、細胞表面に高いレベルのhT2R4を安定的に発現するHEK-G15株(HEK-G15-hT2R4)を使用する。細胞表面に一過性遺伝子導入細胞よりも2-3倍多い受容体を発現する安定HEK-G15-hT2R4株を作製した(図2参照)。この場合は、アッセイの18−24時間前に細胞を96ウエルまたは384ウエル培養プレートに接種する。次いで細胞をカルシウム感受性蛍光色素(Molecular Devices)とインキュベートし、刺激し、標準的蛍光強度プレートリーダー(FLIPRまたはVIPR)で測定する。この方法を使用して、hT2R4に対するキニーネの効果をさらに特徴付けることができた。我々は、キニーネが典型的な用量反応相関でhT2R4を活性化する事を発見した(図3参照)。
この実験において、T2R受容体の活性化を監視するためにGTPγS結合アッセイを使用した(図4)。このアッセイは、GPCRの活性を監視する古典的アッセイである(Wessling-Resnick and Jonson, 1987)。これは、適当なリガンドの存在下にGPCRがGタンパクを活性化することができるという事実に基づいている。生成した活性化Gタンパクは、結合しているGDPをGTPに変換する。GTPの加水分解されない類似体、GTPγSを使用すれば、ヌクレオチドは、Gタンパクに堅く結合したままとなり、非結合ヌクレオチドから分離することができる。放射活性標識[γ-35S]GTPγSを使用することにより、結合したGTPγSの量を測定することが可能となる。結合したGTPγSの量は、活性化Gタンパクの量を反映し、それは翻って受容体の活性化を反映する。GTPγS結合アッセイにおいてGタンパクとしてトランスジューシンを使用した。トランスジューシンは、視覚系において発現し、ガストジューシンのオーソログである。トランスジューシンは、ウシ網膜から精製した(Stryer, Methods Enzymol 96: 617-627 (1983))。
Claims (83)
- hT2R61による苦味を特に調節する化合物を同定するアッセイ方法であって、
(i) hT2R61、または6−ニトロサッカリン、またはサッカリンと特異的に結合する、該受容体の変異体、フラグメント、オーソログ、突然変異体若しくはキメラの活性化に対する影響について、該化合物をスクリーニングし;
(ii)6−ニトロサッカリン、またはサッカリンによる該受容体の活性化に対する影響に基づいて、hT2R61による苦味を該化合物が調節するか否かを測定する
ことを含む、アッセイ方法。 - 該hT2R61が、SEQ ID NO.:5に含まれるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のアッセイ。
- 該hT2R61が、細胞膜に発現している、請求項1に記載のアッセイ。
- 該細胞膜が単離されている、請求項1に記載のアッセイ。
- 該細胞膜が、昆虫細胞上に存在する、請求項1に記載のアッセイ。
- 該細胞が真核細胞である、請求項1に記載のアッセイ。
- 該細胞が、哺乳動物細胞または昆虫細胞である、請求項1に記載のアッセイ。
- 該哺乳動物細胞が、HEK細胞、BHK細胞、COS細胞及びCHO細胞から選択される、請求項1に記載のアッセイ。
- 該化合物の調節効果が、さらに味覚試験により確認される、請求項1に記載のアッセイ。
- hT2R61による苦味を調節する化合物を同定する方法であって、
(i) hT2R61タンパク、または苦味に関与するその変異体、オーソログ、キメラ若しくはフラグメントを発現し、任意に内在性または外来性Gタンパクを含む細胞系または細胞膜を得;
(ii)該細胞系を、hT2R61を活性化する6−ニトロサッカリンに接触させ;
(iii) 該細胞系を、苦味に影響する可能性についてスクリーニングする少なくとも一つの化合物と接触させ;
(iv) 該化合物が苦味を調節するか否かを、6−ニトロサッカリンによる該hT2R61タンパク、又はその変異体若しくはフラグメントの活性化に対する影響に基づいて同定する
ことを含む、同定方法。 - 該化合物に対する該影響が、細胞内イオン濃度の変化に基づいて選択される、請求項10に記載の方法。
- 該イオンが、カルシウムである請求項11に記載の方法。
- 該イオンが、ナトリウムである請求項11に記載の方法。
- 該化合物が、細胞膜電位に関する効果に基づいて選択される、請求項10に記載の方法。
- 該化合物が、該T2Rの転写に関する効果に基づいて選択される、請求項10に記載の方法。
- 該化合物が、該T2Rの6−ニトロサッカリンとの相互作用を阻害する能力に基づいて選択される、請求項10に記載の方法。
- 該hT2R61が、形質膜輸送を促進する配列に作動的に結合している、請求項10に記載の方法。
- 該細胞系が、HEK-293細胞系である請求項10に記載の方法。
- 該hT2R61ポリペプチドに対する該化合物の影響を、細胞内cAMP, cGMPまたはIP3の変化に基づいてアッセイする、請求項10に記載の方法。
- 該hT2R61フラグメントが、細胞外ドメインまたは膜貫通領域である、請求項43に記載の方法。
- レポーター分子を使用して、カルシウムイオン濃度の相違をモニターする、請求項10に記載の方法。
- 該レポーター分子が、カルシウムに特異的な蛍光色素である、請求項10に記載の方法。
- 該色素が、Fluo-3, Fluo-4またはFura-2である、請求項22に記載の方法。
- 該hT2R61、変異体またはフラグメントが、レポーター分子に付属している、請求項10に記載の方法。
- 該レポーターが、緑色蛍光タンパクまたはその変異体である、請求項24に記載の方法。
- 該hT2R61ポリペプチド、変異体またはフラグメントが、溶液中に含まれる、請求項10に記載の方法。
- 該hT2R61ポリペプチド、変異体またはフラグメントが、固相に付着した二層膜中に、脂質単層中に、または小胞中に存在する、請求項10に記載の方法。
- 該化合物の結合が、分光学的特性、流体力学的特性、クロマトグラフィーによる特性または溶解性の変化に基づいて評価される、請求項1に記載の方法。
- 該化合物が、該hT2R61ポリペプチド、変異体またはフラグメントとGタンパクとの複合体形成に対する影響に基づいて選択される、請求項1に記載の方法。
- 該化合物が、該hT2R61ポリペプチド、変異体またはフラグメントとガストジューシンまたはトランスジューシンとの相互作用に対する影響に基づいて選択される、請求項10に記載の方法。
- 該化合物が、蛍光偏光アッセイを使用して選択される、請求項1に記載の方法。
- 該hT2R61ポリペプチドが、固相基質に付着している、請求項1に記載の方法。
- ハイスループットアッセイを含む、請求項1に記載の方法。
- 該細胞系が、該受容体を安定的に発現する、請求項10に記載の方法。
- 該細胞系が、該受容体を一過性に発現する、請求項10に記載の方法。
- 該細胞系が、哺乳動物または昆虫の細胞である、請求項34または35に記載の方法。
- 該昆虫細胞がSf9細胞である、請求項36に記載の方法。
- 該アッセイが、GTPγS結合アッセイである、請求項10に記載の方法。
- 該アッセイが、Gタンパクとしてトランスジューシンまたはガストジューシンを使用する、請求項38に記載の方法。
- 該受容体が、バキュロウイルス発現系を使用して発現される、請求項39に記載の方法。
- hT2R61による苦味を阻害する該化合物の能力を、さらに味覚試験により確認する、請求項10に記載の方法。
- 味覚試験が、サッカリンを含む組成物を使用する、請求項41に記載の方法。
- hT2R44による苦味を特に調節する化合物を同定するアッセイ方法であって、
(i) デナトニウム及び/または6−ニトロサッカリンによるhT2R44、または該受容体の変異体、フラグメント、キメラ、オーソログ若しくは突然変異体の活性化に対する影響について、該化合物をスクリーニングし;
(ii) 該化合物がhT2R44による苦味を調節するか否かを、デナトニウム及び/または6−ニトロサッカリンによる該受容体の活性化を調節する能力に基づいて測定する:
ことを含む、アッセイ方法。 - 該hT2R44が、SEQ ID NO.:3に含まれるアミノ酸配列を有する、請求項43に記載のアッセイ。
- 該hT2R44が、細胞膜に発現している請求項43に記載のアッセイ。
- 該細胞膜が、単離されている請求項45に記載のアッセイ。
- 該細胞膜が、昆虫細胞に由来する請求項45に記載のアッセイ。
- 該細胞が、真核細胞である請求項45に記載のアッセイ。
- 該細胞が、哺乳動物細胞または昆虫細胞である請求項48に記載のアッセイ。
- 該哺乳動物細胞が、HEK細胞、BHK細胞、COS細胞及びCHO細胞から選択される、請求項49に記載のアッセイ。
- 該化合物の調節効果が、さらに味覚試験によって確認される、請求項43に記載の方法。
- hT2R44による苦味を調節する化合物を同定する方法であって、
(i) hT2R44タンパク、又は苦味に関与するその変異体、オーソログ、キメラ若しくはフラグメントを発現し、任意に内在性または外来性Gタンパクを含む、細胞系または細胞膜を得;
(ii) 該細胞系を、hT2R44を活性化するデナトニウムに接触させ;
(iii) 該細胞系を、苦味に影響する可能性についてスクリーニングされる少なくとも一つの化合物と接触させ;
(iv) 該化合物が苦味を調節するか否かを、デナトニウムによる該T2Rタンパク、又はその変異体若しくはフラグメントの活性化に対する影響に基づいて同定する
ことを含む、同定方法。 - 該化合物に対する該影響が、細胞内イオン濃度の変化に基づいて選択される請求項52に記載の方法。
- 該イオンが、カルシウムである、請求項53に記載の方法。
- 該イオンが、ナトリウムである、請求項53に記載の方法。
- 該化合物が、細胞膜電位に関する効果に基づいて選択される、請求項52に記載の方法。
- 該化合物が、該T2Rの転写に関する効果に基づいて選択される、請求項52に記載の方法。
- 該化合物が、該T2Rとデナトニウム及び/または6−ニトロサッカリンとの相互作用を阻害する能力に基づいて選択される請求項52に記載の方法。
- 該hT2R44が、形質膜輸送を促進する配列に作動的に結合している、請求項52に記載の方法。
- 該細胞系が、HEK-293細胞系である、請求項52に記載の方法。
- 該hT2R44に対する該化合物の影響が、細胞内cAMP, cGMPまたはIP3の変化に基づいてアッセイされる、請求項52に記載の方法。
- 該hT2R44フラグメントが、細胞外ドメインまたは膜貫通領域である、請求項52に記載の方法。
- レポーター分子を使用して、カルシウムイオン濃度の相違をモニターする、請求項52に記載の方法。
- 該レポーター分子が、カルシウムに特異的な蛍光色素である、請求項52に記載の方法。
- 該色素が、Fluor-3, Fluo-4またはFura-2である、請求項64に記載の方法。
- 該hT2R44ポリペプチド、又はその変異体若しくはフラグメントが、レポーター分子に付属している、請求項52に記載の方法。
- 該レポーターが、緑色蛍光タンパクまたはその変異体である、請求項66に記載の方法。
- 該hT2R44ポリペプチド、又はその変異体若しくはフラグメントが、溶液中に含まれる請求項43に記載の方法。
- 該hT2R44ポリペプチド、又はその変異体若しくはフラグメントが、固相に付着された二層膜中、脂質単層膜中、または小胞中に存在する、請求項43に記載の方法。
- 該化合物の結合が、分光学的特性、流体力学的特性、クロマトグラフィーによる特性または溶解性の変化に基づいて評価される、請求項43に記載の方法。
- 該化合物が、該hT2R44ポリペプチド、又はその変異体若しくはフラグメントとGタンパクとの複合体形成に対する影響に基づいて選択される、請求項43に記載の方法。
- 該化合物が、該hT2R44ポリペプチド、又はその変異体若しくはフラグメントとガストジューシンまたはトランスジューシンとの相互作用に対する影響に基づいて選択される、請求項52に記載の方法。
- 該化合物が、蛍光偏光アッセイを使用して選択される、請求項43に記載の方法。
- 該hT2R44ポリペプチドが、固相基質に付着している、請求項43に記載の方法。
- ハイスループットアッセイを含む、請求項43に記載の方法。
- 該細胞系が、該受容体を安定的に発現する、請求項52に記載の方法。
- 該細胞系が、該受容体を一過性に発現する、請求項52に記載の方法。
- 該細胞系が、哺乳動物または昆虫の細胞である、請求項76または77に記載の方法。
- 該昆虫細胞が、Sf9細胞である、請求項78に記載の方法。
- 該アッセイが、GTPγS結合アッセイである、請求項76に記載の方法。
- 該アッセイが、Gタンパクとしてトランスジューシンまたはガストジューシンを使用する、請求項80に記載の方法。
- 該受容体が、バキュロウイルス発現系を使用して発現される、請求項79に記載の方法。
- hT2R44による苦味を阻害する該化合物の能力を、さらに味覚試験により確認する、請求項52に記載の方法。
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