JP2008547004A - Ｈｉｖ−１感染の検出 - Google Patents
Ｈｉｖ−１感染の検出 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008547004A JP2008547004A JP2008517110A JP2008517110A JP2008547004A JP 2008547004 A JP2008547004 A JP 2008547004A JP 2008517110 A JP2008517110 A JP 2008517110A JP 2008517110 A JP2008517110 A JP 2008517110A JP 2008547004 A JP2008547004 A JP 2008547004A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- infection
- hiv
- pde
- pme
- subject
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 title claims abstract description 32
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 136
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims abstract description 63
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 51
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims abstract description 42
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 34
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 25
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 10
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 claims description 133
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 57
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 49
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 45
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 35
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 25
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 claims description 23
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 22
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 21
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 19
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 11
- 238000009510 drug design Methods 0.000 claims description 11
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 11
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims description 10
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 claims description 8
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 7
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 6
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 claims description 5
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 5
- 206010057293 West Nile viral infection Diseases 0.000 claims description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000025223 poliovirus infection Diseases 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 claims 1
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 claims 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 82
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 238000001394 phosphorus-31 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N O-phosphoethanolamine Chemical compound NCCOP(O)(O)=O SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 8
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 7
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 7
- YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O phosphocholine Chemical compound C[N+](C)(C)CCOP(O)(O)=O YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000004679 31P NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 4
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- -1 nucleoside triphosphate Chemical class 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008777 Glycerylphosphorylcholine Substances 0.000 description 3
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- SUHOQUVVVLNYQR-MRVPVSSYSA-N choline alfoscerate Chemical compound C[N+](C)(C)CCOP([O-])(=O)OC[C@H](O)CO SUHOQUVVVLNYQR-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 3
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N glycerophosphatidylethanolamine Chemical compound NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004956 glycerylphosphorylcholine Drugs 0.000 description 3
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 3
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000713704 Bovine immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000713756 Caprine arthritis encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N N-phosphocreatine Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=N)NP(O)(O)=O DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 2
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 2
- 108010033737 Pokeweed Mitogens Proteins 0.000 description 2
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000713325 Visna/maedi virus Species 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 229940064366 hespan Drugs 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 2
- 150000003017 phosphorus Chemical class 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-N 2-(trimethylazaniumyl)ethyl hydrogen phosphate Chemical compound C[N+](C)(C)CCOP(O)([O-])=O YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000713711 Primate lentivirus group Species 0.000 description 1
- 208000009341 RNA Virus Infections Diseases 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 241001068263 Replication competent viruses Species 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000008576 chronic process Effects 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 230000005672 electromagnetic field Effects 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000012988 high-throughput synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000001985 kidney epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000002796 nucleotidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229950004354 phosphorylcholine Drugs 0.000 description 1
- 238000000782 polymeric membrane extraction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000007502 viral entry Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
- G01N33/5038—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving detection of metabolites per se
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
- G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
- G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/16—Phosphorus containing
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/16—Phosphorus containing
- Y10T436/166666—Phosphorus containing of inorganic phosphorus compound in body fluid
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/24—Nuclear magnetic resonance, electron spin resonance or other spin effects or mass spectrometry
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physiology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】ＨＩＶ感染を直接、リアルタイム、及びインビボで測定することができ、偽陰性の結果をもたらすことがない方法を提供する。
【解決手段】本発明に係る方法は、生体サンプルを得るステップと、所定の細胞代謝産物のレベルにおける変化に関して前記生体サンプルを分析するステップと、前記変化を定量化するステップと、前記定量化した変化を、標準の代謝産物レベルと比較するステップとを含み、前記所定の細胞代謝産物のレベルが前記標準の代謝産物レベルに対して変化している場合は、前記対象がウイルスに感染していると示す。
【選択図】図１
【解決手段】本発明に係る方法は、生体サンプルを得るステップと、所定の細胞代謝産物のレベルにおける変化に関して前記生体サンプルを分析するステップと、前記変化を定量化するステップと、前記定量化した変化を、標準の代謝産物レベルと比較するステップとを含み、前記所定の細胞代謝産物のレベルが前記標準の代謝産物レベルに対して変化している場合は、前記対象がウイルスに感染していると示す。
【選択図】図１
Description
本件出願は、２００５年６月１５日に出願された米国特許出願番号第６０／６９０，４８９号、及び２００５年６月１５日に出願された米国特許出願番号第６０／６９０，４９１号の優先権を主張するものである（両方とも、参照により、本明細書に組み込まれるものとする）。
本発明は、低費用及び大規模で行うのに実用的であり、且つＨＩＶをインビボで画像検出するのに大きな可能性を秘めた高信頼度の特異的高感度分析に関連するものである。さらに具体的には、本発明は、ＨＩＶ感染の存在及び程度を検査するために細胞の代謝産物における変化を利用する方法に関連する。
ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus：ＨＩＶ）は、後天性免疫不全症候群（acquired immune deficiency syndrome：ＡＩＤＳ）と名づけられた免疫系の変性疾患の第一要因とされてきた。ＨＩＶがＣＤ４＋Ｔリンパ球に感染すると、この必要不可欠なリンパ球が欠失するようになり、それによって、日和見感染症、神経疾患、腫瘍の成長が発生し、患者は最終的に死に至る。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染は、ウイルスが持続的に高速で増殖する慢性的なプロセスである。ＨＩＶ−１感染の発病過程では、急性ウイルス血症期が発生し、無症状性の期間（期間の長さは様々ではあるが、一般的には長期）が続く。
ＨＩＶ感染を検出し、体内でのＨＩＶの発達をモニターするために開発された分析法として、とりわけ、欠失したＣＤ４＋細胞の数を計算し、ＡＩＤＳの予後を示す方法がある。血清学的スクリーニング技術もまた、世界中でＨＩＶ検出に使用されている。この技術では、ＨＩＶのｐ２４抗原などのＨＩＶ抗原に対する抗体を検出する。
また、感染の存在及び程度を評価するために、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定法）及び血清サンプル内のウイルス核酸を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction：ＰＣＲ）などの他の検査法が現在使用されている。しかしながら、これらの分析法には、次に示す３つの主要な欠陥がある。（１）ＨＩＶに感染した全ての感染者に対してＨＩＶを検出するほど十分な感度を有さない（その理由として、例えば、検出可能なレベルのＨＩＶ血清抗体を有さないＨＩＶ感染者がいるため）。（２）セロコンバージョンが起きるまでの期間、又は血液内を循環しているウイルスが大量増殖し、検出が可能になるまでに長い時間がかかる。また、ＨＩＶに感染しているが、血清反応が陰性の人の中には、セロコンバージョンを決して起こさない人もいる。彼らは一生感染者のままであり続ける。血清反応陰性のＨＩＶ感染者においてＨＩＶ感染を検出する方法として、「Proc. Natl. Acad. Sci. UAS, 87: 3972-3076 (1990)」（Jehuda-Cohen, T. et al.）に記載されているものもあるが、これにも同様な問題が存在する。この方法では、血液から末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cell：ＰＢＭＣ）が単離され、ヤマゴボウマイトジェンなどのマイトジェに晒される。この場合、ヤマゴボウマイトジェンの存在下で単離したＰＢＭＣを培養すると、ＰＢＭＣは、ＨＩＶに対して特異的な免疫グロブリンを分泌する。そして最後に、（３）従来の検出法は、主に末梢血の反応（抗体又はウイルス濃度）に依存し、一次免疫又は他の器官（通常、これらがＨＩＶの主な感染部位である）における感染を検出又は示すことはない。
つまり、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ、及び従来の他の分析法では、全てのＨＩＶ感染者に対して感染を検出することができず、ＨＩＶ感染者を感染していないと診断することで、感染者を危険に晒す。それによって、薬剤療法の開始が遅れ、ＨＩＶ感染者が知らずに他人にＨＩＶを感染させる可能性が高くなる。同様に、体内の主要なＨＩＶ感染部位ではなく、末梢血におけるＨＩＶの存在を予想する感染分析に依存すると、薬剤療法前後に体内全体のウイルス濃度に関して誤った情報を得る場合がある。例えば、選択された薬剤療法によって、血液へのウイルスの排出量が変わると、あたかも体内からウイルスが除去されたかのように見え、ウイルス感染に対する療法の効果が過大評価される又は判明しないことがある。
したがって、人間におけるＨＩＶ−１感染の検出のために使用される従来の方法（ＨＩＶ−１抗体の生成に基づく）では、ＨＩＶ感染を直接、リアルタイム、及びインビボで測定することができないので、偽陰性の結果をもたらすことがあり、それによって、感染者が健全な人にＨＩＶを感染させる可能性が増大することは明らかである。
ある実施形態では、本発明は、対象におけるウイルス感染を検出するための方法であって、前記対象から生体サンプルを得るステップと、所定の細胞代謝産物のレベルにおける変化に関して前記生体サンプルを分析するステップと、前記変化を定量化するステップと、前記定量化した変化を標準の代謝産物レベルと比較するステップとを含み、前記標準の代謝産物レベルに対して前記細胞代謝産物のレベルが変化している場合は、前記対象がウイルスに感染していると示す方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、対象に対する抗ウイルス治療の有効性を評価する方法であって、前記対象から生体サンプルを得るステップと、所定の細胞代謝産物のレベルにおける変化に関して前記生体サンプルを分析するステップと、前記変化を定量化するステップと、前記定量化した変化を標準の代謝産物レベルと比較するステップと、時間、医薬の投与量、既存の病状、環境要因、医薬の種類、カクテルの構成物、副作用、又はそれらの組み合わせの関数として、前記所定の細胞代謝産物のレベルが前記標準の代謝産物レベルに戻る率をモニターするステップとを含み、前記変化した細胞代謝産物のレベルが前記標準の細胞代謝産物レベルに速く戻るほど、前記治療がより有効であると示す方法を提供する。
ある実施形態では、本発明は、ＨＩＶ−１治療のための合理的な薬剤の設計のための方法であって、候補の化合物を選択するステップと、感染した対象を前記候補の化合物に晒すステップと、前記感染した対象から生体サンプルを得るステップと、所定の細胞代謝産物のレベルにおける変化に関して前記生体サンプルを分析するステップと、前記変化を定量化するステップと、前記定量化した変化を標準の代謝産物レベルと比較するステップと、時間、医薬の投与量、既存の病状、環境要因、医薬の種類、カクテルの構成物、副作用、又はそれらの組み合わせの関数として、前記所定の細胞代謝産物のレベルが前記標準の代謝産物レベルに戻る率をモニターするステップとを含み、前記変化した細胞代謝産物のレベルが前記標準の代謝産物レベルに戻れば、前記薬剤がＨＩＶ−１の治療に対して有効であると示す方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、感染した対象におけるウイルス感染の重症度を分類する方法であって、前記対象から生体サンプルを得るステップと、所定の細胞代謝産物レベルにおける変化に関して前記生体サンプルを分析するステップと、前記変化を定量化するステップと、前記定量化した変化を、標準の代謝産物レベルと比較するステップと、観察された前記細胞代謝産物のレベルと標準の代謝産物レベルとの間の差を計算するステップとを含み、前記観察されたレベルと前記標準レベルとの間の差が大きいほど、前記感染がより重症であると示す方法を提供する。
ある実施形態では、本発明は、対象における活動性又は非活動性（active or passive）ＨＩＶ感染の程度、位置、又はそれらの組み合わせをインビボで画像化する方法であって、所定の細胞代謝産物における変化を第一の評価基準として使用し、前記対象の体全体又は特定の器官の磁気共鳴画像（magnetic resonance imaging：ＭＲＩ）又は他の同様なスキャンを得るステップと、観察された前記画像と非感染の組織又は器官から得られた標準画像との間の差を計算するステップとを含み、所定の組織又は器官の位置に関して得られた画像における前記差が大きいほど、その位置における感染がより重症であると示す方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ＨＩＶ−１治療のための薬剤の合理的な設計の方法であって、候補の化合物を選択するステップと、感染した器官又は組織を、前記候補の化合物に晒すステップと、所定の細胞代謝産物における変化を第一の評価基準として使用し、対象の体全体又は特定の器官の磁気共鳴画像（ＭＲＩ）又は他の同様なスキャンを得るステップと、観察された前記画像と非感染の組織又は器官から得られた標準画像との間の差を計算するステップと、時間、医薬の投与量、既存の病状、環境要因、医薬の種類、カクテルの構成物、副作用、又はそれらの組み合わせの関数として、前記得られた画像が前記非感染の組織又は器官から得られた標準画像に戻る率をモニターするステップとを含み、前記得られた画像が前記非感染の組織又は器官から得られた標準画像に戻れば、薬剤がＨＩＶ−１の治療に対して有効である示す方法を提供する。
ある実施形態では、ＨＩＶ−１などのウイルスの感染を動的に画像化できることは、リンパ器官、骨髄、中枢神経経（central nervous system：ＣＮＳ）、心臓及び腎臓の組織及び器官など（これらを、リアルタイム及びインビボの条件下で評価及び制御するのは、不可能ではないが非常に困難である）のウイルス・リザーバーを理解する及びターゲットにする上で重要な進歩である。
ある実施形態では、ウイルス・リザーバーは、ウイルスが潜伏感染した静止ＣＤ４＋Ｔ細胞のプールである。他の実施形態では、ウイルス・リザーバーは、ウイルス学的に静止しており、複数のスプライスされたＲＮＡ又はウイルス粒子を生成できない。他の実施形態では、低レベルのウイルスが複製を継続し、その結果、ウイルスの半減期が延長する。これらのウイルスには、幾つかの実施形態では、持続的に増殖するウイルス（replication-competent virus）、組み込まれていないプロウイルスＤＮＡ（unintegrated proviral DNA）（線形又は円形）、及び細胞内ＲＮＡ（cell-associated RNA）が含まれる。
ウイルス感染の検出のために使用されている従来の方法は、幾つかの実施形態では、ウイルスに特異的な抗体、又はウイルスの核酸若しくは遺伝子産物の生成に基づくものである。しかしながら、これらの方法を使用しても、感染の位置及び程度をリアルタイム及びインビボで評価することができない。ある実施形態では、ＨＩＶ−１が通常、細胞に感染することを考慮して、本明細書では、ウイルス感染の存在及び重症度を検出するために、ウイルスの感染及び増殖の影響に関連する細胞代謝の変化の利用について説明する。
したがって、本発明のこの態様及びある実施形態では、本発明は、対象におけるウイルス感染を検出するための方法であって、前記対象から生体サンプルを得るステップと、ホスホジエステル（phosphodiester：ＰＤＥ）及びホスホモノエステル（phosphomonoester：ＰＭＥ）の濃度に関して前記生体サンプルを分析するステップと、前記濃度から、ホスホジエステル（ＰＤＥ）／ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の観察比を計算するステップと、前記観察比を標準の比と比較するステップとを含み、前記ＰＤＥ／ＰＭＥの比の減少が前記対象におけるウイルス感染を示す方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、対象におけるＨＩＶ感染を検出するための方法であって、前記対象から生体サンプルを得るステップと、ホスホジエステル（ＰＤＥ）及びホスホモノエステル（ＰＭＥ）の濃度に関して前記生体サンプルを分析するステップと、前記濃度から、ホスホジエステル（ＰＤＥ）／ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の観察比を計算するステップと、前記観察比を標準の比と比較するステップとを含む方法を提供する。
ある実施形態では、本明細書に記載されている方法によって検出されるウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ヒトＣ型肝炎ウイルス（hepatitis C virus：ＨＣＶ）感染、ポリオウイルス感染、西ナイルウイルス感染、口蹄疫ウイルス感染、又はそれらの組み合わせである。
ある実施形態では、ＲＮＡウイルスは、デノボ合成でＲＮＡ合成を開始する。この機構には、ポリメラーゼの活性部位、ヌクレオチジル転移（nucleotidyl transfer）のために３´ヒドロキシルを第２のヌクレオシド三リン酸（nucleoside triphosphate：ＮＴＰ）に提供する開始ヌクレオチド（ＮＴＰｉ）、及び鋳型開始部位が関わる。ＮＴＰｉは、ポリメラーゼのｉ部位に結合し、Ｔ１と塩基対合する。第２のＮＴＰは、ｉ＋１部位に結合し、Ｔ２と塩基対合する。第一のホスホジエステル結合形成の後には、ポリメラーゼ又は鋳型が位置を変え、次のヌクレオチドを組み込むためにｉ＋１部位が使用される。新生ＲＮＡには、５´キャップ付加などの他の機構が行われる。デノボ合成は、様々なＲＮＡウイルス（ある実施形態ではプラス鎖ＲＮＡ、マイナス鎖ＲＮＡ、及びアンビセンス鎖ＲＮＡのゲノムを有するウイルスなど）に利用されている。これらのウイルスには、ある実施形態では、二重鎖ＲＮＡウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、プラス鎖アルファ様ウイルス、又はそれらの組み合わせが含まれる。ある実施形態では、デノボ合成を開始するウイルスが感染すると、ホスホジエステルの合成が発生し、それによって、ＰＤＥとＰＭＥとの間の比が増加し、本明細書に記載されている方法によって検出されるようになる。
他の実施形態では、ＨＩＶに感染した細胞の過塩素酸抽出液におけるホスホジエステル（ＰＤＥ）の濃度のホスホモノエステル（ＰＭＥ）の濃度に対する比は、３１Ｐ−ＮＭＲ分光法又は他の実施形態で他の任意の分析法で測定すると（ＰＤＥ／ＰＭＥ＝０．３９）、感染していない細胞（ＰＤＥ／ＰＭＥ＝０．９５）よりも４１％低い（図３Ａ及びＢ）。ＰＤＥ／ＰＭＥの濃度における差の測定は比較的簡単であり、ある実施形態では、ＨＩＶ感染の存在及び程度を説明する分析基準として使用するのに有意義である。本明細書に記載されている実施形態に開示されている方法は、低費用及び大規模で行うのに実用的であり、且つＨＩＶをインビボで画像検出するのに大きな可能性を秘めた高信頼度の特異的高感度分析法を提供する。
ある実施形態では、本明細書に記載されている様々な細胞代謝産物及び標識物の濃度は、１００万分の１（parts-per-million：ｐｐｍ）で測定されている。このｐｐｍは、細胞標識物又は代謝産物の濃度を測定するのに使用される分光学的な方法で得られる曲線下面積（area under the curve：ＡＵＣ）を計算することで求めることができる。曲線下面積は、所定の代謝産物の実変数に関する連続及び正の実数関数ｆの左の端点ａ（測定されたピークとその左側のピークとの間の変曲点と定義される）と端点ｂ（測定されたピークとその右側のピークとの間の変曲点と定義される）との間の積分値である。この積分値は、ｘ＝ａ、ｘ＝ｂ、ｘ軸、及びｆのグラフの曲線で囲まれた面積を表す。
本明細書に記載されている方法に使用される生体サンプルにおけるＰＤＥ／ＰＭＥの比は、非感染の生体サンプルのものよりも他の実施形態では約２０〜９５％、他の実施形態では約２５〜７５％、他の実施形態では約３５〜６５％、他の実施形態では約４０〜５５％、又は他の実施形態では約４０〜４５％低い。
ある実施形態では、感染した生体サンプルにおけるＰＤＥ／ＰＭＥの比は、使用される検出方法、検出しようとする感染を引き起こしたウイルスの種類、及び感染の程度に依存する。当業者は、感染した生体サンプルのＰＤＥ／ＰＭＥの比と非感染対照のＰＤＥ／ＰＭＥの比との間の差がウイルス感染の存在及び重症度を決定するものであると分かるであろう。したがって、感染した生体サンプルのＰＤＥ／ＰＭＥの比は、ある実施形態では約０．７〜０．３の間、他の実施形態では約０．７〜０．２の間、他の実施形態では約０．６〜０．３の間、他の実施形態では約０．５〜０．４の間、又は他の実施形態では約０．４〜０．３の間である。
ＮＭＲ分光法は、ある実施形態では虚血、他の実施形態では認知症、他の実施形態では脳障害、他の実施形態ではてんかん、他の実施形態では脳以外の部位に位置する悪性疾患、他の実施形態では多発性硬化症、他の実施形態では心筋虚血、他の実施形態ではパーキンソン病、他の実施形態では精神疾患、又は他の実施形態では炎症に激しく影響されている哺乳類細胞（他の実施形態では心筋細胞、又は他の実施形態では腎臓上皮細胞など）における機能変化を評価するために使用される。ある実施形態では、３１Ｐ−ＮＭＲにより、細胞内代謝産物の濃度における変化の相互関係、又は他の実施形態では、哺乳類細胞の機能のかぎとなる生体エネルギーのパラメータの相互関係相互関係が判明する。これらには、ある実施形態ではクレアチンリン酸（phosphocreatine：ＰＣｒ）、他の実施形態ではアデノシン三リン酸（adenosinetriphosphate：ＡＴＰ）、又は他の実施形態では無機リン酸（Ｐｉ）が含まれる。ある実施形態では、３１Ｐ−ＮＭＲ分光法は非侵襲性であるが、この技術の感度は比較的低く、これは、他の実施形態では、大きな不都合となる。感度の低さの一因となる要因は、幾つか存在する。それらの例として、ある実施形態では原子核の極性形成、他の実施形態では濃度、他の実施形態では二重層膜における原子の限られた回転、他の実施形態では常磁性イオンとの相互作用、他の実施形態では観察チャンバ内における細胞の限られた生存性、又は他の実施形態ではこれらの要因の組み合わせがある。
他の実施形態では、ＰＤＥ／ＰＭＥの比は、１Ｈ又は１３Ｃの磁気共鳴分光法（magnetic resonance spectroscopy：ＭＲＳ）を使用することで測定される。他の実施形態では、ＰＤＥ／ＰＭＥの比は、３１Ｐ、１Ｈ、又は１３Ｃアイソトープの何れか又は全てを使用することで測定され、それによって、本明細書に記載されている方法の感度が上昇する。
磁気共鳴映像法（magnetic resonance imaging：ＭＲＩ）は、ある実施形態では、無線周波数電磁界と体内の特定の原子核との間の相互作用に基づく多断面画像化（multiplanar imaging）法を意味する。ある実施形態では、異なる分子が磁気刺激を受けると、それらの分子は、異なる振動数で振動するようになる。ＭＲＩでこれらの振動数を検出することができるので、したがって、測定している成分を検出することができる。他の実施形態では、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）には、異なる化学構造体に存在する原子核が隣接する化学構造体及びこれらの様々な化学構造体の間の相互作用に応じて異なる特有の共鳴パターンを有するという原理が利用されている。ＭＲＳによって研究対象の組織の化学構成物を検出することができ、関連ソフトウェアを使用して検出された様々な化学物質に対応するピークを有する波形を表示することができる。ある実施形態では、ＭＲＳは、組織及び器官の構造の撮像並びに解剖学的な撮像とは対照的に、分子プロセスを可視化することができる。他の実施形態では、ＭＲＳにより、ウイルス感染及びその後のＰＤＥ／ＰＭＥの比における変化などの細胞プロセスに関する直接の生化学情報を得ることができる。
３１Ｐ−ＮＭＲ分光法の限界を改善するために、ある実施形態では、生きた細胞の代わりに細胞の過塩素酸（perchioric acid：ＰＣＡ）抽出液が分析に使用される。他の実施形態では、ＰＣＡ抽出液は、細胞の細胞質構成物を保持することができる。また、ＰＣＡ抽出液は同質であるので、スペクトル分解が向上し、感度が著しく増大する。ある実施形態では、この抽出液により、常磁性不純物を除去することができる。また、他の実施形態では、ｐＨが調整された抽出液は、ＮＭＲの結果を得るまでの長い間でさえ、安定している。他の実施形態では、ＰＣＡ抽出液は、ＨＩＶ−１に感染した細胞のＮＭＲ分析のスターティング・ポイントとして使用される。ある実施形態では、細胞代謝産物における変化は、ＨＩＶ−１感染の、信頼できる高感度の診断的標識となる。
他の実施形態では、ＨＩＶ−１に感染した細胞と非感染の細胞との間の３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルの低磁場部分には著しい違いがある。ＨＩＶ−１に感染した細胞は、ある実施形態では、ＰＤＥのＰＭＥに対する比において２〜２．５倍の減少を示す。ある実施形態では、この違いは、様々なヒト細胞系（ある実施形態ではＳｕｐＴ１、他の実施形態ではＣＥＭ、他の実施形態ではＵ８７、又は他の実施形態ではＭＡＧＩである）から得られたＮＭＲスペクトルで観察された（ある実施形態ではＸ４−ＨＩＶ−１、又は他の実施形態ではＸ４／Ｒ５−トロピックＨＩＶ−１が使用された）。ＰＢＭＣがＨＩＶ−１に感染したところ（インビトロでＰＢＭＣを感染させた、又はＨＩＶ−１に感染した患者からＰＢＭＣを得た）、ある実施形態では、同様であるが、より小さな変化（０．４８２対０．２７０）が見られた。
ＮＭＲで検出できるＰＭＥ及びＰＤＥは、ある実施形態では、細胞膜の合成及び機能に関連する生化学又は生物物理学プロセスに関わる。ＰＭＥには、他の実施形態では、ホスホコリン（phosphocholine：ＰＣ）及びホスホエタノールアミン（phosphoethanolamine：ＰＥ）が含まれる。一方、他の実施形態では、ＰＤＥは、主にグリセロホスホリルコリン及びグリセロホスホリルエタノールアミンとして同定された。これらの代謝産物の存在は、ある実施形態では、リン脂質の異化作用（他の実施形態ではホスホリパーゼ、又は他の実施形態ではホスホジエステラーゼを伴う）によって制御される。ある実施形態では、ＰＣ及びＰＥは、それぞれホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの前駆体である。
ある実施形態では、ウイルス感染は、レンチウイルスの感染である。レンチウイルスの群は、「霊長類に感染するもの」と「非霊長類に感染するもの」とに分けることができる。ある実施形態では、霊長類のレンチウイルスとして、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（simian immunodeficiency virus：ＳＩＶ）がある。非霊長類のレンチウイルス群には、他の実施形態では、「スローウイルス」の原型であるビスナ／マエディ・ウイルス（visna/maedi virus：ＶＭＶ）、並びに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス（caprine arthritis-encephalitis virus：ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（equine infectious anaemia virus：ＥＩＡＶ）、猫免疫不全ウイルス（feline immunodeficiency virus：ＦＩＶ）、及びウシ免疫不全ウイルス（bovine immunodeficiency virus：ＢＩＶ）が含まれる。
レンチウイルスであるＨＩＶ−１は、ある実施形態では、脂質の二重層に包まれたＲＮＡゲノムを有する。ある実施形態におけるＨＩＶ−１の侵入、及び他の実施形態におけるＨＩＶ−１の増殖は、ウイルスが外側の細胞膜に融合することによって起きる。増殖のときにＨＩＶ−１粒子が出芽すると、他の実施形態では、細胞膜の構成が変わる。これは、他の実施形態ではプラス鎖ＲＮＡウイルス感染の一部、他の実施形態ではヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、他の実施形態ではポリオウイルス感染、他の実施形態では西ナイルウイルス感染、又は他の実施形態では口蹄疫ウイルス感染に見られる。ある実施形態では、細胞膜のトリグリセリド・プールの１Ｈ−ＮＭＲ信号で示される細胞マクロ分子構成における変化は、ＨＩＶ−１に感染した後の初期段階（３０分〜８日）のＣＤ４＋リンパ芽球様細胞で観察される。この場合、ＨＩＶ−１に感染したリンパ芽球様細胞及び前単球細胞の陽子スペクトルでは、脂質シグナルの強度はより低いものであった。
したがって、本発明のこの態様及びある実施形態では、本発明は、対象におけるＨＩＶ感染を検出するための方法であって、前記対象から生体サンプルを得るステップと、ホスホジエステル（ＰＤＥ）及びホスホモノエステル（ＰＭＥ）の濃度に関して前記生体サンプルを分析するステップと、前記濃度から、ホスホジエステル（ＰＤＥ）／ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の観察比を計算するステップと、前記観察比を標準の比と比較するステップとを含み、前記生体サンプルは、ある実施形態では血清、他の実施形態では血漿、他の実施形態では唾液、他の実施形態では尿、他の実施形態で細胞溶解物、他の実施形態ではリンパ液、他の実施形態ではリンパ球、他の実施形態では末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、他の実施形態では胸腺細胞、又は他の実施形態ではそれらの組み合わせである方法を提供する。他の実施形態では、上記の生体液は、本明細書で説明する本発明に係る方法及び実施形態に使用される。
ある実施形態では、「溶解物」又は「血球溶解物（blood cell lysate）」という用語は、膜画分及び細胞小器官などの細胞残屑、並びに溶解（lysis）のプロセス（ある実施形態では酵素的、他の実施形態では化学的、又は他の実施形態では熱的）で生じる液体を意味する。
他の実施形態では、「末梢血単核球」又は「ＰＭＢＣ」は、ＨＩＶ血清反応性陰性のドナーのＰＢＭＣと患者の末梢血単核球（ある実施形態ではリンパ球、又は他の実施形態では単球である）とを共培養させたＨＩＶの定性培養液を意味する。
ある実施形態では、感染した生体サンプルのＰＤＥ／ＰＭＥの比は、非感染対照（他の実施形態では、ウイルス感染の分析において血清反応陰性を示す対象から得られる）と比較される。「血清反応陰性」という用語は、特定の種類の抗体を有さない血清を意味する。前記用語は、他の実施形態では特定の病原体（ある実施形態では、ＨＩＶ−１ウイルスなど）に感染していなこと、他の実施形態では疾患の治療後に抗体が消失したこと、又は他の実施形態では任意の症候群（他の実施形態では、ＡＩＤＳなど）で通常見られる抗体が欠失していることを意味する。ある実施形態では、「対照」という用語は、感染していない対象若しくは対象のプール、ウイルスに対して血清反応陰性である対象若しくは対象のプール、感染後に治療が成功した対象若しくは対象のプール、少なくとも１年の期間でウイルスの痕跡を示さない対象若しくは対象のプール、又は他の実施形態では、ここに記載した対象若しくは対象のプールの組み合わせを意味する。
他の実施形態では、細胞標識の発現は、対照のものと比較される。前記細胞標識は、他の実施形態では、ＨＩＶ−１感染に対して血清反応陽性の対象から得られる。ある実施形態では、血清陽性という用語は、過去に感染したことがあることを示す血清型を意味する。ある実施形態では、本発明に係る方法に使用される細胞標識は、本明細書に記載されている。
ある実施形態では、本明細書に記載されている方法での比較のために使用される標準は、治療前の対象若しくは対象のプール、他の実施形態では治療後の対象若しくは対象のプール、又は他の実施形態では治療中の対象若しくは対象のプールから得られる。ある実施形態では、本明細書に記載されている方法で使用した細胞標識に関して得られた値と標準の値との間の差の程度を決定するための標準は、業界標準である。ある実施形態では、非感染のための業界標準は、比較のための標準対照として使用される。
ある実施形態では、「細胞標識」という用語は、検出可能及び／又は測定可能な細胞の任意のソマティック標識（somatic marker）又は遺伝子標識を意味する。標識に対応して結合するプローブを使用することで、選択された細胞標識に関して細胞が陽性又は陰性と判定することがある。さらに、本発明のある実施形態では、関心のある各標識の強度を定量及び／又は測定する。生物学的又は分子的な特徴の究明は、例えば増殖活性及び感染活性を評価するために抗体の抗原（例えば、受容体、細胞内タンパク質、及び／又はペプチド）への結合活性に基づいてマクロファージの特徴を明らかにすることを伴う場合がある。他の実施形態では、本明細書に記載されている方法に使用される細胞標識は、無機リン酸塩（Ｐｉ）、ホスホコリン（ＰＣ）、ホスホエタノールアミン（ＰＥ）、グリセロホスホリルコリン（glycerophosphorylcholine：ＧＰＣ）、及びグリセロホスホリルエタノールアミン（glycerophosphoryletlianolamjne：ＧＰＥ）である。これらの標識の存在は、ある実施形態では、リン脂質の異化経路（ホスホリパーゼ並びにホオスホジエステラーゼを伴う）によって制御される。ＰＣ及びＰＥは、それぞれホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの前駆体である。
「リンパ球」又は「Ｔ細胞」は、細胞性免疫の機構の一部分を成す、抗体を生成しないリンパ球である。Ｔ細胞は、ある実施形態では、骨髄から胸腺へ移動する未熟なリンパ球から発生する。胸腺では、この未熟なリンパ球が成熟プロセスを経る。成熟したリンパ球は、急激に分裂し、著しく増加する。成熟したＴ細胞は、特定の抗原を認識及び結合する能力に基づいて免疫胆当細胞になる。抗原が免疫胆当Ｔ細胞（immunocompetent cell）の表面受容体に結合すると、このリンパ球は活性化する。
ある実施形態では、患者の細胞がＨＩＶを含んでいると、ウイルス粒子は、培養液に放出され、宿主細胞に感染して増殖する。他の実施形態では、培養の様々な間隔において、ｐ２４Ａｇ（ＨＩＶのコアタンパク質）の存在を検査する。ある実施形態では、このｐ２４Ａｇは、ウイルス合成のピークを示す。他の実施形態では、陽性培養液の培養は、培養の任意の時点で終了させる。一方、ある実施形態では陰性培養液の培養、又は他の実施形態では未確定の培養液の培養は、２８〜３１日目までに終了させる。ある実施形態では、遺伝子型分析又は表現型分析の研究に陽性培養液からのウイルス分離体を使用する。他の実施形態では、プロウイルスのＤＮＡを分析するために、培養細胞を使用する。
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、ある実施形態ではＡＣＤで処理した血液、他の実施形態ではＥＤＴＡで処理した血液、他の実施形態ではヘパリンで抗凝固処理した全血、又は他の実施形態ではクエン酸で抗凝固処理した全血から得られる。ある実施形態では、分子的研究（ある実施形態における血漿ウイルス量など）にＥＤＴＡを使用する。ある実施形態では、得られたＰＭＢＣは、対象によって異なる。
ある実施形態では、本発明は、対象におけるＨＩＶ感染を検出するための方法であって、前記対象から生体サンプルを得るステップと、ホスホジエステル（ＰＤＥ）及びホスホモノエステル（ＰＭＥ）の濃度に関して前記生体サンプルを分析するステップと、前記濃度から、ホスホジエステル（ＰＤＥ）／ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の観察比を計算するステップとを含み、前記生体サンプルにおける前記ホスホジエステル（ＰＤＥ）／ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の観察比は、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、ＧＣ、ＭＳ、又は他の組み合わせを使用して分析される方法を提供する。
他の実施形態では、ＰＤＥ／ＰＭＥの比を求めるために、ＮＭＲよりも感度の高い他の技術（ある実施形態では高速液体クロマトグラフィー（high-performance liquid chromatography：ＨＰＬＣ）、又は他の実施形態では質量分析法（mass-spectrometry：ＭＳ）など）が使用される。ある実施形態では、液体クロマトグラフィー質量分析（liquid chromatography-mass spectrometry：ＬＣ−ＭＳ）が使用される。その場合、対象からのＰＭＢＣ（容量は既知である）におけるＰＤＥが分離され、質量分析計に直接導入されることによって、ＰＤＥ／ＰＭＥの比が求められる。ある実施形態では、本明細書に記載されているように生体液のサンプルを連続的に分析するために、サンプルの調製及び測定のプロセスは自動化されている。ＰＤＥ及びＰＭＥの２つの濃度の比は、他の実施形態では自己較正される、又は、他の実施形態では外部標準を必要としない、及びある実施形態では細胞感染を評価するために直接使用される。
ある実施形態では、非侵襲性であるＮＭＲでリン代謝産物を測定することによって、機能情報が得られる。また、他の実施形態では、リン代謝産物のＮＭＲ測定は、ＨＩＶ−１が誘発する疾患を定量化するために使用される。ある実施形態では、ＨＩＶ−１に感染した及び感染していない細胞の３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルの間に著しい及び再現可能な差が存在する。
ある実施形態では、感染していないＰＢＭＣサンプルのＰＤＥ／ＰＭＥの平均比は、０．４８２±０．０９４である（図６）。他の実施形態では、インビトロで感染したＰＢＭＣのＰＤＥ／ＰＭＥの平均比は、０．２０３±０．０７６であった。ある実施形態では、感染したサンプルのＰＤＥ／ＰＭＥの比は、非感染リンパ球のＰＤＥ／ＰＭＥの平均比である０．４８２よりも低かった。ある実施形態では、単離された感染型のＰＢＭＣの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルが示すＰＤＥ／ＰＭＥの平均比は０．２７０±０．０７であり、これは０．４８２を大きく下回る。
他の実施形態では、本発明は、対象におけるＨＩＶ感染を検出するための方法であって、前記対象から生体サンプルを得るステップと、ホスホジエステル（ＰＤＥ）の濃度及びホスホモノエステル（ＰＭＥ）の濃度に関して前記生体サンプルを分析するステップと、前記濃度から、ホスホジエステル（ＰＤＥ）／ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の観察比を計算するステップと、前記観察比を標準比と比較するステップを含み、前記観察比が０．４８２よりも低い場合は、前記対象がＨＩＶ−１に感染していることを示し、又は他の実施形態では、前記観察比が０．４８２よりも高い場合は、前記対象がＨＩＶ−１に感染していないことを示す方法を提供する。
他の実施形態では、インビトロにおいて３１Ｐ−ＮＭＲで測定した非感染細胞とＨＩＶ−１感染細胞との間の差は、ＨＩＶ−１のインビボ感染の信頼できる検出法としてこの測定法を利用できるほど十分に大きい。ある実施形態では、本明細書に記載されている本発明に係る方法で、単離された細胞集団における感染の程度をすぐに評価することができる。これは、ＮＭＲ、又はより感度が高く、時間効率の良いＨＰＬＣ若しくはＭＳ技術（これらは、簡単に自動化できる）を使用することによって達成することができる。ＮＭＲ分析が秘めている長期的な利点は、現在動的測定を行うことができない中枢神経系又は他の組織におけるＨＩＶ感染を非侵襲的にインビボで画像化する方法を開発できる点にある。ＨＩＶ−１感染をこのように画像化できることは、ある実施形態ではＨＩＶに感染した患者の診断、又は他の実施形態ではＨＩＶに感染した患者の治療への大きな前進である。
したがって、本発明のこの態様及びある実施形態では、本発明は、対象におけるＨＩＶ治療の効果を評価する方法であって、前記対象から生体サンプルを得るステップと、ホスホジエステル（ＰＤＥ）の濃度及びホスホモノエステル（ＰＭＥ）の濃度に関して前記生体サンプルを分析するステップと、前記濃度から、ホスホジエステル（ＰＤＥ）／ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の観察比を計算するステップと、ある実施形態では時間、他の実施形態では医薬の投与量、他の実施形態では既存の病状、他の実施形態では環境要因、他の実施形態では医薬の種類、他の実施形態ではカクテルの構成物、他の実施形態では副作用、又は他の実施形態ではそれらの組み合わせの関数として、前記観察比の減少率をモニターするステップとを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、対象におけるＨＩＶ治療の効果を評価する方法であって、前記対象から生体サンプルを得るステップと、ホスホジエステル（ＰＤＥ）の濃度及びホスホモノエステル（ＰＭＥ）の濃度に関して前記生体サンプルを分析するステップと、前記濃度から、ホスホジエステル（ＰＤＥ）／ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の観察比を計算するステップと、ある実施形態では時間、他の実施形態では医薬の投与量、他の実施形態では既存の病状、他の実施形態では環境要因、他の実施形態では医薬の種類、他の実施形態ではカクテルの構成物、他の実施形態では副作用、又は他の実施形態ではそれらの組み合わせの関数として、前記観察比の減少率をモニターするステップとを含み、有効な治療が、ある実施形態では、前記ＰＤＥ／ＰＭＥの観察比を約０．４８２未満に減少させる治療であると示す方法を提供する。
ある実施形態では、本発明は、ＨＩＶ−１治療のための薬剤の合理的な設計のための方法であって、候補の化合物を選択するステップと、感染した対象を前記候補の化合物に晒すステップと、前記感染した対象から生体サンプルを得るステップと、ホスホジエステル（ＰＤＥ）の濃度及びホスホモノエステル（ＰＭＥ）の濃度に関して前記生体サンプルを分析するステップと、前記濃度から、ホスホジエステル（ＰＤＥ）／ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の観察比を計算するステップと、ある実施形態では時間、他の実施形態では医薬の投与量、他の実施形態では既存の病状、他の実施形態では環境要因、又は他の実施形態ではそれらの組み合わせの関数として、前記観察比の減少率をモニターするステップとを含む方法を提供する。
ある実施形態では、コンピュータによる設計法によって、有用な薬剤となり得る構成物のパターンを、ランダムに化学的改変した実質的に無限数の可能なパターンからを選択するのではなく、合理的に化学的改変した有限数のパターンから選択することができる。それぞれの化学的改変には、さらなる化学ステップが必要である。この化学ステップで有限数の化合物を合成するのは無理ではないが、実際に全ての可能な改変パターンの化合物を合成する場合は困難であり得る。したがって、三次元構造解析及びコンピュータによる設計法によって、コンピュータのモニター画面にこれらの多くの化合物をすばやく表示することができ、様々な化合物を実際に合成せずにわずかな候補を決定することができる。
有用となり得る薬剤又はアンタゴニストを一旦同定した際、ある実施形態では、大抵の化学薬品会社（Merck、Glaxo Welcome、Bristol Meyers Squib、Monsanto/Searle、Eli Lilly、Novartis、及びPharmacia UpJohnなど）が市販する化学物質のライブラリーからそれを選択することができる。又は他の実施形態では、有用となり得る薬剤をデノボ合成することがある。１つの化合物又は比較的少ない複数の化合物のデノボ合成は、合理的な薬剤設計のための無理のない実験である。
生物活性のある物質をスクリーニングするための多くの合成化合物のコレクション及び混合物を利用可能にするハイスループット合成及びコンビナトリアル・ケミストリーが導入されたことによって、合理的薬物設計（ＲＤＤ）は一変した。このような大量の化合物の混合物及びプールは、バイオアッセイ及び分析をする科学者にとって大きな課題となる。分析の課題として、混合物からの有効成分の分離及びその構造の解明の２つのものがある。ＬＣ、ＨＰＬＣ、及びＣＥなどの様々な分離方法が使用されている。しかしながら、１つ以上の標的物質の混合物から生物学的活性のある成分をコンビナトリアル・ライブラリーで分離するには、複合体（通常は、非共有結合している）を選択し、それをリガンド及び標的物質に分離する方法を使用及び開発する必要がある。ある実施形態では、化合物の結合成分を選択的に分離及び分析するために、アフィニティー・カラム法が使用されることがある。
他の実施形態では、ＨＩＶ−１がサイトカイン及びサイトカイン・コレセプターの発現、又はそれらの機能を制御する能力は、本明細書に記載されている合理的薬物設計（ＲＤＤ）に利用される。ある実施形態では、ＲＤＤには、所望するタンパク質の構造を明らかにすること及び予想することだけでなく、標的タンパク質（ＨＩＶ−１のＥｎｖタンパク質など）と相互作用する薬剤物質の構造を制御及び予想することが含まれる。ある実施形態では、細胞代謝産物には、サイトカイン及びそれらのコレセプターが含まれる。
他の実施形態では、本発明は、感染した対象におけるＨＩＶ−１感染の重症度を分類する方法であって、前記対象から生体サンプルを得るステップと、前記生体サンプルにおけるホスホジエステル（ＰＤＥ）／ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の観察比を分析するステップと、前記観察比と標準比との間の差を計算するステップとを含む方法を提供する。ある実施形態では、前記標準比は、０．４８２であり、他の実施形態では、前記観察比と前記標準比との間の差が大きいほど、ＨＩＶ−１感染がより重症である。
ある実施形態では、本発明は、ＨＩＶ−１に感染した又は晒された個人におけるＨＩＶ−１感染位置を特定する方法であって、人間又は動物における活動性及び／又は非活動性ＨＩＶ感染の程度をインビボで画像化するステップと、所定の細胞代謝産物における変化（例えば、ホスホジエステル（ＰＤＥ）及び／又はホスホモノエステル（ＰＭＥ）の他の膜脂質に対する濃度）を第一の評価基準として使用し、前記対象の体全体又は特定の器官の磁気共鳴画像（ＭＲＩ）又は他の同様なスキャンを獲得するステップと、ホスホジエステル（ＰＤＥ）及び／又はホスホモノエステル（ＰＭＥ）の他の脂質に対する観察比を計算するステップと、前記観察比と非感染の組織の標準比との間の差を計算するステップとを含み、リン酸代謝における変化が大きいほど、前記感染がより重症であると示す方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ＨＩＶ−１に感染した又は晒された対象におけるＨＩＶ−１感染の重症度を分類する方法であって、人間又は動物の対象における活動性及び／又は非活動性ＨＩＶ感染の程度をインビボで画像化するステップと、所定の細胞代謝産物における変化（例えば、ホスホジエステル（ＰＤＥ）及び／又はホスホモノエステル（ＰＭＥ）の他の膜脂質に対する濃度）を第一の評価基準として使用し、前記対象の体全体又は特定の器官の磁気共鳴画像（ＭＲＩ）又は他の同様なスキャンを獲得するステップと、ホスホジエステル（ＰＤＥ）及び／又はホスホモノエステル（ＰＭＥ）の他の脂質に対する観察比を計算するステップと、前記観察比と非感染の組織の標準比との間の差を計算するステップとを含み、リン酸代謝における変化が大きいほど、前記感染がより重症であると示す方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ＨＩＶ−１治療のための薬剤の合理的な設計をする方法であって、候補の化合物を選択するステップと、前記候補の化合物に感染した対象を晒すステップと、所定の細胞代謝産物における変化（例えば、ホスホジエステル（ＰＤＥ）及び／又はホスホモノエステル（ＰＭＥ）の他の膜脂質に対する濃度）を第一の評価基準として使用し、体全体若しくは特定の器官のＭＲＩ又は他の同様なスキャンによってＨＩＶに感染した人間又は動物の対象における前記ＨＩＶ治療の有効性をインビボで画像化するステップと、ホスホジエステル（ＰＤＥ）及び／又はホスホモノエステル（ＰＭＥ）の他の脂質に対する観察比を計算するステップと、時間、医薬の投与量、既存の病状、環境要因、副作用、又はそれらの適切な組み合わせの関数として、観察された代謝変化が血清反応陰性の対象のリン脂質のレベルに戻る率をモニターするステップとを含み、ＨＩＶによって誘発されたリン脂質の代謝効果が減少した場合、治療が有効であると示す方法を提供する。
本明細書に記載されている「治療」は、ある実施形態では、（ｉ）感染又は再感染の防止（従来のワクチンの投与など）、又は（ｉｉ）症状を減少させること又は取り除くこと、及び（ｉｉｉ）問題のウイルスを実質的に又は完全に取り除くことを意味する。治療は、予防的（感染前）又は治療的（感染後）に行われ得る。
ある実施形態では、「約」という用語は、１〜２０％の範囲のずれを意味する。他の実施形態では、「約」という用語は、１〜１０％の範囲のずれを意味する。他の実施形態では、「約」という用語は、１〜５％の範囲のずれを意味する。他の実施形態では、「約」という用語は、５〜１０％の範囲のずれを意味する。他の実施形態では、「約」という用語は、１０〜２０％の範囲のずれを意味する。
「対象」という用語は、ある実施形態では、治療を必要とする哺乳動物（ヒトなど）、又はある疾患若しくはその続発症を患う傾向のある哺乳動物（ヒトなど）を意味する。対象には、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、マウス、及びヒトなどが含まれ得る。「対象」という用語は、全ての点において正常な個体を除外するものではない。
下記の実施例は、本発明の最良な実施形態をさらに説明するためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１：３１Ｐ−ＮＭＲ分光法を使用したＨＩＶ−１感染の検出
≪材料及び方法≫
＜細胞単離及び組織培養＞
［細胞系］ヒトリンパ球由来の細胞系であるＳｕｐＴ１及びＣＥＭは、１０％の新生仔ウシ血清（bovine calf serum：ＢＣＳ）（Hyclone, Logan, UT, USA）を添加したＲＰＭＩ培養液（GibcoBRL, Grand Island, NY）で培養した。Ｕ８７／ＣＤ４＋細胞は、１０％の新生仔ウシ血清（ＢＣＳ）及び０．２ｍｇ／ｍＬのジェニティシン（Gibco BRL）を添加したＤＭＥＭ培地（Gibco BRL）で培養した。ＭＡＧＩ／ＣＤ４＋細胞は、それぞれ０．１ｍｇ／ｍＬのジェニティシン及びハイグロマイシン（RocheBMB, Indianapolis, IN, USA）含有のＤＭＥＭ培地で培養した。
［ヒトリンパ球］非感染者からヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を「軟膜（buffy coat）」として得た。赤血球を分離するために、細胞を６％のHES（Hespan）（B.Braun Med.Inc.lrvine, CA, USA）内で堆積させた。次に、リンパ球を、Ficollで単離し、７５ｃｍ２の標準フラスコに（Falcon, BD, Franklin Lakes, NJ, USA）入れ、上記の添加物を含有するＲＰＭＩ培地で培養した。
１６人の対象者からＨＩＶ−１に感染したリンパ球を単離した。これらの人は、無症候性患者及びＡＩＤＳ患者から成り、過去にＨＩＶ−１感染のためのいかなる療法をも受けたことがない。また、これらのリンパ球提供者は１８〜５０歳の人に限定され、その内、男性は５０％であり、これらの男性の１００％は黒人であった。上記のFicollを使用した方法でこれらの患者から細胞を単離し、１０％ＤＭＳＯ及び９０％ＦＢＳの混合液で冷凍した。トリパンブルーで細胞の生存率を測定し、ＰＣＡで細胞を抽出した。５０％よりも高い生存率を示したサンプルのみを下記の研究に使用した。
［ヒト胸腺細胞］通常の胸部手術で得られた新生児（生後１日〜６ヶ月）の胸腺組織を３〜１０ｍｍの断片に切断し、０．１％のコラーゲナーゼ（Sigma, St.Louis, MO）と１０ＩＵ／ｍｌのＤＮＡａｓｅ（Sigma）溶液とを含有するDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate-Buffered Saline：ＰＢＳ）（塩化カルシウム及び塩化マグネシウムを含まない）（GibcoBRL, Gaithersburg, MD）にて２時間３７℃で消化した。次に、前記断片を１００μｍのナイロンの細胞ろ過器（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）に通し、洗浄した。Ficoll-Hypaque（Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden）で単核細胞を単離した。接着していない細胞（胸腺細胞）を、採取及び洗浄し、１０〜２０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と２ｍＭのグルタミンと１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンと１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンと０．２５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢとを含有するＲＰＭＩ培地（GibcoBRL）で培養した。
＜ＤＮＡ単離及びＰＣＲ＞
細胞は、抽出前に、２４個のウエルのプレートで培養した（３×１０４細胞／ウエル）。ＤＮＡを回収するために、培養液を除去した後のウエルの底に２０μｌのプロテイナーゼＫをピペットで注入した。次に、２００μｌのＰＢＳを細胞と混合し、２００μｌのリシス緩衝液を加えた。この混合物を、２時間６０℃で加熱不活性化した。次にサンプルを１５分間沸騰させ、Qiamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen, Valencia, CA）の血液及び体液プロトコルにしたがってＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡサンプルの１０μｌのアリコートをＰＣＲの鋳型として使用した。尚、ＰＣＲは、１×ＰＣＲ緩衝液、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１５ｍＭのｄＮＴＰ、１×Ｑ試薬、６μＭのＬＴＲ（末端反復配列）プラス・プライマー、及び６μＭのＬＴＲマイナス・プライマーを使用した条件下で行った。９７℃で１０分間変性させた後に、各サンプルに０．６μｌのＴａｑポリメラーゼを加え、ＰＣＲを行った。尚、ＰＣＲのサイクルパラメータは、９４℃が３０秒間、５５℃が２分間、及び７２℃が１分間であった。このサイクルを４２回行い、その後、伸長反応を７２℃で１０分間行い、４３０のベースペアの産物を得た。全てのＰＣＲ試薬は、Qiagen（Valencia, CA）から調達した。ＨＩＶ−１のプライマー配列（ＬＴＲ側）「５´−ＡＣＡＡＧＣＴＡＧＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣ−３´（配列認識番号１）」及びＨＩＶ−１プライマー配列「５´−ＣＡＣＡＣＡＣＴＡＣＴＴＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＡ−３´（配列認識番号２）」を調達した。反応産物の１０μｌを、１％のアガロース・ゲルで電気泳動させ、１０μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドで可視化した。
＜ＨＩＶ−１による感染＞
ヒト神経膠腫細胞（ＭＡＧＩ及びＵ８７）を、１週間培養し、その後、１０ｎｇ／ｍｌの８９．６又はＩＩＩＢウイルスと共に培養した。細胞を、ウイルスと共に１２時間培養した後にＰＢＳで５回洗浄し、１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地でさらに３〜５日間培養した。ＰＣＡで抽出する前に細胞をトリプシンで分離した。リンパ球は、５０ｎｇ／ｍｌのＩＩＩＢウイルスと共に１２時間培養した。次に、ウイルスを除去するために細胞を洗浄し、１４日間培養した。ウイルスの感染及び増殖を確認するために、ｐ２４をＥＬＩＳＡ法で分析した。Alliance HIV-1 p-24 ELISAキット（PerkinElmer, Boston, MA）を使用してｐ２４に対してＥＬＩＳＡ反応を行った。簡潔に説明すると、細胞培養液の上清、血清、又は細胞懸濁液を異なった希釈率で希釈し、TritonX-100を加えたＥＬＩＳＡプレート（９６ウエル）に入れ、２時間３７℃でインキュベートした。よく洗浄し、検出抗体を加えた後に、プレートをさらに１時間３７℃でインキュベートした。次に、実験サンプルを、ストレプトアビジン−ＨＲＰと共に３０分間室温でインキュベートし、ＯＰＤ基質の溶液で処理し、Plate Reader MRX Revelation（Dynex, Chantilly, VA）を用いて４９２ｎｍで吸光度を測定した。G4 MacintoshコンピュータでMicrosoft Excel 2000を使用して最終ウイルス濃度を求めた。
＜ＰＣＡ抽出、生細胞ＮＭＲ、ＮＭＲデータの収集及び処理＞
「NMR in Biomedicine 3: 220-226 (1990)」（Askenazy et al. Askenazy N., Kushnir N., Navon G., Kaplan 0）にしたがって、細胞のペレットを氷の上に置き、ＰＣＡで抽出した。次に、高真空ポンプに連結した標準Speedvacユニットを使用して、ＫＨＣＯ３で中和した抽出液を凍結乾燥した。凍結乾燥物を２ｍｌのＤ２Ｏに溶解した。１ｎのＨＣｌを使用してサンプルのｐＨを６．８に調整した。
生細胞（非感染及び１００％感染細胞）の３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルを得た。大きさにしたがって、１０６〜５×１０１０の細胞を使用した（各実験に）。測定された信号面積を、繰り返し時間の間の不完全な緩和に対して補正した。細胞は、４℃を超えない温度で扱った。冷却した細胞を１０ｍｍのテフロン（登録商標）ＮＭＲチューブ（Wilmad, Buena, NJ, USA）に入れ、チューブを密閉して氷上に置いた。次に、前記チューブをＮＭＲセンターに移し、１時間分析した。各実験の前後に細胞の生存率を測定した。全てのリン・スペクトルは、４℃で得られた。
重水素ロック及びプロトン・デカップリングと共に１０ｍｍのリンの選択プローブを使用し、Bruker AMX-500ＮＭＲ分光計においてリンの共振周波数である２０２．４６ＭＨｚで全てのスペクトルを得た。得られたスペクトルは、Brukerの標準ソフトウエア（XSATIN- NMR）で処理した。プロトン・デカップリングを行ったリンの標準１Ｄスペクトルは、２５度の取得パルス（acquisition pulse）及び０．１秒の緩和遅延（relaxation delay）によって得られた。サンプルの温度は、２９８Ｋに安定させた。得られたＦＩＤは、ガウス／指数関数による線幅拡大（Gaussian/exponential line broadening）（ＬＢ＝−２０Ｈｚ、ＧＢ＝０．０２Ｈｚ）で処理した。実験データにガウス／ローレンツ曲線をフィッティングさせた後に、ＰＭＥ及びＰＤＥの信号の面積を測定した。Hsiechら（Hsiech, P. S. & Balaban, R. 5. (1987) J. Magn. Reson. 74, 574-579）が提供した方程式、並びにOkunieffらのＰＭＥ及びＰＤＥのスピン格子緩和時間（Okunieff, P., Vaupel, P., Sedlacek, R. & Neuringer, L. J. (1989) mt. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 16, 1493- 1500）を使用することで、少量の信号飽和に対して値を補正した。
＜統計分析＞
算術平均、標準偏差、及びｐ２４のＥＬＩＳＡ計算は、G4 MacintoshコンピュータでMicrosoft Excel 2000を使用して行った。データは、対応のないサンプルに関してスチューデントｔ検定を使用することで分析した。尚、統計的有意性は、ｐ＜０．０５として定義した。
≪結果≫
ＨＩＶ−１に感染した細胞の３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルが非感染細胞のものと異なるかどうかを調べるために、インビトロでＨＩＶ−１に感染した細胞系を分析した。多くの株化された細胞系（Ｕ８７、ＭＡＧＩ、ＳｕｐＴ１、及びＣＥＭ）及び初代リンパ球（ＰＢＭＣ及び胸腺細胞）を、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ又は８９．６）と共に培養した（ＭＯＩ＝０．０１）。１２時間後に、ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡ分析でこれらの細胞の感染を確認した。図１Ａにこれらの細胞のＰＣＲ産物を示した。ＨＩＶ−１固有のＰＣＲ産物は、ＨＩＶ−１に晒された各細胞型から４７４ｂｐの配列として検出されたが、非感染の細胞からは検出されなかった。同様の細胞に行ったｐ２４ｇａｇタンパク質の発現に関するＥＬＩＳＡ分析の結果（図１Ｂ）は、これらの細胞がＨＩＶ−１に感染したことを裏付けるものである。
実験方法の説明で記載したように、ＰＣＡによる抽出の後に、感染細胞及び非感染細胞の３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルを分析した。感染ＰＢＭＣ及び非感染ＰＢＭＣ抽出物の全３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルを図２に示した。感染ヒト胸腺細胞及び非感染ヒト・リンパ球に関しても同様な結果が得られた（図６）。両方のＰＢＭＣ群は、比較的高いレベルのホスホモノエステル（ＰＭＥ）関連リン脂質を示した（ホスホコリン（δ＝４．８９ｐｐｍ）及びホスホエタノールアミン（δ＝５．０７ｐｐｍ）など）。ＰＭＥレベルの無機リン酸レベルに対する比は、両方のサンプルにおいて３：１であった。非感染細胞及び感染細胞の間で見られた最も大きな相違は、ホスホジエステル（ＰＤＥ）（主にホスホリルエタノールアミン及びホスホリルコリン）の領域（δ＝３．７ｐｐｍ）で見られた。感染細胞における、ホスホジエステル・レベルの無機リン酸レベルに対する比は、非感染細胞における前記比よりも約２倍低かった。
ＰＭＥ及びＰＤＥのピークをさらに際立たせるために、ガウス／ローレンツ指数関数線で関心領域（３．５〜５．５ｐｐｍ）を拡大した（図３）。スペクトルの全ての要素は、よく分解されており、標準Brukerソフトウエアを使用して曲線を積分することによって信号面積を容易に求めることができた。感染細胞でのＰＤＥのＰｉに対する比を計算したところ、０．７７であった。一方、非感染細胞における前記比は、１．５０であった。
ＰＤＥレベルをＰＭＥレベルと直接比較した方が、膜のリン脂質の構成に対するＨＩＶ−１感染の影響がさらに判明する。細胞系におけるＰＤＥ／ＰＭＥの比の分析結果を図４に示した。非感染細胞と比較して、ＨＩＶ−１に感染した細胞では、ＰＤＥ／ＰＭＥの比は２．１〜２．５倍減少した。
３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルの低磁場領域では、ＨＩＶ−１に感染した細胞及び非感染細胞の間に大きな違いが見られる。ＮＭＲで可視化できるＰＭＥ及びＰＤＥは、主に、細胞膜に関連する生化学的及び生物物理学的なプロセスに関わる。これらの結果から、ＨＩＶ−１感染によって膜のＰＤＥ及びＰＭＥの比が変化する（ウイルスの侵入、組み込み、及び／又は粒子合成のプロセスの間に）ことが分かる。したがって、ＰＤＥ／ＰＭＥの比によって、細胞におけるＨＩＶ−１の存在を予想することができる。図４の結果から、異なる種類の細胞間でＰＤＥ／ＰＭＥの比が多少異なることが分かる。したがって、初代リンパ球のＰＤＥ／ＰＭＥ比のベースライン・コントロールを確立するために、最初に複数の非感染ＰＢＭＣに対してＮＭＲ分析を行った。
図５に示されているように、１３個の非感染ＰＢＭＣにおけるＰＤＥ／ＰＭＥの平均比は、０．４８２±０．０９４であった。次に、この結果を、インビトロでＨＩＶ−１のＩＩＩＢに感染した１３個のＰＢＭＣのＰＤＥ／ＰＭＥ比と比較した。インビトロで感染した１３個のＰＢＭＣにおけるＰＤＥ／ＰＭＥの平均比は、０．２０３±０．０７６であり、非感染リンパ球におけＰＤＥ／ＰＭＥの平均比である０．４８２よりも低かった。尚、非感染ＰＢＭＣの１つのサンプルのみが０．２０３よりも低いＰＤＥ／ＰＭＥ比を示した。ＰＤＥ／ＰＭＥの比の減少がＨＩＶ−１血清反応陽性患者から得られたリンパ球の分析でも観察されるかを確認するために、６人の患者から単離したＰＢＭＣにおける３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルを分析した。これらの６個のサンプルにおけるＰＤＥ／ＰＭＥの平均比は、０．２７０±０．０７であり、同様に０．４８２よりも低かった。
以上、本発明の最良の実施形態を説明したが、これらの実施形態は本発明を制限するものではない。当業者ならば、添付の特許請求の範囲に規定された本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修正を行うことが可能であることを理解するであろう。
Claims (42)
- 対象におけるウイルス感染を検出する方法であって、
生体サンプルを得るステップと、
所定の細胞代謝産物における変化に関して前記生体サンプルを分析するステップと、
前記変化を定量化するステップと、
前記定量化した変化を、標準の代謝産物レベルと比較するステップとを含み、
前記所定の細胞代謝産物のレベルが前記標準の代謝産物レベルに対して変化している場合は、前記対象がウイルスに感染していると示すものとすることを特徴とする方法。 - 請求項１に記載の方法であって、
前記所定の細胞代謝産物のレベルは、前記得られた生体サンプルの無機リン酸（Ｐｉ）の濃度、前記得られた生体サンプルのホスホジエステル（ＰＤＥ）の濃度、前記得られた生体サンプルのホスホモノエステル（ＰＭＥ）の濃度、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする方法。 - 請求項２に記載の方法であって、
前記定量化するステップは、前記濃度からホスホジエステル（ＰＤＥ）／ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の比を求めるステップと、前記比を、非感染対象におけるＰＤＥ／ＰＭＥの比と比較するステップとを含むことを特徴とする方法。 - 請求項１に記載の方法であって、
前記生体サンプルは、血清、血漿、唾液、尿、血球細胞の溶解物、リンパ液、リンパ球、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、胸腺細胞、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする方法。 - 請求項３に記載の方法であって、
前記生体サンプルにおける前記ホスホジエステル（ＰＤＥ）／ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の比は、ＭＲＩ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＮＭＲ，ＨＰＬＣ、ＧＣ、ＭＳ、又はそれらの組み合わせによって分析されることを特徴とする方法。 - 請求項１に記載の方法であって、
前記感染を引き起こすウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ポリオウイルス、西ナイルウイルス、又は口蹄疫ウイルスであることを特徴とする方法。 - 請求項３に記載の方法であって、
前記求められたＰＤＥ／ＰＭＥの濃度の比が約０．４８２よりも低い場合は、前記対象がＨＩＶ−１に感染していると示すものとすることを特徴とする方法。 - 請求項３に記載の方法であって、
前記求められたＰＤＥ／ＰＭＥの濃度の比が約０．４８２よりも高い場合は、前記対象がＨＩＶ−１に感染していないと示すものとすることを特徴とする方法。 - 対象に対する抗ウイルス治療の有効性を評価する方法であって、
前記対象から生体サンプルを得るステップと、
所定の細胞代謝産物のレベルにおける変化に関して前記生体サンプルを分析するステップと、
前記変化を定量化するステップと、
前記定量化した変化を、標準の代謝産物レベルと比較するステップと、
前記所定の細胞代謝産物のレベルが前記標準の代謝産物レベルに戻る率をモニターするステップとを含み、
前記細胞代謝産物の変化したレベルが前記標準の代謝産物レベルに速く戻るほど、前記治療がより有効であると示すものとすることを特徴とする方法。 - 請求項９に記載の方法であって、
前記所定の細胞代謝産物のレベルは、無機リン酸（Ｐｉ）の濃度、ホスホジエステル（ＰＤＥ）の濃度、ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の濃度、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする方法。 - 請求項１０に記載の方法であって、
前記定量化するステップは、前記濃度からホスホジエステル（ＰＤＥ）／ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の比を計算するステップを含むことを特徴とする方法。 - 請求項１０に記載の方法であって、
前記比較するステップは、血清反応陰性の対象のＰＤＥ／ＰＭＥの濃度比と比較するステップを含み、
前記ＰＤＥ／ＰＭＥの比における減少が、前記治療が有効であることを示すものとすることを特徴とする方法。 - 請求項９に記載の方法であって、
前記生体サンプルは、血清、血漿、唾液、尿、血球細胞の溶解物、リンパ液、リンパ球、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、胸腺細胞、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする方法。 - 請求項９に記載の方法であって、
前記抗ウイルス治療の対象となるウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、ポリオウイルス感染、西ナイルウイルス感染、又は口蹄疫ウイルス感染であることを特徴とする方法。 - 請求項１４に記載の方法であって、
前記抗ウイルス治療の対象となるウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染であることを特徴とする方法。 - 請求項１５に記載の方法であって、
有効な治療が、観察された前記ホスホジエステル／ホスホモノエステルの比を０．４８２よりも低くする治療であることを特徴とする方法。 - 請求項９に記載の方法であって、
前記モニターするステップは、時間、医薬の投与量、既存の病状、環境要因、医薬の種類、カクテルの構成、副作用、又はそれらの組み合わせを関数として行われることを特徴とする方法。 - ＨＩＶ−１治療のための薬剤をスクリーニングする方法であって、
候補の化合物を選択するステップと、
感染した対象を、前記候補の化合物に晒すステップと、
前記感染した対象から生体サンプルを得るステップと、
所定の細胞代謝産物のレベルにおける変化に関して前記生体サンプルを分析するステップと、
前記変化を定量化するステップと、
前記定量化した変化を、標準の代謝産物レベルと比較するステップと、
前記所定の細胞代謝産物のレベルが前記標準の代謝産物レベルに戻る率をモニターするステップとを含み、
前記細胞代謝産物の変化したレベルが前記標準の代謝産物レベルに戻れば、前記薬剤がより有効であると示すものとすることを特徴とする方法。 - 請求項１８に記載の方法であって、
前記所定の細胞代謝産物のレベルは、無機リン酸（Ｐｉ）の濃度、ホスホジエステル（ＰＤＥ）の濃度、ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の濃度、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする方法。 - 請求項１９に記載の方法であって、
前記定量化するステップは、前記濃度からホスホジエステル（ＰＤＥ）／ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の比を計算するステップと、時間、医薬の投与量、既存の病状、環境要因、副作用、又はそれらの最適な組み合わせを関数として、観察された前記比の減少率をモニターするステップとを含むことを特徴とする方法。 - 請求項１９に記載の方法であって、
前記比較するステップは、血清反応陰性の対象のＰＤＥ／ＰＭＥの濃度比と比較するステップを含み、
前記ＰＤＥ／ＰＭＥの比における減少が、前記治療が有効であることを示すものとすることを特徴とする方法。 - 請求項１８に記載の方法であって、
前記生体サンプルは、血清、血漿、唾液、尿、血球細胞の溶解物、リンパ液、リンパ球、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、胸腺細胞、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする方法。 - ＨＩＶ−１感染の治療のための構成物であって、
請求項１８に記載の方法によって同定された薬剤を含むことを特徴とする構成物。 - 感染した対象におけるウイルス感染の重症度を分類する方法であって、
前記対象から生体サンプルを得るステップと、
所定の細胞代謝産物における変化に関して前記生体サンプルを分析するステップと、
前記変化を定量化するステップと、
前記定量化した変化を、標準の代謝産物レベルと比較するステップと、
前記細胞代謝産物の変化したレベルと標準レベルとの間の差を計算するステップとを含み、
前記細胞代謝産物のレベルと標準レベルとの間の差が大きいほど、前記感染がより重症であると示すものとすることを特徴とする方法。 - 請求項２４に記載の方法であって、
前記所定の細胞代謝産物のレベルは、無機リン酸（Ｐｉ）の濃度、ホスホジエステル（ＰＤＥ）の濃度、ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の濃度、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする方法。 - 請求項２５に記載の方法であって、
前記定量化するステップは、前記濃度からホスホジエステル（ＰＤＥ）／ホスホモノエステル（ＰＭＥ）の比を計算するステップを含むことを特徴とする方法。 - 請求項２５に記載の方法であって、
前記比較するステップは、血清反応陰性の対象のＰＤＥ／ＰＭＥの濃度比と比較するステップを含むことを特徴とする方法。 - 請求項２４に記載の方法であって、
前記生体サンプルは、血清、血漿、唾液、尿、血球細胞の溶解物、リンパ液、リンパ球、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、胸腺細胞、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする方法。 - 請求項２４に記載の方法であって、
前記重症度が分類されるウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、ポリオウイルス感染、西ナイルウイルス感染、又は口蹄疫ウイルス感染であることを特徴とする方法。 - 請求項２９に記載の方法であって、
治療される前記ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染であることを特徴とする方法。 - 請求項３０に記載の方法であって、
前記標準比は、約０．４８２であることを特徴とする方法。 - 対象におけるＨＩＶ感染をインビボで画像化する方法であって、
所定の細胞代謝産物における変化を第一の評価基準として使用し、前記対象から電磁画像を得るステップと、
前記得られた画像と、同様の画像化方法で非感染対象から得られた標準画像との間の差を計算するステップとを含み、
前記得られた画像と前記非感染対象から得られた標準画像との間の差が大きいほど、その位置における感染はより重症であると示す方法。 - 請求項３１に記載の方法であって、
前記所定の細胞代謝産物は、無機リン酸（Ｐｉ）、ホスホジエステル（ＰＤＥ）、ホスホモノエステル（ＰＭＥ）、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする方法。 - 請求項３２に記載の方法であって、
感染の程度、位置、又はそれらの組み合わせを診断するために使用されることを特徴とする方法。 - 請求項３２に記載の方法であって、
前記電磁画像は、ＭＲＩ、ＭＲＳ、又はそれらの組み合わせを使用して得られることを特徴とする方法。 - 請求項３５に記載の方法であって、
前記得られた画像は、前記対象の体全体の画像、前記対象の組織の画像、前記器官の組織の画像、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする方法。 - ＨＩＶ−１治療のための薬剤の合理的な設計の方法であって、
候補の化合物を選択するステップと、
感染した器官又は組織を前記候補の化合物に晒すステップと、
所定の細胞代謝産物における変化を第一の評価基準として使用し、対象から電磁画像を得るステップと、
前記得られた画像と、同様の画像化方法で非感染対象から得られた標準画像との間の差を計算するステップと、
前記得られた画像が前記非感染器官又は組織から得られた標準画像に戻る率をモニターするステップとを含み、
前記得られた画像が前記非感染器官又は組織から得られた標準画像に戻れば、前記薬剤がＨＩＶ−１治療に有効であると示すものとすることを特徴とする方法。 - 対象に対するＨＩＶ治療のための構成物であって、
請求項３７に記載の方法によって同定された薬剤を含むことを特徴とする構成物。 - 請求項３７に記載の方法であって、
前記所定の細胞代謝産物は、無機リン酸（Ｐｉ）、ホスホジエステル（ＰＤＥ）、ホスホモノエステル（ＰＭＥ）、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする方法。 - 請求項３７に記載の方法であって、
前記モニターするステップは、時間、医薬の投与量、既存の病状、環境要因、医薬の種類、カクテルの構成、副作用、又はそれらの組み合わせを関数として行われることを特徴とする方法。 - 請求項３７に記載の方法であって、
前記電磁画像は、ＭＲＩ、ＭＲＳ、又はそれらの組み合わせを使用して得られることを特徴とする方法。 - 請求項３７に記載の方法であって、
前記得られた画像は、前記対象の体全体の画像、前記対象の組織の画像、前記対象の器官の画像、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US69049105P | 2005-06-15 | 2005-06-15 | |
| US69048905P | 2005-06-15 | 2005-06-15 | |
| PCT/US2006/023346 WO2006138481A2 (en) | 2005-06-15 | 2006-06-15 | Detection of hiv-1 infection |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008547004A true JP2008547004A (ja) | 2008-12-25 |
Family
ID=37571175
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008517110A Pending JP2008547004A (ja) | 2005-06-15 | 2006-06-15 | Ｈｉｖ−１感染の検出 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8455227B2 (ja) |
| EP (1) | EP1893778A4 (ja) |
| JP (1) | JP2008547004A (ja) |
| CA (1) | CA2612340A1 (ja) |
| WO (1) | WO2006138481A2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103091270B (zh) * | 2013-01-17 | 2015-09-09 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种亚洲ⅰ型口蹄疫146s抗原定量elisa检测方法及其试剂盒和应用 |
| CN103091490B (zh) * | 2013-01-17 | 2016-01-20 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种a型口蹄疫146s抗原定量elisa检测方法及其试剂盒和应用 |
| US20160223569A1 (en) * | 2013-09-24 | 2016-08-04 | Drexel University | Novel non-invasive methods of monitoring hiv viral loads |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002511763A (ja) * | 1997-07-02 | 2002-04-16 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | フラビビリデ科のウイルス由来のＡＴＰａｓｅタンパク質を用いるスクリーニング法 |
| JP2002372527A (ja) * | 2001-06-13 | 2002-12-26 | Fujirebio Inc | 経血又は膣分泌物採取器具、キット及び方法 |
-
2006
- 2006-06-15 US US11/922,404 patent/US8455227B2/en active Active
- 2006-06-15 JP JP2008517110A patent/JP2008547004A/ja active Pending
- 2006-06-15 WO PCT/US2006/023346 patent/WO2006138481A2/en active Application Filing
- 2006-06-15 CA CA002612340A patent/CA2612340A1/en not_active Abandoned
- 2006-06-15 EP EP06784934A patent/EP1893778A4/en not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002511763A (ja) * | 1997-07-02 | 2002-04-16 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | フラビビリデ科のウイルス由来のＡＴＰａｓｅタンパク質を用いるスクリーニング法 |
| JP2002372527A (ja) * | 2001-06-13 | 2002-12-26 | Fujirebio Inc | 経血又は膣分泌物採取器具、キット及び方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20100034747A1 (en) | 2010-02-11 |
| EP1893778A4 (en) | 2010-05-05 |
| WO2006138481A2 (en) | 2006-12-28 |
| CA2612340A1 (en) | 2006-12-28 |
| WO2006138481A3 (en) | 2009-04-30 |
| EP1893778A2 (en) | 2008-03-05 |
| US8455227B2 (en) | 2013-06-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Peng et al. | Broad and strong memory CD4+ and CD8+ T cells induced by SARS-CoV-2 in UK convalescent individuals following COVID-19 | |
| Zhang et al. | Azvudine is a thymus-homing anti-SARS-CoV-2 drug effective in treating COVID-19 patients | |
| Jiang et al. | Glutamate is a mediator of neurotoxicity in secretions of activated HIV-1-infected macrophages | |
| ES2321809T3 (es) | Establecimiento de valores e corte biologicos para predecir la resistencia a la terapia. | |
| Ghosh et al. | Metabolomic changes in vertebrate host during malaria disease progression | |
| McLEOD et al. | Didanosine and zidovudine resistance patterns in clinical isolates of human immunodeficiency virus type 1 as determined by a replication endpoint concentration assay | |
| Robbins et al. | A novel ultrasensitive LC–MS/MS assay for quantification of intracellular raltegravir in human cell extracts | |
| Reynolds et al. | Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC) | |
| JP2008547004A (ja) | Ｈｉｖ−１感染の検出 | |
| Koçer1ABCDEFG et al. | C-reactive protein is an indicator for fatal outcomes in first-time stroke patients | |
| Schüpbach et al. | HIV-1 p24 antigen is a significant inverse correlate of CD4 T-cell change in patients with suppressed viremia under long-term antiretroviral therapy | |
| Ivens et al. | Development of a homogeneous screening assay for automated detection of antiviral agents active against severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus | |
| Mothapo et al. | Amyloid beta-42 (Aβ-42), neprilysin and cytokine levels. A pilot study in patients with HIV related cognitive impairments | |
| Lu et al. | Automatic quantitation of HIV-1 mediated cell-to-cell fusion with a digital image analysis system (DIAS): application for rapid screening of HIV-1 fusion inhibitors | |
| Radzol et al. | Nonstructural protein 1 characteristic peak from NS1-saliva mixture with surface-enhanced Raman spectroscopy | |
| Rasheed et al. | Possible biomarkers for the early detection of HIV-associated heart diseases: a proteomics and bioinformatics prediction | |
| ES2435040T3 (es) | Procedimiento para la evaluación in vitro del estado de progresión de una infección por un virus del VIH en un individuo | |
| Willetts et al. | Eosinophil shape change and secretion | |
| Reynolds et al. | Heroin-induces differential protein expression by normal human astrocytes (NHA) | |
| Mora-Peris et al. | HIV-1 CNS in vitro infectivity models based on clinical CSF samples | |
| JP2010017130A (ja) | 自己免疫疾患の病因細胞の分離方法および自己免疫疾患の診断補助方法 | |
| RU2486520C1 (ru) | Способ экспресс-диагностики антигенов энтеровирусов в цереброспинальной жидкости | |
| Reynolds et al. | Modulation of the proteome of peripheral blood mononuclear cells from HIV-1-infected patients by drugs of abuse | |
| Krentz et al. | Curing Cats with Feline Infectious Peritonitis with an Oral Multi-Component Drug Containing GS-441524. Viruses 2021, 13, 2228 | |
| Armstrong et al. | 2.04–Predictive toxicology: Latest scientific developments and their application in safety assessment |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090323 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20111014 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111025 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120327 |