JP2008538413A - Ｍｔｐ阻害化合物をスクリーニングするための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）を阻害する活性物質を選択するためのスクリーニング方法および前記方法を使用するスクリーニングキットに関する。

Description

本発明は、効果的であり作用の持続時間が短い、ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）の特異的阻害剤を選択するためのスクリーニング方法に関する。

ＭＴＰ（「ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質」）は、肝細胞および腸細胞の細網に局在する転移タンパク質であり、トリグリセリド類を輸送する生体分子、アポＢタンパク質類の構築を触媒する。

用語アポＢはさらに詳細には、これらに限定されることなく、腸のアポタンパク質Ｂ４８および肝臓のアポタンパク質Ｂ１００を意味する。

ＭＴＰまたはアポタンパク質Ｂにおける変異は、ヒトにおいてはアポＢリポタンパク質類の極低レベルまたはさらに欠如をもたらす。アポＢを含むリポタンパク質類（カイロミクロン類、「超低密度リポタンパク質」＝ＶＬＤＬ）およびこの代謝残留物（カイロミクロンレムナント、「低密度リポタンパク質」＝ＬＤＬ）は、先進国における主な死亡原因、アテローム性動脈硬化症の発症の主なリスク要因であると認められている。

これらの変異についてヘテロ接合である個人において平均でレベルが半分に減少していることは心臓血管リスクが低いことと関連があることが認められている（Ｃ.Ｊ.Ｇｌｕｅｃｋ，Ｐ.Ｓ.Ｇａｒｔｓｉｄｅ，Ｍ.Ｊ.Ｍｅｌｌｉｅｓ，Ｐ.Ｍ.Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｔｒａｎｓ.Ａｓｓｏｃ.Ａｍ.Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ，９０，１８４（１９７７））。

これは、ＭＴＰアンタゴニストおよび／またはアポＢの分泌によるトリグリセリドに富むリポタンパク質類の分泌の調節は、アテローム性動脈硬化症、さらに広くはアポＢリポタンパク質類の増加を特徴とする病理学の治療において有用であることも示唆する。

ＭＴＰおよび／またはアポＢの分泌を阻害する分子は、したがって糖尿病に伴う高トリグリセリド血症、高コレステロール血症および脂質代謝異常の治療ならびに肥満の予防および治療にも有用である。

文献においてはＭＴＰを阻害することができる化合物の例はすでに多数あるが、これらの阻害剤についての調査開始以来商業的に入手可能となったものはないことが知られている。実際には、多数の開発計画が最初の臨床試験の後に中断された。

特に、臨床研究の予備的結果は、ヒトにおけるトリグリセリド類およびコレステロールのレベルを低下させる手段としてＭＴＰの阻害を支持する。しかし、このような治療法は長期の、数年間にわたる治療を必要とする。このような長期にわたるヒトへのＭＴＰ阻害化合物のｉｎ ｖｉｖｏ投与は、毒性効果、例えば肝脂肪症に至る、例えば腸および肝臓における脂肪の蓄積を生じることもある。

言い換えれば、現在、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの初期のスクリーニング試験は潜在的ＭＴＰ阻害剤候補の同定を可能としているが、ｉｎ ｖｉｖｏ確認試験はこれらの候補の多くが肝臓への毒性効果の原因となることを示している。

この問題を克服するために現在、例えばＭＴＰ阻害剤とフィブラート系薬剤とを組み合わせることが提案されている。しかし、この治療の形態は２種の活性物質を投与することに伴う障害を有している（投与量の問題、適合性など）。

結果として、毒性の副作用、特に肝脂肪症を誘導しないかまたはわずかであるＭＴＰ阻害活性物質が依然として求められている。

したがって、本発明の最初の対象は、肝臓および腸における脂質の蓄積を誘導することなく血液中におけるトリグリセリド類およびコレステロールのレベルを減少させることにある。

本発明の他の対象は、肝臓における脂質蓄積のリスクが低く、高トリグリセリド血症およびコレステロール血症を減少させることができる化合物を選択するためのスクリーニング試験を提供することにある。

他の対象は、本明細書以下にさらに詳細に論じられる本発明の記載において明らかになる。

本発明は、肝臓は過剰に蓄積した脂質を（この過剰は化合物の阻害活性に固有のものであり、化合物はもはや活性でないことから）再分泌するという仮説に基づいている。

発明者らは今回、驚くべきことに、十分な薬理学的効果を得るために必要である効力が得られれば、作用の持続時間が短く十分な薬理学的効果（「フラッシュ」効果）を与えられる活性成分だけが、作用の持続時間が長い阻害剤において観察される毒性効果を生じることが少ないかまたは生じないことを見いだした。

さらに、ヒトにおける使用は長期にわたる治療を必要とすることから、脂肪症の出現を生じる可能性のある脂質の蓄積を回避するために２回の投与の間に肝臓の回復期をもうけることが必要である。

したがって、発明者らはＭＴＰ阻害候補の選択のための周知の定性試験を、前記候補の作用の動態を決定するために初めて使用する。

したがって、本発明は最初に、ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）を阻害する活性物質を選択するためのスクリーニング方法であって、
ａ）ＭＴＰの阻害に関連するパラメーターの阻害（アポＢの分泌の阻害、ＶＬＤＬの分泌の阻害など）の動態学的モニタリングの試験において候補化合物を使用するステップと、
ｂ）試験開始から３時間から２４時間、好ましくは５時間から１２時間、より好ましくは６時間から１０時間、前記候補による前記パラメーターの阻害の動態をモニタリングするステップと、
ｃ）ｉ）最長４時間未満、好ましくは３時間未満にわたる５０％以上の前記パラメーターについての阻害の百分率；ならびに
ｉｉ）試験開始後１０時間を過ぎて、好ましくは８時間を過ぎて、より好ましくは６時間を過ぎての２０％未満、好ましくは１０％未満の前記パラメーターの残存阻害活性
を特徴とする前記パラメーターの阻害の動態を有する候補を選択するステップと
を含む方法を提案する。

本明細書の以下の記載において、本発明のスクリーニング方法における、阻害の動態学的モニタリングのための試験を「試験Ａ」と称する。

したがって前記定義の試験Ａは、十分なＭＴＰ阻害活性を有し、特に肝脂肪症および上記で挙げたような有害作用を生じることもある残存阻害活性のない化合物の選択を可能にする。

用語「十分なＭＴＰ阻害活性」は、ＭＴＰの阻害に関連するパラメーター（例えばアポＢまたはＶＬＤＬ）について観察された阻害の百分率が少なくとも５０％に等しいことを意味する。

用語「残存阻害活性」は、２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくはプラセボと対比して有意差のない阻害活性であるＭＴＰの阻害に関連するパラメーター（例えばアポＢまたはＶＬＤＬ）について観察された阻害活性との意味で理解されるべきである。

本明細書以下の記載において、用語「可逆的」は作用の持続時間が短い化合物、すなわち所望する「フラッシュ」効果を有する化合物を意味し、「不可逆的」は作用の持続時間が長い化合物を意味する。

本発明によるスクリーニング方法の試験Ａは、可逆的候補の選択を可能にする。

この試験Ａは、ＭＴＰの阻害に関連するパラメーターの阻害の動態学的モニタリングであり、例えばアポタンパク質Ｂ（アポＢ）の分泌の阻害の試験であり、有利にはこれはｉｎ ｖｉｔｒｏ試験であり、任意の型の肝細胞または腸細胞、好ましくはＨｅｐＧ２細胞などの肝細胞を使用する、もしくは別法として超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の分泌についてのＭＴＰの阻害の動態学的分析の試験であり、有利にはこれはｉｎ ｖｉｖｏ試験である。例示的目的で以下に示す例は試験Ａの実施の詳細な形態を示す。

試験Ａはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施することもできる。本発明の好ましい一変形形態により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される試験Ａ（以下の記載においてＡ_vitroと表記）は、アポＢの分泌の動態を測定し、ｉｎ ｖｉｖｏで実施される試験Ａ（以下の記載においてＡ_vivoと表記）はＶＬＤＬ類の分泌の動態を測定する。

試験Ａ_vitroにおいて、候補化合物が十分な可逆性を示す場合、すなわち、試験化合物の除去の２４時間後にアポＢの分泌が、定義により阻害化合物で処理されていない対照と比較して５０％に等しいかまたは超えるおよび有利には７０％に等しいかまたは超えるレベルに戻っている場合化合物は作用の持続時間が短いとみなされる。

本発明の好ましい一変形形態により試験Ａはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施され、選択された候補は次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験Ａの後に選択された候補の活性を確認するために、１つまたは複数のｉｎ ｖｉｖｏでの試験Ａにおいて使用される。

試験Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養細胞、好ましくは肝細胞、有利にはＨｅｐＧ２細胞において実施される。試験Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏで適切な動物モデル、例えばラットにおいて実施される。

さらに、上記定義の試験Ａは、作用の持続時間が短いＭＴＰ阻害候補の選択のために早いおよび／またはさらに特異的なスクリーニングを可能にする、１つまたは複数の他の事前選択または事後選択試験と組み合わせることもできる。

したがって、ＭＴＰについての作用の可逆性の試験（上記定義の動態学的試験Ａ）に加えて、本発明によるスクリーニング方法に、１つまたは複数のＭＴＰの活性の阻害の定性的試験、例えばＷｅｔｔｅｒａｕおよびＺｌｉｖｅｒｓｍｉｔ（Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ａｃｔａ，（１９８６），８７５−６１０）により記載された試験を続けてまたは先に行うこともできる。

この試験（本明細書以下において試験Ｂと称する）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて候補の阻害能力またはＭＴＰに関して候補の定性的選択を実施することを可能にする。本試験はこの性質により有利には上記定義の試験Ａより先に実施される。

さらに、アポＢの分泌についての候補の阻害能力の分析を可能にする、例えばヒトＨｅｐＧ２細胞系における、アポＢの分泌の阻害の試験（本明細書以下において試験Ｃと称する）に候補物質を使用することが有益であることは証明される。

試験化合物の「活性−非活性」型の予備スクリーニングを可能とするため、試験Ｃは試験Ｂと同様に、特に試験Ａより先に使用される場合において、重要である。

試験Ｃも周知でありこの分野において慣用されている。本試験の実施のために例えばＤｉｘｏｎ.およびＧｉｎｓｂｅｒｇ Ｈ．（Ｊ.Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，（１９９３），３４，１６７−１７９）を参照してもよい。

十分な可逆性を有する化合物を選択するための本発明によるスクリーニング方法は、他の実施形態により、試験化合物の血漿代謝物が活性であるかまたは非活性であるかを決定するための１つまたは複数の試験も含むこともできる。

特に、本発明が解決しようとする課題は、十分な阻害活性を有するが持続時間が短い（「フラッシュ」効果、可逆的阻害剤）ＭＴＰ阻害剤の選択にある。したがって、選択されたまたは選択されることになる化合物の血漿代謝物それ自体は同じ標的についての阻害活性を有さないこと、すなわちＭＴＰ活性についてのＩＣ₅₀が１μＭを超えるおよび好ましくは１０μＭを超えることを確実にすることは有益である。

したがって、試験Ｂおよび／またはＣ（それぞれ上記定義の通り）に類似するもしくはさらに同一である、しかし今回は候補化合物の血漿代謝物について実施される、１つまたは複数のＭＴＰの阻害のおよび／もしくはＶＬＤＬ類の分泌の阻害のならびに／またはアポＢの分泌の阻害の試験を試験Ａより先にまたは続いて好ましくは続いて行うこともできる。代謝物についてのこれらの試験は本明細書以下において試験Ｄ（代謝物／ＭＴＰ阻害試験）および試験Ｅ（代謝物／アポＢ阻害試験）と称する。

用語「血漿代謝物」は生体による候補化合物の分解生成物を意味する。これらの代謝物は当業者に周知の標準的方法、例えば潜在的代謝物の再合成を伴う、生きている細胞において好ましくはミクロソームにおいてインキュベートした後の候補化合物の分解生成物の構造決定により得られる。

本発明によるスクリーニング方法には、１つまたは複数のｉｎ ｖｉｖｏ活性の確認試験（事後選択）を続けることもできる。有利には、本発明によるスクリーニング方法は、上記定義のｉｎ ｖｉｖｏ試験ＢおよびＣに類似するＶＬＤＬ分泌の阻害の定性試験ならびに上記定義のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験Ａに類似のＶＬＤＬ分泌の阻害の動態の評価の試験から選択される少なくとも１つのｉｎ ｖｉｖｏ確認試験も含む。これら２種の確認試験をそれぞれ試験Ｆおよび試験Ａ_vivoと称する。

最後に、上記定義の試験から選択される試験に対して陽性反応を示す候補は、所望する薬理学的効果（血液中トリグリセリドの減少）の決定のためのｉｎ ｖｉｖｏ最終試験（試験Ｈ）の対象となることもできる。この試験Ｈは周知の様式、例えば以下の例において表される様式であってよい。

本発明によるスクリーニング方法における試験Ａを補足／確認する、前記載の全ての試験は、時系列順に以下の表に照合され、本発明によるスクリーニング方法の好ましい変形形態を、試験の標的、すなわちｉｎ ｖｉｖｏ試験においては動物モデル（特にラット）、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ試験においてはＨｅｐＧ細胞、ＭＴＰタンパク質または肝細胞の他の型の記述とともに構成する：

動態学的試験Ａがｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで作用の持続時間が短いＭＴＰ阻害化合物の決定のために単独の試験として使用できることは明確に理解される。しかし、前記方法において試験Ａ_vitroを単独で使用する場合、候補化合物の阻害力の動態学的分析の試験Ａ_vivoが有利には次に続くことを記載する。

好ましい一実施形態により本発明は、上記定義の試験Ａ_vitroによる候補の選択、続いて試験Ａ_vitroに対して陽性反応を示す候補の試験Ａ_vivoによる選択を含むＭＴＰ阻害化合物をスクリーニングするための方法に関する。

他の実施形態により本発明は、上記定義の試験Ｂおよび／または試験Ｃに対して陽性反応を示す候補からの候補の事前選択、上記定義の試験Ａ_vitroによる事前選択から得られる候補からの選択、および試験Ａ_vitroに陽性反応を示す候補の試験Ａ_vivoによる選択を含むＭＴＰ阻害化合物をスクリーニングするための方法に関する。

さらに別の実施形態により本発明は、
ａ）試験Ｂおよび／または試験Ｃにおける候補化合物を使用し、次いで前記試験Ｂおよび／または前記試験Ｃに陽性反応を示す候補を事前選択するステップと、
ｂ）ステップａ）から得られる候補化合物を試験Ａ、有利には試験Ａ_vitroにおいて使用し、前記試験Ａに陽性反応を示す候補を選択するステップと、
ｃ）ステップｂ）で選択される候補化合物を試験Ｄおよび／または試験Ｅによる前記候補の代謝物の分析によって任意選択で追加的に選択するステップと、
ｄ）ステップａ）、ｂ）およびｃ）において選択される候補化合物を、少なくとも１つのｉｎ ｖｉｖｏ確認試験Ｆおよび／またはＡ_vivoにおいて使用し、次いで試験Ｆおよび／または試験Ａ_vivoに陽性反応を示す候補を選択するステップと、
ｅ）血液中におけるトリグリセリド類の減少の制御のｉｎ ｖｉｖｏ試験Ｈを使用して選択することによって前記ステップにおいて選択される候補を確認するステップと
を含むスクリーニング方法に関する。

上記の種々の試験の実施は、この順序が本発明のいかなる制限になることなく、好ましくはＢおよび／またはＣ−Ａ_vitro−Ｄおよび／またはＥ−Ｆおよび／またはＡ_vivo−Ｈの順序で実施される。

本発明は、候補化合物によるＭＴＰの阻害に関連するパラメーターの動態を決定するための、上記定義の通りの少なくとも１つの試験Ａ_vitro、試験Ａ_vivoまたはこの２つの組合せを含む本発明によるスクリーニング方法の使用にも関する。これらの試験を実施するための条件はスクリーニング方法において記載の通り。

好ましくは、この試験は候補化合物が、本発明の意味する範囲内で、作用の短い持続時間（「フラッシュ」効果）を有するか、または反対に作用の長い持続時間を有するかどうかを決定するために使用される。

本発明はまた、上記定義のスクリーニング方法を使用してミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）を阻害する活性物質を選択するためのスクリーニングキットにも関する。

したがってスクリーニングキットは、少なくとも１つの上記定義の試験Ａ、試験Ａ_vitroおよび／または試験Ａ_vivoを実施するための手段の全て、および任意選択で上記定義の試験Ｂから試験Ｈの１つ、複数または全てを、順序を問わずに含むと定義される。

本発明によるスクリーニング方法により選択されるまたは上記定義のキットを使用することにより選択される化合物は、メタボリック症候群および糖尿病に伴う高トリグリセリド血症、高コレステロール血症および脂質代謝異常、ならびに膵炎の治療においてさらに肥満の予防および治療においての完全に有利で適切な適用を有する。

したがって、本発明によるスクリーニング方法によって選択される作用の持続時間が短いＭＴＰ阻害剤は、高トリグリセリド血症の動物モデルである肥満ズッカーラット（ｆａｔｔｙ ｆａ／ｆａ）において、作用の持続時間が長いＭＴＰ阻害剤で正反対に観察される肝臓の脂質含有量の悪化（脂肪症）を生じることなく、高トリグリセリド血症を顕著に減少させる。

他の態様によると本発明は、したがって本発明によるスクリーニング方法によりまたは本発明によるキットにより選択される化合物にも関する。これらはメタボリック症候群および糖尿病に伴う高トリグリセリド血症、高コレステロール血症および脂質代謝異常の治療ならびに肥満の予防および治療のための薬剤の調製に使用できる。

単に例示の目的で、仏国特許出願第２８１６９４０号（および国際特許出願番号ＷＯ０２／４２２９１）に記載されている化合物１および２は、作用の持続時間が短いＭＴＰ阻害化合物である。

本発明は、薬学的に重要な化合物の選択に至る本発明によるスクリーニング方法およびこの化合物と薬学的に許容されるビヒクルまたは賦形剤とを混合することを含む医薬用組成物の調製または製造のための方法にも関する。

本発明は、メタボリック症候群および糖尿病に伴う高トリグリセリド血症、高コレステロール血症および脂質代謝異常などの脂質の調節障害の治療ならびに肥満の予防および治療のための薬剤の調製または製造のための方法に特に関する。

調製または製造方法は好ましくは、１つまたは複数の前記定義の追加的試験、すなわち前記定義の試験ＢからＨの１つ、複数または全部を、順序を問わず加えることができる前記定義の少なくとも１つの試験Ａ_vitroおよび／または少なくとも１つの試験Ａ_vivoを含む、本発明によるスクリーニング方法の実施を含む。

本発明は、上記の方法を実施することにより得ることもできる医薬用組成物または薬剤にも関する。

本発明はさらに一般的に、本発明のスクリーニング方法によりまたは本発明によるスクリーニングキットにより選択される化合物の薬学的に効果的な量を、１つまたは複数の薬学的に許容されるビヒクルまたは賦形剤との組合せにおいて含む医薬用組成物に関する。

これらの組成物は、即効性または除放性錠剤、ゲルもしくは顆粒の形態あるいは液体、例えばシロップの形態において経口で、注射可能な溶液の形態において静脈内に、粘着性経皮デバイスの形態において経皮的にあるいはまた溶液、クリームまたはゲルの形態において局所的に投与されることもできる。

経口投与用の固体組成物は、本発明のスクリーニング方法によりまたは本発明によるスクリーニングキットにより選択される化合物に、賦形剤および必要な場合は結合剤、崩壊剤、潤滑剤、着色料または風味強化剤を加え、混合物を錠剤、コート錠、顆粒、粉末またはカプセルに成形することにより調製する。

賦形剤の例は、乳糖、コーンスターチ、ショ糖、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロースおよび二酸化ケイ素を含み、結合剤の例は、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルエーテル）、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガカントガム、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、クエン酸カルシウム、デキストリンおよびペクチンを含む。

潤滑剤の例は、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカおよび硬化植物油を含む。着色料は薬剤における使用が許可されているいずれの着色料であってよい。

風味強化剤の例は、ココアパウダー、葉の形状のミント、芳香粉、油状のミント、ボルネオールおよびシナモンパウダーを含む。錠剤または顆粒は砂糖、ゼラチンなどによって適切にコーティングされることもできることは理解されるべきである。

本発明のスクリーニング方法によりまたは本発明によるスクリーニングキットにより選択される化合物を活性素として含む注射可能な形態は、必要な場合は、前記化合物をｐＨ調整剤、緩衝剤、懸濁剤、溶解剤、安定剤、等張化剤および／または保存剤と混合すること、ならびに慣用の方法により混合物を静脈内、皮下または筋肉内注射用の形態に変換することにより調製する。必要な場合は、得られる注射用形態剤を慣用の方法により凍結乾燥することもできる。

懸濁剤の例は、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガカントガム粉末、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびポリエトキシル化ソルビタンモノラウレートを含む。

溶解剤の例は、ポリオキシエチレンで固化したヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチンアミド、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレートおよび脂肪酸ヒマシ油のエチルエステルを含む。

さらに安定剤は、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウムおよびエーテルを含み、保存剤はパラヒドロキシ安息香酸メチル、パラヒドロキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾールおよびクロロクレゾールを含む。

ＭＴＰ活性の調節により生じるもしくは関連する疾病、障害または状態の予防あるいは治療を目的とする、本発明のスクリーニング方法によりまたは本発明によるスクリーニングキットにより選択される化合物の効果的な投与量および薬学量は、多数の要因、例えば阻害剤の性質、患者の体格、所望する治療の目的、治療される病理学の性質、使用する特定の医薬用組成物ならびに治療を行う医師の観察および決定に依存する。

例えば経口投与、例えば錠剤またはゲルカプセルの場合、本発明のスクリーニング方法によりまたは本発明によるスクリーニングキットにより選択される化合物の最適な投与量は、活性物質を、１日当たり体重の約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの間、好ましくは１日当たり体重の約０．５ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは１日当たり体重の約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの間、さらに好ましくは１日当たり体重の約２ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇの間である。

上記の通り使用することができる経口日用量範囲を明らかにするために１０ｋｇから１００ｋｇの典型の体重を考慮すると、本発明のスクリーニング方法によりまたは本発明によるスクリーニングキットにより選択される化合物の適切な投与量は、好ましい化合物を含む活性物質が、１日当たり約１−１０ｍｇから１０００−１００００ｍｇの間、好ましくは１日当たり約５−５０ｍｇから５００−５０００ｍｇの間、より好ましくは１日当たり約１０．０−１００．０ｍｇから１００．０−１０００．０ｍｇの間、さらに好ましくは１日当たり約２０．０−２００．０ｍｇから約５０．０−５００．０ｍｇの間である。

これらの投与量範囲は、投与される患者の１日当たりの活性物質の総量を表す。投与を行う１日当たりの投与回数は、薬物動態学的および薬理学的要因、例えばこの物質の異化作用およびクリアランスの速度を反映する活性物質の半減期、ならびに患者において到達し治療効能のために必要とされる前記活性物質の血漿中または他の体液中の最低および最適レベルに依存して大きく変動する。

１日の投与回数および１回の投薬の摂取において投与されるべき活性物質の量を決定する場合には、他の多くの要因も考慮するべきである。これらの要因には、少なからず治療される患者の個々の応答がある。

前記定義の医薬用組成物は好ましくは、メタボリック症候群および糖尿病に伴う高トリグリセリド血症、高コレステロール血症および脂質代謝異常などの脂質の調節障害ならびに膵炎の治療、さらには肥満の予防および治療を目的とする。

本発明はメタボリック症候群および糖尿病に伴う高トリグリセリド血症、高コレステロール血症および脂質代謝異常などの脂質の調節障害ならびに膵炎の治療用の、さらには肥満の予防および治療用の方法にも関する。

この方法は、連続的なフェーズにおける患者の治療を含み、各フェーズは先行するフェーズから、先行するフェーズにおける治療の間に蓄積した脂質を肝臓から除去するに十分である回復期として周知の時期により隔てられている。この方法は、本発明の意味において作用の持続時間が短いことを特徴とする本発明による医薬用組成物または薬剤を有利に使用する。回復またはクリアランス期により中断される治療の時期を繰り返すことを可能にする「フラッシュ」効果を有する化合物を有すること、および患者、観察される治療効果および耐性の状態に相応して治療の密度を自在に適合させることの利益はしたがって理解される。

これらの条件の下で、前述の化合物１および／または化合物２を含む医薬用組成物を使用して治療を実施することもできる。

本発明を、限定することのない例として理解される実施の方法の援用および図の参照とともに以下にさらに詳細に記載し、ここで：
−図１は、ｘ軸が前記化合物１によりラットを処置した後の時間（分）であり、ｙ軸がＶＬＤＬトリグリセリド類の分泌に対する化合物１の作用の持続時間を表す阻害の百分率であるグラフである；
−図２は、ｘ軸が前記化合物２によりラットを処置した後の時間（分）であり、ｙ軸がＶＬＤＬトリグリセリド類の分泌に対する化合物２の作用の持続時間を表す阻害の百分率であるグラフである。

実施例
試験Ｂ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＭＴＰ活性の阻害の定性的分析
以下の作業手順を使用してミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）の活性の阻害の試験を行った。

化合物のＭＴＰ活性の阻害は、ＭＴＰ存在下で供与粒子から受容粒子への標識トリグリセリドの輸送の阻害を観察することにより定量することもできる。ＭＴＰの調製の手順は、ＷｅｔｔｅｒａｕおよびＺｉｌｖｅｒｓｍｉｔ（Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ａｃｔａ（１９８６）８７５,６１０）による方法に基づく。ゴールデンハムスターの肝臓数グラムを採取し、次いで２５０ｍＭ ショ糖溶液中０℃で数回リンスする。以下のすべての作業は４℃で行う。２５０ｍＭショ糖中に５０％の濃度のホモジェネートを、テフロンミルを使用し次いで１００００×ｇで４℃、１０分間遠心分離することにより調製する。次いで上清を１０５０００×ｇで４℃、７５分間遠心分離する。上清を除去しミクロソーム沈澱を１５０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ８．０ ３ｍｌ（出発肝臓１ｇ当たり）に採取する。１ｍｌ一定分量画分は使用時まで−８０℃で保存する。

ミクロソームの画分（１ｍｌ）を融解後、冷却した５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂緩衝液ｐＨ７．４ １２ｍｌおよびデオキシコール酸塩（水中０．５４％）１．２ｍｌを加える。穏やかに撹拌しながら４℃で３０分間インキュベートした後、懸濁液を１０５０００×ｇで７５分間遠心分離する。可溶性ＭＴＰを含む上清を、１５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％アジ化ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４に対して（２から３日間に１Ｌを５回）透析する。ＭＴＰは４℃で保存され、少なくとも３０日間安定であり試験において未修飾型で使用される。

供与粒子（リポソーム）は、クロロホルム中１０ｍｇ／ｍｌの濃度でのＬ−ホスファチジルコリン２０８μｌおよびトルエン中０．５ｍＣｉ／ｍｌの濃度での［３Ｈ］−トリオレイン４８０μｌから調製される。撹拌後、溶液を窒素下で蒸発させ、５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂緩衝液ｐＨ７．４ ６ｍｌに採取し、室温で３０分間超音波浴においてインキュベートする。リポソームは４℃で保存し、各使用の前に再び１０分間超音波にかける。

受容粒子はビオチン標識低密度リポタンパク質(ＬＤＬ−ｂｉｏｔ)である。この粒子は企業Amershamにより供給される。

反応混合物は、未処理１／２ウェルホワイトプレート(Corning Coaster)に以下の順序で加えることにより調製する：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ(ｗ/ｖ)、０．０５％アジ化ナトリウム(ｗ/ｖ)緩衝液ｐＨ７．４を５μｌ；リポソーム５μｌ；ＬＤＬ−ｂｉｏｔ ５μｌ；ＤＭＳＯ中の試験生成物５μｌ；ＭＴＰ ５μｌ。３７℃で１８から２４時間インキュベートした後、ストレプトアビジンに結合させたＡｍｅｒｓｈａｍ ＳＰＡ(シンチレーション近接アッセイ)ビーズを１００μｌ加えることにより反応を停止し、少なくとも１時間の後にＴｏｐ Ｃｏｕｎｔ(Packard)装置を使用して放射性を計測する。化合物によるトリグリセリドの輸送の阻害は輸送される放射性の減少に反映する。所与の化合物についての阻害の百分率は、反応混合物に化合物を含まない対照と比較して決定する。

結果は用語ＩＣ₅₀、すなわちＭＴＰの５０％阻害をもたらす濃度で表す。結果を前記化合物１および２について下記の表Ｉに要約する。

試験Ｃ
ＨｅｐＧ２ヒト細胞系におけるアポＢの分泌の定性分析：
化合物の活性はＨｅｐＧ２細胞におけるアポＢ分泌の阻害を測定することによって評価してもよい。

ＨｅｐＧ２細胞（ＥＣＡＣＣ番号８５０１１４３０）を、Ｄｉｘｏｎ Ｊ.およびＧｉｎｓｂｅｒｇ Ｈ.（Ｊ.Ｌｉｐｉｄ.Ｒｅｓ．，（１９９３），３４，１６７−１７９）による記載の通りリポタンパク質の肝臓分泌のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究のモデルとして使用する。

ＨｅｐＧ２細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭおよびＦＢＳ−Ｇｉｂｃｏ）中で９６穴プレートにおいて５％二酸化炭素の雰囲気下で２４時間培養する（約７０％コンフルエンス）。

試験化合物を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に２または１０ｍＭの濃度で溶解する。一連の希釈液（１：３．１６）をＤＭＳＯ中で作製し、増殖培地（２００μｌ）に加え（１：２００−Ｒｏｂｏｔ Ｍｕｌｔｉｍｅｋ Ｂｅｃｋｍａｎ）、次いで最後にＨｅｐＧ２細胞を含む多数のウェルにおいて２４時間インキュベートする。

２４時間培養の上清を１：５(リン酸緩衝食塩水：１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ)に希釈し、ヒトアポＢに対して特異的なサンドイッチ−ＥＬＩＳＡ法により試験する。

化合物１および２について下記の表ＩＩに示す結果は、用語ＩＣ₅₀、すなわちＨｅｐＧ２細胞においてアポＢ分泌を５０％阻害する濃度で表す。

試験Ａ_vitro
ＨｅｐＧ２細胞によるアポＢの分泌の阻害の動態（可逆性）の分析：
ＨｅｐＧ２細胞を前述の段落において記載したように生成物と接するように置き、６および２４時間後にアポＢの分泌をモニタリングする。比較は等効力の投与量で２４時間後のアポＢの分泌の阻害について行う。

次いで、（０、６、２４および４８時間後の培地の交換の際に）生成物を培養培地から除去し、正常な分泌に回復しているか動態を決定するためにアポＢの分泌を再度測定する。生成物の除去後２４時間で分泌が対照（化合物と接触しないブランク細胞）の値の７０％に等しいかまたは超えている値である場合に可逆性が十分だと判定される。

結果を化合物１および２について下記の表ＩＩＩに示す。

試験Ｄ
生成物の代謝／不活性化
生成物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて急速に不活性化される能力について評価する。これを実施するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで十分な活性を示す化合物を、齧歯類の肝臓ミクロソームにおいてこれらの代謝速度について試験を行う。インキュベーション培地は以下の成分を合わせて混合することにより調製する：ＮＡＤ（１ｍＭ）、グルコース−６−リン酸（５ｍＭ）、ＮＡＤＰ（１ｍＭ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（１ＩＵ／ｍｌ）、ウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）、トリス（１０ｍＭ ｐＨ＝７．６）、ＭｇＣｌ₂（５ｍＭ）。

０．５ｍｇ／ｍｌの濃度のミクロソーム（Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ）を１０μＭの試験生成物と接するように置く。混合物を３７℃で１時間インキュベートする。調製物の一部を開始時に採取し、等容量のエタノールを加える（タンパク質を沈澱させることにより反応を停止する）。同じ作業を１時間インキュベーション後に繰り返す。

得られた試料を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析する。Ｔ０からＴ６０分の間の親生成物の消失の百分率をクロマトグラフィーのピークの面積を算出することにより決定する。

（それぞれ化合物１または２の）潜在的代謝物Ｍ１およびＭ２を同定し、再合成し、これらのＭＴＰ阻害活性を評価する。化合物１および２は、活性の乏しいまたは不活性な代謝物（ＩＣ₅₀＞１μＭ）への１時間当たり５０％を超える代謝／不活性化を示す（表ＩＶ）。

試験Ｆ
ラットにおけるＶＬＤＬの分泌の阻害：
化合物１および２による肝臓ＭＴＰの阻害を、超低密度リポタンパク質類（ＶＬＤＬ）の分泌に対するこれらの影響から評価した。ウィスターラット（２２０から２８０ｇ）オスは標準的飼料および水を自由摂取させる。実験を実施する日に、動物（ｎ＝７）を囲い込み、１時間後に化合物（経口で１００ｍｇ／ｋｇ；賦形剤０．５％メチルセルロース）で処置する。処置の１時間および５時間にわたりトリトン法（ＷＲ１３３９）によりＶＬＤＬの分泌を測定する。血流に注射する場合は、トリトン（４００ｍｇ／ｋｇ）は、リポタンパク質リパーゼによる脂肪分解を阻害することおよび組織への取り込みを阻害することによってＶＬＤＬの異化作用を抑制する。したがって、ＶＬＤＬの成分であるトリグリセリド類（ＴＧ）およびコレステロールの蓄積の測定により、肝臓によるＶＬＤＬの分泌を明らかにすることができる。

したがって、ＶＬＤＬの分泌における生成物の効果は、１００ｍｇ／ｋｇの投与量での処置の１時間から６時間後の間、すなわちトリトンの静脈内投与の０から５時間後に評価する。血液試料は、トリグリセリド類およびコレステロールを分析するためにガス麻酔下で規則的な間隔で採取する。ＶＬＤＬ−トリグリセリド類およびＶＬＤＬ−コレステロールの分泌はｍｍｏｌ／ｌ／ｈ（平均値）で表す。化合物で処置を行わない対照と比較した阻害のレベルを決定し、結果を表Ｖに示す。

試験Ａ_vivo
ＶＬＤＬの分泌に対するＭＴＰ阻害剤の作用の持続時間の決定
この試験により、ＶＬＤＬの過分泌を特徴とする動物モデルである肥満ｆａ／ｆａズッカーラット（１０から１２週齢）におけるＶＬＤＬの分泌に対するＭＴＰ阻害化合物の阻害の動態を評価することが可能になる。阻害の強度および持続時間を、前記トリトン法により生成物の投与後８時間にわたる時間、測定する。生成物の作用の持続時間は投与される量および生成物固有の性質の両方に依存することから、十分な時間間隔にわたり少なくとも５０％の最高阻害（Ｉ_max）に達することができる投与量において決定する。異なる能力を有する２種の化合物の作用の持続時間のプロフィールの比較は、したがって同様のＩ_max値を得られる各投与量において実施する。化合物１および２は、処置後６から８時間の間に十分な残存阻害がなく、８時間未満の作用の持続時間を示す。

化合物１および２について時間の関数としての阻害曲線をそれぞれ図１および２に示す：
試験Ｈ
ＭＴＰ阻害剤の抗高脂血症効果 対 脂質合成効果のｉｎ ｖｉｖｏ評価
ＭＴＰ阻害剤の脂質合成能力の特性を明らかにするために、所望する薬理学的効果（トリグリセリド血症の減少またはＶＬＤＬ画分の減少）と潜在的に有害な機構的効果（肝臓におけるトリグリセリド類の蓄積）の比率を動物において再度処置した後に決定した。

肥満（ｆａ／ｆａ）ズッカーラット１０週齢に標準的飼料を自由摂取させ、経口で７日間化合物２（賦形剤０．５％メチルセルロース）で処置する（ｎ＝７から８）。作用の持続時間が異なる化合物間での比較は、所望する薬理学的効果、すなわち循環するトリグリセリド類の減少のための等効力投与量において実施し、対照動物との比較で肝臓におけるトリグリセリド類の蓄積の程度に関連する。結果を表ＶＩに示す：

ｘ軸が前記化合物１によりラットを処置した後の時間（分）であり、ｙ軸がＶＬＤＬトリグリセリド類の分泌に対する化合物１の作用の持続時間を表す阻害の百分率であるグラフである。 ｘ軸が前記化合物２によりラットを処置した後の時間（分）であり、ｙ軸がＶＬＤＬトリグリセリド類の分泌に対する化合物２の作用の持続時間を表す阻害の百分率であるグラフである。

Claims (13)

1. ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）を阻害する活性物質を選択するためのスクリーニング方法であって、
   ａ）ＭＴＰの阻害に関連するパラメーターの動態学的モニタリングの試験において候補化合物を使用するステップと、
   ｂ）試験開始から３時間から２４時間、好ましくは５時間から１２時間、より好ましくは６時間から１０時間、前記候補による前記パラメーターの阻害の動態をモニタリングするステップと、
   ｃ）ｉ）最長４時間未満、好ましくは３時間未満にわたる５０％以上の前記パラメーターについての阻害の百分率；ならびに
   ｉｉ）試験開始後１０時間を過ぎて、好ましくは８時間を過ぎて、より好ましくは６時間を過ぎての２０％未満、好ましくは１０％未満の前記パラメーターの残存阻害活性
   を特徴とする前記パラメーターの阻害の動態を有する候補を選択するステップと
   を含む方法。
2. ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、より好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ次いでｉｎ ｖｉｖｏにおいて実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. ＭＴＰの阻害に関連するパラメーターが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験である場合はＨｅｐＧ２細胞などの任意の型の肝細胞または腸細胞を使用するアポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）の分泌の阻害であり、ｉｎ ｖｉｖｏ試験である場合は超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の分泌についてのＭＴＰの阻害であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. 動態学的モニタリング試験をＭＴＰの活性の阻害の試験の後にまたは先に行うことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 動態学的モニタリング試験をアポＢの分泌の阻害の試験の後にまたは先に行うことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
6. 候補化合物の代謝物について実施する、ＭＴＰの阻害および／またはアポＢの分泌の阻害の１つまたは複数の試験を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
7. ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、次いでｉｎ ｖｉｖｏ活性の確認のために１つまたは複数の試験を行うことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
8. ＶＬＤＬの分泌の阻害の定性試験およびＶＬＤＬの分泌の阻害の動態の評価のための試験から選択される少なくとも１つのｉｎ ｖｉｖｏ確認試験を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
9. ａ）試験Ｂおよび／または試験Ｃにおける候補化合物を使用し、次いで前記試験Ｂおよび／または前記試験Ｃに陽性反応を示す候補を事前選択するステップと、
   ｂ）ステップａ）から得られる候補化合物を試験Ａ、有利には試験Ａ_vitroにおいて使用し、前記試験Ａに陽性反応を示す候補を選択するステップと、
   ｃ）ステップｂ）で選択される候補化合物を試験Ｄおよび／または試験Ｅによる前記候補の代謝物の分析によって任意選択で追加的に選択するステップと、
   ｄ）ステップａ）、ｂ）およびｃ）において選択される候補化合物を、少なくとも１つのｉｎ ｖｉｖｏ確認試験Ｆおよび／またはＡ_vivoにおいて使用し、次いで試験Ｆおよび／または試験Ａ_vivoに陽性反応を示す候補を選択するステップと、
   ｅ）血液中におけるトリグリセリド類の減少の制御のｉｎ ｖｉｖｏ試験Ｈを使用して選択することによって前記ステップにおいて選択される候補を確認するステップと、
   を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
10. 候補化合物によるＭＴＰの阻害に関連するパラメーターの動態を決定するための少なくとも１つの試験Ａ_vitro、試験Ａ_vivoまたはこれらの組合せを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のスクリーニング方法の使用。
11. 請求項１から９のいずれか一項に記載のスクリーニング方法によって薬学的に重要な化合物を選択するステップと、この化合物と薬学的に許容されるビヒクルまたは賦形剤とを混合するステップを含む、医薬組成物の調製方法。
12. メタボリック症候群および糖尿病に伴う高トリグリセリド血症、高コレステロール血症および脂質代謝異常などの脂質の調節障害ならびに膵炎の治療用、さらには肥満の予防および治療用の薬剤の調製のための、請求項１１に記載の方法。
13. 請求項１から９のいずれか一項に記載のスクリーニング方法を使用してミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）を阻害する活性物質を選択するためのスクリーニングキット。

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