JP2008546417A - 薬剤スクリーニング及び毒性試験のためのレポーター肝細胞及び他の細胞 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】細胞は、スクリーニングされている作用物質により引き起こされる毒物学的又は代謝的変化を反映するプロモーター−レポーター構築物を含有する。プロモーターは、細胞の代謝状態に従って上方又は下方制御されることが知られている遺伝子から取られ、プロモーター活性をモニタリングするために、外部シグナルを提供するレポーター遺伝子に結合している。プロモーター−レポーター細胞は、ヒト胚幹細胞株の中にこれらの遺伝子改変を配置し、細胞を所望の任意の程度に増大し、次に細胞を所望の細胞型に分化することによって産生することができる。本開示は、本発明のプロモーター−レポーター細胞の幾つかの強力な特徴を説明し、当業者が本発明を医薬開発及び試験のために、又は移植片の生存度をモニタリングするために使用できる多様な方法を示す。
【選択図】図6
Description
本出願は、米国仮特許出願第60/693,319号(案件番号140/001x)、2005年6月22日出願及び米国仮特許出願第60/719,843号、2005年9月22日出願(案件番号140/002x)の優先権利益を請求する。
・hES細胞は、同じゲノム及び再現可能な表現型を有する分化細胞の実質的に無制限の供給を提供することができ、一貫した産生及び再現可能なスクリーニングアッセイを可能にする。
定義
プロトタイプ「霊長類多機能幹細胞」(pPS細胞)は、受精後の任意の時点での前期胚子、胚又は胎児組織由来の多機能細胞であり、標準的な技術の許容される試験によって決定されるように、それぞれ3つの胚葉:内胚葉、中胚葉及び外胚葉を表す子孫を適切な条件下で産生することができる特徴、例えば、適切な宿主において奇形腫を形成する能力、又は培養中の3つの胚葉の全ての組織型を表すマーカーにより染色可能な細胞に分化する能力を有する。
細胞生物学、タンパク質化学及び抗体技術における一般的な方法は、Current Protocols in Protein Science (J. E. Colligan et al. eds., Wiley & Sons); Current Protocols in Cell Biology (J.S. Bonifacino et al., Wiley & Sons) および Current protocols in Immunology (J. E. Colligan et al. eds., Wiley & Sons.)において見出すことができる。本開示において参照される試薬、クローニングベクター及び遺伝子操作用のキットは、BioRad、Stratagene、Invitrogen及びClonTechのような商業的供給者から入手可能である。
本発明は、多様な型の幹細胞を使用して実施することができる。本発明の多くの態様での使用に適切なものは、必要とされる定義を満たした、任意のヒト又は他の霊長類の組織由来の多機能幹細胞である。非限定例は、ヒト胚幹(hES)細胞の初代培養又は樹立株である。
胚幹細胞は、霊長類種の胚盤胞から単離することができる(米国特許第5,843,780号; Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995)。hES細胞は、Thomsonら(米国特許第6,200,806号; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133, 1998)により、Reubinoffらによる、Nature Biotech. 18:399, 2000において、及び、Genbacevらによる、Fertil Steril. 2005;83(5): 1517-29において記載されている技術を使用してヒト胚盤胞から調製することができる。hES細胞と同等の細胞型には、WO01/51610(Bresagen)に概説されている、原始外胚葉様(EPL)細胞のようなそれらの多機能誘導体が含まれる。また同等のものは、hES細胞との融合により多機能幹細胞に再プログラムされた細胞である。
実施例セクションに提供されている説明は、hES細胞による処理に続く。しかし、それ以外に必要な場合を除いて、本発明は、ヒト、非ヒト霊長類及び他の非ヒト哺乳動物からの多機能幹細胞を含む、任意の脊椎動物種の多能性細胞を使用して実施することができる。
本発明の細胞は、細胞における遺伝子発現のパターンに影響を与える薬剤又は培養環境の他の局面に反応にするプロモーター又は他の転写調節配列の制御下で1つ以上のレポーター遺伝子を発現させるように設計される。幾つかの場合において、細胞は、ユーザーが、混合細胞個体群の中の同定されるべき目的である1つの細胞を同定することを可能にする、第2(組織特異的)プロモーターを有するように操作される。
培養条件の変化(特に試験薬剤の部類の存在)に反応して上方又は下方制御される遺伝子を制御する任意のプロモーター又は転写制御エレメントは、本発明の使用に適切でありうる。適切な特性を有するプロモーターの例は、以下である:
・アポトーシスに反応する遺伝子、例えばPUMA遺伝子のためのプロモーター。アポトーシスの引き金を引く薬剤は、この範疇のプロモーターの引き金を引くことができる。他の候補は、Gadd34、PUMA、GAHSP40、TRAIL−R2/DR5、c−fos、Gadd153、APAF−1、Gadd45、BTG2/PC3、Peg3/Pwl、Siah1a、S29リボソームタンパク質、FasL/CD95L、組織トランスグルタミナーゼ、GRP78、Nur77/NGFI−B、シクロフィリンD/CYPD及びP73である。
本開示で参照されているこれら及び他のプロモーターを、GenBankのような供給源からの配列データを使用して構築された所望の配列に特異的なプライマーを使用して、適切なゲノムライブラリーから増幅することによってクローニングすることができる。
<組織特異的プロモーター>
個体群において特定の表現型の細胞を同定するカウンターマーカーを提供するために、ユーザーは、試験化合物が培地に存在しているか否かにかかわらず、あるレベルで構造的に発現する第2プロモーターを選択することができる。
<レポーター遺伝子>
培養環境における代謝的又は毒物学的変化に反応するプロモーターによる潜在的な上方又は下方制御を検出するために、検出可能なシグナルを生成するレポーター遺伝子に機能的に結合する。
プロモーター−レポーター系が選択されると、細胞は、標準的な組み換え技術により遺伝子改変されて、レポーター遺伝子をプロモーターの制御下におく。このことは、両方とも細胞に対して異種であるプロモーター及びレポーターを含むベクターを用いた細胞の形質移入によって実施され、前記プロモーター及びレポーターは、既に発現カセットとして結合している。次にカセットを、無作為様式でゲノムの中に配置することができる。あるいは、ユーザーは、異種レポーターを、相同組み換えにより内在性レポーターの制御下におくこともできる。このことは、適切な環境下で転写を許容することが知られているゲノムの位置にプロモーターを配置するという利点を有する。
hES細胞を使用する別の利益は、特定の目的薬剤代謝酵素又は薬剤標的をコードする遺伝子の特定の変種を有することを除いて、全ての局面において同一である細胞を作る能力である。このことは、薬剤スクリーニングの状況において関連性があり、それは、特定の部類の薬剤に反応する又はそれを代謝する個別の能力に影響を与える天然に生じる対立変種が幾つか存在するからである。そうでなければ細胞は同じであるので、ユーザーは、スクリーニングされる化合物の効果をアロタイプ特異的な方法で決定することができる。公開された米国特許出願第2003/0003573 A1号、段落[0128]〜[0134](Geron Corp.)を参照すること。
<所望の組織型への細胞の分化>
いったん、hES細胞が、試験細胞個体群における発現のために設計されたプロモーター−レポーター系により遺伝子改変されると、個体群を、必要な任意の程度に増大することができ、次に、随意に所望の細胞型に分化することができる。
肝細胞は、米国特許第6,458,589号及びPCT公報WO01/81549(Geron Corporation)に記載されているように、ヒストンデアセチラーゼのインヒビターを使用して、hES細胞から分化することができる。未分化hES細胞を、ヒストンデアセチラーゼのインヒビターの存在下で培養する。例示的な方法において、分化は、1%DMSO、次に2.5mMのヒストンデアセチラーゼインヒビターn−ブチレートにより開始される。得られた細胞は、n−ブチレート、DMSO、EGF、肝細胞増殖因子及びTGF−αのような増殖因子を含有する肝細胞培養培地中で4日間培養することによって、成熟させることができる。
神経細胞を、米国特許第6,833,269号;Carpenter et al., Exp Neurol. 2001 ;172(2):383-97;及びWO03/000868(Geron Corporation)に記載されている方法に従ってhES細胞から生成することができる。未分化hES細胞又は胚様体細胞を、1つ以上のニューロトロフィン及び1つ以上のマイトジェンを含有する培地で培養し、少なくとも約60%の細胞がA2B5、ポリシアル酸NCAM又はネスチンを発現し、かつ培養において少なくとも20倍加の能力がある細胞個体群を生成する。例示的なマイトジェンは、EGF、塩基性FGF、PDGF及びIGF−1である。例示的なニューロトロフィンは、NT−3及びBDNFである。TGF−βスーパーファミリーアンタゴニストの使用、又はcAMPとアスコルビン酸の組み合わせの使用を、ドーパミン作動性ニューロンの特徴である、チロシンヒドロキシラーゼに陽性のニューロン細胞の割合を増加するために使用することができる。次に細胞の繁殖は、マイトジェンの不在下でニューロトロフィンにより培養することによって、最終分化を引き起こすことができる。
心筋細胞又は心筋細胞前駆体を、WO03/006950に提供されている方法に従ってhES細胞から生成することができる。細胞は、ウシ胎児血清又は血清代替物及び場合により5−アザシチジンのようなDNAメチル化に影響を与える心臓代謝因子を有する懸濁液で培養される。あるいは、心筋細胞クラスターは、アクチビンAを有する固体基質で培養し、続いてBMP4のような骨形成タンパク質と共に培養し、場合によりIGF−1のようなインスリン様増殖因子と共に更に培養することによって生成することができる。必要に応じて、次に自発的に収縮する細胞を、密度遠心分離により、個体群中の他の細胞から分離することができる。
島細胞は、アクチビンA、ヒストンデアセチラーゼインヒビター(例えば、ブチレート)、マイトジェン(例えば、bFGF)及びTGF−βスーパーファミリーアンタゴニスト(例えば、ノギン)から選択される幾つかの因子の組み合わせを含有する培地中の培養でhES細胞の分化を開始することによって、hES細胞から分化することができる(WO03/050249、Geron Corp.)。次に細胞をニコチンアミドと共に培養して成熟させることができ、少なくとも細胞の5%がPdx1、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵ポリペプチドを発現する細胞個体群を生じる。細胞クラスターは、インスリン産生細胞が豊富な芽を形成することができ、濾過より回収することができる。WO03/050249(Geron Corp.)を参照すること。
薬剤スクリーニングのためのレポーター細胞の使用
プロモーター−レポーター系を含有する本発明の細胞は、代謝特性又は遺伝子発現プロフィールに影響を与える因子(例えば、溶媒、小分子薬剤、ペプチド及びポリヌクレオチド)又は環境条件(例えば、培養条件若しくは操作)をスクリーニングするために使用することができる。このことは、薬剤の代謝及び薬剤の安全性を研究すること、薬剤代謝の調節に影響を与える因子を同定すること、又は薬理学的効果を評価及び確認することによって行うことができる。特に興味深いものは、医薬開発の一部として、小分子薬剤及び細胞に進入することができる他の作用物質をスクリーニングすること、並びに/又はインビボで細胞代謝を改変することにおけるこれらの細胞の使用である。
毒性試験における本発明のプロモーター−レポーター細胞の使用は、細胞個体群を、(典型的には培地に添加することによって)スクリーニングされる作用物質と組み合わせることを含む。プロモーター−レポーター系に対する作用物質の効果は、典型的には、選択されたレポーターに適切な検出系を使用して、作用物質の存在下及び不在下でのレポーター遺伝子からのシグナルを比較することによって追跡される。
毒物学、薬剤代謝及び素因について試験化合物をスクリーニングする他に、本発明の細胞を使用して陽性薬理学的効果についてスクリーニングすることもできる。例えば、インスリンプロモーターにより駆動されるレポーター系を含有する膵臓細胞を使用して、インスリン分泌を誘発できる薬剤をスクリーニングすることができる。神経伝達物質の合成、放出又は取り込みにおける遺伝子のためにプロモーターにより駆動されるレポーター系を含有するニューロン細胞を使用して、潜在的に有益な神経効果を有する薬剤をスクリーニングすることができる。陽性スクリーニングのための本発明の細胞、キット及び方法論の使用は、毒性試験、適切なプロモーター構築物の選択及び必要に応じたアッセイの適合の使用と並行する。
毒物学的又は薬学的効果をスクリーニングする過程において、ユーザーは、特定の薬剤の予測される標的又はその代謝に関わると考えられる酵素を確認することを望む場合がある。このことは、薬剤とプロモーター−レポーター細胞とを、薬剤標的又は代謝酵素の転写又は翻訳を活性化又は阻害する基質の存在下又は不在下で組み合わせることによって行うことができる。プロモーター−レポーター構築物は、活性が試験されているよりも下流の遺伝子活性を反映するように選択される。次にユーザーは、薬剤が当該の薬剤標的又は酵素に影響を与えるかの指標として、RNAiを有するか又は有さない薬剤の存在下でレポーター遺伝子の発現に差があるかを決定する。
同じhES細胞株から作製されるが、薬剤代謝酵素の異なる変種を含有するように操作されているプロモーター−レポーター細胞を使用して、酵素により代謝されると考えられる薬剤のプロセッシング又は効果を比較することができる。例えば、通常形態のCYP2D6遺伝子を有する同じhES細胞由来の肝細胞を、デキストロメトルファンのような薬剤の効果について、個体群の6%に存在する変種(表2)を有する肝細胞と比較することができる。変異に起因する薬剤代謝の差は、細胞における代謝的又は毒物学的変化に反応するプロモーター−レポーターを介して生成されるシグナルに影響を与えるか、又は薬剤の代謝に関連する遺伝子産物の発現を反映する。
移植組織をモニタリングするためのレポーター細胞の使用
本発明のプロモーター−レポーター細胞の別の使用は、ヒト被験体に移植された組織移植片(例えば、同種移植片)の運命をモニタリングすることである。レポーターの発現を、不適切な移植による、又は後の急性又は慢性免疫拒絶反応による、ストレス、アポトーシス又は移植組織の生存度の指標として使用することができる。
営利事業として、ユーザーは、本発明のスクリーニング方法を、化合物又は作用物質の効果を試験することを望んでいる他の事業体にサービスとして提供することができる。あるいは、ユーザーは、本発明の細胞、組み合わせ及び試薬を、薬理学的スクリーニングにおける内部使用のために他の事業体に提供することができる。
本発明の一部の系又はキットは、維持されている2つ以上の異なる細胞個体群を単独で含む。細胞個体群は、同じゲノムを有するものとして参照することができる。これは、標準技術により測定される遺伝子多型(RFLP又はSNP)が、同じ細胞株由来のものと一致する(典型的には95%を越える同一性である)ことを意味する。
hES細胞を、図1で示されているスキームに従って肝細胞に分化することができる。
この実施例及び実施例3、4及び6の実験室作業は、Dept. of Gene Function & Development, Roslin Institute, Midlothian ScotlandのWei Cui、Debiao Zhao、David Hay及びArlene Rossにより実施され、請求される発明の所有者は、謝意を表明する。
1. Watanabe K, Saito A, Tamaoki T., (1987) Cell-specific enhancer activity in a far upstream region of the human alpha-fetoprotein gene. J Biol Chem. 1987 262:4812-8.
2. Hayashi Y, Chan J, Nakabayashi H, Hashimoto T, Tamaoki T., (1992) Identification and characterization of two enhancers of the human albumin gene. J Biol Chem. 267:14580-5.
3. Xu C, lnokuma M.S., Denham J., Golds K., Kundu P., Gold J. D., Carpenter M.K. (2001) Feeder- free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 19:971-4.
4. Gerrard L, Zhao DB, Clark AJ, and Cui W (2005) Stably transfected human embryonic stem cell clones express OCT4-specific green fluorescent protein and maintain self-renewal and pluripotency. Stem Cells 23: 124-33.
レポーター構築物を含有する未分化hESCを、8ng/mLのbFGFを含有するmEF−CMで、およそ70%のコンフルエンスになるまで培養した。次に上述したCMをSR/DMSO培地(20%血清代替物、2mMのl−グルタミン、1×非必須アミノ酸、0.1mMのβ−メルカプトメエノール及び1%DMSOを含有するノックアウトDMEM)に代えて、7日間毎日換えた。次に細胞を、肝細胞増殖因子(HGF)2.5ng/mL及びEGF 10ng/mLを補充した肝細胞培地(CambrexからのHCM)を使用して更に2週間成熟させた。HCMを最初の4日間は毎日、後半の10日間は2日毎に換えた。細胞を、100%メタノールで固定した後に免疫染色した。
この実施例は、チトクロームP450からのヒトCYP3A4遺伝子のプロモーターエレメントにより駆動されるGFPレポーターを有する肝細胞を例示する。調節配列は2つのエレメント:0.8kBaseの生体異物反応性エンハンサーモジュール(XREM)及び0.4kBaseの小型近位プロモーターを含有する。
参考文献:
1. Goodwin B, Hodgson E, and Liddle C, (1999) The Orphan human pregnane x receptor mediates the transcriptional activation of CYP3A4 by Rifampicin through a distal enhancer module. MoI Pharmacol. 56(6):1329-39.
この実施例の実験室作業は、CXR BiosciencesのCliff Elcombeと彼のチームにより実施され、請求される発明の所有者は、謝意を表明する。
<実施例6:アクチビンを使用して生成された肝細胞の細胞系においてシグナル伝達するレポーター>
hES細胞のH1−LZ−hAFP−eGFP株(実施例2)を、Matrigel(商標)被覆プレートにおいて、8ng/mLのbFGFを補充したmEF調整培地中で増大した。いったん90〜95%のコンフルエンスに達すると、細胞を投入し、ビタミンAなしのB27補充(GibcoBRL/lnvitrogen # 12587-010)、1mMの酪酸ナトリウム(Sigma Cat. no. B5887)及び100ng/mLのアクチビンA(R&D Systems # 338-AC-025)を含有するPRMI 1640により1日(1日目と呼ぶ)培養し、次に、0.5mMの酪酸ナトリウムを有する以外は同じ培地で2日間培養した(段階I)。かなりの細胞死があり、ここで残りの細胞は、間葉細胞形態を有し、一部はロゼットを形成した。
本開示に提示されている教科書及び他の参考文献の他に、当業者は、以下の特許開示を参考にすることを望むであろう:
・hES細胞培養:米国特許第6,800,480号;WO01/51616;WO03/020920
・肝細胞:米国特許第6,458,589号;WO01/81549;US2003/0003573A1;US2005/0037493A1
・神経細胞:米国特許第6,833,269号;WO03/000868;WO04/007696
・心筋細胞:WO03/006950;PCT/US2005/009081
・島細胞:WO03/050249
・他の分化細胞;WO03/004605;WO03/050250;WO03/050251;US2004/0009589A1;及びUS2003/0166273Al
Claims (58)
- 細胞における代謝的又は毒物学的変化に反応するプロモーターがレポーター遺伝子の発現を制御するように遺伝子改変されている細胞を含む、未分化ヒト胚幹(hES)細胞の個体群又はそれらから分化した細胞の個体群。
- 実質的に未分化hES細胞の個体群である、請求項1記載の細胞個体群。
- 神経細胞、心筋細胞又は肝細胞の細胞系である、請求項1記載の細胞個体群。
- 細胞における代謝的又は毒物学的変化に反応するプロモーターがレポーター遺伝子の発現を制御するように遺伝子改変されている細胞を含む、非癌由来ヒト肝細胞個体群。
- hES細胞の分化により得られる、請求項4記載の肝細胞個体群。
- 前記プロモーターがアポトーシスに反応する、請求項1〜5のいずれか1項記載の細胞個体群。
- 前記プロモーターが、PUMA遺伝子のためのプロモーターである、請求項6記載の細胞個体群。
- 前記プロモーターがDNA損傷に反応する、請求項1〜5のいずれか1項記載の細胞個体群。
- 前記プロモーターが、p21 OR p21/WAF1遺伝子のためのプロモーターである、請求項8記載の細胞個体群。
- 前記プロモーターが過形成に反応する、請求項1〜5のいずれか1項記載の細胞個体群。
- 前記プロモーターが、Ki−67遺伝子のためのプロモーターである、請求項10記載の細胞個体群。
- 前記プロモーターが酸化ストレスに反応する、請求項1〜5のいずれか1項記載の細胞個体群。
- 前記プロモーターが、ヘムオキシゲナーゼ1、スーパーオキシドジスムターゼ、γ−グルタミルシステイニルリガーゼ又はメタロチオニン遺伝子のためのプロモーターである、請求項12記載の細胞個体群。
- 前記プロモーターが、細胞における代謝的又は毒物学的変化を反映する転写因子のためのプロモーターである、請求項1〜5のいずれか1項記載の細胞個体群。
- 前記プロモーターが、PXR、CAR、アリール炭化水素レセプター(AhR)又はNrf2遺伝子のためのプロモーターである、請求項14記載の細胞個体群。
- 前記プロモーターが、アンドロゲン、エストロゲン又はpPAG反応性遺伝子のためのプロモーターである、請求項1〜5のいずれか1項記載の細胞個体群。
- 前記プロモーターが、前立腺特異抗原(PSA)のためのプロモーターである、請求項16記載の細胞個体群。
- 前記プロモーターが、チトクロームP450酵素のためのプロモーターである、請求項1〜5のいずれか1項記載の細胞個体群。
- 前記プロモーターが、CYP3A4又はCYP1A1のためのプロモーターである、請求項18記載の細胞個体群。
- 前記プロモーターが、薬剤トランスポーター遺伝子のためのプロモーターである、請求項1〜5のいずれか1項記載の細胞個体群。
- 前記遺伝子がMDR1である、請求項20記載の細胞個体群。
- 前記プロモーターが、心臓の収縮速度又はQT間隔に影響を与える遺伝子のためのプロモーターである、請求項1〜5のいずれか1項記載の細胞個体群。
- 前記プロモーターが、カルシウム流遺伝子のためのプロモーターである、請求項22記載の細胞個体群。
- 前記レポーター遺伝子が、発現するときに蛍光又はリン光シグナルを生じるタンパク質をコードする、請求項1〜23のいずれか1項記載の細胞個体群。
- 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質のアイソフォームである、請求項24記載の細胞個体群。
- 前記プロモーター及び前記レポーター遺伝子の両方が、細胞個体群に対して異種である、請求項1〜25のいずれか1項記載の細胞個体群。
- 異種レポーター遺伝子が、内在性プロモーターの制御下におかれる、請求項1〜25のいずれか1項記載の細胞個体群。
- 組織特異的な第2プロモーターが第2レポーター遺伝子の発現を制御するように遺伝子改変されている、請求項1〜28のいずれか1項記載の細胞個体群。
- 前記第2プロモーターが、アルブミン、α1−アンチトリプシン、α−フェトプロテイン、γ−グルタミルトランペプチダーゼ、グルコース−6−ホスファターゼ、カタラーゼ及びモノオキシゲナーゼから選択される肝細胞特異的マーカーのためのプロモーターである、請求項28記載の細胞個体群。
- 内在性薬剤標的又は代謝酵素の変種をコードする遺伝子を発現するように遺伝子改変されている、請求項1〜29のいずれか1項記載の細胞個体群。
- 前記変種が、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、N−アセチルトランスフェラーゼ又はチオプリンメチルトランスフェラーゼの対立変種である、請求項30記載の細胞個体群。
- 異なる細胞が、同じ薬剤標的又は薬剤代謝酵素の異なる変種を発現するように遺伝子改変されている、請求項30又は31記載の細胞個体群。
- 薬剤標的又は薬剤代謝酵素の異なる変種を有する細胞が、異なるレポーター遺伝子に連鎖するプロモーターも含有する、請求項32記載の細胞個体群。
- 前記細胞の少なくとも20%が、以下の肝細胞系の特徴:
・α1−アンチトリプシン(AAT)の抗体検出可能発現:
・アルブミンの抗体検出可能発現;及び
・グルコース−6−ホスファターゼ活性の証拠
を有する、請求項1、3〜21及び23〜33のいずれか1項記載の細胞個体群。 - hES細胞株から請求項1及び3〜34のいずれか1項記載の分化細胞個体群を産生する方法であって、
a)前記hES細胞株からの遺伝子改変細胞と、その結果の、細胞における代謝的又は毒物学的変化に反応するプロモーターがレポーター遺伝子の発現を制御する産生hES細胞;
b)前記遺伝子改変hES細胞を繁殖させて、遺伝子改変hES細胞個体群を形成すること;次に、
c)前記遺伝子改変hES細胞個体群を分化して、細胞における代謝的又は毒物学的変化に反応するプロモーターがレポーター遺伝子の発現を制御する遺伝子改変分化細胞の個体群にすること
を含む方法。 - c)が、前記hES細胞個体群を神経細胞、心筋細胞又は肝細胞の細胞系の個体群に分化することを含む、請求項35記載の方法。
- c)が、内胚葉細胞の個体群を形成し、次に、更に、内胚葉細胞を肝細胞に分化することを含む、請求項35記載の方法。
- より多くの前記プロモーター−レポーター細胞を産生するために、前記プロモーター−レポーター細胞個体群を誘導するのに使用される同じ株からの未分化hES細胞と合わせて、請求項1及び3〜34のいずれか1項記載の分化細胞個体群を含む、プロモーター−レポーター細胞を産生又は維持する系又はキット。
- 薬剤を試験する方法であって、薬剤を請求項1〜34のいずれか1項記載の細胞個体群と組み合わせること、及び前記細胞における前記レポーター遺伝子の発現がそれによって影響をうけるかを決定することを含む方法。
- 前記薬剤が、前記レポーター遺伝子の実質的な上方制御を引き起こさないので、更なる開発のために選択される、請求項39記載の方法。
- 前記薬剤が、別個のストレス誘発化合物又は培養条件の存在により引き起こされる細胞における前記レポーター遺伝子の発現を防止又は低下させるので、更なる開発のために選択される、請求項39記載の方法。
- 薬剤を試験する方法であって、前記薬剤を請求項28又は請求項29記載の細胞個体群と組み合わせること、及び前記第2レポーター遺伝子を発現する細胞において前記第1レポーター遺伝子の発現に変化があるかを決定することを含む方法。
- 薬剤を試験する方法であって、前記薬剤を薬剤標的又は薬剤代謝酵素のためにRNAiの存在下又は不在下で請求項1〜34のいずれか1項記載の細胞個体群と組み合わせること、及び前記RNAiを伴うか又は伴わない前記薬剤の存在下で前記レポーター遺伝子の発現に違いがあるかを決定することを含む方法。
- 請求項1〜34のいずれか1項記載の細胞個体群を含む、請求項40又は41記載の方法による薬剤試験用の系又はキット。
- 細胞においてレポーター遺伝子の発現を変化させることが知られている化合物を更に含む、請求項44記載の系又はキット。
- 同じゲノムを共有しているが、代謝又は毒物学的変化に反応する異なるプロモーターがそれぞれの細胞個体群においてレポーター遺伝子の発現を制御するように遺伝子改変されている複数個の細胞個体群を含む、請求項44又は請求項45記載の系又はキット。
- 同じゲノムを共有しているが、異なる組織の細胞に分化している複数個の細胞個体群を含む、請求項44〜46記載の系又はキット。
- 同じゲノムを共有しているが、薬剤標的又は薬剤代謝酵素の異なる変種を有する請求項1〜30のいずれか1項に記載された複数個の細胞個体群を含む、薬剤標的又は薬剤代謝酵素の異なる変種に対する薬剤の効果を決定するための系又はキット。
- 前記変種が、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、N−アセチルトランスフェラーゼ又はチオプリンメチルトランスフェラーゼの対立変種である、請求項48記載の系又はキット。
- 請求項1〜34のいずれか1項記載の細胞個体群と、薬剤標的又は代謝酵素をコードする遺伝子のためのRNAiとを含み、請求項43記載の方法により薬剤標的を確認するための系又はキット。
- 請求項1〜34のいずれか1項記載のプロモーター−レポーター構築物を有する細胞を含有する、移植のために調製され、被験体への移植後のモニタリングのために適合された単離組織。
- 前記プロモーター−レポーター細胞個体群における前記レポーター遺伝子が、分泌性レポーターをコードする、請求項51記載の単離組織。
- 前記分泌性レポーターがヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)である、請求項52記載の単離組織。
- 被験体への移植後に、請求項51〜53のいずれか1項記載のプロモーター−レポーター細胞個体群を含有する組織同種移植片を評価する方法であって、移植片における前記レポーター遺伝子の発現をモニタリングすることを含む方法。
- 本明細書に記載される、前記細胞における代謝的又は毒物学的変化に反応するプロモーターがレポーター遺伝子の発現を制御するように遺伝子改変されている細胞を含む、細胞個体群。
- 本明細書に記載される、プロモーター−レポーター細胞を使用する、薬剤試験又は標的確認の方法。
- 本明細書に記載される、プロモーター−レポーター細胞を含む、薬剤試験又は標的確認のための系又はキット。
- 本明細書に記載される、移植のために調製され、被験体への移植後のモニタリングのために適合された単離組織。
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