JP2008540450A - ＣＤ１４およびＴｏｌｌ様受容体４シグナル伝達経路を介して細胞をモジュレートする組成物および方法 - Google Patents

ＣＤ１４およびＴｏｌｌ様受容体４シグナル伝達経路を介して細胞をモジュレートする組成物および方法 Download PDF

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Abstract

ＣＤ１４およびリガンドを介したＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）経路のシグナル伝達をモジュレートする化合物をスクリーニングする、および同定するための、組成物および方法が提供される。ＣＤ１４およびリガンドを介したＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）経路のシグナル伝達をモジュレートすることにより、哺乳動物対象における、種々の病態、例えば、炎症または自己免疫疾患の処置に関する方法が提供される。ＣＤ１４遺伝子に機能喪失性の変異を含むヒト以外のトランスジェニック動物およびヒト以外のトランスジェニック動物を作製する方法が提供される。

Description

政府支援の記述
本発明は、国立衛生研究所の助成金番号Ｕ５４−ＡＩ５４５２３による政府支援により成された。当該政府は、本発明の一定の権利を所有する。
関連出願についての相互参照
本発明は、２００５年５月６日に出願された米国仮出願番号第６０／６７８，３９３号、および２００６年５月４日に速達番号ＥＶ８００２８５４５０ＵＳにより出願された表題「COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING CELLS VIA CD14AND TOLL-LIKE RECEPTOR 4 SIGNALING PATHWAY」の米国出願の利益を主張し、そのいずれも出典明示により本明細書の一部とされる。
技術分野
本発明は、一般に、分子免疫学およびヒト疾患の処置に関する。本発明は、ＣＤ１４およびリガンドを介したＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）経路のシグナル伝達の特徴に基づく化合物をスクリーニングする方法および同定する方法に関する。本発明は、哺乳動物対象における様々な病態、例えば感染症、炎症または自己免疫疾患の処置方法をさらに提供する。本発明は、ヒト以外のトランスジェニック動物、およびＣＤ１４遺伝子に機能喪失性の変異を含むヒト以外のトランスジェニック動物を作製する方法に関する。
リポ多糖体（ＬＰＳ）は、グラム陰性細菌の病因作用の多くに関与するが、防御免疫応答もまた誘発する。O'Brienら、J. Immunol. 124: 20-24, 1980; Rosenstreichら、CRC Crit. Rev. Immunol. 3: 263-330, 1982。ＬＰＳは、リピドＡ部分、コア多糖および可変長のＯ−多糖（しばしば５０個以上の単糖単位）からなる。コロニー形態の（「滑らか（スムース）」対「粗い（ラフ）」）は、Ｏ−糖付加状況の指標となる。長いＯ−多糖鎖を有する微生物変異体は、滑らかなコロニーを形成し、Ｏ−多糖鎖が欠損した微生物体は、粗いコロニーを形成し、このため、スムースおよびラフはＬＰＳの指標となる。
付加された糖が全く存在しないリピドＡがＬＰＳの生物学的活性のある部分であるため、糖鎖は内毒素の補助的な役割を果たすと考えられており、また宿主がスムースＬＰＳ化学型とラフＬＰＳ化学型とを区別するという明らかな証拠は存在しない。Galanosら、European Journal of Biochemistry 140: 221-227, 1984；Galanosら、Eur. J. Biochem. 148: 1-5, 1985。むしろ、ＬＰＳ分子はすべて、血漿のＬＰＳ結合蛋白質（ＬＢＰ）により拘束され、単核食細胞上に多量に発現されたＣＤ１４、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−固定された蛋白質に送られると考えられる；ＬＰＳ信号を集中する事象である。Tobiasら、J. Biol. Chem. 263: 13479-13481, 1988；Tobiasら、J. Biol. Chem. 264: 10867-10871, 1989；Schumannら、Science 249: 1429-1431, 1990；Wrightら、Science 249: 1431-1433, 1990。また、すべてのＬＰＳ応答は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）とＭＤ−２により形成される膜貫通複合体に依存し、これを通じて信号は伝播される。Poltorakら、Science 282: 2085-2088, 1998；Nagaiら、Nat. Immunol. 3: 667-672, 2002。ＴＬＲ４は、機能的な組（ＭｙＤ８８とＭａｌ（ＴＩＲＡＰとしても知られている）、およびＴＲＩＦとＴＲＡＭ）で機能と考えられる４つのアダプター蛋白質を介して信号を送る。Hoebeら、Nature 424: 743-748, 2003; Yamamotoら、Science 301: 640-643, 2003；Yamamotoら、Nat. Immunol. 4: 1144-1150, 2003；Beutler, Nature 430: 257-263, 2004。
当分野では現在、自己免疫疾患または感染症に罹患している哺乳動物対象では、活性化されている場合にはＬＰＳ受容体複合体はこれらすべてのアダプターを利用し（ＭｙＤ８８とＭａｌ、ＴＩＲＡＰとしても知られている、およびＴＲＩＦとＴＲＡＭ）、停止状態ではそれらを利用していないことが示されている。当分野には、哺乳動物対象の先天的免疫系のＬＰＳ受容体複合体を調節または制御する因子に関与する疾病、例えば自己免疫疾患および感染症の改善された診断および治療上の処置についての必要性が存在する。
ＣＤ１４およびリガンドを介したＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）経路のシグナル伝達をモジュレートする化合物をスクリーニングし、同定するための組成物および方法が提供される。ＣＤ１４およびリガンドを介したＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）経路のシグナル伝達をモジュレートすることにより、哺乳動物対象の様々な病態、例えば感染症、炎症または自己免疫疾患を処置するための方法が提供される。哺乳動物対象におけるラブドウイルス感染症、例えば、狂犬病感染症または水疱性口内炎ウイルス感染症を処置するための方法が提供される。ラブドウイルス感染症、例えば狂犬病感染症または水疱性口内炎ウイルス感染症を処置するための化合物をスクリーニングし、同定する方法が提供される。ヒト以外のトランスジェニック動物がＣＤ１４遺伝子に機能喪失性の変異を含むところの、ヒト以外のトランスジェニック動物および該動物を作製する方法が提供される。
感染症を有することが疑われる哺乳動物対象においてラブドウイルス感染症を処置する方法であって、該対象にＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性のモジュレーターを、ラブドウイルス感染症を軽減もしくは除去するのに、またはその発症もしくは再発を予防するのに有効な量で投与することを含む方法が提供される。１つの態様において、モジュレーターは、ＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性のアンタゴニストである。さらなる態様において、モジュレーターは、ＣＤ１４活性またはＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性の阻害物質である。阻害物質には、限定されるものではないが、ＣＤ１４もしくはＴＬＲ−４に対する干渉ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、リボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらなる態様において、阻害物質には、ＣＤ１４もしくはＴＬＲ−４に対するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ペプチド、ペプチド模倣体、または低分子の化学阻害物質が挙げられる。阻害物質は、例えばＣＤ１４に対する抗体、またはＴＬＲ−４に対する抗体であってもよい。詳しい態様において、ラブドウイルスは、狂犬病ウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスである。
哺乳動物対象における自己免疫疾患を処置する方法であって、哺乳動物対象にＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性のモジュレーターを、自己免疫疾患を軽減または除去するのに、あるいはその発症または再発を予防するのに有効な量で投与することを含む方法が提供される。１つの態様において、モジュレーターは、ＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性のアンタゴニストである。さらなる態様において、モジュレーターは、ＣＤ１４活性またはＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性の阻害物質である。その阻害物質には、限定されるものではないが、ＣＤ１４もしくはＴＬＲ−４に対する干渉ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、リボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらなる態様において、阻害物質には、ＣＤ１４もしくはＴＬＲ−４に対するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ペプチド、ペプチド模倣体、または低分子の化学阻害物質が挙げられる。この阻害物質は、ＣＤ１４に対する抗体またはＴＬＲ−４に対する抗体であってもよい。
哺乳動物対象における炎症を処置する方法であって、哺乳動物対象にＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性のモジュレーターを、炎症を軽減または除去するのに、あるいはその発症または再発を予防するのに有効な量で投与することを含む方法が提供される。１つの態様において、モジュレーターは、ＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性のアンタゴニストである。さらなる態様において、モジュレーターは、ＣＤ１４活性またはＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性の阻害物質である。その阻害物質には、限定されるものではないが、ＣＤ１４もしくはＴＬＲ−４に対する干渉ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、リボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらなる態様において、阻害物質には、ＣＤ１４もしくはＴＬＲ−４に対するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ペプチド、ペプチド模倣体、または低分子の化学阻害物質がある。この阻害物質は、ＣＤ１４に対する抗体またはＴＬＲ−４に対する抗体であってもよい。
Ｔｏｌｌ様受容体４経路 を介して細胞のシグナル伝達をモジュレートする化合物を同定する方法であって、試験化合物を、リガンドに対する応答をシグナル伝達できるＴｏｌｌ様受容体４を発現する細胞を含む、細胞に基づくアッセイ系と接触させ、ＣＤ１４およびリガンドを、Ｔｏｌｌ様受容体４シグナル伝達を活性化するのに有効であるように選択された量でアッセイ系に供し、そしてアッセイにおける試験化合物の有効性がモジュレーションの指標であるため、アッセイ系での試験化合物のＴｏｌｌ様受容体４シグナル伝達 における効果を検出することを含む方法が提供される。Ｔｏｌｌ様受容体４経路 を介した細胞のシグナル伝達をモジュレートする化合物を同定する方法は、細胞内でＣＤ１４およびＴｏｌｌ様受容体４を共発現させることをさらに含む。さらなる態様において、本方法は、Ｔｏｌｌ様受容体４をアッセイ系に供し、アッセイにおける試験化合物の有効性がモジュレーションの指標であるため、アッセイ系での試験化合物のＣＤ１４／Ｔｏｌｌ様受容体４シグナル伝達における影響を検出することを含む。
本方法の実施形態において、リガンドは、内因性のリガンドまたは外因性のリガンドである。外因性のリガンドには、限定されるものではないが、リポ多糖体、リピドＡ、ジ−アシル化リポペプチド、トリ−アシル化リポペプチド、Ｓ−ＭＡＬＰ−２、Ｒ−ＭＡＬＰ−２、細菌性リポペプチド、Ｐａｍ２ＣＳＫ４、リポテイコ酸、またはザイモサンＡが含まれる。詳細な態様において、外因性のリガンドは、サルモネラ・ミネソタからのラフリポ多糖体、スムースリポ多糖体またはリピドＡである。内因性のリガンドには、限定されるものではないが、脂質が含まれる。さらなる実施形態において、検出工程は、腫瘍壊死因子産生が、サルモネラ・ミネソタからのラフリポ多糖体に応答して変化するが、スムースリポ多糖体またはリピドＡ に応答して変化しない細胞におけるＴＮＦ産生における影響を測定することを含む。
さらなる実施形態において、本方法は、化合物により低下されたリガンドのＣＤ１４に対する結合に影響を及ぼす検出工程を含む。
本方法のさらなる実施形態において、検出工程は、化合物により低下されたＣＤ１４のＴｏｌｌ様受容体４に対する結合に影響を及ぼす工程を含む。１つの態様において、化合物は、Ｔｏｌｌ様受容体４経路シグナル伝達のアンタゴニストである。さらなる態様において、検出工程は、細胞アッセイにおいて腫瘍壊死因子の低下を測定することを含む。
本方法のさらなる実施形態において、検出工程は、化合物により増強されたリガンドのＣＤ１４に対する結合に影響を及ぼす工程を含む。
Ｔｏｌｌ様受容体４経路を介して細胞内のシグナル伝達をモジュレートする化合物を同定する方法は、化合物により増強されたＣＤ１４のＴｏｌｌ様受容体４に対する結合に影響を及ぼす検出工程をさらに含む。１つの態様において、化合物は、Ｔｏｌｌ様受容体４経路シグナル伝達のアゴニストである。本方法の別の態様において、検出工程は、細胞アッセイにおける腫瘍壊死因子の増加を測定することをさらに含む。細胞アッセイは、マクロファージ細胞をさらに含む。
Ｔｏｌｌ様受容体４経路を介して細胞内のシグナル伝達をモジュレートする化合物を同定する方法は、標識化されたＣＤ１４のリガンドに対する結合または標識化されたＣＤ１４のＴｏｌｌ様受容体４に対する結合を測定する検出工程をさらに含む。標識には、限定されるものではないが、放射標識または蛍光標識が含まれる。
さらなる実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体４経路を介して細胞内のシグナル伝達をモジュレートする化合物を同定する方法であって、細胞がリガンドに対する応答をシグナル伝達できるＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆを発現し、さらにＣＤ１４およびリガンドを、ＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達を活性化するのに有効であるように選択された量でアッセイ系 に供し、そしてアッセイにおける試験化合物の有効性がモジュレーションの指標であるため、アッセイ系での化合物のＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達における影響を検出することを含む方法が提供される。
１つの態様において、本方法は、細胞内でＣＤ１４、Ｔｏｌｌ様受容体４、およびＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆを共発現させることを含む。本方法は、アッセイ系にＴｏｌｌ様受容体４を供し、そしてアッセイにおける試験化合物の有効性がモジュレーションの指標であるため、アッセイ系での試験化合物のＣＤ１４／Ｔｏｌｌ様受容体４／ＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達における効果を検出することをさらに含む。本方法の１つの態様において、検出工程は、化合物により低下されたリガンドのＴｏｌｌ様受容体４に対する結合に影響を及ぼす工程をさらに含む。本方法の１つの態様において、検出工程は、化合物により低下されたＴｏｌｌ様受容体４のＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆに対する結合に影響を与えることをさらに含む。本方法の１つの態様において、検出工程は、化合物により増強されたリガンドのＣＤ１４に対する結合に影響を与えることをさらに含む。本方法の１つの態様において、検出工程は、化合物により増強されたＴｏｌｌ様受容体４のＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆに対する結合に影響を与えることをさらに含む。
本方法の１つの態様において、化合物は、ＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆ経路シグナル伝達のアゴニストである。本方法の１つの態様において、化合物は、ＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆ経路シグナル伝達のアンタゴニストである。さらなる態様において、リガンドは、内因性のリガンドまたは外因性のリガンドである。外因性のリガンドには、限定されるものではないが、リポ多糖体が含まれる。内因性のリガンドには、限定されるものではないが、脂質が含まれる。
本方法のさらなる態様において、、細胞アッセイは、マクロファージ細胞を含む。本方法のさらなる態様において、検出工程は、標識化されたＣＤ１４のリガンドに対する結合または標識化されたＣＤ１４のＴＬＲ４もしくはＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆに対する結合を測定することを含む。標識には、限定されるものではないが、放射標識または蛍光標識が含まれる。
本方法のさらなる態様において、化合物は、ＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆ経路シグナル伝達のアゴニストである。本方法は、細胞アッセイにおけるＩＲＦ−３のリン酸化の増加を測定することを含む検出工程をさらに含む。さらなる態様において、検出工程は、細胞アッセイにおけるインターフェロン−βの増加を測定することを含む。さらなる態様において、検出工程は、細胞アッセイにおけるウイルス感染に対する低下された感受性を測定することを含む。
本方法のさらなる態様において、化合物は、ＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆ経路シグナル伝達のアンタゴニストである。化合物は、細胞アッセイにおいてＩＲＦ−３のリン酸化の減少を測定することを含む検出工程を含む。さらなる態様において、検出工程は、細胞アッセイにおけるインターフェロン−βの減少を測定すること含む。さらなる態様において、検出工程は、細胞アッセイにおけるウイルス感染に対する増大された感受性を測定することを含む。
異種核酸を含むヒト以外のトランスジェニック動物が提供され、該核酸および該動物は、野生型の表現型と比較して、マクロファージ活性化の阻害、ウイルス性感染症もしくは細菌性感染症に対する感受性、ＴＮＦ−α産生の低下の特徴、またはそのいずれか２つもしくはそれ以上の組み合わせを含む表現型を示す。１つの態様において、該動物の表現型が、低下されたリン酸化およびリポ多糖体による誘導でのＩＲＦ−３の二量体化、リポ多糖体による誘導での非−応答性ＩＦＮ−β産生、または水疱性口内炎ウイルスもしくは狂犬病ウイルスにより誘導される細胞溶解に対するマクロファージの過剰な感受性を特徴とする。さらなる態様において、ＣＤ１４遺伝子における機能喪失性の対立遺伝子は、Ｑ２８４Ｘの未成熟終始コドンである。詳細な態様において、動物は、マウスまたはラットである。細胞または細胞系は、ＣＤ１４遺伝子の機能喪失性の対立遺伝子を含むヒト以外のトランスジェニック動物から誘導され得る。
Ｔｏｌｌ様受容体４−またはＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆ−シグナル伝達活性のモジュレーターをスクリーニングする試験官内の方法であって、ヒト以外のトランスジェニック動物から誘導された細胞または細胞系を試験化合物と接触させること、およびＴＮＦ−α産生量の増加もしくは減少、ウイルス性感染症もしくは細菌性感染症に対する感受性、またはＴｏｌｌ様受容体４−もしくはＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆ−誘導性のマクロファージ活性化の活性を検出し、それにより、試験化合物をＴｏｌｌ様受容体４−もしくはＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆ−誘導性のマクロファージ活性化の活性のモジュレーターと同定することを含む方法が提供される。
Ｔｏｌｌ様受容体４−またはＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達活性のモジュレーターをスクリーニングするインビボの方法であって、ヒト以外のトランスジェニック動物から誘導された細胞または細胞系を、試験化合物と接触させること、およびＴＮＦ−α産生量の増加もしくは減少、ウイルス性感染症もしくは細菌性感染症に対する感受性、またはＴｏｌｌ様受容体４−もしくはＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆ−誘導性のマクロファージ活性化の活性を検出し、それにより、試験化合物をＴｏｌｌ様受容体４−もしくはＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆ−誘導性のマクロファージ活性化の活性のモジュレーターと同定することを含む方法が提供される。
自己免疫疾患をモジュレートする化合物をスクリーニングする方法であって、試験化合物を、リガンドに対する応答をシグナル伝達できるＴｏｌｌ様受容体４を発現する細胞を含む、細胞に基づくアッセイ系と接触させること、ＣＤ１４およびリガンドを、Ｔｏｌｌ様受容体４シグナル伝達を活性化するのに有効であるように選択された量でアッセイ系に供すること、およびアッセイにおける試験化合物の有効性が自己免疫疾患のモジュレーションの指標であるため、アッセイ系での試験化合物のＴｏｌｌ様受容体４シグナル伝達における効果を検出することを含む方法が提供される。さらなる態様において、本方法は、リガンドに対する応答をシグナル伝達できるＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆを発現する細胞を含み、ＣＤ１４およびリガンドを、ＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達を活性化するのに有効であるように選択された量でアッセイ系に供すること、およびアッセイにおける試験化合物の有効性が自己免疫疾患のモジュレーションの指標であるため、アッセイ系での試験化合物のＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達における効果を検出することを含む。
詳細な態様において、自己免疫疾患は、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、実験的自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、実験的ぶどう膜網膜炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早発閉経、男性不妊症、若年性糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎Ｈｂｓ−ｖｅ、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、ポリ／皮膚筋炎、円板状ＬＥまたは全身性エリテマトーデスである。
感染症をモジュレートする化合物をスクリーニングする方法であって、試験化合物を、リガンドに対する応答をシグナル伝達できるＴｏｌｌ様受容体４を発現する細胞を含む、細胞に基づくアッセイ系と接触させること、ＣＤ１４およびリガンドを、Ｔｏｌｌ様受容体４シグナル伝達を活性化するのに有効であるように選択された量でアッセイ系に供すること、およびアッセイにおける試験化合物の有効性が感染症のモジュレーションの指標であるため、アッセイ系での試験化合物のＴｏｌｌ様受容体４シグナル伝達における効果を検出することを含む方法が提供される。さらなる態様において、本方法は、リガンドに対する応答をシグナル伝達できるＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆを発現する細胞を含み、ＣＤ１４およびリガンドを、ＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達を活性化するのに有効であるように選択された量でアッセイ系に供すること、およびアッセイにおける試験化合物の有効性が感染症のモジュレーションの指標であるため、アッセイ系での試験化合物のＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達における効果を検出することを含む方法が提供される。
感染症は、細菌性疾患もしくはウイルス性疾患である。詳細な態様において、感染症は、ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、サイトメガロウイルス感染症または黄色ブドウ球菌感染症である。
詳しい記載
Ｔｏｌｌ様受容体４経路を介した細胞内のシグナル伝達をモジュレートする化合物を同定する、組成物および方法が提供される。ＣＤ１４蛋白質は、Ｔｏｌｌ様受容体のシグナル伝達およびリポ多糖体（ＬＰＳ）センシングを介した活性化に役割を果たす。この研究において、ＣＤ１４遺伝子中の変異が生じた場合、それはＬＰＳセンシングの観点で、およびＣＤ１４ＭＤ−２ＴＬＲ４複合体特性の制限の点で利点があった。Ｔｏｌｌ様受容体４経路を介した細胞内のシグナル伝達をモジュレートする化合物を同定する方法であって、試験化合物をリガンドに対する応答をシグナル伝達できるＴｏｌｌ様受容体４を発現する細胞を含む、細胞に基づくアッセイ系と接触させること、ＣＤ１４およびリガンドを、Ｔｏｌｌ様受容体４シグナル伝達を活性化するのに有効であるように選択された量でアッセイ系に供すること、およびアッセイにおける試験化合物の有効性がモジュレーションの指標であるため、アッセイ系での試験化合物のＴｏｌｌ様受容体４シグナル伝達の効果を検出することを含む方法が提供される。
リポ多糖体（ＬＰＳ）センシングに関与する全ての蛋白質を同定し、それらの特異性および相互作用を理解しようとする努力の中で、生殖細胞系突然変異生成し、スクリーニングするプログラムにおいて、第三世代（Ｇ３）変異体Ｃ５７ＢＬ／６マウスから集められたマクロファージを生体外（エックスビボ）で多様なＴＬＲ活性化因子（ＬＰＳを含む）を用いて刺激する。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）産生を、表現型分析の主な評価項目として監視する。ＣＤ１４遺伝子中の変異が生じた場合、それはＬＰＳセンシングの観点でおよびＣＤ１４ＭＤ−２ＴＬＲ４複合体特性の制限の点で利益を与える、組成物および方法が提供される。
劣性突然変異「ヒードレス」は、微生物の誘導因子に対する欠損応答を示す、第三世代（Ｇ３）のＮ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア−変異マウスにおいて検出された。ヒードレスホモ接合型のマクロファージは、ラフＬＰＳおよびリピドＡに対する応答でＭｙＤ８８−依存経路を介してシグナル伝達したが、スムースＬＰＳに対しては応答しなかった。さらに、ヒードレス変異は、すべてのＬＰＳ化学型に応答するＴＲＡＭ−ＴＲＩＦ−依存性のシグナル伝達を妨げた。また、ヒードレスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に応答するマクロファージを失っており、実質的にＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）−ＴＬＲ６ヘテロ二量体に対する特異リガンドに対する応答を阻害した。ヒードレス表現型は、Ｃｄ１４における未成熟終始コドンの位置に起因する。FerreroおよびGoyert, Nucleic Acids Res., 16: 4173, 1988; NCBI GenBank P08571。我々のデータは、ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体が、ＬＰＳ化学型を認識するが、ＣＤ１４がこの認識能を無効にすることを示す。従って、ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合受容体は、２つの異なる様式で機能し得る；１つは、完全なシグナル伝達が生じる場合であり、もう１つは、ＭｙＤ８８−依存的シグナル伝達が制限された場合である。
本発明は、特定の方法、試薬、成分、組成物または生物系に限定されるものではなく、当然ながら変更することができると理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は、単に特定の態様を記載する目的ためのものであり、限定されることを意図するものではないこともまた、理解されるべきである。詳細な説明および添付する特許請求の範囲で用いられる、単数形の「ある（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文章で特に明確しない限り、複数形を含む。従って、例えば「ある細胞」に対する言及には、２個またはそれ以上の細胞の組み合わせなどが含まれる。
測定値、例えば量、一時的な期間などに言及する場合に、本明細書で用いられる「約」は、開示する方法を実施するのに適当であるように、具体的な値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、およびさらにより好ましくは±０．１％の変分を含有することを意味する。
特に定義しない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載するものと類似のまたは相当する方法および物質のいずれも、本発明を試験するための実地に用いることができ、好ましい物質および方法を本明細書に記載する。本発明の記載および請求項において、以下の用語が用いられよう。
「自己免疫疾患」は、自己の分子から外来分子を区別する免疫系の不能性および自己抗原に対する免疫学的寛容性の喪失により生じ、自己の分子を破壊する結果となる疾患を意味する。自己免疫疾患には、限定されるものではないが、インスリン−依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎（動物モデルの多発性硬化症）、関節リウマチ、実験的自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、実験的ぶどう膜網膜炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早期閉経、男性不妊症、若年性糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、突発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎Ｈｂｓ−ｖｅ、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、ポリ／皮膚筋炎、円板状ＬＥおよび全身性エチテマトーデスが含まれる。
「自己抗原」は、自分の抗原を意味し、それは、哺乳動物内で一般に見られる物質であり、通常自己として認識されるが、自己免疫疾患のため、その哺乳動物に外来物と誤って認識される。すなわち、自己抗原がその哺乳動物のリンパ球または抗体によりその哺乳動物自身の一部と認識されず、自己抗原が外来物質であるかのように認められ、その哺乳動物の免疫調節系から誤って攻撃される。従って、自己抗原は、特定の自己免疫疾患を引き起こす要因となる免疫系部門を下方調節して作用する。本明細書で用いられる「自己抗原」は、哺乳動物に投与された場合に、自己免疫疾患の症状を示す病態を誘発する自己抗原性の物質もまた意味する。本発明にかかる自己抗原は、哺乳動物により外来と認識されるが、病態でなければ自己の抗原として認識される、自己抗原から誘導されるエピトープまたはエピトープ群の組み合わせを含む。
本発明に関して有益な自己抗原は、限定されるものではないが、Ｔ−細胞媒介型の自己免疫疾患の抑制に関係する自己抗原を含む。
自己抗原は、免疫応答を引き起こす分子、または免疫寛容の状態を誘導する分子を意味し、限定されるものではないが、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ、抗体またはその断片を含み、核酸の遺伝子情報に対応する合成ペプチド、ガンマグロブリンまたはその断片を含み、核酸の遺伝子情報に対応する合成ペプチド、移植抗原またはその断片を含み、核酸の遺伝子情報に対応する合成ペプチドを含む。本発明に関する自己抗原にはまた、自己抗原から誘導されるエピトープまたはエピトープ群の組み合わせも含まれる。
「Ｔ−細胞媒介型の自己免疫疾患」は、疾患の影響が、リンパ球の炎症性サイトカイン産生のＴＨ１媒介刺激により誘導される自己免疫疾患を示す。Ｔ−細胞媒介型の自己免疫疾患には、限定されるものではないが、実験的自己免疫脳脊髄炎、多発性硬化症、間接リウマチ、重症筋無力症、甲状腺炎、実験的ぶどう膜網膜炎および放射線疾患が含まれる。ＴＨ１媒介型の自己免疫疾患の抑制に関係する自己抗原には、限定されるものではないが、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、インスリン、ミエリン塩基性蛋白質、ＩＩ型コラーゲン、ニコチン性アセチルコリン受容体、チログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼおよびロドプシン糖タンパクＳ−抗原、ＩＲＢＰ−レチナール蛋白質およびリカバリンが含まれる。
「マクロファージ活性化の阻害」は、誘導物質、例えばリポ多糖に応答したマクロファージにおけるＴＬＲ４−誘導共刺激分子（ＣＤ１４）の発現の阻害を意味する。マイクロファージ上のＣＤ１４の発現は、ＦＡＣＳにより解析できる。
「ウイルス性感染症または細菌性感染症に対する感受性」は、感染性ウイルス、例えばマウス・サイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）、または感染性細菌、リステリア菌に対する感受性を意味する。ＭＣＭＶ感染に対する感受性は、ＭＣＭＶ感染の結果としてのマウスの死亡までの時間で測定される。リステリア菌感染に対する感受性は、リステリア菌に感染したマウスのマクロファージにおけるＴＮＦおよびＩＬ−１２ｐ４０ｍＲＮＡ産生として測定される。黄色ブドウ球菌感染に対する感受性は、黄色ブドウ球菌感染の結果としてのマウスの死亡までの時間で測定される。
「ＴＮＦ−α産生の低下」は、リポ多糖体（ＴＬＲ４−選択的刺激物）に応答して正常な量のＴＮＦ−αを産生できない哺乳動物対象を意味する。
「免疫細胞応答」は、免疫細胞遊走、標的細胞の破壊、食作用、抗体の産生、免疫応答の他の水溶性エフェクターなどの生成の結果をもたらす、生化学的変化を免疫細胞に生じさせる、外的または内的刺激（例えば、抗原、サイトカイン、ケモカインおよび他の細胞）に対する免疫系細胞の応答を意味する。
「Ｔリンパ球反応」および「Ｔリンパ球活性」は、Ｔリンパ球に依存する免疫応答の構成（すなわち、Ｔリンパ球の増殖および／またはヘルパー、細胞障害性キラーもしくはサプレッサーＴリンパ球への分化、抗体産生を引き起こすまたは抑制するヘルパーＴリンパ球によるＢリンパ球に対するシグナルの供給、細胞障害性Ｔリンパ球による特定の標的細胞の破壊、および他の免疫細胞の機能をモジュレートするサイトカインなどの可溶性因子の放出）に言及する際に、本明細書中では相互交換可能に用いられる。
「免疫応答」は、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または自己免疫または病理学的炎症の場合には正常なヒト細胞もしくは組織に対する、選択的な損傷、破壊あるいは人体からの排除の結果を伴う、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒細胞、および前記細胞または肝臓により産生される可溶性高分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の協調作用を意味する。
「炎症」または「炎症反応」は、組織が細菌、外傷、毒素、熱または他のいずれかの原因により損傷を受けた場合に起こる、先天的な免疫応答を意味する。その損傷組織は、ヒスタミン、ブラジキニンおよびセロトニンを含む化合物を放出する。炎症は、急性反応（すなわち、炎症の進行が盛んな時の反応）および慢性反応（すなわち、緩徐な進行および新しい結合組織の形成により示される反応）の両方を意味する。急性および慢性的炎症は、関与する細胞型により区別できる。急性炎症は、多形核好中球がしばしば関係するが、慢性的炎症は、リンパ組織球増加（lymphohistiocytic）および／または肉芽腫性反応により通常特徴付けられる。炎症は、特定および不特定の防衛システム両方の反応を含む。特定の防衛システム反応は、抗原（場合により、自己抗原を含む）に対する特定の免疫系の反応である。不特定の防衛システム反応は、免疫記憶不能な白血球により媒介される炎症反応である。そのような細胞には、顆粒細胞、マクロファージ、好中球および好酸球が含まれる。炎症の特定の型の例には、びまん性炎症、局所性炎症、クループ性炎症、介在性炎症、閉塞性炎症、実質性炎症、反応性炎症、特定炎症、毒性炎症および外傷性炎症がある。
「患者」、「対象」または「哺乳動物」は、相互交換可能に用いられ、哺乳動物、例えばヒト患者およびヒト以外の霊長類、並びに実験動物、例えばウサギ、ラットおよびマウスおよび他の動物を意味する。動物には、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物および哺乳類以外の動物、例えばヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類および爬虫類が含まれる。
「処置する」または「処置」は、症状、合併症、または疾患の生化学的兆候の発症を予防または遅延させ、症状を軽減または改善させるか、または疾患、病状または障害（例えば、感染症、炎症または自己免疫疾患）のさらなる進行を抑制または阻害するため、本発明の組成物、化合物または薬剤を投与することを含む。「処置する」はさらに、病気、病状または障害（例えば、感染症、炎症または自己免疫疾患）の処置または改善または予防における一連の兆候を示し、いずれかの客観的または主観的パラメータ、例えば、寛解すること；緩和すること；兆候の軽減もしくは患者を病状に対してより寛容化させること；衰退または減退の速度を遅らせること；または衰退の最終点をより弱めることを含む。兆候の処置または改善は、医師による検査結果を含む、客観的または主観的パラメータに基づき得る。従って、用語「処置する」は、感染症、炎症または自己免疫疾患に関連する兆候もしくは症状の進行を予防もしくは遅延させるため、軽減させるため、または阻止もしくは阻害するために、本発明の化合物または薬剤を投与することを含む。用語「治療効果」は、対象における疾患、病状もしくは疾患の副作用の軽減、解消もしくは予防を意味する。本発明の方法を用いて「処置する」または「処置」は、感染症、炎症または自己免疫疾患の増大した危険性を有し得るが、いまだ症状を経験も顕在化もしていない対象における症状の発症を予防すること、感染症、炎症または自己免疫疾患の症状を阻害すること（進行を遅らせること、または阻止すること）、感染症、炎症または自己免疫疾患の副作用の症状に対し軽減を与えること（緩和剤処置を含む）、および感染症、炎症または自己免疫疾患の症状を除去すること（退行を生じさせる）を含む。処置には、予防（疾病の発症の予防もしくは遅らせること、またはその臨床的もしくは亜臨床的症状の顕在化を予防すること）または治療的抑制、あるいは疾病または状態が顕在化した後の、症状の臨床的もしくは亜臨床的緩和があり得る。
感染症を有することが疑われる哺乳動物対象において、感染症を処置する方法であって、該対象にＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性のモジュレーターを、ラブドウイルス感染症を軽減または除去するのに有効な量で、あるいはその発症または再発を予防するのに有効な量で投与することを含む方法が提供される。１つの態様において、ＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性の阻害物質は、感染性のウイルス性疾患、例えばラブドウイルス感染症を処置するのに用いることができる。加えて、グラム陽性およびグラム陰性細菌の感染症および真菌感染症のいずれも、ＴＬＲ４（グラム陰性の疾病の場合）およびＴＬＲ２（グラム陽性または真菌の疾病の場合）を介したシグナル伝達を弱め得る阻害物質を用いて処理することができる。
哺乳動物対象における自己免疫疾患または炎症を処置する方法であって、哺乳動物対象にＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性のモジュレーターを、自己免疫疾患または炎症を軽減または除去するのに有効な量で、あるいはその発症または再発を予防するのに有効な量で投与することを含む方法が提供される。１つの態様において、モジュレーターは、ＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性のアンタゴニストまたは阻害物質である。最新の研究で、炎症の間に産生されるヒアルロン酸部分は、ＴＬＲ４を刺激することが示された。このことは、ＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性をアンタゴニストまたは阻害物質を用いて阻害することで、炎症を弱め得ることを示している。Jiang, Dら、Nat Med.;11: 1173-1179, 2005；Taylor, KRら、J Biol Chem. 279: 17079-84, 2004。Termeer, C.ら、J Exp Med. 195: 99-111, 2002。
細胞のＴｏｌｌ様受容体の「阻害物質」「活性物質」および「モジュレーター」は、阻害、活性化またはモジュレートする分子に言及して用いられ、それぞれ、Ｔｏｌｌ様受容体結合またはシグナル伝達についてのインビトロおよびインビボアッセイに用いることが確認された分子、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニストおよびその相同体ならびに模倣物である。
「モジュレーター」は、阻害物質、活性物質を含む。阻害物質は、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体に結合する、部分的もしくは全体的に刺激を阻止する、低下させる、抑制する、遅延活性化する、不活性化する、脱感作する、またはＴｏｌｌ様受容体の活性を下方制御する物質、例えば、アンタゴニストである。活性物質は、Ｔｏｌｌ様受容体と結合する、Ｔｏｌｌ様受容体の活性を刺激する、増大させる、開放する、活性化する、促進する、活性化を増強する、増感するまたは上方制御する物質、例えば、アゴニストである。モジュレーターは、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体との相互作用を改変する物質、活性物質または阻害物質と結合する蛋白質、受容体を含み、蛋白質、ペプチド、脂質、炭水化物、多糖類またはそれらの組み合わせ、例えば、リポ蛋白質、糖蛋白質およびその類似物が含まれる。モジュレーターには、例えば、改変された活性を有する、天然のＴｏｌｌ様受容体リガンドの遺伝的にモディファイされた形態、ならびに天然リガンドおよび合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、低分子化合物およびその類似物が含まれる。阻害物質および活性物質の「細胞に基づくアッセイ」には、本明細書中に記載されるように、例えば、推定されるモジュレーター化合物を、Ｔｏｌｌ様受容体を発現する細胞に適用し、次いで、Ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達の機能効果を決定することが含まれる。「細胞に基づくアッセイ」には、限定されるものではないが、インビボ組織または哺乳動物対象からの細胞試料、またはインビトロの細胞に基づくアッセイが含まれ、潜在的な活性物質、阻害物質またはモジュレーターで処理されたＴｏｌｌ様受容体を含む該試料は、阻害範囲を調べるために阻害物質、活性物質またはモジュレーターを含まない対照試料と比較される。対照試料（阻害物質で処理していない）には、相対的なＴｏｌｌ様受容体活性値１００％を割り当てることができる。Ｔｏｌｌ様受容体の阻害は、対照に対してＴｏｌｌ様受容体活性値が約８０％、場合により５０％または２５−０％が達成される。Ｔｏｌｌ様受容体の活性化は、対照に対してＴｏｌｌ様受容体活性値が１１０％、場合により１５０％、場合により２００−５００％または１０００−３０００％以上が達成される。
例えば、ＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性のアゴニストは、適応的免疫応答を助長するであろうシグナル伝達を誘導し得る；すなわち、クチン摂取に有用である。また、アゴニストは、多種多様な感染症に対し宿主の耐性に短期の増強をもたらし得る。ＭｙＤ８８−非依存またはＭｙＤ８８−依存経路を介したシグナル選択性の能力を有するため、特別な効果、例えば低い毒性、およびＭｙＤ８８−非依存シグナル伝達に関するＩ型インターフェロンの選択的導入、またはＭｙＤ８８−依存的シグナル伝達に関するＮＦ−ｋβ依存的サイトカインの選択的導入を与え得る。
さらなる例として、ＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性のアンタゴニストは、潜在的な重篤な感染症の致死的な炎症効果を減衰させることができ、自己免疫疾患に有用であり得る。
Ｔｏｌｌ様受容体４経路を介する細胞内シグナル伝達のモジュレーターを同定する方法であって、試験化合物を、リガンドに対する応答をシグナル伝達できるＴｏｌｌ様受容体４を発現する細胞を含む、細胞に基づくアッセイ系と接触させること、ＣＤ１４およびリガンドを、Ｔｏｌｌ様受容体４シグナル伝達を活性化するのに有効であるように選択された量でアッセイ系に供すること、およびアッセイにおける試験化合物の有効性がモジュレーションの指標であるため、アッセイ系での試験化合物のＴｏｌｌ様受容体４シグナル伝達における効果を検出することを含む方法が提供される。
さらなる態様において、本方法は、リガンドに対する応答をシグナル伝達できるＴＲＡＭ−ＴＲＩＦを発現する細胞を提供し、ＣＤ１４およびリガンドを、ＴＲＡＭ−ＴＲＩＦシグナル伝達を活性化するのに有効であるように選択された量でアッセイ系に供すること、およびアッセイにおける試験化合物の有効性がモジュレーションの指標であるため、アッセイ系での試験化合物のＴＲＡＭ−ＴＲＩＦシグナル伝達における効果を検出することを含む方法である。ＣＤ１４を介したＴＬＲ−４シグナル伝達について上記したように、ＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達は、ＭｙＤ８８−非依存シグナル伝達である。ＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達のアゴニストは、選択的にインターフェロン産生をもたらすため、ＬＰＳ投薬の方法で受容体を活性化する（両方の経路を刺激する）よりも低い毒性を示す。ＴＲＡＭ−ＴＲＩＦシグナル伝達のアゴニストは、アジュバントを製剤化するのに、また抗ウイルス効果にも有用であり得る。ＴＲＡＭ−ＴＲＩＦシグナル伝達のアンタゴニストは、ある程度の炎症を阻止することができるし、ＩＬ−６、ＩＬ−２およびＴＮＦの誘導を部分的に妨げることができ、それにより感染症と戦う手助けとなり得る。
Ｔｏｌｌ様受容体に結合する分子能力は、例えば、アッセイプレート上に被覆されたＴｏｌｌ様受容体免疫接着因子（イムノアドヘシン）に結合する推定リガンドの能力により決定することができる。結合の特異性は、Ｔｏｌｌ様受容体以外のものへの結合と比較することにより決定され得る。
「試験化合物」は、ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４のモジュレーターとして試験されるいずれかの化合物を意味する。試験化合物は、有機小分子、または生物学的な構成要素、例えば、抗体もしくはペプチドなどの蛋白質、糖、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉもしくはボザイムなどの核酸、または脂質であってよい。別には、試験化合物は、ＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質の遺伝的に改変された形式のモジュレーターであってもよい。典型的には、試験化合物は、有機小分子、ペプチド、脂質または脂質類似体であろう。
１つの態様において、Ｔｏｌｌ様受容体に結合する抗体は、リガンドまたは受容体のいずれかを固定することによりアッセイできる。例えば、このアッセイは、Ｎｉ−活性化ＮＴＡ樹脂ビーズ上に、Ｈｉｓタグ融合されたＴｏｌｌ様受容体を固定することを含み得る。抗体は、適当な緩衝液に加えられ、そのビーズを所定の温度で一定期間インキュベートし得る。結合していない物質を除去するために洗浄した後、結合した蛋白質を、例えば、ＳＤＳ、高ｐＨの緩衝液およびその類似物を用いて放出させ、分析することができる。
「シグナル伝達応答」は、Ｔｏｌｌ様受容体、例えばＴｏｌｌ様受容体４を介したシグナル伝達を意味する。シグナル伝達応答は、例えばＬＰＳがＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４）とＭＤ−２により形成される膜貫通型の複合体に依存して応答し、シグナルを伝播することを意味し得る。４つのアダプター蛋白質によるＴＬＲ４シグナルは、機能的な一対、ＭｙＤ８８とＭａｌ（ＴＩＲＡＰとしても知られている）、およびＴＲＩＦとＴＲＡＭで作動すると考えられる。細胞に基づくアッセイにおいて測定するためのシグナルを生じさせる化合物は、例えば、酵素または蛍光分子との結合により作製することができる。標識として関心のある酵素は、第一には加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーぜおよびグリコシダーゼ、または酸化酵素、特にペルオキシダーゼであろう。蛍光化合物には、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれる。化学ルミネセント化合物には、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールが含まれる。
「試験化合物のＴｏｌｌ様受容体４シグナル伝達における効果を検出する」は、哺乳動物対象における治療もしくは予防効果、例えば、対象における疾病、疾病の症状、または疾病の副次的な悪影響の低下、除去または予防を意味する。「試験化合物のＴｏｌｌ様受容体４シグナル伝達における効果を検出する」は、細胞に基づくアッセイ、例えば診断アッセイにおいて、ＬＰＳシグナル伝達またはリピドＡシグナル伝達により測定される、およびＴＮＦ−α発現により測定されるような、効果を有する化合物を意味する。ＣＤ１４遺伝子における機能喪失性の変異、例えばヒードレス変異は、Ｉ型ＩＦＮの産生に影響を及ぼし得る。この変異は、ＭｙＤ８８−非依存経路を介したシグナル伝達によるスムースＬＰＳとリピドＡの両方を妨げる。特に、ＣＤ１４機能的喪失性の変異、ヒードレスは、Ｉ型ＩＦＮおよびＩＦＮ−βｍＲＮＡの産生、ならびにＩＦＮ−誘導性遺伝子、例えばＩＦＩＴ１、ＩＳＧ１５の誘導の産生を妨げる。リピドＡに応答したＩＲＦ−３リン酸二量体（phosphodimer）の形成が、ヒードレス変異細胞では検出されなかった。ＣＤ１４機能喪失性の変異（ヒードレス）トランスジェニック動物からのマクロファージは、ＶＳＶにより誘導される細胞溶解素に過剰に反応する。
本発明の化合物と既知の薬剤の「同調投与」は、既知薬剤と化合物の両方が、治療効果または診断効果を有するよう、適時の薬物と本化合物との投与を意味する。このような同調投与は、本発明の化合物の投与に関して、併用（すなわち、同時）、前または後の投与を含んでいてもよい。当業者には、特定の薬物および本発明の化合物を投与する適当な時期、順序および投与量を決定することは困難なことではない。
一般に、用語「よく寛容化される」は、処置結果として起こる、および処置の決定に影響する健康状態に不利な変化が見られないことを意味する。
ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４のモジュレーターとしての抗体
本明細書中に記載される抗体およびその抗原結合断片は、ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４に特異的に結合し、外因性のリガンド、例えばラフＬＰＳまたはリピドＡに対する先天性の免疫応答、または細胞における水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）感染もしくは狂犬病ウイルス感染に対する応答をモジュレートし、活性化し、または阻害し得るが、外因性のリガンドであるスムースＬＰＳに対する応答には反応しない。
ＴＬＲ４を結合する抗体またはＣＤ１４を結合する抗体は、Ｔｏｌｌ様受容体４経路を介した細胞内のシグナル伝達をモジュレートする化合物として有用である。例えば、Akashi,ら、The Journal of Immunology 164: 3471-3475, 2000；Leturcqら、J Clin Invest. 98: 1533-1538, 1996を参照のこと。
幾つかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ハイブリドーマ細胞系により産生される抗体により選択的に結合される抗原に選択的に結合する（例えば、競合的に結合する、または同じエピトープ、例えば構造エピトープもしくは直線状エピトープに結合する）。従って、エピトープは、抗体により結合される既知のエピトープに対して、空間的に非常に近傍し、もしくは機能的に関係していてもよく、例えば直線配列もしくは立体構造で重複または近接したエピトープであってよい。潜在的なエピトープは、ペプチド読み取りプログラムを用いてコンピューターにより同定することができるし、当分野で既知の方法により、例えば、抗体のＴｏｌｌ様受容体４もしくはＣＤ１４の変異体または断片、例えばＴｏｌｌ様受容体４もしくはＣＤ１４ドメインの変異体または断片に対する結合をアッセイすることにより実証できる。
本明細書で記載される抗体の配列を決定する方法は、当分野で知られており；例えば、抗体の配列は、ハイブリドーマ細胞系から抗体をコードするｃＤＮＡを単離し、同定する既知の技術を用いて決定することができる。ｃＤＮＡの配列を決定する方法は、当分野で知られている。
本明細書で記載される抗体は、典型的には、少なくとも１つまたは２つの重鎖可変領域（ＶＨ）、および少なくとも１つまたは２つの軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに、非常によく保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）で分離して配置された相補性決定領域（ＣＲＤ）と称される超可変領域に分けることができる。これらの領域は、正確に定義されている（Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991およびChothiaら、J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987を参照のこと）。抗体または１つまたはそれ以上のフレームワーク領域を含む抗体断片はまた、本発明に有用である。そのような断片は、Ｔｏｌｌ様受容体４ドメインに特異的に結合し、リポ多糖体により誘導された細胞内のＴＮＦ−α活性を活性化もしくは阻害するか、または水疱性口内炎ウイルスまたは狂犬病ウイルスに対するマクロファージ応答を活性化または阻害する能力を有する。
本明細書で記載される抗体は、重鎖および／または軽鎖定常領域（定常領域は、典型的には、免疫系のエフェクター細胞と古典的補体系の最初の成分（Ｃ１ｑ）とを含む、抗体と宿主組織または因子との間の結合を媒介する）を含み、その結果、それぞれ重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖を形成し得る。例えば、抗体は、４量体（２つの重鎖と２つの軽鎖免疫グロブリンで、それらは、例えばジスルフィド結合により連結され得る）であり得る。抗体は、重鎖の定常領域部分（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３と称される３つの重鎖ドメインのいずれか）または軽鎖の定常領域部分（例えば、ＣＬと称される領域部分）だけを含む場合がある。
抗原結合断片もまた本発明に含まれる。そのような断片は、（ｉ）Ｆａｂ断片（すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（すなわち、ヒンジ領域でジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂ断片からなる二価の断片）；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Wardら, Nature 341: 544-546 1989)；および／または（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）であってもよい。
抗体の断片（上記の抗原結合断片を含む）は、当分野で既知の方法、例えば自動ペプチド合成機で、または例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において全長遺伝子もしくは遺伝子断片の発現によって、合成することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体分子のペプシン消化により産生でき、またＦａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド結合を還元することにより生成できる。別法として、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の比較的迅速な同定を可能にする、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築してもよい（Huseら、Science 246: 1275-81, 1989）。
他の抗体および抗体断片の作成方法は、当分野で知られている。例えば、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬとＶＨは、別々の遺伝子にコードされているが、それらを、一本鎖の蛋白質として作製するため、ＶＬとＶＨ領域を一組にして一価の分子を形成させることを可能にする組み換え方法を用いて、または合成リンカーを用いて連結することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Birdら、Science 242: 423-426, 1988；Hustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988；Colcherら、Ann. NY Acad. Sci. 880: 263-80, 1999；およびReiter, Clin. Cancer Res. 2: 245-52, 1996を参照のこと）。
一本鎖抗体を産生するための技術はまた、米国特許第４，９４６，７７８号明細書および第４，７０４，６９２号明細書に記載されている。そのような一本鎖抗体は、抗体の用語「抗原結合断片」の中に含まれる。これらの抗体断片は、当業者に既知の一般的な技術を用いて得られ、該断片は、完全な抗体をスクリーニングするのと同じ様式で実用的にスクリーニングされる。さらに、一本鎖抗体は、複合体または多量体を形成させ、それにより、同じ標的蛋白質の異なるエピトープに対する特性を有する多価抗体とすることができる。
本明細書で記載される抗体またはその一部は、モノクローナル抗体であってよく、モノクローナル抗体から生成されてもよく、または、当分野で既知の合成方法により産生することもできる。抗チアは、組み換え技術により産生することができる（例えば、米国特許出願第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／１８６１９号パンフレット；国際公開第９１／１７２７１号パンフレット；国際公開第９２／２０７９１号パンフレット；国際公開第９２／１５６７９号パンフレット；国際公開第９３／０１２８８号パンフレット；国際公開第９２／０１０４７号パンフレット；国際公開第９２／０９６９０号パンフレット；国際公開第９０／０２８０９号パンフレット； Fuchsら、Bio/Technology 9: 1370-1372, 1991；Hayら、Human Antibody Hybridomas 3: 81-85, 1992；Huseら、Science 246: 1275-1281, 1989；Griffithsら、EMBO J. 12: 725-734, 1993；Hawkinsら、J. Mol. Biol. 226: 889-896, 1992；Clacksonら、Nature 352: 624-628, 1991；Gramら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580, 1992；Garradら、Bio/Technology 9: 1373-1377, 1991；Hoogenboomら、Nucl. Acids Res. 19: 4133-4137, 1991；およびBarbasら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982, 1991に記載されるように、ファージディスプレイによって、または組み換え技術方法により産生される）。
１つの例として、Ｔｏｌｌ様受容体４抗体またはＣＤ１４抗体は、動物を、ＴＬＲ４ポリペプチドもしくはＣＤ１４ポリペプチド、または断片（例えば、誘導された抗原性ペプチド断片（すなわち、これらＴＬＲ４もしくはＣＤ１４の一部の配列を有する）、またはＴＬＲ４抗原またはＣＤ１４抗原もしくはそれらの抗原断片を発現する細胞を用いて免疫する。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、精製されたＴＬＲ４またはＣＤ１４に結合し得る。幾つかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、組織切片、完全な細胞（生細胞、溶解されたもしくは細分化された細胞）、または膜画分におけるＴＬＲ４またはＣＤ１４に結合することができる。抗体は、例えばインビトロ系、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において、リポ多糖体により誘導されたＴＮＦ−α活性を活性化もしくは阻害する能力、または水疱性口内炎ウイルスもしくは狂犬病ウイルスに対するマクロファージの応答を活性化もしくは阻害する能力について試験し得る。
ＴＬＲ４もしくはＣＤ１４から誘導された抗原性ペプチドを用いても、それは、典型的には、ＴＬＲ４もしくはＣＤ１４ドメインの少なくとも８個（例えば、１０個、１５個、２０個、３０個、５０個、１００個もしくはそれ以上）の連続アミノ酸残基を含むであろう。幾つかの実施形態において、抗原性ペプチドは、ＴＬＲ４もしくはＣＤ１４ドメインの全部を含んでいてもよい。産生された抗体は、天然型の蛋白質（従って、直線状エピトープまたは立体構造エピトープを認識する抗体は、本発明の範囲内にある）、変性もしくはその他の非天然型の蛋白質のいずれか、あるいはその両方と特異的に結合し得る。抗原性があるようなペプチドは、当分野で既知の方法により、例えば、コンピューターに基づく抗原性予想アルゴリズム（antigenicity-predicting algorithm）により同定し得る。立体構造エピトープは、天然型の蛋白質には結合するが、変性型の蛋白質には結合しない抗体を確認することによって同定し得る。
宿主動物（例えば、ラビット、マウス、テンジクネズミもしくはラット）を、抗原、場合により担体（すなわち、該分子の免疫原性を安定化させるか、あるいは改善する物質）と連結された抗原を用いて免疫することができ、また、場合によりアジュバントを用いて投与してもよい（例えば、Ausubelら、を参照のこと、前掲）。例示的な担体は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が挙げられ、例示的なアジュバントには、フロインドアジュバント（完全もしくは不完全）、アジュバントミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアンサス、ペプチド、油乳剤、ジニトロフェノール、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌（bacille Calmette-Guerin））、およびコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum））が挙げられ、典型的には宿主動物の種の観点から選択され得る。また、ＫＬＨもしばしば、アジュバントとして参照される。宿主から産生された抗体は、例えば、そのポリペプチド抗原もしくはその断片を樹脂上に固定化する親和性クロマトグラフィー法により精製することができる。
抗原性ペプチドに包含されるエピトープは、典型的には蛋白質表面に（すなわち、親和性領域に）、または抗原性の高い領域に（そのような領域は、多くの電荷残基を含む理由で、最初に選択され得る）位置するであろう。ヒト蛋白質配列のエミニ・サーフェス（Emini surface）確率分析は、蛋白質表面に配置される確率の特に高い領域を示すのにを用いることができる。
抗体は、完全なヒト抗体であってもよい（例えば、ヒト免疫グロブリン配列、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子（カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロンおよびミューの定常領域遺伝子、または無数の免疫グロブリン可変領域）から抗体を産生するよう遺伝的に作り出された、マウスまたは他の哺乳動物において産生される抗体）。あるいは、抗体は、ヒト以外の抗体であってもよい（例えば、げっ歯類（マウスまたはラット）、ヤギ、ラビット、またはヒト外の霊長類（例えば、サル）の抗体）。
ヒトモノクローナル抗体は、マウスのそれよりはヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスで産生され得る。これらのマウス（興味のある抗原を用いて免疫した後）から得られた脾臓細胞は、ヒト蛋白質のエピトープに対して特異的な親和性を有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを作製するために用いることができる（例えば、国際公開第９１／００９０６号パンフレット、国際公開第９１／１０７４１号パンフレット；国際公開第９２／０３９１８号パンフレット；国際公開第９２／０３９１７号パンフレット；Lonbergら、Nature 368: 856-859, 1994；Greenら、Nature Genet. 7: 13-21, 1994；Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855, 1994；Bruggemanら、Immunol. 7: 33-40, 1993；Tuaillonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3720-3724, 1993；およびBruggemanら、Eur. J. Immunol. 21: 1323-1326, 1991を参照のこと）。
抗−ＴＬＲ４抗体または抗−ＣＤ１４抗体はまた、その可変領域、またはその一部（例えば、ＣＤＲ）が、ヒト以外の生物（例えば、ラットもしくはマウス）において生じるものであってもよい。従って、本発明は、キメラ抗体、ＣＤＲ−グラフト化（grafted）抗体、およびヒト化抗体、ならびにヒト以外の生物で産生され、次いでヒトにおける抗原性を減じさせるため（例えば、可変のフレームワークまたは定常領域において）モディファイされた抗体を包含する。キメラ抗体（すなわち、異なる部分が、他の動物種から誘導されている抗体（例えば、ネズミｍＡｂの可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域）は、当分野で既知の組み換え技術により作製され得る。例えば、ネズミ（または他の種）のモノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子は、制限酵素を用いて消化し、ネズミのＦｃをコードする領域を取り除くことができ、その結果、ヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の同等部分に置き換えることができる（例えば、欧州特許出願番号第１２５，０２３号；第１８４，１８７号；第１７１，４９６号；および第１７３，４９４号；また、国際公開第８６／０１５３３号パンフレット；米国特許第４，８１６，５６７号パンフレット；Betterら、Science 240: 1041-1043, 1988；Liuら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443, 1987；Liuら、J. Immunol. 139: 3521-3526, 1987；Sunら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218, 1987；Nishimuraら、Cancer Res. 47: 999-1005, 1987；Woodら、Nature 314: 446-449, 1985；Shawら、J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559, 1988；Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851, 1984；Neubergerら、Nature 312: 604, 1984；およびTakedaら、Nature 314: 452, 1984を参照のこと）。
ヒト化抗体またはＣＤＲ−グラフト抗体において、受容ＣＤＲの（重鎖もしくは軽鎖免疫グロブリンの）、一般的に３つ全部ではなく少なくとも１つまたは２つのが、供与ＣＤＲと置き換え得る（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号明細書；Jonesら、Nature 321: 552-525, 1986；Verhoeyanら、Science 239: 1534, 1988；およびBeidlerら、J. Immunol. 141: 4053-4060, 1988を参照のこと）。Ｔｏｌｌ様受容体４またはＣＤ１４に対するヒト化抗体の結合に必要な数のＣＤＲのみ置き換える必要がある。供与物は、げっ歯動物の抗体であってよく、受容物はヒトフレームワークであってもよいし、またはヒトのコンセンサス・フレームワークであってもよい。典型的には、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは、「供与物（ドナー）」と呼ばれ（しばしば、げっ歯動物の抗体である）、フレームワークを提供する免疫グロブリンは、「受容物（レシピエント）」と呼ばれる。受容物フレームワークは、天然の（例えば、ヒト）フレームワークであってもよく、コンセンサス・フレームワークもしくは配列、またはそれらと少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９９％）同一の配列であってもよい。「コンセンサス・配列」は、関連配列のファミリーからに最も頻繁に見られるアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成されたものである（例えば、Winnaker, From Genes to Clones, Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1987を参照のこと）。コンセンサス配列の各部位が、そのファミリーのその部位で最も頻繁に現れるアミノ酸残基により占められている（２つが同じ頻度で生じる場合、そのいずれかが含まれ得る）。「コンセンサス・フレームワーク」は、コンセンサス・免疫グロブリン配列のフレームワーク領域を意味する。Ｔｏｌｌ様受容体４もしくはＣＤ１４のヒト化抗体は、特定のアミノ酸残基が、（例えば、抗原結合性を向上させるためにフレームワーク領域において）置換、欠失もしくは付加されて作製されてもよい。例えば、ヒト化抗体は、供与物の残基と、または受容物以外の受容体のアミノ酸と同一のフレームワーク残基を有していてもよい。そのような抗体を産生するため、ヒト化免疫グロブリン鎖の選ばれた少数の受容物フレームワーク残基が、対応する供与物のアミノ酸に置換される。置換は、ＣＤＲと隣接して、またはＣＤＲの相互作用する領域内に生じてもよい（米国特許第５，５８５，０８９号明細書を参照のこと、特に１２〜１６段落を参照のこと）。ヒト化抗体についての他の技術は、欧州特許第５１９５９６Ａ１号に記載されている。
Ｔｏｌｌ様受容体４抗体またはＣＤ１４抗体は、上記のように、または当分野で既知の他の方法を用いてヒト化されてもよい。例えば、ヒト化抗体は、直接は抗原の結合と関係のないＦｖの可変領域の配列を、ヒトのＦｖ可変領域の同等の配列と置き換えることにより生成することができる。ヒト化抗体を生成する一般的な方法は、MorrisonによるScience 229: 1202-1207, 1985；Oiら、BioTechniques 4: 214, 1986およびQueenら（米国特許第５，５８５，０８９号明細書；第５，６９３，７６１号明細書および第５，６９３，７６２号明細書）により提供される。これらの方法に必要とされる核酸配列をＴｏｌｌ様受容体４またはＣＤ１４に対する抗体、あるいは、所望の特徴、例えば、リポ多糖体により誘導される細胞内のＴＮＦ−α活性を活性化もしくは阻害する能力、または水疱性口内炎ウイルスまたは狂犬病ウイルスに対するマクロファージ応答を活性化または阻害する能力を有するそれらの断片を産生するハイブリドーマから得ることができる。次いで、ヒト化抗体またはその断片をコードする組み換えＤＮＡは、適当な発現ベクター中にクローニングすることができる。
特定の実施形態において、抗体は、エフェクター機能を有し、相補物を固定することができる一方で、エフェクター細胞を補充したり、相補物を固定することはできない。また、抗体は、Ｆｃ受容体を結合する能力をほとんど、もしくは全く有し得ない。例えば、アイソトープもしくはサブタイプであってもよいし、または断片もしくはＦｃ受容体を結合することができない他の変異体（例えば、該抗体は、変異した（例えば、欠失）Ｆｃ受容体結合領域を有していてもよい）であってもよい。Ｆｃ領域を欠損した抗体は、典型的には、相補物を固定することができず、かくして、それが結合する細胞死を引き起こさないようである。
他の実施形態において、抗体は、異種の物質、例えば、治療物質（例えば、抗生物質）または検出可能な標識と結合されていてもよい。検出可能な標識には、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ、ベータ・ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ）、補欠分子団（例えば、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン），または蛍光物質、発光物質、生物発光物質、または放射性物質（例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフェコエリトリン（蛍光性である）、ルミノール（発光性である），ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリン（生物発光である）、９９ｍＴｃ、１８８Ｒｅ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈ（放射性である））が含まれる。
本明細書に記載の抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、Ｔｏｌｌ様受容体４またはＣＤ１４蛋白質もしくはそれらの断片、例えば、リポ多糖体により誘導される細胞内のＴＮＦ−α活性の活性化もしくは阻害、または水疱性口内炎ウイルスまたは狂犬病ウイルスに対するマクロファージ応答の活性化もしくは阻害に関係する断片を単離するために（例えば、親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈降法により）、または例えば、細胞溶解液もしくは上清例えば、ウェスタン・ブロッティング、酵素免疫測定吸着法、（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイなどの方法により）、または組織切片中のものを検出するために（用いることもできる。これらの方法は、特定の蛋白質の発現量および発現様式の決定を可能にする。この情報は、診断を行うのに、または臨床試験または処置の効果を評価するのに有用であり得る。
本発明はまた、上記の抗体をコードする核酸、ならびにそれらを含むベクターおよび細胞（例えば、ＣＨＯ細胞もしくはリンパ球細胞などの哺乳動物細胞）（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体４またはＣＤ１４を特異的に結合する抗体をコードする核酸で形質転換された細胞）を含む。同様に、本発明は、本発明の抗体を産生する細胞系（例えば、ハイブリドーマ）およびそれらの細胞系を作製する方法を含む。
ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４ポリペプチド、およびそれらのモジュレーターの免疫学的検出
ＣＤ１４遺伝子またはＴｏｌｌ様受容体４遺伝子、および核酸ハイブリダイゼーション技術を用いた遺伝子発現の検出に加えて、ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質を検出するために、免疫学的検定もまた用いることができる。そのようなアッセイは、ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４のモジュレーターをスクリーニングするのに、ならびに治療および診断応用に有用である。免疫学的検定は、定性的にもしくは定量的にＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質を分析するのに用いることができる。応用可能な技術の一般的な概観は、Harlow ＆ Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988において見出すことができる。
Ａ．抗体の産生
ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は、当業者に既知である（例えば、Coligan, Current Protocols in Immunology, 1991；Harlow ＆ Lane, 前掲；Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 第2版. 1986；およびKohlerら、Nature 256: 495-497, 1975。そのよう技術は、ファージベクターまたは類似のベクターにおける組み換え抗体のライブラリーから抗体を選択することによる抗体調製、ならびに、ラビットもしくはマウスを免疫することによるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体調製が含まれる（例えば、Huseら、Science 246: 1275-1281, 1989；Wardら、Nature 341: 544-546, 1989を参照のこと）。
ＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質の一部を含む多くの免疫原は、ＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質と特異的に反応する抗体を産生するために用いることができる。例えば、組み換えＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質、もしくはその抗原性断片は、本明細書に記載されるように単離することができる。組み換え蛋白質は、上記のように真核細胞または原核細胞に発現させることができ、また、上記のように一般的に精製することができる。組み換え蛋白質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生するための好ましい免疫原である。別法として、本明細書に開示された配列から誘導され、担体蛋白質に複合化された合成ペプチドは、免疫原として用いることができる。天然蛋白質もまた、純粋もしくは不純な形態のいずれかで用いることができる。次いで、その産物は、抗体を産生できる動物に注入される。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを作り出し、次に、その蛋白質を測定するため免疫学的測定に用いることができる。
ポリクローナル抗体の産生方法は、当業者に知られている。マウスの近交系（例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウス）またはラビットの近交系を、標準的なアジュバント、例えばフロインドアジュバント、および標準的な免疫プロトコルを用いて免疫した。免疫原調製物に対する動物の免疫応答は、試験血液を採取し、ベータサブユニットに対する反応性の力価を決定することにより監視した。免疫原に対する適当な高い力価の抗体が得られた場合、動物から血液を採取し、血清が調製される。要すれば、蛋白質に対して反応する抗体を富ませるため血清の分画がさらに行われる（Harlow ＆ Lane、前掲）。
モノクローナル抗体は、当業者には慣用の様々な技術により得ることができる。簡単には、所望の抗原で免疫した動物からの脾臓細胞を、一般的には骨髄腫細胞と融合することにより不死化させる（Kohlerら、Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976を参照のこと）。免疫の別法には、エプスタイン・バーウイルス、癌遺伝子またはレトロウイルスを用いたトランスフェクション、当分野で周知の他の方法が含まれる。単一の不滅細胞から生じたコロニーが、抗原に対して所望の特異的で、親和性の抗体産物についてスクリーニングされ、該細胞により産生されたモノクローナル抗体は、脊椎動物の腹膜腔中に注射することを含む種々の技術により増強することができる。あるいは、Huseら、Science 246: 1275-1281, 1989による一般的なプロトコルに従ってヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはその結合断片をコードするＤＮＡ配列を単離してもよい。
モノクローナル抗体およびポリクローナル血清を集め、免疫学的検定、例えば固体支持体上で固定された免疫原を用いる固相免疫学的検定において、免疫原蛋白質に対して力価測定した。典型的には、１０４またはそれ以上の力価を有するポリクローナル抗血清を選択し、ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４でない蛋白質に対するそれらの交差反応について、競合結合免疫学検定を用いて試験する。特異的なポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約０．１ｍＭ、より一般的には少なくとも約１μＭ、好ましくは少なくとも約０．１μＭもしくはそれ以上、および最も好ましくは約０．０１μＭもしくはそれ以上のＫｄで結合するであろう。特定のＣＤ１４オルソログまたはＴｏｌｌ様受容体４オルソログ、例えば、ヒトＣＤ１４もしくはヒトＴｏｌｌ様受容体４にのみ特異的な抗体は、種、例えばヒト以外の動物から他の交差反応オルソログをサブトラクトすることによっても作製できる。この様式で、ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４にのみ結合する抗体を得ることができる。
ＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質に対する特定の抗体が利用できれば、その蛋白質を様々な免疫学的検定法により検出することができる。加えて、該抗体は、ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４のモジュレーターとして治療に用いることができる。免疫学的および免疫学的検定手順の報文については、Basic and Clinical Immunology（Stites ＆ Terr編、第７版. 1991）を参照のこと。さらに、本発明の免疫学的検定は、さまざまな構成のいずれかで行うことができ、そのような構成はEnzyme Immunoassay (Maggio編、1980)；およびHarlow ＆ Lane（前掲）で幅広く調べることができる。
Ｂ．免疫学的結合アッセイ
ＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質は、多くの周知の免疫学的結合アッセイのいずれかを用いて検出し、および／または定量することができる（米国特許第４，３６６，２４１号明細書；第４，３７６，１１０号明細書；第４，５１７，２８８号明細書；および第４，８３７，１６８号明細書を参照のこと）。一般的な免疫学的検定の報文については、Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume 37（Asai編 1993）；Basic and Clinical Immunology（Stites ＆ Terr編、第7版. 1991）も参照のこと。免疫学的結合アッセイ（または免疫学的検定）は、典型的には選択した蛋白質または抗原（ＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質、その抗原性部分列の場合）に特異的に結合する抗体を用いる。抗体（例えば、抗−ＣＤ１４または抗−Ｔｏｌｌ様受容体４）は、多くの当業者に周知の方法および上記の方法のいずれかにより産生することができる。
免疫学的検定は、しばしば特異的に結合する標識試薬を用い、抗体および抗原により形成される複合体を標識する。標識試薬は、それ自体が抗体／抗原複合体を含む部分のいずれかであってよい。従って、標識試薬は標識化されたＣＤ１４もしくは標識化されたＴｏｌｌ様受容体４、または標識化された抗−ＣＤ１４もしくは抗−Ｔｏｌｌ様受容体４抗体であってよい。あるいは、標識試薬は、第三の成分、例えば抗体／ＣＤ１４もしくは抗体／Ｔｏｌｌ様受容体４複合体に特異的に結合する二次抗体であってもよい（二次抗体は、典型的には、第一の抗体が誘導された種の抗体に対して典型的には特異的である）。免疫グロブリンの定常領域に特異的に結合できる他の蛋白質、例えばプロテインＡまたはプロテインＧもまた、標識試薬として用いることができる。これらの蛋白質は、様々な種の免疫グロブリンの定常領域と強力な非免疫学的反応を示す（例えば、Kronvalら、J. Immunol. 111: 1401-1406, 1973；Akerstromら、J. Immunol. 135: 2589-2542, 1985を参照のこと）。標識試薬は、別の分子、例えばストレプトアビジンが特異的に結合できる検出可能な成分、例えばビオチンを用いてモディファイすることができる。様々な検出可能な成分は、当業者に周知である。
アッセイを通じて、インキュベーション工程および／または洗浄工程は、各試薬の組み合わせ後に要求されてもよい。インキュベーション工程は、約５秒〜数時間、場合によっては約５分〜約２４時間で変更できる。しかしながら、インキュベーション時間は、アッセイ形式、抗原、溶液の容量、濃度などに依存しよう。通常、アッセイは周囲温度で行われるが、１０℃〜４０℃の温度範囲にわたって行われ得る。
非競合アッセイ形式：試料中のＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４を検出する免疫学的検定は、競合または非競合のいずれであってもよい。非競合免疫学的検定は、抗原量を直接測定するアッセイである。好ましい「サンドウィッチ」アッセイにおいて、例えば抗−ＣＤ１４または抗−Ｔｏｌｌ様受容体４抗体は、それらが固定される固体基板に直接結合することができる。次いで、それらの固定された抗体は、試験試料中に存在するＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４を捕捉する。このようにして固定されたＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質は、次いで、標識試薬、例えば標識を有するＣＤ１４二次抗体またはＴｏｌｌ様受容体４二次抗体により結合される。あるいは、二次抗体は標識を有していなくても、次に、その二次抗体が誘導された種の抗体に特異的な第三の標識化抗体により結合させることができる。二次もしくは三次抗体は、典型的には、別の分子、例えばストレプトアビジンが特異的に結合する検出可能な成分、ビオチンでモディファイされる。
競合アッセイ形式：競合アッセイにおいて、試料中に存在するＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質の量は、抗−ＣＤ１４または抗−Ｔｏｌｌ様受容体４抗体が試料中に存在する未知のＣＤ１４蛋白質まはたＴｏｌｌ様受容体４蛋白質により（競合的様式で）置き換えられる、既知量の添加された（外因性の）ＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質を測定することにより間接的に測定される。１つの競合アッセイにおいて、既知量のＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質を試料に加え、次いでその試料をＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質と特異的に結合する抗体と接触させる。その抗体に結合した外因性のＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質の量は、試料中に存在するＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質の濃度に逆比例する。特に好ましい実施形態において、抗体は、固体基板上に固定化される。抗体に結合されるＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質の量は、ＣＤ１４蛋白質／抗体複合体またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質／抗体複合体中に存在するＣＤ１４もしくはＴｏｌｌ様受容体４の量を測定するか、あるいは、残存する複合体化していない蛋白質量を測定することにより決定できる。ＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質の量は、標識化されたＣＤ１４分子またはＴｏｌｌ様受容体４分子を供することにより検出できる。
ハプテン阻害アッセイは、他の好ましい競合アッセイである。このアッセイでは、既知のＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質を固体基板上に固定する。既知量の抗−ＣＤ１４抗体または抗−Ｔｏｌｌ様受容体４抗体を試料に加え、次に、その試料を固定化されたＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４に接触させる。固定化された既知のＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４に結合した抗−ＣＤ１４抗体または抗−Ｔｏｌｌ様受容体４抗体の量は、試料中に存在するＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質の量に逆比例する。さらに、固定された抗体の量は、固定化された抗体画分か、溶液中に残存する抗体画分のいずれかを検出することで検出できる。検出は、抗体が標識されるように直接的であっても、上記のように抗体に特異的に結合する標識化成分を続いて加えるように間接的であってもよい。
交差反応決定：競合結合形式の免疫学的検定はまた、交差反応決定にも用いることができる。例えば、ＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質は、固体支持体に固定することができる。蛋白質（例えば、ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４、および相同体）を、抗血清を固定化された抗原に結合させて競合させる検定に加える。加えた蛋白質の、抗血清の固定化された蛋白質に対する結合と競合するその能力を、それ自体と競合するＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質の能力と比較する。上記蛋白質の交差反応の百分率を、標準的な計算方法を用いて計算する。上記の添加した蛋白質のそれぞれとの交差反応が１０％未満の抗血清を選択し集めた。交差反応抗体は、場合により、考慮して加えられた蛋白質、例えば遠位の相同体との免疫学的吸着により集められた抗血清から取り除かれる。
次いで、免疫学的吸着により集められた抗血清は、上記のように競合結合免疫学的アッセイに用いられ、ＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質の対立形式または多型変異型である可能性があると考えられる第二の蛋白質を免疫原蛋白質と比較する。この比較を行うために、２つの蛋白質がそれぞれ広範囲の濃度でアッセイされ、固定された蛋白質に対する抗血清の結合を５０％阻害するのに必要とされる各蛋白質量を決定する。結合の５０％を阻害するのに必要とされる第二の蛋白質量が結合の５０％を阻害するのに必要とされるＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質の量よりも１０倍低い場合、その第二の蛋白質は、ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４免疫原に対して産生されたポリクローナル抗体に特異的に結合すると称される。
他のアッセイ形式：ウェスタンブロット（免疫ブロット）分析は、試料中のＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質を検出し定量するのに用いられれる。この技術は、一般的に、電気泳動により分子量に基づいて試料蛋白質を分離し、その分離された蛋白質を適切な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導化されたナイロンフィルター）に移し、そしてその試料をＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質に特異的に結合する抗体と共にインキュベートすることが含まれる。抗−ＣＤ１４蛋白質または抗−Ｔｏｌｌ様受容体４抗体は、固体支持体上のＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４に特異的に結合する。これらの抗体は、直接標識化されてもよいし、あるいは抗−ＣＤ１４抗体または抗−Ｔｏｌｌ様受容体４抗体に特異的に結合する標識化抗体（例えば、標識化ヒツジ抗−マウス抗体）を用いて次に検出してもよい。
他のアッセイ形式には、特定の分子（例えば、抗体）を結合するよう設計されたリポソームを用い、封入された試薬または標識体を放出する、リポソーム免疫学的アッセイ（ＬＩＡ）が含まれる。次いで、その放出された化学物質は、標準的な技術に従って検出される（Monroeら、Amer. Clin. Prod. Rev. 5: 34-41, 1986を参照のこと）。
非特異的結合の低下：当業者であれば、免疫学的検定で非特異的な結合を小さくすることがしばしば望まれることは理解されよう。具体的には、固体基板に固定された抗原または抗体を含むアッセイは、基質に非特異的に結合する量を小さくすることが望まれる。そのような非特異的な結合を低下させる方法は、当業者には周知である。典型的には、この技術には、基質を蛋白質組成物で被覆させることが含まれる。特に、蛋白質組成物、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳およびゼラチンは、最も好まれている粉乳で広く使われている。
標識：本アッセイに用いられる特定の標識または検出可能な群は、本アッセイに用いられる抗体の特異的な結合を顕著に干渉しない限り、本発明の重要な態様ではない。検出可能な群には、検出可能な物理的なもしくは化学的な特徴を有する何らかの物質であってよい。そのような検出可能な標識は、免疫学的検定の分野で広く開発されており、一般に、そのような方法で有用な標識のほとんどが本発明に適用することができる。従って、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気学的、光学的または化学的方法により検出可能ないずれかの組成物を含む。本発明に有用な標識には、磁性ビーズ（例えば、DYNABEADS（登録商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼおよびＥＬＩＳＡに一般的に用いられる他の酵素）、化学ルミネセンス標識、および 比色標識、例えば金コロイドまたは色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）が含まれる。
標識は、当分野で周知の方法に従って、アッセイの所望の成分に直接的にもしくは間接的に結合させることができる。上記のように、多種多様な標識を用いることができ、要求される感受性、化合物との複合体化の容易さ、安定性要求性、利用できる器具、および処分規定に応じて標識は選択される。
放射性でない標識は、しばしば間接的な方法で付加される。一般に、リガンド分子（例えば、ビオチン）を分子に共有結合で結合される。次いで、そのリガンドは、本質的に検出可能な分子であるか、またはシグナル系、例えば検出可能な酵素、蛍光化合物、または化学ルミネセンス化合物に共有結合で結合された分子のいずれかの他の分子（例えば、ストレプトアビジン）に結合する。そのリガンドとそれらの標的は、ＣＤ１４蛋白質もしくはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質を認識する抗体、または抗−ＣＤ１４抗体もしくは抗−Ｔｏｌｌ様受容体４抗体を認識する二次抗体と、いかようにも適切に組み合わせて用いることができる。
分子はまた、酵素または蛍光団を用いた会合により、シグナルを生成する化合物を直接会合させることができる。標識として興味のある酵素は、まず、加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、または酸化酵素、特にペルオキシダーゼであろう。蛍光分子には、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれる。化学ルミネセンス化合物には、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタルアジンジオン、例えばルミノールが含まれる。様々な標識もしくはシグナル生成システムの報文に関しては、米国特許第４，３９１，９０４号明細書を参照のこと。
標識を検出する方法は、当業者には周知である。従って、例えば標識は放射活性標識であり、検出方法には、シンチレーション計数器または写真フィルム、例えば放射線写真におけるものが含まれる。標識が蛍光標識である場合、適当な光の波長を用いて蛍光色素を励起し、得られる蛍光を検出することにより検出することができる。蛍光は、電気的検出器、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管などにより可視的に検出することができる。同様に、酵素的標識は、適当な基質を酵素に供し、その結果得られる反応産物を検出することにより検出できる。最後に、単純な比色標識は、標識と関係する色を観察することにより簡単に検出できる。このように様々な計量アッセイにおいて、結合された金はしばしばピンク色を呈し、一方、様々な結合されたビーズはそのビーズの色を呈する。
いくつかのアッセイ形式は、標識化された成分の使用を必要としない。例えば、凝集アッセイは、標的となる抗体の存在を検出するのに用いることができる。この場合、抗体で被覆された粒子が、標的となる抗体を含む試料により凝集される。この形式では、その成分は標識化されている必要もなく、標的となる抗体の存在は単純に視覚的に検査することで検出される。
ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４のモジュレーターについてのハイスループットアッセイ
ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４のモジュレーターとして試験される化合物は、有機小分子または生物学的な構成要素、例えば、抗体もしくはペプチドなどの蛋白質、糖、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉもしくはボザイムなどの核酸、または脂質であってよい。別には、モジュレーターは、ＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質の遺伝的に改変された形式のモジュレーターであってもよい。典型的には、試験化合物は、有機小分子、ペプチド、脂質および脂質類似体であろう。
本質的に、いずれの化学物質も、本発明のアッセイにおいて潜在的なモジュレーターまたはリガンドとして用いることができるが、ほとんどの化合物は用いられる水溶液または有機（特に、ＤＭＳＯに基づく）溶液に溶解することができる。アッセイは、アッセイ工程を自動化し、いずれかの慣用のアッセイ源から化合物を供給することにより（これらは典型的に同時におこなわれる（例えば、ロボットアッセイにおけるマイクロタイター形式またはマイクロタイタープレートで））、巨大分子ライブラリーをスクリーニングするために設計される。多くの化学物質の供給業者、シグマ（St. Louis, MO）、アルドリッチ（St. Louis, MO）、シグマ−アルドリッチ（St. Louis, MO）、フルカケミカ−バイオケミカアナリティカ（Fluka Chemika-Biochemica Analytika）（Buchs Switzerland）などがあることは認められよう。
好ましい実施形態において、ハイスループットスクリーニング方法には、多数の潜在的な治療化合物（潜在的なモジュレーターまたはリガンド化合物）を含む組み合わせの有機小分子またはペプチドライブラリーを提供することが含まれる。次いで、そのような「組み合わせの化学ライブラリー」または「リガンドライブラリー」は、それらのライブラリーの所望の特徴的な活性を示すメンバー（具体的な化学種またはサブクラス）を同定するため、本明細書に記載されるように、１つまたはそれ以上のアッセイでスクリーニングされる。従って、化合物は慣用的に「リード化合物」として供給され、それぞれを潜在的なもしくは実際の治療として用いることができる。
組み合わせ化学ライブラリーは、化学的合成または生化学的合成のいずれかによって作り出された、多くの化学「構成ブロック」、例えば試薬を組み合わせることによって作り出された誘導化学物質の集合物である。例えば、直線的組み合わせ化学ライブラリー、例えばポリペプチドライブラリーは、化学構成ブロック（アミノ酸）の組みを所定の化合物長（すなわち、ポリペプチド化合物のアミノ酸の数）について可能性のあるすべての様式で組み合わせることによって形成される。何百万もの化学物質は、化学構成ブロックを組み合わせて混合することを通じて合成することができる。
組み合わせ化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者には周知である。そのような組み換え化学ライブラリーには、限定されるものではないが、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号明細書、Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493, 1991およびHoughtonら、Nature 354: 84-88, 1991を参照のこと）。他の化学誘導ライブラリーを生成する他の化学もまた用いることができる。そのような化学には、限定されるものではないが、ペプチド（例えば、ＰＣＴ発行番号国際公開第９１／１９７３５号パンフレット）、コードされたペプチド（例えば、ＰＣＴ発行番号、国際公開第９３／２０２４２号パンフレット）、ランダム・バイオ−オリゴマー（例えば、ＰＣＴ発行番号国際公開第第９２／０００９１号パンフレット）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号明細書）、ダイバルソマー（diversomer）、例えばヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド（Hobbsら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913, 1993）、ビニル性ポリペプチド（Hagiharaら、J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568, 1992）、糖の足場を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（Hirschmannら、J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218, 1992）、類似体の有機合成低分子化合物ライブラリー（Chenら、J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661, 1994）、オリゴカルバメート（oligocarbamate）（Choら、Science 261: 1303, 1993）および／またはリン酸ペプチジル（Campbellら、J. Org. Chem. 59: 658, 1994）、核酸ライブラリー（Ausubel、BergerおよびSambrook（前掲）を参照のこと）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号明細書を参照のこと）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughnら、Nature Biotechnology, 14: 309-314, 1996およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照のこと）、炭水化物ライブラリー（例えば、Liangら、Science 274: 1520-1522, 1996および米国特許第5,593,853号明細書を参照のこと）、有機小分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum C ＆ EN, Jan 18, 頁33 (1993)；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号明細書；チアゾリジノン（thiazolidinone）およびメタチアザノン（metathiazanones）、米国特許第５，５４９，９７４号明細書；ピロリジン（pyrrolidine）、米国特許第５，５２５，７３５号明細書および第５，５１９，１３４号明細書；モルホリノ（morpholino）化合物、米国特許第５，５０６，３３７号明細書；ベンゾジアゼピ、第5,288,514号などを参照のこと）が挙げられる。
組み合わせライブラリーを調製するための装置は、商業的に入手可能である（例えば、357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MAを参照のこと）。加えて、多くの組み合わせライブラリーが、それ自体を商業的に入手できる（例えば、ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MDなどを参照のこと）。
候補化合物は、Ｔｏｌｌ様受容体４／ＣＤ１４相互作用またはＴｏｌｌ様受容体４／ＣＤ１４／ＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆ相互作用を含む経路を介したＴＮＦ−α誘導に関係する障害を処置するための薬物を同定するための部分的なストラテジーに有用である。ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆに結合する試験化合物は、候補化合物と考えられる。
ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆに結合する候補化合物または試験化合物、ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆ蛋白質またはポリペプチド、あるいはその生物学的に活性のある部分を同定するためのスクリーニングアッセイもまた、本発明に含まれる。試験化合物は、当分野で既知の組み合わせライブラリー法、限定されるものではないが、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス指定可能な平行な固相または液相；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「ワン−ビーズ・ワン−コンパウンド」ライブラリー法；および親和性クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法の多くのアプローチのいずれかを用いて得ることができる。生物ライブラリーアプローチは、例えばペプチドライブラリーについて用いることができるが、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子化合物のライブラリーに応用可能である（Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145, 1997）。分子ライブラリーの合成方法の例としては、当分野で知られており、例えば、DeWittら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909, 1993；Erbら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422, 1994；Zuckermannら、J. Med. Chem. 37: 2678, 1994；Choら、Science 261: 1303, 1993；Carrellら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059, 1994；Carellら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061, 1994；およびGallopら、J. Med. Chem. 37: 1233, 1994において見い出すことができる。いくつかの実施形態において、試験化合物は、ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆの優性劣性変異体である。
化合物のライブラリーは、溶液中に（例えば、Houghten, Bio/Techniques 13: 412-421, 1992）、またはビーズ上（Lam, Nature 354: 82-84, 1991）、チップ（Fodor, Nature 364: 555-556, 1993）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子（米国特許第5,571,698号明細書、第5,403,484号明細書および第5,223,409号明細書）、プラスミド（Cullら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869, 1992）またはファージ（Scottら、Science 249: 386-390, 1990；Devlin, Science 249: 404-406, 1990；Cwirlaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382, 1990；およびFelici, J. Mol. Biol. 222: 301-310, 1991）に存在してもよい。
ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆの活性、または生物学的に活性なその一部をモジュレートする試験化合物の能力は、例えば、試験化合物の存在下でＴｏｌｌ様受容体４／ＣＤ１４複合体、またはＴｏｌｌ様受容体４／ＣＤ１４／ＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆ複合体を形成する能力を監視することにより決定することができる。Ｔｏｌｌ様受容体４または生物学的に活性名その一部の活性をモジュレートする試験化合物の能力もまた、ＴＲＡＭ／ＴｒｉｆのＣＤ１４に結合する能力を監視することにより決定することができる。そのようなアッセイは、ＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆの存在下で行われ得る。結合アッセイは、細胞に基づいて、または無細胞であってよい。
ＣＤ１４および／またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆに結合するまたは相互作用するＴｏｌｌ様受容体４蛋白質の能力は、本明細書で記載される方法のいずれか、または直接的な結合を決定するための当分野で既知の方法により決定することができる。１つの実施形態において、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆと結合する、または相互作用するＴｏｌｌ様受容体４蛋白質の能力は、ＴＮＦ−αの誘導を監視することにより決定することができる。ＴＮＦ−αの検出は、検出可能な標識、例えばＦＬＡＧ配列またはルシフェラーゼもまたコードする組み換えＴＮＦ−αの発現を検出することを含む。このアッセイは、直接的な結合のアッセイに加えることができる。一般に、そのようなアッセイは、Ｔｏｌｌ様受容体４蛋白質のＣＤ１４および／またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆに対する結合に影響を与える試験化合物の能力を決定するために用いられる。
一般に、ＣＤ１４に結合する試験化合物の能力；Ｔｏｌｌ様受容体４を通じたシグナル伝達を干渉するが、ＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆを通じたシグナル伝達を干渉しない能力、あるいは、ＴＮＦ−αの誘導に影響を与える能力は、結合またはＴＮＦ−α発現の誘導を試験化合物が存在しない状況で決定する対照と比較される。いくつかの場合、あらかじめ決定された参照値を用いる。そのような参照値は、対照と比較して決定することができ、対照について、試験試料は参照と異なるものであり、該化合物は興味のある分子（例えばＴｏｌｌ様受容体４）と結合するか、または発現をモジュレートする（例えば、リポ多糖体により誘導される細胞内のＴＮＦ−α活性を活性化もしくは阻害するが、あるいは、水疱性口内炎ウイルスまたは狂犬病ウイルスに対するマクロファージ応答を活性化もしくは阻害する）ことが指標となろう。参照値はまた、標準で観察される結合またはＴＮＦ−α発現の誘導（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体４に対する抗体の親和力、またはリポ多糖体によるＴＮＦ−α発現のモジュレーション）の量を参照にし得る。この場合、試験化合物の参照と類似する（例えば、等しいかもしくはそれ以下の）化合物は、候補化合物である（例えば、参照の抗体と同程度またはそれ以上、Ｔｏｌｌ様受容体４に結合する）。
本発明は、上記のスクリーニングアッセイにより同定された新規な物質に関し、本明細書に記載されるように処置のためのそれらの使用に関する。
１つの実施形態において、本発明は、天然または組み換えのいずれかのＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質、あるいは、ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質を発現する細胞または組織を用いた可溶性のアッセイを提供する。別の実施形態において、本発明は、そのＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質あるいはそのリガンドが共有結合または非共有結合を解して固相基質に結合されている、ハイスループット形式のインビトロアッセイに基づいた固相を提供する。本明細書に記載のアッセイのいずれも、ハイスループットスクリーニングに適用可能である。
本発明のハイスループットアッセイにおいて、可溶状態または固体状態のいずれも、一日で数千もの種々のモジュレーターまたはリガンドをスクリーニングすることが可能である。この方法論は、ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質を含むインビトロアッセイ、細胞に基づくアッセイまたは膜に基づくアッセイに、ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質を用いることができる。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルを用いて、それぞれのアッセイを選択された潜在的なモジュレーターに対して実施し、濃度またはインキュベーション時間の効果を観察し、５〜１０ウェルずつ単一のモジュレーターを試験することができる。従って、単一の標準的なマイクロタイタープレートで、約１００（例えば、９６）のモジュレーターをアッセイすることができる。次いで、１５３６ウェルプレートを用いた場合、単一のプレートで容易に約１００〜約１５００の異なる化合物をアッセイすることができる。一日に複数のプレートをアッセイすることができるため、アッセイは、最大で約６，０００、２０，０００、５０，０００または１００，０００以上の異なる化合物を、本発明の統合されたシステムを用いることでスクリーニングすることが可能である。
固体状態の反応について、関心のある蛋白質またはその断片、例えば、細胞外ドメイン、あるいは融合蛋白質の一部として関心のある蛋白質またはその断片を含む細胞もしくは膜は、固体状態の成分に直接もしくは間接的に、共有結合または非共有結合、例えばタグを介して結合させることができる。タグは、様々な成分のいずれかであってよい。一般に、タグを結合する分子（タグバインダー）は、固体支持体に固定化され、関心のあるタグ付きの分子をその固体支持体に、そのタグとタグバインダーの相互作用を介して結合させる。
文献で広く記載されている既知分子相互作用に基づいて、多くのタグおよびタグバインダーを用いることができる。例えば、タグは天然のバインダーを有しており、例えば、ビオチン、プロテインＡまたはプロテインＧは、適当なタグバインダー（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、免疫グロブリンのＦｃ領域など）との連結に用いることができる。天然のバインダー、例えばビオチンを有する、分子に対する抗体はまた、幅広く利用される適当なタグバインダーである； SIGMA Immunochemicals 1998 catalogue SIGMA, St. Louis MOを参照のこと。
同様に、ハプテンまたは抗原化合物を、タグ／タグバインダーペアを形成するために適当な抗体含む組み合わせに用いてもよい。数千の特異的な抗体は商業的に入手でき、多くのさらなる抗体は文献に記載される。例えば、ある共通の構成において、タグは一次抗体であり、そのタグバインダーは、その一次抗体を認識する二次抗体である。抗体−抗原相互作用に加えて、受容体−リガンド相互作用もまた、タグとタグ−バインダーペアとして適当である。例えば、細胞膜受容体のアゴニストとアンタゴニスト（例えば、細胞受容体−リガンド相互作用、例えばＴｏｌｌ様受容体、トランスフェリン、Ｃ−キット、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体および抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリーなど；例えば、Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I, 1993を参照のこと）が含まれる。同様に、毒素 および毒物、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、アヘン、ステロイドなど）、細胞内受容体（例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンＤ；ペプチドを含む様々な小リガンドの効果を媒介する受容体）、薬物、レクチン、核酸（直鎖および環状の高分子配列）、オリゴ糖、蛋白質、リン脂質および抗体はすべて様々な細胞受容体と相互作用し得る。
合成ポリマー、例えば、ポリウレタン、ポリエステル、 ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンイミン、硫酸ポリアリールエン（polyarylene sulfides）、ポリシロキサン、ポリイミドおよびポリアセテートもまた適当なタグまたはタグバインダーを形成することができる。他の多くのタグ／タグバインダーペアもまた、本明細書に記載のアッセイ系に有用であり、この開示内容に照らし当業者には認められよう。
共通のリンカー、例えば、ペプチド、ポリエーテルおよびその類似物もまた、タグとして役立ち、ポリペプチドペプチド配列、例えば約５個〜２００個のアミノ酸のポリ・グリ配列が挙げられる。そのようなフレキシブルなリンカーは当業者には既知である。例えば、ポリエチレングリコールリンカーは、Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabamaから入手可能である。これらのリンカーは、アミド結合、スルフヒドリル結合、ヘテロ機能性結合（heterofunctional linkage）を有していてもよい。
タグバインダーは、現在利用可能な様々な方法のいずれかを用いて、固体基板に固定される。固体基板は、一般的に、基板の全部もしくは一部に化学試薬を曝し、そのタグバインダーの一部と反応性のある表面に化学基を固定することによって、誘導され、または機能化される。例えば、長鎖部分と結合させるのに適した基には、アミン、ヒドロキシル、チオールおよびカルボキシル基が含まれる。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルスタンナンは、種々の表面、例えばガラス表面を機能化するのに用いることができる。そのような固相生体高分子の構造は、文献に広く記載されている。例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154, 1963（例えば、ペプチドの固相合成を記載する）；Geysenら、J. Immun. Meth. 102: 259-274, 1987（ピンにおける固相成分の合成を記載する）；Frank ＆ Doring, Tetrahedron 44: 6031-6040, 1988（セルロースディスク上の種々のペプチド配列の合成を記載する）；Fodorら、Science 251: 767-777, 1991；Sheldonら、Clinical Chemistry 39: 718-719, 1993；およびKozalら、Nature Medicine 2: 753-759, 1996（固体基板に固定された生体高分子アレイの全てを記載する）を参照のこと。基板にタグバインダーを固定する化学的でないアプローチとしては、他の一般的な方法、例えば加熱、ＵＶ照射による架橋などが挙げられる。
ＣＤ１４およびＴｏｌｌ様受容体４のモジュレーターとしての二重特異的化合物
１つの態様において、ヒト以外の動物の血清および／または循環液中抗原の濃度を低下させる、候補または試験二重特異的化合物を同定する方法が提供される。本方法を用いるのに選択され、または最適化された化合物は、そのような化合物の投与により利益を得るであろう対象、例えばヒト対象を処置するのに用いられ得る。
本発明のこの方法の実施形態で試験することができる候補化合物は、二重特異的化合物である。本明細書で用いられる用語「二重特異的化合物」は、２つの異なる結合特異性を有する化合物を含む。二重特異的化合物の例には、例えば二重特異的抗体、ヘテロポリマーおよび抗原に基づくヘテロポリマーが挙げられる。
本発明の実施形態で試験され得る二重特異的分子は、好ましくは、標的化された物質に特異的な第二の結合部分（例えば、別個の抗体または抗原）と架橋されたＣＤ１４、好ましくはヒトＣＤ１４に特異的な結合部分を含む。Ｔｏｌｌ様受容体４に特異的な結合部分の例にとしては、限定されるものではないが、Ｔｏｌｌ様受容体４リガンド、例えばＣＤ１４、または好ましい実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体４に対する抗体が挙げられる。
他の実施形態において、新たなＴｏｌｌ様受容体４結合分子は、Ｔｏｌｌ様受容体４に結合する能力に基づいて同定され得る。例えば、化合物または小分子ライブラリーは、無細胞結合アッセイで試験され得る。多くの試験化合物、例えば、ペプチド模倣体、小分子または他の試薬は、試験するのに用いることができ、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス指定可能な平行固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「ワン−ビーズ・ワン−コンパウンド」ライブラリー法；および親和性クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を含む、当分野で既知の組み合わせライブラリー法における多くのアプローチのいずれｋを用いて得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、その他４つのアプローチを、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145, 1997）。
モジュレーティング試薬および天然の抽出物のライブラリーを試験する薬物スクリーニングプログラムの多くにおいて、所定の期間内で調べられるモジュレーティング物質の数を最大にするため、ハイスループットアッセイが望ましい。例えば、精製された、もしくはほぼ精製された蛋白質を用いて行うことができる、無細胞系で行われるアッセイは、それらが試験モジュレーティング物質により媒介される分子標的における改変の迅速な展開および比較的容易な検出を可能にするよう作り出すことができるため、しばしば、「最初の」スクリーニングとして好まれる。さらに、試験化合物の細胞内毒性および／または生物学的利用能に対する影響は、一般的にインビトロの系では無視することができ、その代わり、このアッセイでは、上流のもしくは下流の因子との結合親和力の変更を明らかにできるため、分子標的における薬物の影響を本質的に明らかにできる。
他の実施形態において、当分野で既知のファージディスプレイ技術を、新たなＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆ結合分子を同定するために用いることができる。
１つの実施形態において、本発明は、ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆまたはその生物学的に活性な部分をスクリーニングする方法を提供する。
ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆに結合する分子を同定する細胞に基づくアッセイは、本発明の二重特異的化合物に使用するためのさらなる物質を同定するために用いることができる。例えば、ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆを発現する細胞はスクリーニングアッセイに用いることができる。例えば、ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆに対する結合の統計学的に有意な変化を生じさせる化合物を同定することができる。
１つの実施形態において、アッセイは、Ｔｏｌｌ様受容体４結合分子がインビトロでＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆに結合するその能力に基づいて同定される、無細胞アッセイである。ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆ結合分子が提供され、ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆを結合する蛋白質の能力は、直接的な結合を決定する当分野で認められた方法を用いて試験することができる。標的分子に結合する蛋白質の能力を決定することは、例えば、リアルタイム・バイオモレキュラー・インターラクションアナリシス（ＢＩＡ）Sjolanderら、Anal. Chem. 63: 2338-2345, 1991およびSzaboら、Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705, 1995などの技術を用いて行うことができる。本明細書で用いられる「ＢＩＡ」は、相互作用対のいずれも標識化することなく、実時間で二重特異的相互作用を研究するための技術である（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象における変化は、生体分子間の実時間の反応の指標として用いることができる
本発明の無細胞アッセイは、可溶性および／または膜結合型の蛋白質いずれの使用も可能である。膜結合型の蛋白質を用いる無細胞アッセイの場合、膜結合型の蛋白質を溶液中で維持できるよう、可溶化剤を利用することが望ましい。そのような可溶化剤の例としては、非イオン性の洗浄剤、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデカシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルクアミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルクアミド、トライトン（登録商標）Ｘ−１００、トライトン（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンミニオ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナートが含まれる。
蛋白質−蛋白質相互作用の検出を可能にする適切なアッセイは当分野で知られている（例えば、免疫沈降法、ツー・ハイブリッドアッセイおよび類似の方法）。そのようなアッセイを試験化合物の存在下および非存在下での実施することで、これらのアッセイは、本発明の蛋白質と標的分子（群）との相互作用をモジュレート（例えば、阻害または増強）する化合物を同定するのに用いることができる。
標的分子に結合するもしくは相互作用する蛋白質の能力を決定することは、例えば、直接的な結合により実施することができる。直接的な結合アッセイにおいて、蛋白質の標的分子との結合が複合体中の標識化蛋白質を検出することにより決定できるよう蛋白質は、放射標識または酵素標識と結合され得る。例えば、蛋白質は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで、直接的かもしくは間接的のいずれかで標識化され、その放射同位体は、放射能を直接計数することによって、またはシンチレーション計数によって検出される。別法として、分子は、例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼまたはルシフェラーゼで酵素的に標識化されていてもよく、その酵素標識は、適当な基質の生産物への変換を決定することにより検出される。
典型的には、蛋白質の一方もしくは両方の複合体を複合体化していない形態から分離することを容易にし、そして、自動的に蓄積できるよう、本発明の蛋白質またはその結合蛋白質のいずれかを固定化することが望ましいであろう。候補物質の存在下または費存在下での上方または下方の結合因子に対する結合は、反応物を含むいずれかの適切な容器内で行うことができる。例として、マイクロタイタープレート、試験管およびマイクロ遠心管が挙げられる。１つの実施形態において、蛋白質のマトリクスに対する結合を可能にするドメインを付加された融合蛋白質が提供される。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＣＤ１４（ＧＳＴ／ＣＤ１４）融合蛋白質は、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, Mo.）またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、次いで、それを細胞溶解液と接触させ、例えば３５Ｓ−標識化した物質と試験モジュレート物質、そしてその混合物を複合体形成を行わせる条件下、例えば、塩およびｐＨについて生理学的条件で、わすかに厳格な条件を用いて、インキュベートする。インキュベーションに続いて、ビーズを洗浄して結合していない標識を取り除き、マトリクスを固定化し、放射活性を（例えば、シンチラントで置き換えられたビーズ）直接検出するか、あるいは複合体を続いて解離させた後にその上清中で放射活性を検出する。別法として、複合体をマトリクスから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、ＣＤ１４−結合蛋白質のレベルを、標準的な電気泳動技術を用いてゲルから定量的にビーズ画分中に確認する。
蛋白質またはマトリクスを固定化する他の技術もまた、対象アッセイで使用するのに利用できる。例えば、ビオチン化分子は、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から当分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill）を用いて調製でき、ストレプトアビジン被覆された９６ウェルプレート（Pierce Chemical）に固定化できる。
相互作用体のいずれをも標識化することなく、ＴＬＲ４、ＣＤ１４およびＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆ間の相互作用をモジュレートする化合物の能力を決定することは、本発明の範囲内にある。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、本発明の蛋白質とその標的分子との相互作用を、その蛋白質まはた標的分子のいずれをも標識化することなく検出できる。McConnellら、Science 257: 1906-1912, 1992。本明細書に記載の「マイクロフィジオメーター」（例えば、サイトセンサー（Cytosensor））は、光による電位差測定センサー（ＬＡＰＳ）を用いて、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析装置である。この酸性化速度の変化は、化合物とレポーターとの間の相互作用の指標として用いることができる。
本発明において試験することが可能な抗原−に基づくヘテロポリマーは、好ましくは、自己抗体により認識される抗原に架橋された、ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆ、好ましくはヒトＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆに特異的な結合部分を含む。自己抗体により認識される抗原の例として、限定されるものではないが、因子ＶＩＩＩ（置換組み換え因子（置換組み換え因子）ＶＩＩＩによる血友病の処置に関連する抗体）；筋肉アセチルコリン受容体（重症筋無力症に関係する抗体）；カルジオリピン（狼瘡に関連する）；血小板関連蛋白質（特発性血小板減少性紫斑病に関連する）；シェーグレン症候群に関係する多機能性抗原；組織移植自己免疫応答に関わる抗原；心筋に見い出される抗原（自己免疫疾患心筋炎に関連する）；免疫複合体媒介性腎臓病に関連する抗原；ｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ抗原（狼瘡性腎炎に関連する）；デスモグレインおよびデスモプラキン（天疱瘡および類天疱瘡に関連する）；またはよく特徴付けられ、疾患の病因に関係のある他のいずれかの抗原が挙げられる。
本発明で試験するためのヘテロポリマーおよび抗原に基づくヘテロポリマー、ならびにそれらを作成する方法の例は、当分野で知られている。例えば、ヘテロポリマーの例としては、国際公開第０３００７９７１Ａ１号；米国特許第２００２０１０３３４３Ａ１号；米国特許第５，８７９，６７９号パンフレット；米国特許第５，４８７，８９０号パンフレット；米国特許第５，４７０，５７０号パンフレット；国際公開第９５２２９７７Ａ１号パンフレット；ＷＯ／０２０７５２７５Ａ３号、ＷＯ／０２４６２０８Ａ２号またはＡ３号、ＷＯ／０１８０８８３Ａ１号、ＷＯ／０１４５６６９Ａ１号、国際公開第９２０５８０１Ａ１号パンフレット、Lindorferら、J. Immunol. Methods. 248: 125, 2001；Hahnら、J. Immnol. 166: 1057, 2001；Nardinら、J. Immunol. Methods. 211: 21, 1998；Kuhnら、J. Immunol. 160: 5088, 1998；Taylorら、Cancer Immunol. Immunother. 45: 152, 1997；Taylorら、J. Immunol. 159: 4035, 1997およびTaylorら、J. Immunol. 148: 2462, 1992に教示されている。加えて、これらへテロポリマーの様々な形態を作製することができる。例えば、１つの実施形態において、異なる化合的性質を連結して作製された二重特異的分子の形態を用いることができる。二重特異的分子の成分を架橋するのに用いることができる試薬の例としては、ポリエチレングリコール、ＳＡＴＡ、ＳＭＣＣ、ならびに当分野で既知の他のものが含まれ、例えば、Pierce Biotechnologyから入手可能である。試験することができる二重特異的分子の例示的な形態は、２００２年7月１６日に出願された米国特許第60/411,731号に記載されており、その内容は出展明示により本明細書の一部とされる。
他の実施形態において、様々な二重特異的分子の多重結合型を行うことができる（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、またはそれ以上の複合体）。他の実施形態において、二重特異的分子の精製型は、例えば、２００２年５月１３日に出願された米国特許第６０／３８０，２１１号（その内容は、出展明示により本明細書の一部とされる）に記載のように試験することができる。
他の実施形態において、へテロポリマーの結合部分が抗体である場合、他のアイソタイプの抗体（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２（例えば、ＩｇＧ２ａ）、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＭ）を用いることができる。他の実施形態において、抗体分子の一部（例えば、Ｆａｂ断片）は、結合部分のいずれかについて用いることができる。好ましい実施形態において、少なくとも1つの結合部分は、Ｆｃドメインを含む抗体である。1つの実施形態において、抗体はマウス抗体である。
他の実施形態において、抗体に対するモディフィケーションの効果、例えば抗体の脱免疫化（deimmunization）の効果を試験することができ、例えば２００３年３月２８日に出願された米国特許第６０／４５８，８６９号に記載のように試験することができる。
本発明に提供される方法において、ヒト以外の動物の血清、循環流および／または組織中の試薬、例えば病原性試薬の濃度は、少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％まで減じたものであってよい。
他の実施形態において、対象の血清、循環流および／または組織中の試薬の濃度は、間接的に測定することができる。例えば、血清および／または循環流中の試薬の存在の結果としての病理学は、例えば動物からの組織試料を試験することにより、測定することができる。ヒト以外の動物の血清、循環流および／または組織中の試薬の濃度の他の間接的な測定は、ヒト以外の動物に感染症を引き起こす試薬の能力の測定である。例えば、感染症の臨床兆候および症状における二重特異的化合物の効果を測定することができる。感染の広がり、例えばある臓器系から他の臓器系へ、またはある個体から他の個体への広がりを阻止する二重特異的化合物の能力もまた試験することができる。
他の実施形態において、ヒト以外の動物におけるＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆを有する細胞に結合する二重特異的化合物の能力が測定される。例えば、１つの実施形態において、ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆ標的分子に結合する二重特異的化合物の能力を決定することは、リアルタイムバイオモレキュラー・インターラクション・アナリシス（ＢＩＡ）（Sjolanderら、Anal. Chem. 63: 2338-2345, 1991およびSzaboら、Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705, 1995）を用いて実施できる。本明細書で用いられる「ＢＩＡ」は、相互作用体のいずれをも標識化することなく、実時間で二重特異的相互作用を調べる技術である（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象における変化は、生体分子間の実時間の反応の指標として用いることができる。
他の実施形態において、ヒト以外の動物の細胞による試薬の破壊（例えば、マクロファージによる破壊）は測定される。
ヒト以外の動物の血清および／または循環流中の試薬の濃度を低下させる化合物（二重特異的分子を受けていないヒト以外の動物で観察される濃度と比較して）が選択され得る。
対象において試験するための化合物は、試験される多数の化合物の中から選択することができる。他の実施形態において、このアッセイで試験するための二重特異的化合物は、ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆを結合できることはすでに、例えば、インビトロアッセイで確認されており、本アッセイを用いてさらに評価または最適化することができる。このような場合、血清および／または循環流中の試薬の濃度を低下させる二重特異的化合物の能力は、血清および／または循環流中の抗原の濃度を低下させるその能力を決定するため、他の二重特異的化合物とまたは同じ化合物の最適化されていない状態とを比較することができる。
好ましい実施形態において、本発明の二重特異的化合物は、適切な範囲、約１μｇの化合物／ｋｇ体重〜約１００μｇの化合物／ｋｇ体重で投与される。本明細書で定義されるように、二重特異的化合物の治療上の有効な量（すなわち、有効な投薬量）は、約０．０１〜５０００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜５００μｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約２〜８０μｇ／ｋｇ体重、そしてさらにより好ましくは約５〜７０μｇ／ｋｇ、１０〜６０μｇ／ｋｇ、２０〜５０μｇ／ｋｇ、２４〜４１μｇ／ｋｇ、２５〜４０μｇ／ｋｇ、２６〜３９μｇ／ｋｇ、２７〜３８μｇ／ｋｇ、２８〜３７μｇ／ｋｇ、２９〜３６μｇ／ｋｇ、３０〜３５μｇ／ｋｇ、３１〜３４μｇ／ｋｇまたは３２〜３３μｇ／ｋｇ体重の範囲である。当業者であれば、特定の因子が、限定されるものではないが、疾患または障害の重篤度、前処置、対象の一般的な健康および／または年齢、および罹患している他の疾患を含む因子が、対象を効果的に処置するのに必要とされる投薬量に影響を及ぼし得ることは理解されよう。さらに、蛋白質、ポリペプチドまたは抗体の治療上有効な量を用いた対象の処置には、単回の処置が含まれ、好ましくは一連の処置が含まれ得る。
好ましい実施形態において、動物は、試薬を静脈内（ｉｖ）注射した後、約１〜５００μｇ／ｋｇ体重の範囲の二重特異的化合物で処置する。処置に用いられる二重特異的化合物の有効な投薬量は、特定の処置経過によって増加もしくは減少させ得ることは理解されよう。用量の変更は、本明細書に記載されるように、診断アッセイの結果に起因し、明らかとなろう。
試験化合物および／または試薬の投与経路は、動物の循環流中への静脈内（ｉｖ）注射であってよい。他の投与経路には、限定されるものではないが、局所、非経口、皮下、または吸入によるものが含まれる。用語「非経口」には、例えば、皮下、静脈内、または筋肉内経路による注射が含まれ、例えば、疾患もしくは傷害部位への局部投与もまた含まれる。移植片からの化合物の徐放もまた当分野で知られている。当業者であれば、適切な投薬量は、処置されるべき傷害の性質、患者の体重、年齢および一般健康状態および投与経路などの因子に応じて変更され得ることは理解しよう。予備的な用量は、動物試験に従って決定することができ、ヒト投与についての投薬量の変更は、当分野で許容された実地に従って行われる。
候補化合物および試薬は、用量範囲にわたって動物に投与することができる。試薬を動物に投与する場合、候補化合物は、その投与前、同時もしくはその後のいずれかで投与することができる。
ＴＬＲ４−、ＣＤ１４−またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆ−発現トランスジェニック動物、例えば本発明のマウスは、対象の血清および／または循環流中に望ましくはない物質、例えば、自己抗体、炎症物質または毒素の存在に関係するヒトの障害または疾患を処置するのに有用な候補化合物をスクリーニングまたは評価するために用いることができる。
本発明の二重特異的な化合物により結合され得る例示的な標的物質には、血液感染物質が含まれ、限定されるものではないが、次の物質：ウイルス、ウイルス粒子、毒素、細菌、ポリヌクレオチド、抗体、例えば、自己免疫疾患に関係する自己抗体のいずれかが含まれる。１つの実施形態において、例示的な標的ウイルス物質には、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス、インフルエンザ、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、単純ヘルペスウイルス、肝炎、アデノウイルス−２、牛ウイルス性下痢ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、デング熱ウイルス、マールブルグウィルス、エプスタイン・バーウイルスが含まれる。
細菌性試薬の例には、緑膿菌（シュードモナス・アエルギノサ）（Pseudomonas aeruginosa）、蛍光菌（シュードモナス・フルオレセンス）（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・アシドボランス（Pseudomonas acidovorans）、シュードモナス・アルカリジェネス（Pseudomonas alcaligenes）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）角膜菌（ステノトロフォモナス・マルトフィリア）、（ Stenotrophomonas maltophilia）、セパシア菌（バークホルデリア・セパシア）（Burkholderia cepacia）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophilia）、大腸菌（エシェリキア・コリ）（Escherichia coli）、シトロバクター・フロインデイ（Citrobacter freundii）サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、チフス菌（サルモネラ・ティフィ）（Salmonella Typhi）、パラチフス菌（Salmonella paratyphi）、腸炎菌（サルモネラ・エンテリティディス）（Salmonella enteritidis）、志賀赤痢菌（シゲラ・ディゼンテリエ）（Shigella dysenteriae）、シゲラ・フレキシネリ（Shigella flexneri）、ソンネ菌（シゲラ・ソネイ）（Shigella sonnei）、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、肺炎桿菌（クレブシエラ・ニューモニエ）（Klebsiella pneumoniae）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、霊菌（セラチア・マルセッセンス）（Serratia marcescen）、野兎病菌（フランシセラ・ツラレンシス）（Francisella tularensis）、モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）、ミラビリス変形菌（プロテウス・ミラビリス）（Proteus mirabilis）、変形菌（プロテウス・ブルガリス）（Proteus vulgaris）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）プロビデンシア・レットゲリ（Providencia rettgeri）、プロビデンシア スチュアルティイ（Providencia stuartii）、アシネトバクター・カルコアセティクス（Acinetobacter calcoaceticus）、アシネトバクター・ヘモリチカス（Acinetobacter haemolyticus）、腸炎エルシニア（エルシニア・エンテロコリチカ）（Yersinia enterocolitica）、ペスト菌（エルジニア・ペスティス）（Yersinia pestis）偽性結核菌（エルシニア・シュードツベルクローシス）（Yersinia pseudotuberculosis）、エルジニア・インターメディア（Yersinia intermedia）、百日咳菌（ボルデテラ・ペルツシス）（Bordetella pertussis）、パラ百日咳菌（ボルデテラ・パラペルツシス）（Bordetella parapertussis）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）、インフルエンザ菌（ヘモフィルス・インフルエンザ）（Haemophilus influenzae）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Haemophilus parainfluenzae）、ヘモフィルス・ヘモリティクス（Haemophilus haemolyticus）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（Haemophilus parahaemolyticus）、軟性下疳菌（ヘモフィルス・デユクレイイ）（Haemophilus ducreyi）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、パスツレラ・ヘモリティカ（Pasteurella haemolytica）、ブランハメラ・カタラーリス（Branhamella catarrhalis）、ピロリ菌（ヘリコバクター・ピロリ）（Helicobacter pylori）、カンピロバクター・フィータス（Campylobacter fetus）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）、ボレリア・バーグドルフェリー（Borrelia burgdorferi）、コレラ菌（ビブリオ・コレラ）（Vibrio cholerae）、腸炎ビブリオ（ビブリオ・パラヘモリティカス）（Vibrio parahaemolyticus）、レジオネラ・ニューモフィラ菌（Legionella pneumophila）、リステリア菌（リステリア・モノサイトゲネス）（Listeria monocytogenes）、淋菌（ナイセリア・ゴノレエ）（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（ナイセリア・メニンジティディス）（Neisseria meningitidis）、ガルドネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、クテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス・ディスタソニス（Bacteroides distasonis）、バクテロイデス３４５２Ａホモロジー群、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus）、バクテロイデス・オバルス（Bacteroides ovalus）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Bacteroides uniformis）、バクテロイデス・エガーシイ（Bacteroides eggerthii）、バクテロイデス・スプランクニクス（Bacteroides splanchnicus）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、ヒト型結核菌（ミコバクテリウム・チューバーキュロシス）（Mycobacterium tuberculosis）、トリ型結核菌（ミコバクテリウム・アビューム）（Mycobacterium avium）、ミコバクテリウム・イントラセルレア（Mycobacterium intracellulare）、らい菌（ミコバクテリウム・レプレ）（Mycobacterium leprae）、ジフテリア菌（ コリネバクテリウム・ジフテリア）（Corynebacterium diphtheriae）、 コリネバクテリウム・ウルセランス（Corynebacterium ulcerans）、肺炎連鎖球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ）（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・アガラクチェ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、大便連鎖球菌（エンテロコッカス・フェカリス）（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス）（Staphylococcus aureus）、 スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus）、スタフィロコッカス・インテルメヂウス（Staphylococcus intermedius）、スタフィロコッカス・ハイカス亜種ハイカス（Staphylococcus hyicus subsp. hyicus）、スタフィロコッカス・ヘモリティクス（Staphylococcus haemolyticus）、スタフィロコッカス・オミニス（Staphylococcus hominis）、スタフィロコッカス・サッカロリティクス（Staphylococcus saccharolyticus）が含まれる。
１つの実施形態において、標的化物質は、典型的な治療に耐性があり、すなわち、抗生物質に耐性がある。
他の実施形態において、本発明の抗原に基づくヘテロポリマーにより結合され得る例示的な標的化物質には、限定されるものではないが、次の物質：置換組み換え因子ＶＩＩによる血友病の処置に関連する自己抗体；免疫疾患、重症筋無力症、狼瘡，狼瘡性腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、心筋炎または天疱瘡および類天疱瘡に関連する自己抗体；組織移植自己免疫応答に関係する自己抗体；免疫複合体媒介性腎臓病（immune complex mediated kidney disease）に関係する自己抗体；またはよく特徴付けられたもしくは疾患病因と関係する他のいずれかの抗体のいずれかが含まれる。
さらなる他の実施形態において、本発明の二重特異的な化合物により結合され得る例示的な生物学的物質には、細菌戦に関係し得る炎症物質および毒素が含まれ、限定されるものではないが、炭疽、天然痘、疫病、エボラおよびマールブルグウィルスのいずれかが含まれる。
１つの実施形態において、本発明のアッセイを実施するにあたって、例えば、二重特異的化合物の投与前に、それと同時に、またはその後に、試薬がトランスジェニック動物に投与される。
本発明の二重特異的化合物、またはそのいずれかの部分は、その半減期を増大させるためにモディファイされ得る。ペプチド類似物は、その鋳型のペプチドの特徴と類似した特長を有する非−ペプチド試薬として医薬工業で一般に用いられる。この形式の非−ペプチド化合物は、「ペプチドミメティクス」または「ペプチド模倣体」と称され（Fauchere, Adv. Drug Res. 15: 29, 1986；Veberら、TINS p.392, 1985；およびEvansら、J. Med. Chem 30: 1229, 1987（これらは、出展明示により本明細書の一部とされる））、一般にコンピューターによる分子モデリングの目的で開発される。治療上有効なペプチドと構造上類似するペプチド模倣体は、治療上もしくは予防上同等の効果をもたらすために用いられ得る。一般に、ペプチド模倣体は、パラダイムポリペプチド（すなわち、生物学的活性または医薬活性を有するポリペプチド）、例えば抗原ポリペプチドと構造上類似するが、場合により−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−および−−ＣＨ２ＳＯからなる群より選択される連結基で、当分野で既知の方法により置換されている1つまたはそれ以上のペプチド結合を有し、以下の報文：Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins Weinstein, B編., Marcel Dekker, New York, p. 267, 1983；Spatola, A. F., Vega Data, Vol. 1, Issue 3, 「Peptide Backbone Modifications」 1983；Morley, Trends. Pharm. Sci. pp.463-468, 1980；Hudsonら、Int. J. Pept. Prot. Res. 14: 177-185, 1979 (--CH2NH--, CH2CH2--)；Spatolaら、Life. Sci. 38: 1243-1249, 1986 (--CH2--S)；Hann, J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1: 307-314, 1982 (--CH--CH--、シスおよびトランス)；Almquistら、J. Med. Chem. 23: 1392-1398, 1980 (--COCH2--)；Jennings-Whiteら、Tetrahedron Lett. 23: 2533, 1982 (--COCH2--)；Szelkeら、欧州特許出願番号第45665 CA号: 97: 39405, 1982 (--CH(OH)CH2--)；Holladayら、Tetrahedron. Lett. 24: 4401-4404, 1983 (--C(OH)CH2--)；およびHruby, Life Sci. 31: 189-199, 1982 (--CH2--S--)（それぞれ出展明示により本明細書の一部とされる）にさらに記載されている。特に好ましい非−ペプチド結合は、−−ＣＨ２ＮＨ−−である。そのようなペプチド模倣体は、例えば、より経済的な生産性、より高い化学的安定性、増強された医薬上の特徴（半減期、吸収、有効性、効能など）、改変された特異性（例えば、生物学的活性の広範囲スペクトル）、低減された抗原性および他の特徴を含む、ポリペプチド実例よりも顕著な利点を有する。ペプチド模倣体の標識化は、通常、定量的な構造上の活性データおよび／または分子モデリングにより予想されるペプチド模倣体を干渉しない部位（群）に、1つまたはそれ以上の標識の、直接的なもしくはスペーサー（例えば、アミド基）を通じた共有結合による付加を含む。このように干渉しない部位は、一般的に、高分子（群）と直接的な接触を形成しない部位で、ペプチド模倣体が治療上の効果を生じさせるために結合する部位である。ペプチド模倣体の誘導体化（例えば、標識化）は、該ペプチド模倣体の所望の生物学的活性または医薬上の活性を実質的に干渉しないべきである。
アミノ酸配列の1つまたはそれ以上のアミノ酸の同型でＤ−アミノ酸との系統的置換（例えば、Ｌ−リジンのＤ−リジンによる置換）は、より安定なペプチドを作り出すために用いることができる。加えて、自然にないペプチドは、当分野で既知の方法により：例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド結合を形成させることができるシステイン残基を内部に加えることにより作り出すことができる（Rizoら、Annu. Rev. Biochem. 61: 387, 1992、出展明示により本明細書の一部とされる）。
このようなモディファイされたポリペプチドは、原核宿主細胞または真核宿主細胞に産生させることができる。別法として、該ペプチドは、化学的方法により合成することができる。組み換え宿主における異種ポリペプチド、化学合成のポリペプチドの発現方法、およびインビトロ翻訳は、当分野で周知であり、さらなる詳細は、Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版、Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；Bergerら、Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.；Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 91: 501, 1969；Chaiken, CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255, 1981；Kaiserら、Science 243: 187, 1989；Merrifield, Science 232: 342, 1986；Kent, Annu. Rev. Biochem. 57: 957, 1988；およびOfford, Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing, 1980（これらは、出展明示により本明細書の一部とされる）に記載されている。
ポリペプチドは、典型的には、直接化学合成により生産され、ヘテロポリマーの結合部分として用いられ得る。ペプチドは、そのＮ末端および／またはＣ末端に共有結合で連結することにより非ペプチド部分を付加してモディファイしたペプチドとして生産することができる。ある好ましい実施形態において、カルボキシ−末端またはアミノ−末端のいずれか、もしくは双方が化学的にモディファイされる。末端のアミノ基またはカルボキシル基の最も一般的なモディフィケーションは、それぞれアセチル化とアミド化である。アミノ末端のモディフィケーション、例えばアシル化（例えば、アセチル化）またはアルキル化（例えば、メチル化）、およびカルボキシ末端のモディフィケーション、例えばアミド化、ならびに環化を含む他の末端のモディフィケーションは、様々な態様で試験化合物に組み込むことができる。特定のアミノ末端および／またはカルボキシ末端のモディフィケーションおよび／またはコア配列に対するペプチド伸張は、物理学的、化学的、生化学的、および薬理学的に利点のある特徴、例えば、増強された安定性、増大した有効性および／または効用、血清のプロテアーゼに対する耐性、所望の薬理動力学的特長およびその他の特徴を与え得る。
トランスジェニック動物の構築
１つの態様において、本発明は、そのゲノムがプロモーターに作動可能に連結されたＣＤ１４をコードするポリヌクレオチドを含み、ヒト以外のまたはヒトのＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆ遺伝子が動物のマクロファージで機能的に発現する、あるいはヒト以外のまたはヒトのＣＤ１４が動物のマクロファージで機能上の変異を含まない動物を提供する。本発明は、さらに、ヒト以外またはヒトのＣＤ１４を動物のマクロファージで発現するヒト以外のトランスジェニック動物を作製する方法を提供する。
本発明の方法に用いられるトランスジェニック動物は、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、または両生類であってよい。本明細書で記載される使用に際して適切な哺乳動物には、げっ歯類；反芻動物；有蹄類；家畜動物；および搾乳動物が含まれる。好ましい動物には、げっ歯類、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、ウシ、ブタ、ウマ、雄牛、ラマ、ニワトリ、ガチョウおよびアヒルが含まれる。好ましい実施形態において、ヒト以外の動物はウマである。
トランスジェニック動物を作製する様々な方法は、当分野で知られている（例えば、Watson,ら、Recombinant DNA、第２版中の「The Introduction of Foreign Genes Into Mice」, W. H. Freeman ＆ Co., New York, pp. 255-272, 1992；Gordon, Intl. Rev. Cytol. 115: 171-229, 1989；Jaenisch, Science 240: 1468-1474, 1989；Rossant, Neuron 2: 323-334, 1990）。トランスジェニックブタ調製のための例示的なプロトコルは、White and Yannoutsos, Current Topics in Complement Research: 64th Forum in Immunology, pp. 88-94；米国特許第５，５２３，２２６号明細書；米国特許第５，５７３，９３３号明細書；ＰＣＴ出願番号第９３／２５０７１号；およびＰＣＴ出願番号第９５／０４７４４号において見い出すことができる。トランスジェニックラット調製のための例示的なプロトコルは、Baderら、Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 前掲、3: S81-S87, 1996において見い出すことができる。トランスジェニックウシ調製のための例示的なプロトコルは、Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, 編集, Carl A. Pinkert, Academic Press, Incにおいて見い出すことができる。トランスジェニックヒツジ調製のための例示的なプロトコルは、Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, 編集, Carl A. Pinkert, Academic Press, Incにおいて見い出すことができる。いくつかの例示的な方法が、以下にさらに詳細に記載される。
Ａ．前核への注入
トランスジェニック動物は、本発明に基づき拡散構築物を卵細胞に導入して作製することができる。その結果得られた卵細胞は、正常な胎児の発生のために雌の子宮に移植され、そして発生し、トランス遺伝子を保有する動物を戻し交雑させ、トランス遺伝子のヘテロ接合体を作り出す。様々な発生段階の胎児の標的細胞を用いて、本発明のトランス遺伝子を導入する。胎児標的細胞（群）の発生段階に応じて、種々の方法が用いられる。トランス遺伝子を導入する例示的な方法には、限定されるものではないが、受精可能な卵もしくは接合体を顕微注入すること（Brinsterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442, 1985）、およびウイルス組み込み（Jaenisch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 1260-1264, 1976; Jahnerら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 82: 6927-6931, 1985; Van der Puttenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148-6152, 1985）が含まれる。胎児の操作および顕微注入の手順は、例えば、Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY., 1986)（その内容は出展明示により本明細書の一部とされる）に記載されている。類似の方法が、他のトランスジェニック動物作製に用いられる。
例示的な実施形態において、トランスジェニックマウス作製は、次の工程を行う。明確な同血統繁殖の遺伝的背景を有する雄と雌のマウスを交配させる。交配させた雌のマウスを、排卵を誘発するため、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を含む妊娠した雌の血清（ＰＭＳ）であらかじめ処理する。交配に続いて、雌を犠牲にし、受精可能な卵をその子宮管から取り出す。この際、前核はまだ融合しておらず、それらは光学顕微鏡を用いて可視化することができる。別のプロトコルにおいて、胎児は、様々な発生の段階で回収することができ、例えば胚盤胞を回収することができる。胎児は、ダルベッコ改変リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で回復され、１０％胎児ウシ血清を含むダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）で維持される。
次いで、外来のＤＮＡまたは組み換え構築物（例えば、ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆ発現構築物）は、前核に顕微注入される（卵あたり１００〜１０００分子）。発現構築物の顕微注入は、顕微鏡に備えられた標準的なミクロ操縦装置を用いて行うことができる。例えば、胎児は、典型的には、顕微注入される間、油下の１００マイクロリットルのＤＰＢＳ液滴中で抑制される。ＤＮＡ溶液がオスの前核に顕微注入される。一連の注入は、前核の膨張により監視される。その後すぐに、前核の融合（雌の前核と雄の前核）が生じ、多くの場合、外来ＤＮＡが、（通常）受精可能な卵または接合子の一方の染色体に挿入される。上記のように調製された組み換えＥＳ細胞は、類似の技術を用いて胚盤胞に注入することができる。
Ｂ．胎児期幹細胞
トランスジェニックマウスを作製する別の方法において、本発明の組み換えＤＮＡ分子を、マウスの胎児期幹細胞（ＥＳ）に導入することができる。その結果得られた組み換えＥＳ細胞を、これまでに記載された技術と類似の技術を用いて、マウス胚盤胞に顕微注入する。
ＥＳ細胞は、移植前の胎児から得ることができ、インビトロで培養することができる（Evansら、Nature 292: 154-156, 1981；Bradleyら、Nature 309: 255-258, 1984；Gosslerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065-9069, 1986；Robertsonら、Nature 322: 445-448, 1986）。発生中の胎児の生殖細胞系に組み込むことができ、その一部となることができるいずれのＥＳ細胞系は、標的構築物のの生殖細胞系遺伝的伝達を作り出すため、本発明の使用に好ましい。例えば、ＥＳ細胞の産生に用いられ得るマウス株は、１２９Ｊ株である。好ましいＥＳ細胞系は、ネズミの細胞系Ｄ３（アメリカン・タイプカルチャーコレクション・カタログ番号ＣＲＬ１９３４）である。そのＥＳ細胞は、培養することができ、当分野で既知の方法で、Robertson, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson編. IRL Press, Washington, D.C., 1987, Bradleyら、Current Topics in Devel. Biol. 20: 357-371, 1986およびHoganら、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986（これらの内容は、出展明示により本明細書の一部とされる）に記載の方法を用いてＤＮＡ挿入のために調製することができる。
発現構築物は、当分野で既知の方法、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor laboratory Press: 1989（この内容は出展明示により本明細書の一部とされる）に記載の方法によりＥＳ細胞に導入することができる。適切な方法には、限定されるものではないが、電気穿孔法、顕微注入法、およびリン酸カルシウム処置法が含まれる。ＥＳ細胞に導入される発現構築物（例えば、ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆ）は、好ましくは直鎖である。直鎖化は、ＤＮＡを、ベクター配列内にただ１つ存在し、遺伝子内（例えば、ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆ）に存在しない箇所を切断するよう選択された適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化することにより実施することができる。
発現構築物の導入後に、ＥＳ細胞は、その構築物の存在についてスクリーニングされる。細胞は、様々な方法を用いてスクリーニングすることができる。標識遺伝子が構築物に用いられている場合、その動物の細胞は、その標識遺伝子の存在について試験することができる。例えば、標識遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である場合、細胞は、その他の細胞にとって致死濃度の抗生物質（例えば、ネオマイシンについて選択するためのＧ４１８）の存在下で培養することができる。生存する細胞は、おそらくトランス遺伝子構築物が組み込まれている。標識遺伝子が、その活性が検出できる酵素（例えば、ベータ・ガラクトシダーゼ）をコードする遺伝子である場合、その酵素の基質を適切な条件下で細胞に加え、その酵素活性を分析することができる。別法として、あるいはさらに、ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡを直接試験してもよい。例えば、ＤＮＡを標準的な方法を用いてＥＳ細胞から抽出し、次いでそのＤＮＡを、あるプローブまたはそのトランス遺伝子に特異的にハイブリダイズするよう設計されたプローブを用いてサザンブロットで調べることができる。ゲノムＤＮＡもまた、特定の大きさで、トランスジェニック構築物を含む細胞だけがその適切な大きさのＤＮＡ断片を生成するよう、そのトランス遺伝子の配列を含むＤＮＡ断片を増幅できるよう特に設計されたプローブを用いたＰＣＲにより増幅することができる。
Ｃ．移植
本発明の組み換え核酸分子（例えば、ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆ）を保有する接合体を、精菅切除されたオスと先に交配させることによって得られた偽妊娠メスマウスに移植する。一般的なプロトコルにおいて、受容体のメスを麻酔し、傍腰部（paralumbar）切開を施しその卵管を曝して、胎児を卵管の膨大部領域に移した。体壁を縫合し、傷クリップ（paralumbar）で皮膚を閉じた。その胎児を完全な懐胎期間まで成長させ、代理母にトランスジェニックの可能性のあるマウスを産ませる。最後に、新生マウスを、外来もしくは組み換えＤＮＡの存在について試験する。卵注入の場合、平均１０％でマウスは適当に発育し、産生される。新生のうち、平均四分の一（２５％）でトランスジェニックであり、全体の効率は２．５％である。ひとたび、これらのマウスが生まれると、それらは、その外来遺伝子を、マウスの染色体に連結された正常な（メンデル）様式で遺伝させる。
Ｄ．トランス遺伝子構築物の存在の配列決定
トランスジェニック動物は、標準的なプロトコルにより出産後に確認することができる。尻尾組織からのＤＮＡを、トランス遺伝子構築物の存在について、例えば、サザンブロットおよび／またはＰＣＲを用いて、スクリーニングすることができる。次いで、ホモ接合体の動物を作製するため、それらがトランス遺伝子を保有すると考えられる場合、モザイクと思われる子孫を互いに交配させる。その子孫が生殖細胞系の伝達性を有するかどうか明らかでない場合、それらは親系統もしくは他の系統と交配させ、その死をんをヘテロ接合型についてスクリーニングすることができる。ヘテロ接合型は、サザンブロットおよび／またはＤＮＡのＰＣＲ増幅により同定される。次いで、ヘテロ接合型を互いに交配させ、ホモ接合型のトランス遺伝子の子孫を作り出すことができる。ホモ接合型は、この交配の産物であるマウス、ならびに既知のヘテロ接合型のマウスおよび野生型マウスからのゲノムＤＮＡを当量用いたサザンブロッティングにより同定することができる。サザンブロットでスクリーニングするためのプローブは、ヒトもしくはヒト以外のＴＬＲ4、ＣＤ１４もしくはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆ遺伝子、または標的遺伝子、もしくはその両方を元に設計することができる。
トランス遺伝子の子孫を確認し、特徴づける他の方法が当分野え知られている。例えば、これらの子孫の様々な組織に導入された遺伝子の発現レベルを評価するため、ウェスタンブロットで、導入された遺伝子にコードされた蛋白質（例えば、ヒトもしくはヒト以外のＴＬＲ４，ＣＤ１４もしくはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆ蛋白質）に対する抗体、または遺伝子が発現された場合に、その標識遺伝子産物に対する抗体を用いて探索することにより、ウェスタンブロットを用いることができる。
インシトゥ（系内）分析、例えば、細胞を固定し、抗体を用いて標識し、および／または種々の細胞、例えばその子孫からの赤血球のＦＡＣS（細胞標示式細胞分取器）分析は、トランス遺伝子産物が存在することまたは存在しないことを見い出すのに適切な抗体を用いて実施することができる。例えば、マクロファージにおけるＴＬＲ４、ＣＤ１４もしくはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆの発現を実証するため、発色団が複合化されており、ＴＬＲ４、ＣＤ１４もしくはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆに対する抗体を認識する二次抗体に直接複合化される、または複合化に用いられるヒトＣ ＴＬＲ４、ＣＤ１４もしくはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆに特異的な抗体を用いた、フローサイトメトリーを行うことができる。この分析において、ＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆの存在に関して、ヒト赤血球が陽性対照として用いられ、正常なマウスの赤血球が陰性対照として用いられ得る。
Ｅ．複数のトランス遺伝子またはさらなる変異を含むマウス
本明細書に記載されるように、循環赤血球上のＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆを発現するトランスジェニックマウスは、ａ）さらなるトランス遺伝子（群）を有する、またはｂ）他の遺伝子に突然変異を有するマウスと、交雑させることができる。それぞれの変異についてのヘテロ接合型またはホモ接合型のマウスは、標準的な交雑手順（crossbreeding procedure）を用いて、作り出し維持することができる。ＣＤ１４トランス遺伝子を有するマウスと交配させることができるマウスの例としては、限定されるものではないが、抗−免疫疾患の傾向が強いマウス株、例えば狼瘡モデルのマウス株、例えばＮＺＢ／Ｗ、ＭＲＬ＋またはＳＪＬマウス株が含まれる。
本発明は、さらに、トランスジェニック動物から誘導された細胞に関する。突然変異もしくは環境の影響のいずれかにより特定のモディフィケーションが次の世代に生じることがあるため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一でないが、本明細書で用いられる用語の範囲内にまだ含まれる。
組み換え核酸技術
本発明の実施に用いられる、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルスまたはそれらの混成物のいずれかの核酸は、種々の供給源から単離することができ、一般的に作製し、増幅し、および／または組み換え技術により発現させ／作り出すことができる。これらの核酸から作り出された組み換えポリペプチドは、個別に単離し、もしくはクローン化することができ、そして、所望の活性について試験することができる。細菌、哺乳動物、酵母、昆虫または植物細胞発現系を含む、いずれかの組み換え発現系を用いることができる。
別法としては、これらの核酸は、例えば、Adams, J. Am. Chem. Soc. 105:661, 1983；Belousov, Nucleic Acids Res. 25:3440-3444, 1997；Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19:373-380, 1995；Blommers, Biochemistry 33:7886-7896, 1994；Narang, Meth. Enzymol. 68:90, 1979；Brown Meth. Enzymol. 68:109, 1979；Beaucage, Tetra. Lett. 22:1859, 1981；米国特許第４，４５８，０６６号明細書に記載されるように、周知の化学合成技術によりインビトロで合成することができる。
本発明は、本発明の配列を含むオリゴヌクレオチド、例えば、本発明で例示される配列の部分配列を提供する。オリゴヌクレオチドには、例えば化学的に合成することができる、一本鎖のポリ−デオキシヌクレオチドまたは二本鎖の相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖が含まれる。
核酸の操作技術、例えば、サブクローニング、標識化プローブ（例えば、クレノウポリメラーゼを用いたランダム−プライマー標識化、ニックトランスレーション法、増幅）、配列決定、ハイブリダイゼーションおよびその類似の方法は、科学文献および特許文献に広く記載されており、例えば、Sambrook編., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (第2版), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel編. John Wiley＆Sons, Inc., New York, 1997；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, 第I部. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen編. Elsevier, N.Y., 1993を参照のこと。
核酸、ベクター、キャプシド、ポリペプチドおよび類似物は、当業者に周知の多くの一般的な方法のいずれかにより分析し、定量化することができる。これらには、例えば、分析生化学的方法、例えば、ＮＭＲ、分光法、分析撮影法、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、および高分散（hyperdiffusion）クロマトグラフィー、種々の免疫学的方法、例えば、液体もしくはゲル沈降反応法、免疫拡散法、免疫−電気泳動法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫−蛍光アッセイ、サザン分析法、ノーザン分析法、ドット−ブロット分析法、ゲル電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、核酸もしくは標的もしくはシグナル増幅方法、放射同位元素標識法、シンチレーション計数法および親和性クロマトグラフィーが挙げられる。
本発明の方法を実施するために用いられる核酸の取得および操作は、ゲノム試料からクローニングすることによって、要すれば、例えばゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンから単離するかまたは増幅した挿入物をスクリーニングし、そして再びクローニングすることによって行うことができる。本発明の方法で用いられる核酸の供給源には、例えば、哺乳類の人工染色体（ＭＡＣ）、例えば、米国特許第５，７２１，１１８号明細書；第６，０２５，１５５号明細書を参照のこと；ヒトの人工染色体、例えば、Rosenfeld, Nat. Genet. 15:333-335, 1997を参照のこと；酵母の人工染色体（ＹＡＣ）；細菌の人工染色体（ＢＡＣ）；Ｐ１の人工染色体、例えば、Woon, Genomics 50:306-316, 1998を参照のこと；Ｐ１−誘導ベクター（ＰＡＣ）、例えば、Kern, Biotechniques 23:120-124, 1997を参照のこと；コスミド、組み換えウイルス、ファージまたはプラスミドに含まれる、ゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリーが挙げられる。
本発明は、融合蛋白質およびそれらをコードする核酸を提供する。ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４ポリペプチドは、異種のペプチドもしくはポリペプチド、例えば、Ｎ−末端同定ペプチドと融合させ、所望の特性、例えば、増大された安定性または簡易化された精製を与えることができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドもまた、例えば、さらなる免疫性ペプチドを産生するよう、より容易に組み換え合成ペプチドを単離できるよう、抗体および抗体発現Ｂ細胞などを同定し、単離できるよう、それらに１つまたはそれ以上のさらなるドメインを付加した融合蛋白質として合成し、発現させることができる。検出および精製を容易にするドメインには、例えば、金属キレート性のペプチド、例えば固定された金属上での精製を可能にするポリヒスチジン帯およびヒスチジン−トリプトファン分子、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、ＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製系（Immunex Corp, Seattle Wash.）で利用できるドメインが挙げられる。精製するドメインと精製を容易にするためのモチーフを含むペプチドまたはポリペプチドとの間に、開裂可能なリンカー配列、例えばＸａ因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego Calif.)を含ませる。例えば、発現ベクターは、６個のヒスチジン残基、続いて、チオレドキシンおよびエンテロキナーゼ開裂部位に連結されたエピトープをコードする核酸配列を含ませることができる（例えば、Williams, Biochemistry 34:1787-1797, 1995；Dobeli, Protein Expr. Purif 12:404-414, 1998を参照のこと)。ヒスチジン残基は検出および精製を容易にするが、エンテロキナーゼ部位は、融合蛋白質の残部からエピトープを精製する手法を提供する。１つの態様において、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、翻訳されたポリペプチドまたはその断片を分泌させることができるリーダー配列を用いて適当な段階で集められる。融合蛋白質をコードするベクターに関係する技術および融合蛋白質の応用は、科学文献および特許文献に広く記載されており、例えば、Kroll, DNA Cell. Biol. 12:441-53, 1993を参照のこと。
Ａ．転写調節因子
本発明の核酸は、プロモーターに作動可能に連結されていてもよい。プロモーターは、１個のモチーフであっても、または核酸の転写を方向づける核酸制御配列の群列であってもよい。プロモーターは、転写の開始部位、例えばポリメラーゼＩＩ型のプロモーターの場合には、ＴＡＴＡ因子の近くに必要な核酸配列を組み入れることができる。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対程度離れて配置される場合がある、遠位のエンハンサーまたはリプレッサー要素を含んでいてもよい。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件および発生条件下で活動するプロモーターである。「誘導」プロモーターは、環境もしくは発生制御下にあるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、生物の特定の組織型で活性であるが、同じ生物の他の組織型では活性でないプロモーターである。用語「作動可能に連結された」は、核酸発現の制御配列（例えば、プロモーターまたは転写因子結合部位の群列）と第二の核酸配列との間にあり、該発現制御配列が第二の配列に関する核酸の転写を方向づける、機能的な連結を意味する。
Ｂ．発現ベクターおよびクローニング媒体
本発明は、本発明の核酸、例えば本発明の蛋白質をコードする配列を含む、発現ベクターおよびクローニング媒体を提供する。本発明の発現ベクターおよびクローニング媒体は、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ホスミド（fosmid）、細菌の人工染色体、ウイルスのＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、ファウルポックスウイルス、ＳＶ４０の仮性狂犬病および派生体）、Ｐ１−に基づく人工染色体、酵母プラスミド、酵母の人工染色体および目的の特定の宿主に特異的な他のいずれかのベクター（例えば、バチルス、アスペルギルスおよび酵母）を含んでいてもよい。本発明のベクターは、染色体配列、染色体以外の配列、および合成DNA配列を含んでいてもよい。多くの適切なベクターが当業者には知られており、商業的に入手可能である。
本発明の核酸は、要すれば、通常の分子生物学的方法；例えば、米国特許第５，４２６，０３９号明細書に記載されるインビトロ増幅された核酸をクローニングする方法を用いて、種々のベクターのいずれかにクローニングすることができる。増幅された配列のクローニングを容易にするため、制限酵素部位をＰＣＲプライマーの組みに「組み込む」ことができる。
本発明は、本発明のポリペプチドおよびペプチドをコードする発現ベクターのライブラリーを提供する。これらの核酸は、ゲノム内に、または細胞質内にもしくは細胞核内に導入し、科学文献および特許文献に広く記載された、種々の慣用技術により発現させることができる。例えば、Roberts, Nature 328:731, 1987；Schneider, Protein Expr. Purif. 6435:10, 1995；Sambrook, Tijssen or Ausubelを参照のこと。ベクターは、天然資源から単離することができ、ＡＴＣＣもしくはジーンバンクライブラリーなどの資源から得ることができるし、あるいは、合成もしくは組み換え方法により調製することができる。例えば、本発明の核酸は、発現カセット、ベクターまたはウイルスにて、細胞内で安定にまたは一過性に発現させることができる（例えば、エピソーム発現系）。選択標識は、形質転換された細胞の選択的な表現型および配列を確認するために発現カセットおよびベクター中に組み込むことができる。例えば、選択的標識は、宿主のゲノム内に組み込むことが必要でない場合に、エピソームの維持および複製についてコードすることができる。
１つの態様において、本発明の核酸は、本発明のペプチドまたはポリペプチドのインシトゥ発現のためにインビボ投与される。核酸は、「裸のＤＮＡ」として（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号明細書）、または発現ベクターの形式で、例えば組み換えウイルスの形式で投与することができる。核酸は、以下に記載されるように腫瘍周辺もしくは内部を含む、いずれかの経路により投与することができる。インビボ投与されるベクターは、組み換え技術により改変された被覆もしくは被覆されていないＤＮＡおよびＲＮＡウイルス、好ましくは、バキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科またはピコルナウイルス科（picornnaviridiae）から選択されるウイルスゲノムから誘導することができる。それぞれ元のベクターが有する特徴の有利な利点を巧みに利用するキメラベクターもまた用いることができる (例えば、Feng, Nature Biotechnology 15:866-870, 1997を参照のこと)。そのようなウイルスゲノムは、組み換えＤＮＡ技術により本発明の核酸を含むように改変することができ；そして、さらに条件付で複製するまたは複製能を有する複製欠損性となるように作り出すことができる。別の態様において、ベクターは、アデノウイルスゲノム（例えば、ヒトアデノウイルスゲノムから誘導された複製不能のベクター、例えば、米国特許第６，０９６，７１８号明細書；第６，１１０，４５８号明細書；第６，１１３，９１３号明細書；第５，６３１，２３６号明細書を参照のこと）；アデノ−随伴ウイルスゲノムおよびレトロウイルスゲノムから誘導される。レトロウイルスベクターは、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくものが含まれる；例えば、米国特許第６，１１７，６８１号明細書；第６，１０７，４７８号明細書；第５，６５８，７７５号明細書；第５，４４９，６１４号明細書；Buchscher, J. Virol. 66:2731-2739, 1992；Johann, J. Virol. 66:1635-1640, 1992を参照のこと)。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）−基づくベクターは、標的核酸を有する放射免疫細胞に用いることができ、例えばインビトロでの核酸およびペプチドの産生に、およびインビボおよび生体外（エックスビボ）での遺伝子治療手順に用いることができる；例えば、米国特許第６，１１０，４５６号明細書；第５，４７４，９３５号明細書；Okada, Gene Ther. 3:957-964, 1996を参照のこと。
本明細書で用いられる「発現カセット」は、構造遺伝子（すなわち、蛋白質、例えば本発明のポリペプチドをコードする配列）の発現に、それらの配列と適合性のある宿主内で影響を与えることができるヌクレオチド配列を意味する。発現カセットには、少なくとも、ポリペプチドをコードする配列と作動可能に連結されたプロモーター；および、場合により他の配列、例えば転写終結シグナルを含む。発現をもたらすのに必要もしくは助けとなるさらなる因子、例えばエンハンサーもまた用いることができる。
核酸が、他の核酸配列と機能的な関係で設置された場合に、作動可能に連結される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合、コード配列と作動可能に連結される。転写調節配列に関して、「作動可能に連結された」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接しており、２つの蛋白質のコード領域を繋げる必要のある場合には、読み取り枠内で隣接していることを意味する。スイッチ配列に関して、「作動可能に連結された」は、配列がスイッチ組み換えをもたらすことができることを示す。従って、発現カセットはまた、プラスミド、発現ベクター、組み換えウイルス、組み換え「裸のＤＮＡ」ベクターのいずれかの形態、およびその類似物が含まれる。
「ベクター」は、連結された他の核酸を輸送することができる核酸分子を意味するものである。ベクターの１つの形式としては、「プラスミド」があり、これは、その中にさらなるＤＮＡ断片を連結することができる、環状の二本鎖ＤＮＡループを意味する。ベクターのその他の型には、ウイルスベクターがあり、そのウイルスゲノム中にさらなるＤＮＡ断片を連結することができる。特定のベクターは、宿主細胞内に導入され、そこで自己複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、エピソームでない哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると、その宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと一緒に複製され得る。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を方向付けることができる。そのようなベクターは、本明細書中では「組み換え発現ベクター」（または、単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組み換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターは、しばしばプラスミド型である。詳細な説明において、「プラスミド」および「ベクター」は、相互に交換して用いることができ、プラスミドが最も一般的に用いられるベクター型である。しかしながら、本発明は、他の形式の発現ベクター、例えば同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含むものである。
Ｃ．宿主細胞および形質転換された細胞
本発明はまた、本発明の核酸配列、例えば発明のポリペプチドをコードする配列、または本発明のベクターを含む、形質転換された細胞を提供する。宿主細胞は、当業者によく知られた、原核細胞、真核細胞、例えば細菌細胞、菌類細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞または植物細胞を含むいずれかの宿主細胞であってよい。細菌細胞の例には、大腸菌、ストレプトマイセス、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）およびシュードモナス、ストレプトマイセスおよびブドウ球菌（Staphylococcus）属の範囲内の種々の種が挙げられる。例示的な昆虫細胞には、ショウジョウバエＳ2およびスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９が挙げられる。哺乳動物細胞の例には、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはボウズ（Bowes）黒色腫またはマウスもしくはヒトのいずれかの細胞株が挙げられる。適当な宿主の選択は、当業者の能力の範囲内にある。
ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃、またはＴｉ−媒介遺伝子導入を含む様々な技術のいずれかを用いて宿主細胞中に導入することができる。特定の方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔法が含まれる。
作り出された宿主細胞は、必要に応じてプロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、あるいは本発明の遺伝子を増幅するために、改変された典型的な栄養培地中で培養することができる。適切な細胞株の形質転換および適当な細胞密度に宿主細胞を増殖することに続いて、選択されたプロモーターを適当な方法（例えば、温度変化または化学的導入）により導入することができ、そして細胞に所望のポリペプチドまたはその断片を産生させる前に、さらに培養することもできる。
細胞を遠心分離により集め、物理的もしくは化学的方法により破壊し、得られた粗抽出物を、さらに精製するために維持することができる。蛋白質の発現のために用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクルリング、超音波処理、機械的な破壊、または細胞溶解試薬の使用を含む、典型的な方法のいずれかにより破壊することができる。そのような方法は、当業者には周知である。発現されたポリペプチドまたは断片は回収し、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン交換または陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む方法により、組み換え細胞培養物から精製することができる。蛋白質のリフォールディンク工程は、必要に応じて、ポリペプチドの遠心分離を完了して用いることができる。要すれば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終的な精製工程に用いることができる。
種々の哺乳類の細胞培養系を、組み換え蛋白質の発現のために用いることができる。哺乳類の発現系の例には、サル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７および適合性のベクターから蛋白質を発現することができる他の細胞系、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系が挙げられる。
宿主細胞において構築物は、組み換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生させるために、通常の様式で用いることができる。組み換え産生過程が行われている宿主細胞に依存して、ベクターを含む宿主細胞により産生されたポリペプチドは、グリコシル化される場合もあれば、グリコシル化されない場合もある。本発明のポリペプチドは、最初にメチオニンのアミノ残基を含んでいても、いなくてもよい。
無細胞翻訳系もまた、本発明のポリペプチドを産生するために用いることができる。無細胞翻訳系は、該ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡ構築物から転写されたｍＲＮＡを用いることができる。幾つかの態様において、ＤＮＡ構築物は、インビトロ転写反応を行う前に、直鎖にしてもよい。次いで、転写されたｍＲＮＡを適当な無細胞翻訳抽出物、例えば、ラビット網状赤血球抽出液とインキュベートし、所望のポリペプチドまたはその断片を産生させる。
発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択に関して表現型の特徴を与えるため、１つまたはそれ以上の選択可能な標識遺伝子、例えば、真核細胞培養については、ジヒドロ葉酸還元酵素耐性またはネオマイシン耐性、あるいは、例えば、大腸菌の場合は、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を含ませることができる。
Ｄ．核酸の増幅
本発明の実施において、本発明のポリペプチドをコードする核酸、またはモディファイされた核酸を、例えば増幅により再生成することができる。本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を増幅するための増幅プライマー配列の組み、例えば、ＣＤ１４蛋白質もしくはＴｏｌｌ様受容体４配列、またはその部分配列を含む核酸配列を増幅することができるプライマーの組みを提供する。
増幅方法には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、PCR(PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y., 1990およびPCR STRATEGIES, 1995, ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y.,)、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Wu, Genomics 4:560, 1989；Landegren, Science 241:1077, 1988；Barringer, Gene 89:117, 1990を参照のこと）；転写増幅（例えば、Kwoh, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173, 1989を参照のこと）；および自家持続配列複製（self-sustained sequence replication）（例えば、Guatelli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874, 1990を参照のこと）；Ｑベータ複製増幅（例えば、Smith, J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491, 1997を参照のこと）、自動Ｑ−ベータ複製増幅アッセイ（例えば、Burg, Mol. Cell. Probes 10:257-271, 1996を参照のこと）および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario）が挙げられ;さらに、Berger, Methods Enzymol. 152:307-316, 1987；Sambrook；Ausubel；米国特許第４，６８３，１９５号明細書および第４，６８３，２０２号明細書；Sooknanan, Biotechnology 13:563-564, 1995を参照のこと。
Ｅ．核酸のハイブリダイゼーション
本発明は、厳格な条件下で本発明の発明で例示する配列、例えば配列番号：１または配列番号：３に記載される配列、またはそれらのいずれかと相補的な配列、または本発明のポリペプチドをコードする核酸とハイブリダイズする単離されたまたは組み換え核酸を提供する。別の態様において、厳格な条件には、当分野で知られるように、また本明細書で記載されるように、強い厳格な条件、中程度の厳格な条件または弱い厳格な条件がある。これらの方法は、本発明の核酸を単離するために用いることができる。
別の態様において、厳格な条件下でハイブリダイズするその能力により確立されるように、本発明の核酸は、本発明の核酸の約５残基から全長の間であってもよい；例えば、それらは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００またはそれ以上の残基長であってよく、あるいは遺伝子もしくはコード配列、例えばｃＤＮＡの全長であってよい。全長よりも短い核酸もまた含まれる。これらの核酸は、例えば、ハイブリダイゼーションのプローブ、リーディングプローブ、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプローブ、ｉＲＮＡ、抗体が結合するペプチド（エピトープ）、モチーフ、活性部位などをコードするアンチセンス配列もしくは配列として有用である。
「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」は、配列が、複合体混合物で存在する場合に（例えば、全ての細胞のまたはライブラリーのＤＮＡもしくはＲＮＡ）、特定のヌクレオチド配列は少なくともバックグラウンドの約１０倍で検出されるよう、分子が厳格なハイブリダイゼーションの条件下で、特定のヌクレオチド配列に結合すること、二本鎖となること、またはハイブリダイズすることを意味する。１つの実施形態において、核酸は、厳格な条件下で核酸にハイブリダイズするその能力により、本発明の目的の範囲内（例えば、本明細書に記載した例示的な配列）にあるかどうかが決定され得る。
「厳格なハイブリダイゼーション条件」は、その条件下で、あるプローブが、その標的物質に典型的に核酸の複合体混合物でハイブリダイズするが、有意な量で他の配列にハイブリダイズしない条件を意味する（陽性信号（例えば、本発明の核酸を同定する）は、バックグラウンドのハイブリダイゼーションの約１０倍要する）。厳格な条件は、配列に依存し、種々の環境により異なるものである。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての多くの手引きは、例えば、Sambrook編、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989；Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel編、John Wiley＆Sons, Inc., New York, 1997；Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology: Hybridization With NUCLEIC ACID Probes, 第I章、Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen編、Elsevier, N.Y., 1993において見出される。
一般的に、厳格な条件は、確定されたイオン強度ｐＨにおけるその特定の配列の融解温度Ｉよりも約５℃〜１０℃低い温度が選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が標的の配列に平衡状態でハイブリダイズする温度である（標的配列が過剰に存在する場合、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態を占める）。厳格な条件は、塩の濃度が、ｐＨ７．０から８．３で、約１．０Ｍのナトリウムイオンよりも低い、典型的には約０．０１Ｍ〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または、他の塩）濃度であり、温度は、短いプローブの場合には（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）少なくとも約３０℃、そして長いプローブの場合には（例えば、５０ヌクレオチド以上）少なくとも約６０℃である。厳格な条件は、Sambrookにおいて記載されるように（以下に詳述する）、不安定化剤、例えばホルムアミドを用いて達成することもできる。強い厳格なハイブリダイゼーションについて、陽性信号は、少なくともバックグラウンドの２倍、好ましくはバックグラウンドの１０倍のハイブリダイゼーションである。例示的な強い厳格なまたは厳格なハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳのもと４２℃でインキュベートするか、または５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳのもと６５℃でインキュベートし、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳのもと６５℃で洗浄することを含む。選択的もしくは特異的なハイブリダイゼーションについて、陽性信号は、バックグラウンドハイブリダイゼーションの約１０倍である。本発明の範囲内で核酸を同定するのに用いられる厳格なハイブリダイゼーションの条件には、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む緩衝液中４２℃でのハイブリダイゼーション、または５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む緩衝液中６５℃でのハイブリダイゼーション、両方とも０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの６５℃での洗浄が含まれる。本発明において、本発明の核酸を含むゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、本明細書に開示される核酸配列を用いて厳格な条件下で標準的なサザンブロットにより同定することができる。ハイブリダイゼーションについてのさらなる厳格な条件は（本発明の目的の範囲内で核酸を同定するために）、４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中３７℃でのハイブリダイゼーションを含む。
しかしながら、ハイブリダイゼーション形式の選択は、重要ではなく−核酸が、本発明の目的の範囲内にあるかどうかを決定する条件を記載した洗浄条件の厳格性が、重要である。本発明の目的の範囲内にある核酸であるかどうかを同定するために用いられる洗浄条件は、例えば、塩濃度は約０．０２モーラー、ｐＨ７および温度は少なくとも約５０℃または約５５℃から約６０℃の間；または、塩濃度は約０．１５ＭのＮａＣｌ、７２℃で約１５分間；または塩濃度は約０．２×ＳＳＣ、温度は少なくとも約５０℃、または約５５℃から約６０℃で約１５分から約２０分であり；あるいは、ハイブリダイゼーション複合体は、塩濃度が約０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣの溶液を用いて、６８℃にて１５分間の洗浄を２回行い、ついで、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣの溶液、６８℃で１５分間の洗浄を２回；または同じ条件を行う。ＳＳＣ緩衝液および等価条件についての記載は、Sambrook, TijssenおよびAusubelを参照のこと。
Ｆ．それらに用いるためのオリゴヌクレオチドプローブおよび方法
本発明はまた、ＴＬＲ−４シグナル伝達活性のモジュレーターである、ポリペプチドをコードする核酸を同定するための核酸プローブを提供する。１つの態様において、プローブは、本発明の核酸の少なくとも１０個の連続する塩基を含む。別には、本発明のプローブは、本発明の核酸において記載されるように、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１５０もしくは約１０〜５０、約２０〜６０、約３０〜７０の連続する塩基の配列である。プローブは、結合および／またはハイブリダイゼーションすることにより、核酸を同定する。プローブは、後述するように、本発明のアレイで用いることができる。本発明のプローブはまた、他の核酸またはポリペプチドを単離するために用いることができる。
Ｇ．配列同一性の程度の決定
本発明は、ＣＤ１４ポリペプチドまたはＴｏｌｌ様受容体４ポリペプチドと、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸を提供する。本発明は、ＣＤ１４蛋白質またはＴｏｌｌ様受容体４蛋白質と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。配列の同一性は、配列比較アルゴリズムを用いた分析により、または目視により決定することができる。蛋白質および／または核酸配列の同一性（相同性）は、当分野で既知の種々の配列比較アルゴリズムおよびプログラムのいずれかを用いて評価できる。
配列比較について、典型的には、１つの配列を参照配列として用い、それと試験配列を比べる。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、配列座標を設計し、要すれば、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを設定する。プログラムの所定のパラメータを用いてもよいし、または、別のパラメータを設定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムのパラメータに応じて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の百分率を計算する。核酸および蛋白質の配列比較については、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．２．２．またはＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８アルゴリズム、および後述する所定のパラメータを用いることができる。
本明細書で用いられる「比較ウィンドウ」は、２０個から６００個、一般的には約５０個から約２００個、より一般的には約１００個から約１５０個の群から選択されるある数の連続部分の断片に対する参照を含み、その配列は、同じ数の連続部分の参照配列と、その２つの配列を最適に並べた後に、比較され得る。比較のために配列を整列させる方法は、当業者には周知である。最適な比較のための配列の整列は、例えばSmith＆Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981のローカルホモロジーアルゴリズムにより、Needleman＆Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970のホモロジーアライメントアルゴリズムにより、Pearson＆Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444, 1988の類似方法の調査により、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（ＦＡＳＴＤＢ（Intelligenetics）、ＢＬＡＳＴ（National Center for Biomedical Information）、the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、あるいは、手作業によるアライメントおよび目視により（例えば、Ausubelら、(1999前掲)を参照のこと）、Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1987におけるCurrent Protocolにより実施することができる。
本発明の配列同一性および配列類似性を決定するために適当なアルゴリズムの好ましい例は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムであり、それは、Pearson, W.R.＆Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444, 1988に記載されている。W. R. Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258, 1996を参照のこと。同一性の百分率を計算するため、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＡアライメントで用いられる好ましいパラメータは、最適化され、ＢＬ５０マトリクス１５：−５、ｋ−タプル＝２；ジョインティング・ペナルティー＝４０、最適化＝２８；ギャップペナルティー＝−１２、ギャップ長ペナルティー＝−２；および長さ＝１６である。
配列同一性および配列類似性の百分率を決定するために好ましい、別の好ましいアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それらは、Altschulら、Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977;およびAltschulら、J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本明細書に記載したパラメータを用いて、本発明の核酸および蛋白質の配列同一性の百分率を決定するために使用される。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公的に入手できる。このアルゴリズムは、最初に、クエリ配列中の長さWのショートワードを確認し、データベース配列中の同じ長さのワードを整列させて、陽性と評価される閾値Ｔと同等かまたは満足するかにより、高スコアの配列の組み（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、ネイフボード・ワード・スコア・スレッシュホールド（neighborhood word score threshold）と称される（Altschulら、前掲）。これら最初のネイフボードワードヒットは、それらを含みより長いHSPを探し出すための当初の検索シードとして働く。このワードヒットは、追加方式のアライメントスコアが増加できる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。追加方式のスコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（マッチング残基の組みに対する報酬スコア；つねに＞０）およびＮ（マッチング残基に対するペナルティースコア；つねに＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリクスは、追加方式のスコアを計算するために用いられる。各方向のワードヒットの拡張は；追加様式のアライメントスコアが、その最大に達成される値からＸ量まで落ち込んだ場合；追加方式のスコアが、１つまたはそれ以上の負のスコアの残基アライメントの蓄積のために、ゼロまたはそれ以下になった場合；あるいは、いずれかの配列が最後に達した場合は中止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータ、Ｗ、ＴおよびＸは、アライメントの精度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラム（ヌクレオチド配列に関して）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４を用い、両鎖の比較を行う。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、長さ３、および期待値（Ｅ）１０を用い、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Henikoff＆Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915, 1989を参照のこと）アライメントは、（Ｂ）は５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４を用い、両鎖の比較を行う。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析を行う（例えば、Karlin＆Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787, 1993を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される１つの類似方法は、最小の確率の合計（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致度が偶然に生じ得る確率の指標を提供する。例えば、核酸は、最小の確率の合計が試験核酸と参照核酸との比較で、約０．２よりも小さい、より好ましくは約０．０１よりも小さい、さらに好ましくは約０．００１よりも小さい場合、参照配列と類似するとみなされる。
有用なアルゴリズムの他の例には、ＰＩＬＥＵＰがある。ＰＩＬＥＵＰは、連続し対をなすアライメントを用いて関係する配列群から複数の配列アライメントを作成し、関係と配列同一性の百分率を示す。また、樹状もしくはデンドログラムをプロットし、アライメントを作り出すために用いられるクラスタリング化関係を示す。ＰＩＬＥＵＰは、Feng＆Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360, 1987の簡素化した連続アライメント方法を用いる。用いられる方法は、Higgins＆Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989に記載された方法と似ている。このプログラムは、３００個までの配列で、ヌクレオチドまたはアミノ酸それぞれ最大５，０００までの長さをアライメントすることができる。この複雑なアライメント手順は、最も類似する２つの配列の対アライメントから開始し、２つのアライメントされた配列群を作成する。次に、この群を次に最も関係の深い配列か、アライメントされた配列群とアライメントする。２つの配列群は、２つの個別の配列の対アライメントの単純な拡張によりアライメントされる。最後のアライメントは、一連の連続する、対アライメントにより行われる。このプログラムは、特定の配列を指定することにより作動し、そのアミノ酸またはヌクレオチドは、配列比較の領域に関して、プログラムのパラメータを指定することにより調整される。ＰＩＬＥＵＰを用いることで、参照配列は、他の試験配列と比較され、次のパラメータ：デフォルトのギャップの幅（３．００）、デフォルトのギャップ長の幅（０．１０）および重み付けエンドギャップを用いて配列同一性の関係の百分率を決定する。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ、例えば、バージョン７．０（Devereauxら、Nuc. Acids Res. 12:387-395, 1984）から得ることができる。
複数のＤＮＡおよびアミノ酸配列のアライメントに適した、別の好ましいアルゴリズムの例には、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム(Thompson, J. D.ら、Nucl. Acids. Res. 22:4673-4680, 1994）がある。ＣｌｕｓｔａｌＷは、配列群間の複数の対となる比較を行い、それらを平均してホモロジーに基づいて複数のアライメントとする。ギャップオープンおよびギャップエクステンションペナルティーは、それぞれ１０および０．０５である。アミノ酸アライメントについて、ＢＬＯＳＵＭアルゴリズムは、プロテインウェイトマトリクスとして用いることができる(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919, 1992)。
「配列同一性」は、アミノ酸またはヌクレオチド配列間の類似性の測定値を意味し、当分野で既知の方法、例えば後述する方法を用いて測定することができる。
２つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチドの関係で、「同一の」または「同一性」百分率は、指定した配列を、次の配列比較アルゴリズムのいずれかを使用して、または手作業によりアライメントし目視により測定して、２つまたはそれ以上の配列または部分配列を比較した場合および対比ウィンドウにてマキシマムコレスポンデンスについてアライメントした場合に、同じであるか、または同じとされる特定の百分率（すなわち、特定の領域で、６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％またはそれ以上の同一性）のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有することを意味する。
２つの核酸またはポリペプチドの関係で、「実質的に同一」は、以下の配列比較アルゴリズムのいずれかを用いて、または目視により測定して、マキシマムコレスポンデンスについて比較しアライメントした場合に、少なくとも、少なくとも６０％、しばしば少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％または少なくとも９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する２つまたはそれ以上の配列または部分配列を意味する。好ましくは、置換同一性は、少なくとも約５０塩基もしくは残基長の配列領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１００塩基もしくは残基の配列領域に渡って存在し、最も好ましくは配列が、少なくとも約１５０塩基もしくは残基にわたって実質的に同一である。最も好ましい実施形態において、配列はコード領域の全量に渡って実質的に同一である。
２つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の関係で、「相同性（ホモロジー）」および「同一性」は、任意の数の配列比較アルゴリズムを用いて、または手作業によりアライメントし目視により測定して、比較ウィンドウまたは指定した領域に関してマキシマム・コレスポンダンスについて比較しアライメントした場合に、
同じまたは特定の百分率のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、２つまたはそれ以上の配列または部分配列を意味する。配列比較について、１つの配列を参照配列（例として、ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）として用い、それと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、配列座標を設計し、要すれば、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを設定する。プログラムのデフォルトパラメータを用いてもよいし、または、別のパラメータを設定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムのパラメータに応じて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の百分率を計算する。
本明細書で用いられる「比較ウィンドウ」は、多くの連続残基のいずれか１つのセグメントについての参照を含む。例えば、本発明の別の態様において、本発明の例示するポリペプチドまたは核酸配列、例えば、ＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの２０から全長のいずれかの範囲の連続残基を、参照配列の同じ数の連続部分と、それら２つの配列を最適にアライメントした後に比較する。参照配列が、本発明の例示するポリペプチドまたは核酸配列と必要な配列同一性、例えば配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有する場合、その配列は、本発明の目的の範囲内にある。
上記プログラムを用いて検出することができるモチーフには、ロイシンジッパー、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、アルファーヘリックスおよびベータシート、コードされた蛋白質の分泌を方向づけるシグナルペプチドをコードするシグナル配列、転写調節に関わる配列、例えばホメオボックス、酸性ストレッチ、酵素活性化部位、基質結合部位および酵素開裂部位が含まれる。
Ｈ．コンピューターシステムおよびコンピュータープログラム製品
配列同一性、構造ホモロジー、モチーフなどをコンピューター内（インシリコ）で決定し同定するため、本発明の配列を保存し、記録し、そしてコンピューターにより読み取ることができ、アクセスすることができる複数のメディアで操作することができる。従って、本発明は、本発明の核酸およびポリペプチド配列を記録し、保存するコンピューター、コンピューターシステム、コンピューターに読み取り可能なメディア、コンピュータープログラム製品などを提供する。本明細書で用いられる、用語「記録」および「保存」は、コンピューターのメディアに情報を保存するための過程を示す。当業者は、コンピューターに読み取り可能なメディア上の情報を読み取る既知のいずれかの方法を容易に用いて、本発明の核酸および／またはポリペプチド配列を含む製品を作製することができる。
本発明の別の態様は、コンピューターに読み取り可能なメディアに記録された本発明の少なくとも１つの核酸および／またはポリペプチド配列を含む、コンピューターに読み取り可能なメディアである。コンピューターに読み取り可能なメディアは、磁気により読み取り可能なメディア、光により読み取り可能なメディア、電気により読み取り可能なメディア、および磁気／光のメディアが含まれる。例えば、コンピューターに読み取り可能なメディアは、ハードディスク、フロッピーディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、またはリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、並びに当業者に既知のその他の形式のメディアが含まれる。
本明細書で用いられる、用語「コンピューター」、「コンピュータープログラム」および「プロセッサー」は、広く一般的な内容で用いられ、そのような装置のすべてを包含する。
ポリペプチドの発現および転写の阻害
本発明は、さらに、本発明の核酸配列と相補的な核酸（例えば、アンチセンス配列）を提供する。アンチセンス配列は、蛋白質をコードする遺伝子の輸送、スプライシングまたは転写を阻害することができる配列、例えば本発明のＣＤ１４をコードする核酸である。その阻害は、ゲノムＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを標的として作用できる。標的核酸の転写または機能は、例えばハイブリダイゼーションおよび／または開裂により阻害することができる。本発明により提供される、１つの具体的な有用な阻害の組み合わせは、遺伝子またはメッセンジャーのいずれかに結合し、いずれかの様式でその蛋白質の産生もしくは機能を抑制もしくは阻害することのできるオリゴヌクレオチドを含む。結合は、配列に特異的なハイブリダイゼーションを通じて行われ得る。別の有用な一連の阻害剤には、蛋白質メッセンジャーの不活性化または開裂を引き起こすオリゴヌクレオチドを含む。そのような開裂を引き起こすオリゴヌクレオチドは、リボザイムのように、酵素活性を有し得る。オリゴヌクレオチドを、化学的に修飾することができるし、相補的な核酸を開裂できる酵素または組成物と複合体形成させることができる。オリゴヌクレオチドは、所望の活性を有するものについて、多種多様な該オリゴヌクレオチドのプールからスクリーニングすることができる。
遺伝子発現を制御するためのアンチセンス、リボザイム技術およびＲＮＡｉ技術を用いる一般的な方法、またはその様式で内因性の遺伝子の発現のための遺伝子治療の一般的な方法は、当分野で周知である。これらの方法は各々、例えば本発明のホスファターゼポリペプチドのアンチセンスまたはリボザイム転写のいずれかをコードするベクターの系を利用する。用語「ＲＮＡｉ」は、ＲＮＡ干渉を意味する。この用語が、遺伝子をサイレント化できるＲＮＡ分子を用いる技術を包含することは、当分野では理解される。例えば、McManusら、Nature Reviews Genetics 3: 737, 2002を参照のこと。この応用では、用語「ＲＮＡｉ」は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、一過性低分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）などの分子を含む。概して、ＲＮＡ干渉は、遺伝子と二本鎖ＲＮＡとの相互作用に起因する。
Ａ．アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、ＣＤ１４のメッセンジャーと結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ｍＲＮＡを標的とすることによりポリペプチドの活性を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する方針は、科学文献および特許文献に広く記載されており、当業者であれば、本発明の新たな試薬を用いてそのようなオリゴヌクレオチドを設計することができる。例えば、効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングするための遺伝子ウォーキング／ＲＮＡマッピングプロトコルは当分野では周知であり、例えば、可能性のあるアンチセンス配列を選択するための簡易かつ信頼のある方法を提供する標準的な分子技術に基づいたＲＮＡマッピングアッセイを記載したものについてはHo, Methods Enzymol. 314: 168-183, 2000を参照のこと。また、Smith, Eur. J. Pharm. Sci. 11: 191-198, 2000を参照のこと。
天然の核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意の鎖長であってよく、例えば、別の態様においてアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５から１００、約１０から８０、約１５から６０、約１８から４０である。最適な鎖長は、慣用のスクリーニングにより決定することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意の濃度で存在させることができる。最適な濃度は、慣用のスクリーニングにより決定することができる。多種多様な合成、天然でないヌクレオチドおよび核酸類似物が知られており、この潜在的な問題を扱うことができる。例えば、非イオンのバックボーンを有するペプチド核酸（ＰＮＡ）、例えばＮ−（２−アミノエチル）グリシンユニットを用いることができる。国際公開第９７／０３２１１号パンフレット；国際公開第９６／３９１５４号パンフレット;Mata, Toxicol Appl Pharmacol 144: 189-197, 1997；Antisense Therapeutics著. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996）に記載されるように、ホスホチオネート結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた用いることができる。本発明により提供される合成ＤＮＡバックボーン類似物を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記のように、ホスホロ−チオエート、メチルスルホネート、ホスホロアミダート、アルキルホスホトリエステル、スルホネート、３’−チオ汗タール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメートおよびモルホリノカルバメート核酸もまた含む。
組み合わせ化学方法論は、いずれかの標的に適当な結合親和性および特異性を有する特定のオリゴヌクレオチド、例えば本発明のセンスおよびアンチセンスポリペプチド配列を容易にスクリーニングすることができる莫大な数のオリゴヌクレオチドを作り出すために用いることができる（例えば、Gold、J. of Biol. Chem. 270: 13581-13584、1995を参照のこと）。
Ｂ．ｓｉＲＮＡ
「短鎖干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）は、約１０から約３０ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子を意味し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を通じて蛋白質発現を特異的に干渉するその能力にちなんで名づけられた。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、１２−２８ヌクレオチド長である。より好ましくは１５−２５ヌクレオチド長、さらにより好ましくは１９−２３ヌクレオチド長および最も好ましくは２１−２３ヌクレオチド長である。従って、好ましいｓｉＲＮＡ分子は、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９ヌクレオチドである。
ＲＮＡｉは、２つの工程の機序を有する（Elbashir ら、Genes Dev.、15(2): 188-200 (2001)）。第一は、長いｄｓＲＮＡが、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）として知られる酵素により、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる２１−２３リボヌクレオチド（ｎｔ）の断片に開裂される。次に、ｓｉＲＮＡは、リボヌクレアーゼ複合体（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体を表すＲＩＳＣと称される）と会合し、その複合体を相補的なｍＲＮＡに標的化する。そして、ＲＩＳＣは、相補的なｍＲＮＡと反対の標的とするｍＲＮＡを開裂させ、他のＲＮＡ分解経路に処理されやすいｍＲＮＡとする。
本発明のｓｉＲＮＡは、標的のリボヌクレオチド配列と相互作用させるために、その標的配列に結合するのに十分に標的配列に対して相補的であるという意味に設計される。本発明はまた、ヌクレアーゼ分解に対して増大された安定性を与えるよう化学的に修飾されているが、標的の核酸が存在する場合に、その標的核酸と結合する能力を保持しているｓｉＲＮＡ分子も含む。
Ｃ．阻害性リボザイム
本発明は、ｍＲＮＡを標的とすることによりポリペプチド活性を阻害することができる、伝達物に結合できるリボザイム、例えば、ＣＤ１４活性、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体４シグナル伝達活性を有するポリペプチドの阻害物質を提供する。リボザイムを設計し、標的化するための蛋白質−特異的なアンチセンス配列を選択する方策は、科学文献および特許文献において広く記載されており、当業者であれば、本発明の新しい試薬を用いてそのようなリボザイムを設計することができる。
リボザイムは、リボザイムの標的ＲＮＡ結合部を通じて標的ＲＮＡと結合し、そのＲＮＡの酵素分解部位の近傍に留まって、標的ＲＮＡを開裂させることにより作用する。従って、リボザイムは、相補的な塩基対形成を通じて標的ＲＮＡを認識して、結合し、そしてひとたび正しい位置に結合すると、酵素のように作用し、その標的ＲＮＡを開裂させて不活性化する。このような様式の標的ＲＮＡの開裂は、その開裂がコード配列に生じた場合、そのコードされた蛋白質の合成を行う能力を破壊することになる。リボザイムは、そのＲＮＡ標的に結合し開裂させた後、典型的には、そのＲＮＡから離れ、そして再び新たな標的に結合し開裂させることができる。
幾つかの環境下で、リボザイムの酵素的な性質は、治療処置に効果を発揮するために必要なリボザイムの有効濃度が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度よりも低くい場合があるため、他の技術、例えば、アンチセンス技術（ここで、核酸分子は単純に核酸標的に結合し、その転写、翻訳または他の分子との会合を阻害する）に対して有利となり得る。この潜在的な有利さは、酵素的な作用するリボザイムの能力を反映している。従って、単一のリボザイム分子は、多くの標的ＲＮＡ分子を開裂させることができる。加えて、リボザイムは典型的には特異性の高い阻害物質であり、その阻害の特異性は、塩基対形成機序の結合による機序だけでなく、分子が結合するＲＮＡの発現を阻害する機序にも依存する。すなわち、阻害は、ＲＮＡ標的の開裂により生じ、そして、その特異性は、標的でないＲＮＡの開裂速度よりも標的ＲＮＡの開裂速度の比として定義される。この開裂機序は、塩基対形成に関係する因子を加えた因子に依存する。従って、リボザイム作用の特異性は、同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性よりも高くなり得る。
酵素的なリボザイムＲＮＡ分子は、ハンマー型のモチーフで構成され得るが、ヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロンまたはＲｎａｓｅＰ−様ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と関係がある）のモチーフであってもよい。そのようなハンマー型のモチーフの例は、Rossi, Aids Research and Human Retroviruses 8: 183, 1992に；デルタ肝炎ウイルスモチーフはPerrotta, Biochemistry 31: 16, 1992に；RnasePモチーフはGuerrier-Takada, Cell 35: 849, 1983に；そして、グループＩイントロンはＣｅｃｈによる米国特許第４，９８７，０７１号明細書に記載されている。これらの具体的なモチーフの反応は、限定されるものではないが、当業者であれば、本発明の酵素的なＲＮＡ分子は、１つまたはそれ以上の標的遺伝子のＲＮＡ領域と相補的な特異的な基質結合部位を有し、その基質結合部位の周辺のヌクレオチド配列が、その分子にＲＮＡ開裂活性を与えることは理解されよう。
処置方法
また、本明細書で記載されるものに、望ましくないＴｏｌｌ様受容体４発現または活性化に関係する障害の危険性のある（または罹患しやすい）、または障害を有する対象を処置する、予防方法および治療方法がある。
予防方法
本発明は、対象において、望ましくないＴｏｌｌ様受容体４発現量または活性に関係する疾病または状態を、該対象にＴｏｌｌ様受容体４、ＴＲＡＭ−ＴｒｉｆまたはＣＤ１４を通じたシグナル伝達をモジュレートする試薬を投与することによる予防方法に関する。Ｔｏｌｌ様受容体４もしくはＣＤ１４−媒介性のシグナル伝達により生じるまたは起因する、障害または望ましくない症状に関する危険性のある対象は、例えば、本明細書に記載されるまたは当分野で既知の診断もしくは予後アッセイのいずれかの組み合わせにより確認し得る。一般に、そのような障害は、望ましくない先天性の免疫系の活性化、例えば、望ましくないＴＮＦ−αなどのサイトカインの誘導に関係する。予防薬としての試薬の投与は、その試薬が投与されなかった場合の症状と比べて、その症状が予防され、遅延され、または減少されるように、症状の発現前に行われ得る。幾つかの実施形態において、試薬は、Ｔｏｌｌ様受容体４のＣＤ１４および／またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆの結合を低下させる。幾つかの実施形態において、試薬は、リガンドのＴｏｌｌ様受容体４、ＣＤ１４および／またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆに対する結合を低下させる。適切な試薬は、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイに基づいて同定され得る。一般に、そのような試薬は、Ｔｏｌｌ様受容体４に対して、ＣＤ１４および／またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆに対して特異的に結合する。
治療方法
本発明の他の態様は、治療目的のＴＬＲ４、ＣＤ１４またはＴＲＡＭ／Ｔｒｉｆの発現または活性の方法に関する。本方法は、細胞を、細胞に関係するＴｏｌｌ様受容体４および／またはＣＤ１４活性の１つまたはそれ以上の活性をモジュレートする、例えばＣＤ１４と特異的に結合し、Ｔｏｌｌ様受容体４を通じたシグナル伝達を阻害する物質と接触させることを含み得る。試薬は、Ｔｏｌｌ様受容体４と特異的に結合し、リポ多糖体により誘導される細胞内のＴＮＦ−α活性を特異的に活性化するか、もしくは阻害する、あるいは、水疱性口内炎ウイルスまたは狂犬病ウイルスに応答するマクロファージを活性化するか、もしくは阻害する化合物であってよい。その試薬は、抗体もしくは蛋白質、Ｔｏｌｌ様受容体４蛋白質、ペプチド、Ｔｏｌｌ様受容体４もしくはＣＤ１４ペプチド模倣体の天然の関係するリガンド、または有機小分子であってよい。これらのモジュレート方法は、インビトロで（例えば、細胞を試薬と一緒に培養することによって）実施されてもよいし、あるいは、インビボで（例えば、試薬を対象に投与することによって）実施されてもよい。
本発明は、望ましくないＴｏｌｌ様受容体４蛋白質の発現または活性；例えば、望ましくないＴＮＦ−αなどのサイトカイン活性により特徴付けられる疾病または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの態様において、本方法は、試薬（例えば、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにより同定される試薬）、またはＴｏｌｌ様受容体４を通じてシグナル伝達を増加もしくは低下する試薬の組み合わせを投与することを含む。試薬により処置され得る組み合わせには、望ましくない先天性の免疫系の活性化（例えば、望ましくない炎症）を示す対象における方法が含まれる。
本方法および組成物により処置できる他の障害には、真菌感染症、敗血症、サイトメガロウイルス感染症、結核、らい病、骨吸収（例えば、歯周病において）、関節炎（例えば、ライム病に関連する）、およびウイルス性肝炎が含まれる。Ｔｏｌｌ様受容体４を通じたシグナル伝達を干渉する（例えば、ＣＤ１４に結合することにより）化合物はまた、炎症反応の間のサイトカイン、例えばマイコバクテリアなどの微生物による感染症に対する応答で産生されるサイトカインの産生を選択的に制御するのに有用である。
望ましくない先天性の免疫系の活性化、例えば、望ましくない炎症反応に関係する障害の成功的処置は、ＣＤ１４のＴｏｌｌ様受容体４に対する結合を阻害する、またはリガンドのＴｏｌｌ様受容体４複合体に対する結合を阻害するのに役立つ技術によりほとんどもたらされ得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイを用いて同定された薬物などの化合物、例えば、負のモジュレート活性を示すことが確認された抗体を用いて、望ましくないＣＤ１４またはＴｏｌｌ様受容体４活性により生じる障害の症状を予防および／または改善することができる。そのような分子には、限定されるものではないが、ペプチド、リンペプチド、有機もしくは無機小分子、または抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体または一本鎖抗体、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ発現ライブラリー断片、ｓｃＦＶ分子、ならびにそのエピトープ結合断片を含む）が含まれる。特に、Ｔｏｌｌ様受容体４に特異的に結合し、リポ多糖体により誘導される細胞内のＴＮＦ−α活性を活性化できるか、もしくは阻害でき、あるいは、水疱性口内炎ウイルスもしくは狂犬病ウイルスに対するマクロファージの応答を活性化もしくは阻害できる、抗体およびその誘導体（例えば、その抗原結合断片）である。
キット
本発明は、本発明の組成物、例えば、核酸、発現カセット、ベクター、細胞、ポリペプチド（例えば、ＣＤ１４ポリペプチドまたはＴＲＡＭ／ＴｒｉｆもしくはＴｏｌｌ様受容体４シグナル伝達活性化ポリペプチド）および／または抗体を含むキットを提供する。キットには、本明細書で記載されるような、本発明の方法論および使用法を示す教材も含まれ得る。
治療適用
本発明の方法により同定された化合物およびモジュレーターは、様々な処置方法に用いることができる。従って、本発明は、自己免疫疾患、感染症、Ｔｏｌｌ様受容体４シグナル伝達欠損症、ＣＤ１４細胞欠損症を処置する組成物および方法を提供する。
自己免疫疾患の例としては、急性突発性血小板減少性紫斑病、慢性的突発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、ループス腎炎、リウマチ熱、多内分泌腺症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎（post-streptococcalnephritis）、紅斑結節炎（erythema nodosurn）、高安動脈炎、アジソン病、間接リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性関節炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血管血栓炎（thromboangitisubiterans）、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、強皮症、慢性的活動性肝炎、多発筋炎/皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性触覚錯誤症（parnphigus vulgaris）、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ろう、巨細胞性動脈炎/多発筋痛、ペミシオウサネミア（pemiciousanemia）、急速進行性糸球体腎炎および線維化肺胞炎がある。
感染症の例としては、限定されるものではないが、ウイルス性、細菌性、菌性または寄生虫性の疾患が含まれる。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、感染源の処置または検出に用いることができる。例えば、免疫応答の増大、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化の部分的な増大により、感染症を処置し得る。免疫応答は、存在する免疫応答を増強すること、あるいは新たに免疫応答を開始させることのいずれかにより、増大させることができる。一方、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、必ずしも免疫応答を惹起させる必要がなく、感染物質を直接阻害することもできる。
ウイルスは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドにより処置または検出することができる疾患または徴候の原因となり得る感染源の１つの例である。ウイルスの例として、限定されるものではないが、以下のＤＮＡおよびＲＮＡのウイルスファミリー：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、動脈ウイルス、ビルナウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、サーコウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、ヘルペスシンプレックス、帯状疱疹）、モノネガウイルス（例えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザ）、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、疱瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス）が含まれる。こららのファミリーに含まれるウイルスは、さまざまな疾患および徴候、限定されるものではないが：関節炎、細気管支炎、脳炎、眼感染症（例えば、結膜炎、隔膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、活動性慢性、デルタ）、髄膜炎、日和見感染（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキット−リンパ種、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、風邪、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚疾患（例えば、カポジ肉腫（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ）、疣贅）、およびウイルス血症の原因となり得る。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、これらすべての徴候または疾患の処置または検出に用いることができる。
同様に、疾患または徴候の原因となり、そして本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドにより処置または検出され得る細菌のまたは菌物質は、限定されるものではないが、以下のグラム陰性およびグラム陽性細菌性のファミリーおよび菌類：放線菌（例えば、コリネバクテリウム、マイコバクテリア、ノルカルディア）、アスペルギルス属、バシラス科（例えば、炭疽、クロストリジウム属）、バクテロイデス科、ブラストミセス属、ボルデテラ属、ボレリア属、ブルセラ属、カンジダ属、カンピロバクター属、コクシジオイデス属、クリプトコックス属、皮膚真菌（Dermatocycoses）、腸内細菌科(クレブシエラ属、サルモネラ属、霊菌属、エルシニア属、エリジペロスリックス属、ヘリコバクター属、レジオネラ属、レプトスピラ属、リステリア属、マイコプラズマウイルス、ナイセリア科（例えば、アシネトバクター属、淋病、髄膜炎菌）、パスツレラ科感染症（例えば、アクチノバチルス属、ヘモフィラス属、パスツレラ属）、シュードモナス科、リッケチア科、クラミジア科、梅毒およびブドウ球菌が含まれる。これらの細菌または菌ファミリーは、以下の疾患または徴候、限定されるものではないが：菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連感染症）、爪囲炎、人工器官関連感染症、ライター病、呼吸器感染症、例えば、百日咳または蓄膿症、敗血症、ライム病、猫引っかき病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、チフス症、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテリア、らい病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒症、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染症、皮膚疾患（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌）、毒血症、尿路感染症、創傷感染を含む疾患または徴候の原因となり得る。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、これらすべての徴候または疾患を処置または検出するために使用することができる。
さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドにより処置または検出され得る疾患または徴候の原因となる寄生性作用は、限定されるものではないが、以下のファミリー：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバー症（Dientamoebiasis）、媾疫、外部寄生者、ジアルジア症、蠕虫病、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラズマ症、トリパノソーマ症およびトリコモナスを含む。これらの寄生虫は、限定されるものではないが：疥癬、ツツガムシ病、眼感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア症）、肝疾患、肺疾患、日和見感染（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症およびトキソプラズマ症を含むさまざまな疾患または徴候の原因となり得る。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、これらすべての徴候または疾患の処置または検出のために使用することができる。
好ましくは、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いる処置は、患者に有効量のポリペプチドを投与してもよし、患者の細胞を取り出し、その細胞に本発明のポリヌクレオチドを供して、そして作製した細胞を元の患者に戻してもよい（エックスビボ治療）。さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、感染症に対する免疫応答を惹起するワクチンの抗原として用いることができる。
医薬組成物の製剤および投与
本発明は、本発明の核酸、ペプチドおよびポリペプチド（Ａｂを含む）を含む医薬組成物を提供する。上記のように、本発明の核酸、ペプチドおよびポリペプチドは、内因性のＣＤ１４ポリペプチドの発現を阻害するため、または活性化するために用いることができる。細胞またはヒト以外の動物におけるそのような阻害は、自己免疫疾患、感染症、抗原提示細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症を標的とする、または軽減する化合物を同定するためのスクリーニング様式を与え得る。本発明の医薬組成物の対象への投与は、その対象に寛容化した免疫学的環境を生じさせるために用いられる。これを用いて、対象を抗原に対して寛容化させることができる。
本発明の核酸、ペプチドおよびポリペプチドは、医薬上許容される担体（賦形剤）と組み合わせて、医薬組成物を形成させることができる。医薬上許容される担体は、本発明の医薬組成物に作用し、例えば安定化させ、または吸収もしくは排除の割合を増加もしくは低下させる、生理学上許容される化合物が含まれ得る。生理学的に許容される化合物には、例えば炭水化物、例えばグルコース、シュークロースもしくはデキストラン、抗酸化物質、例えばアスコルビン酸もしくはグルタチオン、キレート剤、低分子量蛋白質、ペプチドまたはポリペプチドの浄化値もしくは加水分解を低下させる組成物、または賦形剤、または他の安定化剤および／または緩衝剤を含んでいてもよい。希釈剤もまた、リポソーム担体、医薬上許容される担体を含む医薬組成物を安定化させるために、あるいはその吸収を増加もしくは低下させるために用いることができ、そしてペプチドおよびポリペプチドの組成物当業者には既知であり、詳細は科学文献および特許文献に記載されており、例えば、最近の出版物ではRemington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pa. （「Remington's」）を参照のこと。
他の生理学的に許容される化合物には、特に微生物の増殖または活動を予防するのに有用な、湿潤剤、乳化剤、分散剤または防腐剤が含まれる。様々な防腐剤が広く知られており、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸が含まれる。当業者であれば、生理学的に許容される化合物を含む医薬上許容される担体の選択は、例えば本発明のペプチドまたはポリペプチドの投与経路に、およびその具体的な物理−化学的な特徴に依存することは認められよう。
１つの態様において、本発明の核酸、ペプチドまたはポリペプチド溶液は、医薬上許容される担体、例えば、組成物が可溶性である場合、水性担体に溶解させる。経腸、非経口または経粘膜的薬物輸送のための組成物に使用することができる水溶液の例としては、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス液、リンゲル液、デキストロース／食塩水、グルコース溶液およびその類似物が含まれる。組成物には、生理条件に近づけることが要求される場合、医薬上許容される補助剤、例えば緩衝剤、等張調節剤、湿潤剤、希釈剤およびその類似物を含ませることができる。添加剤は、さらなる活性成分、例えば殺菌剤、または安定剤を含ませてよい。例えば、溶液は、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリンソルビタンまたはオレイン酸トリエタノールアミンを含んでいてもよい。これらの組成物は、慣用の、周知の滅菌技術により滅菌されていてよく、滅菌濾過されてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装されてもよく、また投与前に滅菌水と組み合わされる凍結乾燥品のために凍結乾燥されてもよい。組成物中のペプチド濃度は、種々変更でき、主として液量、粘性、体重などに基づいて、そして選択される具体的な投与形式や患者の供給に従って選択されるであろう。
固体組成物も、経腸（経口）投与に使用することができる。それらは、例えば丸薬、錠剤、粉剤またはカプセル剤として製剤化されていてよい。固体組成物について、慣用の無毒な固体担体を用いることができ、それには、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、滑石粉、セルロース、グルコース、シュークロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。経口投与について、医薬上許容される非毒性の組成物は、通常用いられる賦形剤、例えば上記の担体のいずれかと、通常１０％〜９５％の活性成分（例えばペプチド）を組み合わせて製剤化される。固体以外の組成物もまた、経腸投与に用いることができる。担体は、鉱油、動物油、植物油、または合成油を含む種々の湯物、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などから選択できる。適切な医薬賦形剤には、例えば澱粉、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、シュークロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールが含まれる。
経口で投与される、本発明の核酸、ペプチドまたはポリペプチドは、分解から保護することができる。これは、核酸、ペプチドまたはポリペプチドを酸や酵素加水分解に対して耐性にさせるために、それを組成物と複合体形成させること、あるいは核酸、ペプチドまたはポリペプチドを適当な耐性のある担体、例えばリポソーム内に包み込むことのいずれかにより達成することができる。消化から化合物を保護する方法は、当分野では周知であり、例えば、治療薬の経口輸送のための脂質組成物（リポソーム輸送は、後掲でさらに詳細に記載される）を記載するFix, Pharm Res. 13: 1760-1764, 1996；Samanen, J. Pharm. Pharmacol. 48: 119-135, 1996；米国特許第5,391,377号明細書を参照のこと。
全身投与はまた、経粘膜的方法または経皮方法であってよい。経粘膜投与または経皮投与について、浸透されるべき障壁に対する適当な浸透剤は、組成物に用いることができる。そのような浸透剤は、当分野で一般に知られており、例えば、経粘膜投与については、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。加えて、希釈剤を用いて、浸透を容易にすることができる。経粘膜投与は、鼻スプレイを通じるものであってもよいし、または坐剤を用いてもよい。例えば、Sayani, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13: 85-184, 1996を参照のこと。局所、経皮投与について、試薬は、軟膏、クリーム、塗剤、粉剤およびゲルに製剤化される。経皮輸送系、例えばパッチも含む。
本発明の核酸、ペプチドまたはポリペプチドはまた、徐放または持続放出機序で投与することができ、組成物を内部に輸送することができる。例えば、生分解性の微小球またはカプセル剤、またはペプチドを徐放できる他の生分解性の高分子構造物は、本発明の組成物に含まれる（例えば、Putney, Nat. Biotechnol. 16: 153-157, 1998を参照のこと)。
吸入について、本発明の核酸、ペプチドまたはポリペプチドは、乾燥粉末エアロゾル、液体輸送経、エアージェット噴霧器、噴射剤系およびその類似系を含む、当分野で既知の系を用いて輸送することができる。例えば、Patton, Biotechniques 16: 141-143, 1998を参照のこと；例えば、デュラ・ファーマセウティカル（Dura Pharmaceuticals）(サンディエゴ、カルフォルニア)、アラジーン（Aradigrn）(へーワード、カルフォルニア、エアロジェン（Aerogen）(サンタクララ、カルフォルニア)、吸入治療システム（Inhale Therapeutic Systems）(サンカルロス、カリフォルニア)などによる、ポリペプチド高分子の生産物および吸入輸送系がある。例えば、医薬組成物は、エアロゾルまたはミストの形態で投与することができる。エアロゾル投与について、組成物は、界面活性剤および噴射剤と共に、細かく分割された形態で提供され得る。別の態様では、呼吸組織に組成物を輸送するための装置には、組成物を蒸発させる吸入器がある。他の液体輸送系には、例えばエアージェット噴霧器が含まれる。
本発明の医薬を調製するにあたって、薬物動力学および生体分布を改変するため、種々の組成物の改良を行って、操作することができる。薬物動力学および生体分布を改変するための方法は数多く、当業者には知られている。そのような方法の例としては、蛋白質、脂質（例えば、リポソーム、以下を参照のこと）、炭水化物または合成高分子（上述したもの）などの基質からなる小胞にて本発明の組成物を保護することが含まれる。薬物動力学の一般的な議論は、例えば、Remington's３７章〜３９章を参照のこと。
本発明の核酸、ペプチドまたはポリペプチドは、単独で輸送することができるし、または当分野で既知のいずれかの方法、例えば、全身、局部もしくは局所で（例えば、組織に直接もしくは組織への方向付け）；動脈内、くも膜内（ＩＴ）、静脈内（ＩＶ）、非経口、膜腔内、局部、経口、または皮下、気管内（例えば、エアロゾルにより）もしくは経粘膜（例えば、頬、膀胱、膣、子宮、直腸、鼻粘膜）のように局所投与により、医薬組成物として輸送することができる。処置する組成物を実際に調製する方法は、当業者には知られており、また明らかであろうし、詳細は、科学文献および特許文献を、例えば、Remington'sを参照のこと。「局所的効果」について、例えば、特定の器官に絞った投与の１つの形式には、例えば特定の器官、例えば脳およびＣＮＳに絞った、動脈内またはくも膜内（ＩＴ）注射が含まれる(例えば、Gurun, Anesth Analg. 85: 317-323, 1997を参照のこと)。例えば、本発明の核酸、ペプチドまたはポリペプチドを脳に直接輸送することが望ましい場合、好ましくは頚動脈内注射である。非経口投与は、全身投与量が必要な場合の好ましい輸送経路である。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は、当業者には知られており、また明らかであろうし、詳細は、例えば、Remington'sに記載されている。また、Bai, J. Neuroimmunol. 80: 65-75, 1997；Warren, J. Neurol. Sci. 152: 31-38, 1997；Tonegawa, J. Exp. Med. 186: 507-515, 1997を参照のこと。
１つの態様において、本発明は、本発明の核酸、ペプチドまたはポリペプチドを含む医薬組成物は、脂質単分子層または脂質二重層、例えばリポソームに包含されいてもよく、例えば、米国特許第６，１１０，４９０号明細書；第６，０９６，７１６号明細書；第５，２８３，１８５号明細書；第５，２７９，８３３号明細書を参照のこと。本発明はまた、本発明の可溶性の核酸、ペプチドまたはポリペプチドが、その単重層もしくは二重層の表面に結合されている組成物も提供する。例えば、ペプチドを、ヒドラジド−ＰＥＧ−（ジステアロイルホスファチジル（distearoylphosphatidyl）エタノールアミン−含有リポソーム（例えば、Zalipsky, Bioconjug. Chem. 6: 705-708, 1995を参照のこと）に結合させてもよい。リポソームまたはいずれかの形態の液体膜、例えば、脂質平面膜または無傷の細胞、例えば、赤血球の細胞膜を用いることができる。リポソーム組成物は、静脈内、経皮（例えば、Vutla, J. Pharm. Sci. 85: 5-8, 1996を参照のこと）、経粘膜的または経口投与を含み、どのような様式であってもよい。本発明はまた、本発明の核酸、ペプチドおよび／またはポリペプチドを、ミセルおよび／またはリポソーム内部に包含する医薬製剤（例えば、Suntres, J. Pharm. Pharmacol. 46: 23-28, 1994；Woodle, Pharm. Res. 9: 260-265, 1992を参照のこと）を提供する。リポソームおよびリポソーム組成物は、標準的な方法よび当分野で周知の方法に従って調製することができ、Remington's；Akimaru, Cytokines Mol. Ther. 1: 197-210, 1995；Alving, Immunol. Rev. 145: 5-31, 1995；Szoka, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467, 1980、米国特許第４、２３５，８７１号明細書、第４，５０１，７２８号明細書および第４，８３７，０２８号明細書を参照のこと。
１つの態様において、活性化合物は、体からの迅速な排除に対して該化合物を保護し得る担体を用いて、例えば、移植およびマイクロカプセル化輸送系を含む放出制御製剤のように調製される。エチレン酢酸ビニール、酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを用いてもよい。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。また、そのような物質は、Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的かされたリポソームを含む）はまた、医薬上許容される担体として用いることができる。これらは、当業者に既知の方法、例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載の方法に従って調製することができる。
容易な投与および均一な投与のために、単位投薬剤型で経口または非経口組成物に製剤化することも有利である。本明細書で用いる単位投薬剤型は、処置されるべき対象に関する投薬単位として都合のよい物理的に分離した単位を意味し；それぞれの単位は、必要な医薬上の担体と関係する望ましい治療効果を生じるよう、予め決定された量の活性化合物を含む。
そのような化合物の毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物における標準的な医薬手順により、例えば、ＬＤ５０（全体の５０％までが致死的な用量）およびＥＤ５０（全体の５０％に治療効果のある用量）を決定することにより、決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比には、治療指数があり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性のある副作用を示す化合物を用いる場合、そのような化合物が、罹患された組織部位を標的とし、罹患していない細胞に対する潜在的な傷害を最小限にし、それにより副作用を軽減させる送達系を設計するよう注意すべきである。
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するための投薬範囲を製剤化するために用いることができる。そのような化合物の投薬量は、毒性がほとんどないもしくは全くないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にあることが好ましい。投薬量は、用いる投薬形態および利用する投与経路に応じた範囲内で変更することができる。本発明の方法に使用されるいずれの化合物についても、治療上有効な用量は、細胞培養アッセイから最初は見積もることができる。用量は、例えば炎症、または望ましくない炎症に関係する傷害の動物モデルにおいて、細胞培養で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む、循環血漿濃度の範囲を達成するよう、処方することができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。血漿レベルは、例えば、一般に標識化試薬についての、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。実験に有用な動物モデル、例えば、前臨床プロトコルは、当分野で既知であり、例えば、Sonderstrup（Springer, Sem. Immunopathol. 25: 35-45, 2003）およびNikulaら、Inhal. Toxicol. 4(12): 123-53, 2000)に記載されるような炎症傷害についての動物モデル；および真菌感染症、敗血症、サイトメガロウイルス感染症、結核、らい病、ウイルス性肝炎およびウイルス性感染症（例えば、マイコバクテリアによる）について当分野で既知の動物モデルにおいて、測定することができる。
本明細書で提起されるように、蛋白質もしくはポリペプチド、例えば抗体の治療上の有効な量（すなわち、有効な投薬量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、例えば、約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重または約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇまたは５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。蛋白質またはポリペプチドは、一日あたり、または一週あたり、約１〜１０週の間、例えば、２〜８週の間、約３〜７週の間、または約４、５もしくは６週あたり、１回または複数回投与することができる。幾つかの例において、投薬は、数ヶ月もしくはそれ以上にわたって必要な場合がある。当業者であれば、限定されるものではないが、疾病もしくは傷害の重篤度、前処地、対象の一般的な健康および／または年齢、および現在の他の疾病を含む特定の因子が、対象を効果的に処置するのに必要な投薬量および回数を左右し得ることは認められよう。さらに、試薬、例えば蛋白質またはポリペプチド（抗体を含む）の治療上の有効量を用いた、対象の処置には、一回での処置、または好ましくは一連の処置が含まれ得る。
抗体について、投薬量は、一般に、０．１ｍｇ／体重ｋｇ（例えば、１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ）である。特に、ヒト抗体および完全なヒト抗体は、一般に、他の抗体と比べてヒト体内で長い半減期を有する。従って、低用量および低頻度の投与が、しばしば可能である。脂質付加などのモディフィケーションは、抗体を安定化させるために、取り込みおよび組織浸透性（例えば、脳への）を増大させるために用いることができる。抗体の脂質付加に関する方法は、Cruikshankら、J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology, 14: 193, 1997に記載されている。
本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体４またはＣＤ１４を通じたシグナル伝達をモジュレートすることによって、ＴＮＦ−αの発現または活性をモジュレートする、試薬または化合物を包含する。試薬は、例えば、小分子であってよい。そのような小分子には、限定されるものではないが、ペプチド、ペプチド模倣体（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類似体、分子量がモルあたり約１０，０００グラム未満の非−核酸有機もしくは無機低分子化合物（すなわち、ヘテロ有機（heteroorganic）および有機金属化合物）、分子量がモルあたり約５，０００グラム未満の有機もしくは無機化合物、分子量がモルあたり約１，０００グラム未満の有機もしくは無機化合物、分子量がモルあたり約５００グラム未満の有機もしくは無機化合物、さらにそのような化合物の塩、エステルおよび医薬上許容される他の形態が含まれる。
例示的な用量は、対象または試料体重キログラムあたり、ミリグラムまたはマイクログラム量の小分子（例えば、キログラムあたり約１マイクログラム〜キログラムあたり約５００ミリグラム、キログラムあたり約１００マイクログラム〜キログラムあたり約５ミリグラム、またはキログラムあたり約１マイクログラム〜キログラムあたり約５００マイクログラム）が含まれる。小分子の適当な用量は、モジュレートされるべき小分子の発現または活性に関する効力に依存することは、さらに理解される。１つまたはそれ以上のこれらの小分子を、本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性をモジュレートするため、動物（例えば、ヒト）に投与する場合、医師、獣医師または研究者は、例えば、最初は比較的低用量で、次に、適当な応答が得られるまでその用量を増加させるよう処方することができる。加えて、いずれかの特定の動物対象に対する特別な用量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、一般的な健康、性別および食事、投与時期、投与経路、排出頻度、いずれかの薬物との組み合わせ、ならびにモジュレートされるべきものの発現または活性の程度を含む、様々な因子に依存し得ることは理解される。
抗体またはその断片は、他の治療部分、例えば治療試薬または放射活性金属と結合体を形成させるために、例えば共有結合でおよび／またはリンカーを用いて連結させてもよい。治療試薬には、限定されるものではないが、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））が含まれる。
本明細書に記載される結合体は、所定の生物学的応答をモディファイするために用いることができる。例えば、抗体に結合された部分は、所望の生物学的活性を有する蛋白質またはポリペプチドであってよい。そのような蛋白質には、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素などの毒性；腫瘍壊死因子、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン活性化因子などの蛋白質；または生物学的修飾物質が含まれ得る。
あるいは、Segalによる米国特許第４，６７６，９８０号明細書に記載されるように、抗体を、２次抗体と結合させ、ヘテロ結合体を形成させてもよい。
医薬組成物は、投与についての取り扱い説明書と共に、容器、パックまたはディスペンサー内に含ませることができる。
本明細書に記載される化合物は、本明細書に記載されるいずれかの処置方法に使用するための医薬の調製に用いることができる。
医薬組成物は、一般的に、滅菌で、実質的に等張に、さらに米国食品医薬品局の適正製造基準（ＧＭＰ）規則を完全に満たすよう、製剤化される。
処置計画：薬物動態解析
本発明の医薬組成物は、投与方法に応じて、様々な単位投与剤型で投与することができる。典型的な核酸、ペプチドおよびポリペプチド医薬組成物の投薬量は、当業者に周知である。そのような投薬量は、性質を参考にして、具体的な治療内容、患者の許容度などに応じて調整される。これを実施するのに適した核酸、ペプチドもしくはポリペプチドの量は、「治療上有効量」と定義される。投薬スケジュールおよびこの使用に有効な量、すなわち「投薬計画」は、疾病もしくは状態のステージ、疾病または状態の重篤度、患者の健康の一般的状況、患者の身体的状況、年齢、医薬組成物、および活性成分の濃度などを含む様々な要因に依存するであろう。患者に合った投薬計画を立てるに当たって、投与型式もまた考慮される。投薬計画はまた、薬物動力学、すなわち医薬組成物の吸収速度、生体適合性、代謝、浄化などを熟慮する必要もある。例えば、最新のRemington's；Egleton, Peptides 18: 1431-1439, 1997；Langer, Science 249: 1527-1533, 1990を参照のこと。
治療への適用において、組成物は、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症もしくはＣＤ４細胞欠損症に罹患した患者に、該状態または疾病および／またはその合併症を少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で投与される。例えば、１つの態様において、適切なペプチド医薬組成物の静脈内（ＩＶ）投与の投薬量は、約０．０１ｍｇ／時間から約１．０ｍｇ／時間を数時間に渡って（典型的には、１、３または６時間）投与され、この投与は、断続的な周期で数週間繰返すことができる。相当高い投薬量（例えば、約１０ｍｇ／ｍｌまでの範囲）は、薬物を隠れた部位に、血流中でなく、例えば，特に器官の体腔内にもしくは管腔内に、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与する場合に用いることができる。
本発明を実施するための具体的な実施形態の以下の実施例は、単に例示を目的として提供されるものであり、本発明の範囲をいかようにも制限するもではない。
本明細書で引用されるすべての出版物、特許および特許出願の開示内容は、出典明示により完全に本明細書の一部とされる。
実施例１
ヒードレス変異
「ヒードレス」は、ホモ接合型血統を生産するために繁殖させたＧ３動物で確認された遺伝性の劣性ＬＰＳ−低応答性の表現型である。その突然変異は、サルモネラ・ミネソタ（Salmonella. minnesota）のスムースＬＰＳに応答してＴＮＦ産生を妨げるが、ラフＬＰＳ化学型またはリピドＡには応答しないことが見出された（図．１ａ−ｃ）。また、この突然変異は、合成ジアシル化マクロファージ活性化リポペプチド−２（ＭＡＬＰ−２；Ｓ立体異性体よりもＲ立体異性体に関しての欠陥）およびＰａｍ２ＣＳＫ４、並びによく精製されたリポテイコ酸およびザイモサンＡ（図．１ｄ−ｈ）を含むＴＬＲ２−ＴＬＲ６リガンドに対する応答の部分的な欠陥を生じた。Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ＴＬＲ２−ＴＬＲ１リガンド、および他の既知のＴＬＲリガンド、例えば、レシキモッド（ＴＬＲ７）、ポリＩＣ（ＴＬＲ３）およびＣｐＧ（ＴＬＲ９）に対する応答は、正常であった。このように、この変異はリガンド抵抗性を示すが、本質的には、ＴＬＲ２−ＴＬＲ６複合体を介したシグナル伝達における部分的な効果を除き、ＴＬＲ４および他のリガンドを介したシグナル伝達における応答は完全なものであった。
図１は、ヒードレス変異体のラフＬＰＳおよびＴＬＲ２−６特異性を示す。野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合型ヒードレス（Ｈｄｌヘテ）、ホモ接合型ヒードレス（Ｈｄｌホモ）またはＭｙＤ８８−欠損マウスに、マクロファージ浸潤を誘導するため、３％チオグリコレートを腹腔内注射した。マクロファージを単離し、培養し、そして用量応答試験を示したように特定の各誘導物質について行った。３７℃のインキュベーターを用いて４時間インキュベートした後、上清を集め、これまでに記載されたように、Ｌ９２９バイオアッセイを用いてＴＮＦ濃度を２回アッセイした。値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝マウス６匹以上）を示す。用いた誘導物質は、スムースＬＰＳ（ａ）、ラフＬＰＳ（ｂ）、リピドＡ（ｃ）、Ｓ−ＭＡＬＰ−２（ｄ）、Ｒ−ＭＡＬＰ−２（ｅ）、ＬＴＡ（ｆ）、ザイモサンＡ（ｇ）、Ｐａｍ２ＣＳＫ４（ｈ）、ポリＩＣ（ｉ）、レシキモッド（ｊ）、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（ｋ）およびＣｐＧ−含有ＤＮＡ（ｌ）である。類似の結果は、３回の独立実験でも観察された。
実施例２
ショックに対するｆＬＰＳ化学型非依存的な抵抗性
ヒードレスは、スムースＬＰＳに応答してＴＮＦ産生を選択的に妨げるため、この変異はスムース（ラフではない）ＬＰＳの致死効果からマウスを単に保護するだけと予想された。この変異のホモ接合型マウス、またはヘテロ接合型Ｃ５７ＢＬ／６同腹子に、腹腔内経路でＬＰＳ（ラフまたはスムース化学型のいずれか）を１ｍｇ注入した。ラフまたはスムースＬＰＳのいずれかを受けたヘテロ路接合型マウスはすべて、３６時間以内に死亡した。期待に反して、ホモ接合型ヒードレスマウスはすべて、ラフまたはスムースのいずれを投与しても生存した。本質的に、ヒードレスホモ接合体はすべて、対照よりもラフおよびスムース化学型のいずれに対してほとんど感受性を示さなかった（図．２ａおよび２ｂ）。ラフＬＰＳはヒードレスマクロファージがＴＮＦを産生するよう誘導し得るが、この変異は、少なくとも幾つかのＬＰＳ応答に関する態様を妨げるのであろう。
実施例３
ヒードレスはＬＰＳ誘導性Ｉ型ＩＦＮ産生を阻止する
全ての形態のＬＰＳは、アダプターＭｙＤ８８とＭａｌに関係するＭｙＤ８８−依存経路、アダプターＴＲＩＦとＴＲＡＭに関係するＭｙＤ８８−非依存経路を通じたＴＬＲ４を介して、信号を発する。Poltorakら、Science 282: 2085-2088, 1998；Hoebeら、Nature 424: 743-748, 2003；Yamamotoら、Science 301: 640-643, 2003；Yamamotoら、Nat. Immunol. 4: 1144-1150, 2003；Kawaiら、11(1): 115-122, 1999；Yamamotoら、Nature 420: 324-329, 2002；Horngら、Nature 420: 329-333, 2002。ＩＦＮ−β転写因子ＩＲＦ−３のリン酸化および二量体化が可能となる、ＬＰＳ−誘導性ＩＦＮ−β産生は、完全にＴＲＩＦとＴＲＡＭに依存している。Hoebeら、Nature 424: 743-748, 2003；Yamamotoら、Science 301: 640-643, 2003；Yamamotoら、Nat. Immunol. 4: 1144-1150, 2003。ＩＦＮ−βは、チロシンキナーゼＴｙｋ２およびシグナル伝達物質および転写ＳＴＡＴ−１の活性化を利用する、自己増幅ループを介してそれ自身の合成を増加させ、また、ＬＰＳ毒性に重要な役割を果たすことが知られている。Karaghiosoffら、Nat. Immunol. 4: 471-477, 2003。Ｉ型ＩＦＮ産生におけるヒードレス変異の影響を試験し、それにより、この変異が、スムースＬＰＳとリピドＡの両方による、ＭｙＤ８８−非依存経路を介したシグナル伝達を妨げることが見出された（図．２ｃ、ｄ）。特に、ヒードレスは、Ｉ型ＩＦＮおよびＩＦＮ−βｍｒＮＡ産生、同様に、ＩＦＮ−誘導遺伝子、例えばＩＦＩＴ１、ＩＳＧ１５の誘導を妨げた。リピドＡに対する応答するＩＲＦ−３リン酸二量体（phosphodimer）の形成が、ヒードレス変異細胞では検出されなかった（図．２ｅ）。しかしながら、転写因子ＮＦ−κβおよび有糸分裂促進物質である活性型プロテインキナーゼＥＲＫ１およびＥＲＫ２のリン酸化は、ヒードレスマクロファージ中に自然に生じていた（図．２ｆ）。ラフＬＰＳまたはスムースＬＰＳのいずれかを注入されたマウスにおいてインビボでＴＮＦとＩ型ＩＦＮの産生もまた試験した。野生型マウスの血清中には、スムースおよびラフＬＰＳの両方で、ＴＮＦおよびＩ型ＩＦＮの強い産生が誘導されたが（図．２ｇ−ｊ）、ヒードレス変異型マウスの血清中には、スムースＬＰＳで、ＴＮＦまたはＩ型ＩＦＮが誘導されなかった（図．２ｇ、２ｉ）。ラフＬＰＳは、ヒードレスマウスと野生型マウスの両方でＴＮＦ産生を誘導したが、ヒードレスマウスでは、Ｉ型ＩＮＦ産生を刺激しなかった（図．２ｈ、ｊ）。これらの結果は、生体外でのマクロファージ応答分析と同じであり、ヒードレスが、インビボでＬＰＳ−誘導性のＩ型ＩＦＮ産生を妨げることによって死を防ぐという仮説と一致する。従って、ＬＰＳ受容体複合体は、ＭｙＤ８８−依存シグナル伝達を選択的に開始させ得るか、あるいは、ＭｙＤ８８−依存とＭｙＤ８８−非依存シグナル伝達の両方を開始させ得るのいずれかである。ヒードレスにより影響を受ける蛋白質は、ＭｙＤ８８−非依存経路の有効性を支配し、ヒードレス蛋白質は、スムースＬＰＳがＴＬＲ４シグナル伝達の何らかの形成を誘導するのに必要である。最後に、ヒードレス蛋白質は、リピドＡ（またはラフＬＰＳ）がＭｙＤ８８−非依存経路を介してシグナル伝達を誘導するのに必要であるが、リピドＡ（またはラフＬＰＳ）がＭｙＤ８８−依存経路を介してシグナル伝達を誘導するのには必要ではない。
図２は、ヒードレスが、ＬＰＳにより誘導されるＩＦＮ−βを妨げることを示す。
年齢を適合させた雄のヒードレスへテロ接合体およびホモ接合体（同腹子−つがい）を、１ｍｇのＳ．アボルタスのＬＰＳ（スムースＬＰＳ）（ａ）またはＳ．ミネソタＲｅ５９５のＬＰＳ（ラフＬＰＳ）（ｂ）を腹腔内に注射した。生存を３日の期間ごとに観察し、そのデータを、カプラン・マイヤープロット（Ｐ＜０．０００１）で表した。（ｃ）Ｉ型ＩＦＮ活性は、表示した変異マウス（ｎ＝６）のマクロファージの上清で試験した。細胞は、スムースＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはリピドＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）で４時間処理した。エラーバーは、測定のＳＥＭを表す。（ｄ）野生型Ｃ５７ＢＬ／６またはヒードレスマウスの腹膜マクロファージは、ポリＩＣまたはリピドＡで２時間処理した。全ＲＮＡを細胞から単離し、ＩＦＮβ、ＩＦＮ−誘導性遺伝子ＩＦＩＴ１、ＩＳＧ１５およびＩＬ−１２β、ＨＰＲＴの誘導を、ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。リピドＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理した野生型およびヒードレスマクロファージにおける、ＩＲＦ−３活性化（ｅ）またはＩκβおよびＥＲＫ（ｐ４２／４４）リン酸化（ｆ）。（ｇ−ｊ）ＬＰＳを注入されたマウスの血清中のＴＮＦおよびＩ型インターフェロンの産生。年齢を適合させた（８週齢）野生型およびヒードレスマウス（１群あたり４匹）を、Ｓ．アボルタスからのスムースＬＰＳ（ｇ、ｉ）か、またはＳ．ミネソタＲｅ５９５からのラフＬＰＳ（ｈ、ｊ）のいずれかを０．５ｍｇ用いて腹腔内注射し、血液を表示した時間に集め、血清中のＴＮＦ（ｇ、ｈ）およびＩ型ＩＦＮ（ｉ、ｊ）の濃度を、物質および方法に記載したＴＮＦまたはＩＦＮバイオアッセイにより分析した。同様の結果が、さらなる実験でも得られた。
実施例４
ヒードレスおよびＴＬＲ４を介したＶＳＶシグナル
ウイルス増殖の制限におけるＩ型インターフェロンの重要な役割により、生体外マクロファージ中での水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）増殖制御におけるヒードレス要求に関する実験に用いた。ヒードレスマクロファージは、１０〜５０の間の範囲のＭＯＩでＶＳＶに曝露された場合、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マクロファージよりも溶解に対してより感受性があった（図．３ａ）。さらに、ＬＰＳ−非応答性のＣ３Ｈ／ＨｅＪからのＴｌｒ４Ｌｐｓ−ｄ／Ｌｐｓ−ｄマクロファージは、ＬＰＳ−応答性のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスからのＴｌｒ４Ｌｐｓ−ｎ／Ｌｐｓ−ｎと比較して著しく過剰に感受性であった。感染した野生型細胞と比較して、少なくとも１０００倍以上のウイルスが、ヒードレスマクロファージで見られ、このことは、ヒードレスマウスからのマクロファージが、感染を内包できないことを示している（図．３ｂ）。加えて、ヒードレスマクロファージによるＩＦＮ−αの産生は、著しく低下した（図．３ｃ）。ヒードレスまたはＴｌｒ４Ｌｐｓ−ｄ／Ｌｐｓ−ｄマクロファージにおけるＶＳＶの溶解効果は、感染前にＩ型インターフェロンを用いて細胞を処理することにより阻止された（図．３ｄ）。
ＶＳＶ接種物のＬＰＳ汚染が、感染に対するヒードレス−およびＴＬＲ４−依存体制に関与している多少の可能性を排除するため、そのウイルスを、マクロファージ培養に用いた培地と同じ培地を用い、Ｖｅｒｏ細胞の単層で連続して継代した。ウイルス感染は、ウイルスの精製または濃縮の努力なしに、マクロファージ単層の産生系からの希釈された培地を直接用いて実施し（偽−感染性生細胞を対照として用いた）、ウイルスタイターを別々に測定した。ＬＰＳと異なり、ウイルスは、感染後８時間、１６時間、２１時間、および３６時間でＴＮＦ応答を誘導せず、ＮＦ−κβの活性もＥＲＫのリン酸化も検出されなかった（図．３ｅ）。Ｃ５７ＢＬ／６からのマクロファージのＶＳＶ感染が、４時間後に強いＩＲＦ−３活性化応答（バンドのシフトで示される）を誘導するが（図．３ｆ）、ヒードレスマウスからのマクロファージの感染は、１０時間後にわずかなＩＲＦ−３活性化を誘導した。従って、ヒードレス−ＴＬＲ４−ＩＦＮ−β軸が、ＶＳＶに対する保護的な応答には必要である。ＴＬＲ−３欠損マウスから得られたマクロファージで感受性の増強がなかったことは、注目される。
図３は、ヒードレスマクロファージが、ＶＳＶに誘導される細胞溶解に対して過剰な感受性がある。ＶＳＶの細胞溶解効果は、Ｃ５７ＢＬ／６（ＷＴ）、ヒードレス（Ｈｄｌ）、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（ＨｅＮ）およびＴｌｒ４Ｌｐｓ−ｄ／Ｌｐｓ−ｄＣ３Ｈ／ＨｅＪ（ＨｅＪ）マウスからのチオグリコレート誘発性腹膜マクロファージで試験した。細胞生存（ａ）、ウイルスタイター（ｂ）、および培養基中のＩＮＦ−α（ｃ）を、マクロファージあたり１０個または５０個のウイルス粒子の感染多重度（ｍｏｉ）を用いて生じさせた感染の４８時間後に測定した。また、細胞生存は、培養物中で決定され、ＩＮＦ−βを用いた前処理は、ウイルス感染の４時間前に行った（ｄ）。ＶＳＶ（５０ｍｏｉ）を用いて感染させた野生型マクロファージにおける、表示した時間でのＩκβ、ＥＲＫ（ｐ４２／４４）リン酸化の免疫部ロット解析（ｅ）。ＶＳＶ（５０ｍｏｉ）を用いて感染させた野生型マクロファージおよびヒードレスマクロファージにおける、表示した時間でのＩＲＦ−３活性化の免疫部ロット解析（ｆ）。同様の結果は、３回の独立した実験でも観察された。
実施例５
ヒードレスはＣｄｌ４変異に相当する
ヒードレス変異は、マウスの１８番染色体の中央にマップされ、それにより＞９８．２％のマウスゲノムが、２４の減数分裂で排除された（図．６）。その重要な領域にはＣＤ１４をコードする遺伝子が含まれる。ＣＤ１４ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、配列決定したところ、未成熟終始コドン（Ｑ２８４Ｘ）がヒードレス試料で観察された。FerreroおよびGoyert, Nucleic Acids Res., 16: 4173, 1988；ＮＣＢＩジーン・バンクＰ０８５７１。
重要な塩基のモルホロジーは変わっており、多くのホモ接合体のＤＮＡ鎖の両方で２つのピークの出現を示すので、変異の存在は、野生型の対立遺伝子は切断できるが、ヒードレス対立遺伝子は切断できない酵素ＢｆｕＡ−Ｉを用いた制限エンドヌクレアーゼ開裂により確認された（図．４）。変異は、８３番目のカルボキシル末端のアミノ酸の除去が予想され、それにより、ＣＤ１４ポリペプチド鎖の３６６番目のアミノ酸の第二のロイシンに富む繰り返しＬＲＲドメインを形成する。
図４は、ヒードレス、制限エンドヌクレアーゼ開裂により検出されるＣＤ１４の変異を示す。ｈｄｌ変異部位を含むＣＤ１４遺伝子の断片を、ゲノムＤＮＡ鋳型を用い、野生型マウス、ヒードレスホモ接合型およびヘテロ接合型からＰＣＲにより増幅した。各断片の約０．２マイクログラムを、制限酵素ＢｆｕＡＩを用いて５０℃で２時間消化し、１％アガロースゲルで分離した。ＢｆｕＡＩ消化後の未切断のＰＣＲ断片は１５７１ｂｐである。野生型（ｈｄｌでない）配列の消化は、１１１１ｂｐ長の断片と４６０ｂｐ長の別の断片を生じることが予想される。
図６は、配列決定によりマップされ、同定されたヒードレス変異を示す。（ａ）．Ｆ２マウスの表現型の分類は、Ｌ９２９バイオアッセイを用いたＬＰＳ−誘導性のマクロファージＴＮＦ産生の測定に基づいた。２４減数分裂において、ｈｄｌの第１８染色体の中央領域に対する制限は、ＬＯＤスコア＞６で実施した。（ｂ）．ｈｄｌ／ｈｄｌホモ接合型の詳細なコード領域の配列（上のトレース；両方向の配列決定）、および正常なＣ５７ＢＬ／６マウスの配列（下のトレース）を示す、変異をまとめた表示。Ａ Ｃは、変異株でＴに置換されているが、ホモ接合体であるにも関わらず、二本のピークとして現れた。
ＬＰＳ応答に専念するためにＣＤ１４が選択的に働くことが、これまで報告されていなかったため、観察された表現型が、無関係な突然変異により生じたという可能性を排除することを決め、Ｃｄ１４−／−マウスを試験した。これらの動物から得られたマクロファージは、ヒードレス細胞で観察された表現型とまったく同じ表現型を示した。（図．２ｃ、３ｄ、５ａおよび５ｂ）。さらに、マクロファージ培養物に、高濃度（２μｇ／ｍｌ以上）の、精製された組み換え可溶性ＣＤ１４を加えると、ヒードレス表現型を回復することができた（図．５ｃ）。このようにヒードレス表現型は、ＣＤ１４の機能的なヌル対立遺伝子により生じる。
図５は、組み換えｍＣＤ１４により、Ｃｄ１４ホモ接合型変異がスムースＬＰＳ応答性を回復することを示す。ａ、ｂ．正常またはＣＤ１４ノックアウトマウスからの腹膜マクロファージを、表示量のスムースＬＰＳ（ａ）、リピドＡ（ｂ）、または５０ｎｇ／ｍｌのスムースＬＰＳに表示量の組み換えｍＣＤ１４（ｃ）を用いて４時間処理した。（ｃ）において、ＣＤ１４−／−細胞とＨｄｌ変異細胞の応答が両方で見られた。ＴＮＦ産生は、応答の評価項目として測定した。
実施例６
−ＴＲＩＦ−ＴＲＡＭ経路のＬＰＳ−誘導性の活性化に、およびＶＳＶ応答に必要とされるＣＤ１４
公平な表現型スクリーニングおよびポジショナルクローニングにより、ＣＤ１４は、これまで考えられたきた機能とは異なる機能を果たすことが明らかとなった。ＬＰＳシグナルにだけ単純に取り掛かるというよりは、ＣＤ１４はＴＲＩＦ−ＴＲＡＭ経路のＬＰＳ−誘導性の活性化に絶対に必要であった。また、ＴＬＲ４−媒介性のＩＲＦ−３リン酸二量体形成の排他的な活性化に必要とされる、ＶＳＶに対する応答に関しても重要であった。より小さい範囲で、ＣＤ１４はまた、ＴＬＲ２−ＴＬＲ６受容体複合体を介してシグナル伝達することに関係した（ＣＤ３６を組み込むことも知られている）。
これまでの提示から、ＣＤ１４は、ラフとスムースＬＰＳ化学型を区別し得ることが考えられ得る。しかしながら、これまでのデータではこの結論を出すことはできない。それどころか、ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体は、ＣＤ１４が存在しなくてもスムースとラフＬＰＳとを区別するため、識別できる能力を有するのはＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体であるが、ＣＤ１４はラフとスムースＬＰＳ化学型の両方を特異的に生物学的に活性にすることができる。ＣＤ１４は、ラフＬＰＳまたはリピドＡに応答したＭｙＤ８８−非依存シグナル伝達を引き起こす能力を与える。対照的に、ＣＤ１４は、スムースＬＰＳに応答したすべてのＴＬＲ−４依存的シグナル伝達活性を与える。従って、ＣＤ１４は、ラフとスムース化学型とを区別できないが、その両方のシグナル伝達において重要な因子として作用する。
ＬＰＳ受容体は、２段階の停止を有するスイッチとして振る舞う；受容体の「完全な活性化」か、または制限されたＭｙＤ８８−依存的活性化が、ＣＤ１４が存在するまたは存在しないに依存して、および活性化リガンドに依存して、生じ得る。ラフＬＰＳまたはリピドＡは、ＣＤ１４が存在しない場合にＭｙＤ８８−依存的活性化を刺激し、これは、リピドＡ分子が信号を生成するためＴＬＲ４との直接の接触を受ける。Poltorakら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 2163-2167, 2000；Lienら、J. Clin. Invest. 105: 497-504, 2000。幾つかの細胞は、ＴＬＲ４−ＭＤ−２を発現するが、ＣＤ１４は発現しない、厳密には、ラフＬＰＳにより開始されるMyD８８−依存シグナル伝達は、動物がラフＬＰＳ化学型を産生する生物体に感染された場合に生じ、ＣＤ１4−欠損マウスに限られた現象ではないようである（例えば、脂肪細胞およびＢ細胞がＣＤ１4を発現しない；Huber,ら、個人的な情報交換）。これまでＴＬＲ７経路によるシグナルについて考えられてきたが、ＶＳＶはマクロファージにおいてＣＤ１4−ＴＬＲ４経路に明らかに依存し、ＩＲＦ−３−依存性のＩＦＮ−β産生を誘発するが、ＭｙＤ８８経路を活性化しない。Lundら、Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 101: 5598-5603, 2004。
我々の観察結果を説明し得る１つの仮説は、ＣＤ１４が、ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体の超分子構造の影響を通じた（すなわち、複合体の誘導され近接する方法で）ＭｙＤ８８−非依存シグナル伝達を可能にするが、ＭｙＤ８８−依存シグナル伝達が、ラフＬＰＳまたはリピドＡにより乱されたＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体の直接的な刺激の結果として生じるということを支持する。他のモデルでは、ＣＤ１４は、ＬＰＳが存在する場合のＭｙＤ８８−非依存シグナル伝達を許す構造変化をＴＬＲ−ＭＤ−２複合体に与え得る。別のモデルでは、ＣＤ１４が、ラフとスムース化学型ＬＰＳ分子の両方を直接作動させ、ＴＬＲ４−ＭＤ−２は単独の形成を作動可能にするだけと考えられる。ＣＤ１４の３次元構造が近年Ｘ線結晶学により決定され、ＬＰＳおよび他の微生物リガンドに関すると考えられる結合部位、ならびに下流のシグナル伝達に関係し得る部位が開示され、最終的に本明細書で報告した効果の解釈に貢献し得る。Kimら、J. Biol. Chem. 280: 11347-11351, 2005。ｓ
Ｃｄ１４ヌル対立遺伝子に対して、Ｔｒｉｆヌル対立遺伝子のホモ接合型マウスは、表現型により一方から他方を区別することができる。両方とも、ＩＦＮ−β賛成に関し、ＬＰＳに対する応答は示さない。しかしながら、Ｔｒｉｆ変異マクロファージはまた、リピドＡに対する応答でリピドＡ−誘導性ＴＮＦ産生により重度の障害を示すが、Ｃｄ１４ヌルマクロファージは、リピドＡに対する応答でＴＮＦを完全に産生することができる。Hoebeら、Nature 424: 743-748, 2003。これは、ＴＲＩＦとＭｙＤ８８−依存経路の成分；例えば、ＴＲＡＦ−６との機能的に重要な相互作用による可能性がある；Jiangら、Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 101: 3533-3538, 2004。さらに、Ｃｄ１４変異は、ＴＬＲ２−ＴＬＲ６センシングに影響を及ぼすが、Ｔｒｉｆ変異は及ぼさない。Hoebeら、Nature 424: 743-748, 2003；Yamamotoら、Science 301: 640-643, 2003。
ＴＬＲ２−ＴＬＲ６およびＴＬＲ４刺激促進物質（ＬＰＳとＶＳＶ感染のいまだ未知の産物を含む）としての２重の役割において、ＣＤ１４は、構造的に異なる分子のからの信号を変換し、ＴＬＲ２−ＴＬＲ６複合体は、ＴＬＲ−ＭＤ−２複合体の相互作用のようにＣＤ１４と強く相互作用すると考える得る。ＬＴＡとＭＡＬＰ−２（ザイモサンではない）の両方は、ＣＤ１４だけでなくＣＤ３６にも部分的に依存してＴＬＲ２−ＴＬＲ６へテロ二量体を介して信号を送る、そこで、CD36ヌル対立遺伝子（Ｃｄ３６ｏｂｌ）とＣｄ１４Ｈｄｌの複合ホモ接合型の表現型が、現在試験されている。Hoebeら、Nature 433: 523-527, 2005。ＶＳＶ感染に対するマクロファージ耐性におけるＣＤ１４−ＴＬＲ４シグナル伝達の重要な機能は、意外なものであったが、少なくともマクロファージにおいては、ＴＬＲ３またはＴＬＲ７よりもＴＬＲ４が、微生物の検出に決定的に重要であることは明らかである。異なる細胞型は、種々のＴＬＲを介して特異なウイルス産物を認識することにより同じウイルスを知覚する可能性がある。ＣＤ１４を活性化し、ＶＳＶ感染の経過におけるＭｙＤ８８−依存ＴＬＲ応答を許す分子の同定は、決定されないでいる。
図７は、ラフＬＰＳおよびスムースＬＰＳ（異なる長さの多糖「波線」を有するリピドＡ「円柱」）と、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体（それぞれ青色と黒色の長方形)、およびＣＤ１４（円錐曲線回転面）との相互作用をまとめた略図を示す。ＣＤ１４は、スムースＬＰＳとラフＬＰＳに対して定量的に同程度の応答を生じさせる。ラフＬＰＳは、ＣＤ１４が存在しなくても、ＭｙＤ８８−非依存シグナル伝達を活性化し得る。
図８は、ＣＤ１４が、ＴＬＲ４複合体からのＭｙＤ８８−非依存シグナル伝達を可能にする仮説の機序を示す。スムースとラフＬＰＳ、ＣＤ１４、ＴＬＲ４／ＭＤ−２およびアダプター蛋白質の上からの図を表す（細胞膜は透明である）。Ａ．ＣＤ１４が存在しない場合、ラフＬＰＳは、ＴＬＲ４／ＭＤ−２からのＭｙＤ８８／Ｍａｌ補充を刺激することができるが、スムースＬＰＳは相互作用から排除される。Ｂ．ＣＤ１４が存在する場合、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体間に巨大分子の凝集が生じ、ＴＲＩＦ／ＴＲＡＭ補充が、誘導型の近接の結果として生じる。スムースＬＰＳ分子とラフＬＰＳ分子の両方が、ＣＤ１４に関わっており、複合体集合に組み込まれ得る。
実施例７
方法論
マウス。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、これまでに記載されたように突然変異生成に用いた。Hoebeら、Nature 424: 743-748, 2003。チオグリコレート（ＴＧ）−誘発腹膜 マクロファージは、ＴＧ注入後３日で回収し、これまでに記載されたようにＴＫＲアゴニストに対する応答についてスクリーニングした。Hoebeら、Nature 424: 743-748, 2003。Ｃｄ１４／およびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスは、Jackson Laboratoriesから入手した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスは、Charles Riverから入手した。すべての実験は、TSRI Animal Use Committeeの規則に従って行われた。
ヒードレスの遺伝子地図作成および位置の同定。ヒードレスホモ接合型は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスと異種交配させ、ヒードレス株に戻り交配させた。２４匹のマウスは、６０の有益なマイクロサテライト遺伝子座の遺伝子型であった。この変異は、第二染色体の１８の標識間で確認された（単一の重複により近接標識により、複数の重複により遠位標識から分離される）。遺伝子型決定は、蛍光プライマーとＡＢＩ３１００ＤＮＡ標識を用いた断片長分析により行われた。
試薬。サルモネラ・ミネソタＲｅ５９５（ラフ）ＬＰＳ、サルモネラ・アボルタス・エクイ（スムース）ＬＰＳ、サルモネラティフィムリウム（スムース）ＬＰＳ、サルモネラ・ミネソタＲ５９５（Ｒｅ）（超純粋、液体）からのリピドＡ、およびマクロファージ−活性化リポペプチド−２（ＭＡＬＰ−２、ＳおよびＲ型）は、アレキシス社（Ａｌｅｘｉｓ、ドイツ）から得た。高純度リポテイコ酸は、T. Hartungが親切にも贈ってくれた。メチル化されていないＤＮＡオリゴヌクレオチド、５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’は、Integrated DNA Technologies（Coralville、IA）により合成された。ｄｓＲＮＡは、Amersham Pharmacia Biotechから入手した。レシキモッドは、３Ｍ社から入手した。Ｐａｍ２ＣＳＫ４，およびＰａｍ３ＣＳＫ４は、ＥＭＣマイクロコレクションズ（Tubingen、Germany）から入手した。ザイモサンＡは、Sigmaから入手した。すべては所定の濃度で用いた。組み換え可溶性CD14は、CellSciences (Canton、MA)から購入した。ｒＭｕＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−αＥＬＩＳＡキットは、Ｒ＆Ｄシステムズから入手した。配列分析で用いたＢｆｕＡ−Iは、New England Biolabsから入手した。ＲＴ−ＰＣＲは、InvitrogenのThermoScriptＲＴ−ＰＣＲ系を用いて行った。全ＲＮＡは、細胞から単離し、Ｉ型インターフェロン誘導は、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、および６８℃で４０秒間のサイクルを２８〜３０回行うＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ＩＦＮ−β、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴ１、ＩＬ−１２β、ＨＲＰＴｃＤＮＡは、以下のプライマー：ＩＦＮ−βについては、５’−ＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣＡＣ−３’と５’−ＡＡＧＧＴＡＣＣＴＴＴＧＣＡＣＣＣＴＣＣ−３’、ＩＳＧ１５については、５’−ＴＧＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧ−３’と５’−ＴＧＣＴＴＧＡＴＣＡＣＴＧＴＧＣＡＣＴＧＧＧ−３’、ＩＦＩＴ１については、５’−ＴＣＡＣＴＴＣＡＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＡＴＴＴＧ−３’と５’−ＣＣＡＴＧＧＣＴＴＧＴＴＴＡＴＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣ−３’、ＩＬ−１２βについては、５’−ＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＴＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣＣ−３’と５’−ＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＴＧＴＣＡＡＡＧＡＧ−３’、ＨＲＰＴについては、５’−ＧＧＡＣＡＧＧＡＣＴＧＡＡＡＧＡＣＴＴＧＣＴＣＧ−３’と５’−ＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＴＣＴＧＧＣＣＴＧＴＡＴＣＣ−３’、を用いて増幅した。JumpStart RED AccuTaq LA DNAポリメラーゼは、Sigmaから入手した。ＩＲＦ−３に対する抗体（ネイティブゲルにおけるリン酸二量体の検出のため）は、Santa Cruz Biotechnologyから入手し、リン酸化されたＩκβおよびＥＲＫ１／２（ｐ４２／ｐ４４）に対する抗体は、Cell Signaling（Beverly、MA）から、ＩＲＦ３、β−チューブリンに対する抗体は、Zymed（South San Francisco、CA）とPharmingen（San Diego、CA）からそれぞれ入手した。
生物学的アッセイ。Ｉ型ＩＦＮ活性は、インターフェロン−感受性ルシフェラーゼ構築物を用いてトランスフェクトされたＬ−９２９細胞系を用いて、組み換えマウスＩＦＮ−β標準を参照して、測定した。腹膜マクロファージにより産生されるＴＮＦ活性は、Ｌ−９２９細胞溶解アッセイを用いて、組み換えマウスＴＮＦ標準を参照して測定した。ＴＧ−誘導性の腹膜マクロファージにおけるＶＳＶの溶解の影響を測定するため、細胞を、９６ウェルプレートの１ウェルあたり１０５の密度で撒き、各ウェルをウイルスと共にインキュベートし、Ｌ−９２９細胞単層におけるプラーク形成アッセイにより別々に力価測定した。細胞をＭＴＴで染色し、一定期間後に生存力を評価した。
免疫ブロッティング。表示した時間の間、スムースＬＰＳまたはリピドＡを用いて処理しないもしくは処理した腹膜マクロファージを、溶解緩衝液（０．５％トライトンＸ−１００、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１２．５ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＮａＦ、２ｍＭ ジチオトレイトール、１ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＧＴＡ、２０μＭ アプロチニン、１ｍＭ フェニル−フッ化メチルスルホニル）で溶解した。細胞抽出液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（ミリポア社）に移し、ホスホ−ＥＲＫ、ホスホ−Ｉκβ、ＩＲＦ３およびβ−チューブリンに対する抗体を用いた免疫ブロッティングにより分析した。ＩＲＦ−３リン酸二量体形成の蛋白質分析は、これまで記載されたように行った。Poltorakら、Science 282: 2085-2088, 1998。
物理的特性、例えば分子量または化学式などの化学的特性に関して本明細書で範囲が用いられる場合、その範囲およびその中の具体的な値の組み合わせおよびサブコンビネーションのすべてが含まれる。
本出願において引用もしくは記載された特許、特許出願および刊行物それぞれの開示内容は、出典明示により完全に本明細書の一部とされる。
当業者であれば、多くの変更および改良を本発明に実施形態についてなし得るし、そのような変更および改良は本発明の精神を逸脱することなくなし得ることは認められよう。従って、添付の特許請求の範囲は、そのようなすべての均等な変更を、本発明の精神および目的の範囲内に含めるものである。
図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、１ｇ、１ｈ、１ｉ、１ｊ、１ｋおよび１ｌは、ヒードレス変異のラフＬＰＳおよびＴＬＲ２−６特異性を示す。 図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉおよび２ｊは、ヒードレスが、ＬＰＳによるＩＦＮ−β誘導を抑制することを示す。 図３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅおよび３ｆは、ヒードレスマクロファージがＶＳＶにより誘導される細胞溶解に対する過剰な感受性を示す。 制限エンドヌクレアーゼ切断により検出されたヒードレス、ＣＤ１４における突然変異を示す。 図５ａ、５ｂおよび５ｃは、組み換えｍＣＤ１４によるホモ接合型変異細胞でのスムースＬＰＳ応答のレスキューを示す。 図６ａおよび６ｂは、配列決定により地図作成および同定されたヒードレス変異を示す。 ラフおよびスムースＬＰＳ、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体、およびＣＤ１４との間の相互作用をまとめた略図を示す。 図８ａおよび８ｂは、ＣＤ１４がＴＬＲ４複合体からのＭｙＤ88非依存的なシグナル伝達を可能にし得る仮説の機序を示す。

Claims (81)

  1. 感染症を有することが疑われる哺乳動物対象に、ＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性のモジュレーターを、ラブドウイルス感染症を軽減または除去するのに、あるいはその発症または再発を予防するのに有効な量で投与することを含む、該対象におけるラブドウイルス感染症を処置するための方法。
  2. モジュレーターが、ＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性のアンタゴニストであるところの、請求項１記載の方法。
  3. モジュレーターが、ＣＤ１４活性またはＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性の阻害物質であるところの、請求項１記載の方法。
  4. 阻害物質が、ＣＤ１４もしくはＴＬＲ−４に対する、干渉ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであるところの、請求項３記載の方法。
  5. 阻害物質が、ＣＤ１４もしくはＴＬＲ−４に対する、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ペプチド、ペプチド模倣体または低分子の化学阻害物質であるところの、請求項３記載の方法。
  6. 阻害物質が、ＣＤ１４に対する抗体であるところの、請求項５記載の方法。
  7. 阻害物質が、ＴＬＲ−４に対する抗体であるところの、請求項５記載の方法。
  8. ラブドウイルスが、狂犬病ウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスであるところの、請求項５記載の方法。
  9. 哺乳動物対象に、ＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性のモジュレーターを、自己免疫疾患を軽減または除去するのに、あるいはその発症または再発を予防するのに有効な量で投与することを含む、該対象における自己免疫疾患を処置するための方法。
  10. モジュレーターが、ＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性のアンタゴニストであるところの、請求項９記載の方法。
  11. モジュレーターが、ＣＤ１４活性またはＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性の阻害物質であるところの、請求項１０記載の方法。
  12. 阻害物質が、ＣＤ１４もしくはＴＬＲ−４に対する、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ペプチド、ペプチド模倣体または低分子の化学阻害物質であるところの、請求項１１記載の方法。
  13. 阻害物質が、ＣＤ１４に対する抗体であるところの、請求項１１記載の方法。
  14. 阻害物質が、ＴＬＲ−４に対する抗体であるところの、請求項１１記載の方法。
  15. 哺乳動物対象に、ＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性のモジュレーターを、炎症を軽減または除去するのに、あるいはその発症または再発を予防するのに有効な量で投与することを含む、該対象における炎症を処置するための方法。
  16. モジュレーターが、ＣＤ１４を介したＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性のアンタゴニストであるところの、請求項１５記載の方法。
  17. モジュレーターが、ＣＤ１４活性またはＴｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達活性の阻害物質であるところの、請求項１６記載の方法。
  18. 阻害物質が、ＣＤ１４もしくはＴＬＲ−４に対する、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ペプチド、ペプチド模倣体または低分子の化学阻害物質であるところの、請求項１７記載の方法。
  19. 阻害物質が、ＣＤ１４に対する抗体であるところの、請求項１７記載の方法。
  20. 阻害物質が、ＴＬＲ−４に対する抗体であるところの、請求項１７記載の方法。
  21. 試験化合物を、リガンドに対する応答のシグナル伝達能を有するＴｏｌｌ様受容体４を発現する細胞を含む、細胞に基づくアッセイ系と接触させること；
    ＣＤ１４およびリガンドを、Ｔｏｌｌ様受容体４のシグナル伝達を活性化するのに有効であるように選択された量で、アッセイ系に提供すること；および
    アッセイ系での試験化合物のＴｏｌｌ様受容体４シグナル伝達における効果を検出し、アッセイにおける試験化合物の有効性がモジュレーションの指標であることを含む、Ｔｏｌｌ様受容体４経路を介した細胞におけるシグナル伝達のモジュレーターを同定するための方法。
  22. さらに、細胞においてＣＤ１４およびＴｏｌｌ様受容体４を発現させることを含む、請求項２１記載の方法。
  23. Ｔｏｌｌ様受容体４をアッセイ系に供すること、およびアッセイ系での試験化合物のＣＤ１４／Ｔｏｌｌ様受容体４−シグナル伝達における効果を検出し、アッセイにおける試験化合物の有効性がモジュレーションの指標であることをさらに含む、請求項２１記載の方法。
  24. リガンドが、内因性のリガンドまたは外因性のリガンドであるところの、請求項２１記載の方法。
  25. 外因性のリガンドが、リポ多糖体、リピドＡ、ジアシル化リポペプチド、トリアシル化リポペプチド、Ｓ−ＭＡＬＰ−２、Ｒ−ＭＡＬＰ−２、細菌性リポペプチド、Ｐａｍ２ＣＳＫ４、リポテイコ酸またはザイモサンＡであるところの、請求項２４記載の方法。
  26. 外因性のリガンドが、サルモネラ・ミネソタから由来のラフリポ多糖体、スムースリポ多糖、またはリピドＡであるところの、請求項２４記載の方法。
  27. 検出工程が、腫瘍壊死因子産生がサルモネラ・ミネソタから由来のラフリポ多糖体に対する応答で変化するが、スムースリポ多糖体またはリピドＡに対する応答では変化しない、細胞におけるＴＮＦ産生の効果を測定することをさらに含むところの、請求項２６記載の方法。
  28. 内因性のリガンドが脂質であるところの、請求項２１記載の方法。
  29. 検出工程が、該化合物によるリガンドのＣＤ１４に対する結合の低下の効果をさらに含むところの、請求項２１記載の方法。
  30. 検出工程が、該化合物によるＣＤ１４のＴｏｌｌ様受容体４に対する結合の低下の効果をさらに含むところの、請求項２１記載の方法。
  31. 検出工程が、該化合物によるリガンドのＣＤ１４に対する結合の強化の効果をさらに含むところの、請求項２１記載の方法。
  32. 検出工程が、該化合物によるＣＤ１４のＴｏｌｌ様受容体４に対する結合の強化の効果をさらに含むところの、請求項２１記載の方法。
  33. 化合物が、Ｔｏｌｌ様受容体４経路シグナル伝達のアンタゴニストであるところの、請求項３０記載の方法。
  34. 化合物が、Ｔｏｌｌ様受容体４経路シグナル伝達のアゴニストであるところの、請求項３２記載の方法。
  35. 検出工程が、細胞アッセイにおいて腫瘍壊死因子の減少を測定することをさらに含むところの、請求項３３記載の方法。
  36. 検出工程が、細胞アッセイにおいて腫瘍壊死因子の増加を測定することをさらに含むところの、請求項３４記載の方法。
  37. 細胞アッセイが、マクロファージ細胞をさらに含むところの、請求項３２記載の方法。
  38. 検出工程が、標識化されたＣＤ１４のリガンドに対する結合を測定すること、または標識化されたＣＤ１４のＴｏｌｌ様受容体４に対する結合を測定することをさらに含むところの、請求項２１記載の方法。
  39. 標識が、放射標識または蛍光標識であるところの、請求項３８記載の方法。
  40. 細胞が、リガンドに対する応答のシグナル伝達能を有するＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆを発現し；
    ＣＤ１４およびリガンドを、アッセイ系にＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達を活性化するのに有効であるように選択された量で提供し；および
    アッセイ系での試験化合物のＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達における効果を検出し、アッセイにおける試験化合物の有効性がモジュレーションの指標であるところの、請求項２１記載の方法。
  41. 細胞内でＣＤ１４、Ｔｏｌｌ様受容体４およびＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆを共に発現させることをさらに含む、請求項４０記載の方法。
  42. Ｔｏｌｌ様受容体４をアッセイ系に提供すること、およびアッセイ系での試験化合物のＣＤ１４／Ｔｏｌｌ様受容体４／ＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達における効果を検出し、該アッセイにおける試験化合物の有効性がモジュレーションの指標であることをさらに含む、請求項４０記載の方法。
  43. 検出工程が、該化合物によるリガンドのＴｏｌｌ様受容体４に対する結合の低下の効果をさらに含むところの、請求項４０記載の方法。
  44. 検出工程が、該化合物によるＴｏｌｌ様受容体４のＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆに対する結合の低下の効果をさらに含むところの、請求項４０記載の方法。
  45. 検出工程が、該化合物によるリガンドのＣＤ１４に対する結合の強化の効果をさらに含むところの、請求項４０記載の方法。
  46. 検出工程が、該化合物によるＴｏｌｌ様受容体４のＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆに対する結合の強化の効果をさらに含むところの、請求項４０記載の方法。
  47. 化合物が、ＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆ経路シグナル伝達のアゴニストであるところの、請求項４０記載の方法。
  48. 化合物が、ＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆ経路シグナル伝達のアンタゴニストであるところの、請求項４０記載の方法。
  49. リガンドが、内因性のリガンドまたは外因性のリガンドであるところの、請求項４０記載の方法。
  50. 外因性のリガンドがリポ多糖体であるところの、請求項４９記載の方法。
  51. 内因性のリガンドが脂質であるところの、請求項４９記載の方法。
  52. 検出工程が、細胞アッセイにおけるＩＲＦ−３のリン酸化の増加を測定することをさらに含むところの、請求項４７記載の方法。
  53. 検出工程が、細胞アッセイにおけるＩＲＦ−３のリン酸化の減少を測定することをさらに含むところの、請求項４８記載の方法。
  54. 検出工程が、細胞アッセイにおけるインターフェロン−βの増加を測定することをさらに含むところの、請求項４７記載の方法。
  55. 検出工程が、細胞アッセイにおけるインターフェロン−βの減少を測定することをさらに含むところの、請求項４８記載の方法。
  56. 検出工程が、細胞アッセイにおけるウイルス感染に対する感受性の低下を測定することをさらに含むところの、請求項４７記載の方法。
  57. 検出工程が、細胞アッセイにおけるウイルス感染に対する感受性の増加を測定することをさらに含むところの、請求項４８記載の方法。
  58. 細胞アッセイが、マクロファージ細胞をさらに含むところの、請求項４０記載の方法。
  59. 検出工程が、標識化されたＣＤ１４のリガンドに対する結合、または標識化されたＣＤ１４のＴＬＲ４もしくはＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆに対する結合を測定することをさらに含むところの、請求項４０記載の方法。
  60. 標識が、放射標識または蛍光標識であるところの、請求項５９記載の方法。
  61. 感染症を処置するための化合物をスクリーニングする方法であって、
    試験化合物を、リガンドに対する応答のシグナル伝達能を有するＴｏｌｌ様受容体４を発現する細胞を含む、細胞に基づくアッセイ系と接触させること；
    ＣＤ１４およびリガンドを、Ｔｏｌｌ様受容体４シグナル伝達を活性化するのに有効であるように選択された量でアッセイ系に提供すること；および
    アッセイ系での試験化合物のＴｏｌｌ様受容体４のシグナル伝達における効果を検出し、アッセイにおける試験化合物の有効性が感染症のモジュレーションの指標であることを含む、方法。
  62. 細胞が、リガンドに対する応答のシグナル伝達能を有するＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆを発現し、
    ＣＤ１４およびリガンドを、ＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達を活性化するのに有効であるように選択された量でアッセイ系に提供し；および
    アッセイ系での試験化合物のＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達における効果を検出し、該アッセイにおける試験化合物の有効性が感染症のモジュレーションの指標であるところの、請求項６１記載の方法。
  63. 化合物が、リガンドに対するＴｏｌｌ様受容体４シグナル伝達のアンタゴニストであるところの、請求項６１記載の方法。
  64. 化合物が、リガンドに対するＴｏｌｌ様受容体４シグナル伝達のアンタゴニストであるところの、請求項６２記載の方法。
  65. 感染症が、細菌性疾患またはウイルス性疾患であるところの、請求項６１記載の方法。
  66. 感染症が、ラブドウイルス感染症、狂犬病ウイルス感染症、水疱性口内炎ウイルス感染症、ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、サイトメガロウイルス感染症または黄色ブドウ球菌感染症であるところの、請求項６５記載の方法。
  67. 化合物が、ラブドウイルスＧ糖蛋白質のＣＤ１４との相互作用の阻害物質であるところの、請求項６６記載の方法。
  68. 自己免疫疾患を処置するための化合物をスクリーニングする方法であって、
    試験化合物を、リガンドに対する応答のシグナル伝達能を有するＴｏｌｌ様受容体４を発現する細胞を含む、細胞に基づくアッセイ系と接触させること；
    ＣＤ１４およびリガンドを、Ｔｏｌｌ様受容体４シグナル伝達を活性化するのに有効であるように選択された量でアッセイ系 に提供すること；および
    アッセイ系での試験化合物のＴｏｌｌ様受容体４シグナル伝達における効果を検出し、該アッセイにおける試験化合物の有効性が自己免疫疾患のモジュレーションの指標であることを含む、方法。
  69. 細胞が、リガンドに対する応答のシグナル伝達能を有するＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆを発現し、
    ＣＤ１４およびリガンドを、ＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達を活性化するのに有効であるように選択された量でアッセイ系に提供し；および
    アッセイ系での試験化合物のＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達における効果を検出し、該アッセイにおける試験化合物の有効性が自己免疫疾患のモジュレーションの指標であることを含む、方法。
  70. 化合物が、リガンドに対するＴｏｌｌ様受容体４シグナル伝達のアンタゴニストであるところの、請求項６８記載の方法。
  71. 自己免疫疾患が、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、実験的自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、実験的ぶどう膜網膜炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早発閉経、男性不妊症、若年性糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎Ｈｂｓ−ｖｅ、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、ポリ／皮膚筋炎、円板状ＬＥまたは全身性エリテマトーデスであるところの、請求項６８記載の方法。
  72. 炎症を処置するための化合物をスクリーニングする方法であって、
    試験化合物を、リガンドに対する応答のシグナル伝達能を有するＴｏｌｌ様受容体４を発現する細胞を含む、細胞に基づくアッセイ系と接触させること；
    ＣＤ１４およびリガンドを、Ｔｏｌｌ様受容体４シグナル伝達を活性化するのに有効であるように選択された量で、アッセイ系に提供すること；および
    アッセイ系での試験化合物のＴｏｌｌ様受容体４シグナル伝達における効果を検出し、該アッセイにおける試験化合物の有効性が自己免疫疾患のモジュレーションの指標であることを含む、方法。
  73. 細胞が、リガンドに対する応答のシグナル伝達能を有するＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆを発現し；
    ＣＤ１４およびリガンドを、ＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達を活性化するのに有効であるように選択された量で、アッセイ系に提供し；および
    アッセイ系における試験化合物のＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達における効果を検出し、該アッセイにおける試験化合物の有効性が自己免疫疾患のモジュレーションの指標であるところの、請求項７２記載の方法。
  74. 化合物が、リガンドに対するＴｏｌｌ様受容体４シグナル伝達のアンタゴニストであるところの、請求項７２記載の方法。
  75. 異種の核酸を含むヒト以外のトランスジェニック動物であって、該核酸がＣＤ１４遺伝子の機能喪失性の対立遺伝子を含み、そして該動物が、野生型の表現型と比較して、マクロファージ活性化の阻害、ウイルス性感染症もしくは細菌性感染症の感受性、ＴＮＦ−α産生の低下の特徴、またはそのいずれか２つまたはそれ以上の組み合わせを含む表現型を示すところの、動物。
  76. ＣＤ１４突然変異動物の表現型が、リン酸化の低下およびリポ多糖体による誘導でのＩＲＦ−３の二量体化、リポ多糖体による誘導での非−応答性ＩＦＮ−β産生、または水疱性口内炎ウイルスもしくは狂犬病ウイルスにより誘導される細胞溶解に対するマクロファージの過敏性を特徴とするところの、請求項７５記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
  77. ＣＤ１４遺伝子の機能喪失性の対立遺伝子が、Ｑ２８４Ｘでの未成熟終止コドンであるところの、請求項７５記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
  78. 動物が、マウスまたはラットであるところの、請求項７５記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
  79. 請求項７５に記載のヒト以外のトランスジェニック動物から誘導された、細胞または細胞系。
  80. Ｔｏｌｌ様受容体４またはＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達活性のモジュレーターをスクリーニングするインビトロの方法であって、請求項７９に記載の細胞または細胞系を、試験化合物と接触させること；およびＴＮＦ−α産生量の増加もしくは減少、ウイルス性感染症もしくは細菌性感染症に対する感受性、またはＴｏｌｌ様受容体４−もしくはＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆ−誘導性のマクロファージ活性化の活性を検出し、それにより、試験化合物をＴｏｌｌ様受容体４−もしくはＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆ−誘導性のマクロファージ活性化の活性のモジュレーターと同定することを含む、方法。
  81. Ｔｏｌｌ様受容体４またはＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆシグナル伝達活性のモジュレーターをスクリーニングするインビボの方法であって、請求項７９に記載の細胞または細胞系を、試験化合物と接触させること；およびＴＮＦ−α産生量の増加もしくは減少、ウイルス性感染症もしくは細菌性感染症に対する感受性、またはＴｏｌｌ様受容体４−もしくはＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆ−誘導性のマクロファージ活性化の活性を検出し、それにより、試験化合物をＴｏｌｌ様受容体４−もしくはＴＲＡＭ−Ｔｒｉｆ−誘導性のマクロファージ活性化の活性のモジュレーターと同定することを含む、方法。
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