JP2008537499A - 細胞及び薬物送達用の光架橋性オリゴ(ポリ(エチレングリコール)フマレート)ヒドロゲル - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2005年3月23日に出願された米国仮特許出願第60/664,540号からの優先権を主張する。
この研究は、認可番号R01−AR45871及びR01−EB003060により国立衛生研究所により支援された。
1.発明の分野
本発明は、UV光及び光開始剤によるOPFマクロマーの光重合から作製される光架橋性の注入可能な生分解性オリゴ(ポリ(エチレングリコール)フマレート)(OPF)ヒドロゲルに関する。様々な機械特性及び含水量を有するヒドロゲルは、前駆体溶液中のマクロマー及び架橋剤の濃度の変化により作製することができる。生分解性OPFヒドロゲルは、任意の形状の身体的欠損部へ流体として注入することができ、様々な治療剤(例えば、細胞及び/又は成長因子)を組み込ませてもよく、低侵襲的関節鏡視下技法(minimally invasive arthroscopic techniques)により移植されてもよい。
成長因子のような生理活性分子の制御放出は、それが罹患部位での細胞機能の調節及び組織形成を可能にするため、組織工学の重要な一面となっている。生分解性材料内の薬物、タンパク質及び他の生理活性分子の封入は、含有される物質の放出プロファイルを制御するのに有効な方法である。
本発明は、オリゴ(ポリ(エチレングリコール)フマレート)(OPF)マクロマーから開発された生分解性ヒドロゲルを提供する。OPFヒドロゲルの重要な特徴は、それらが低出力のUV光及び細胞適合性光開始剤を使用して室温で数分で架橋することである。N−ビニルピロリジノン(NVP)は、コモノマーとして且つ光架橋促進剤として使用され得る。これらのヒドロゲルは、水性環境中で高度の膨潤を有し、95%を超える含水量でそれらの構造完全性を維持することができる。したがって、これらのヒドロゲルは、細胞封入に適用して、数ミリメートル厚である構築物において細胞生存率を支持することができる。これは、栄養分及び廃棄物の交換が、水中でこの程度の距離にわたって行われ得るためである。さらに、合成マトリックス特性(例えば、架橋密度、含水量、弾性率及び表面張力)は、その最終用途に適合するように調整することができる。
一実施態様では、本発明は、ヒドロゲルを形成するのに使用され得る光架橋性の生分解性材料を提供する。一形態では、上記材料は、オリゴ(ポリ(エチレングリコール)フマレート)、不飽和ピロリジノンモノマー及び光架橋用の光開始剤を含む。上記材料は好ましくは、光の適用による患者の身体におけるin situでの架橋のために注入可能である。1つ又は複数の生理活性剤が上記材料中に含まれてもよい。一例では、軟骨形成細胞及び骨形成原細胞から成る群から選択される細胞が、軟骨成長及び/又は骨成長用途用に上記材料中に含まれる。上記材料は、多孔質スカフォールドの形成用のポロゲン(例えば、塩化ナトリウム粒子)を含んでもよい。別の形態では、光架橋性の生分解性材料は、オリゴ(ポリ(エチレングリコール)フマレート)、軟骨形成細胞及び骨形成原細胞から成る群から選択される細胞、並びに光開始剤を含む。本発明はまた、組織再生方法を提供し、ここで上記材料は患者の体内へ注入され、そして上記材料は光源によって光架橋されて、組織再生を可能にするためのスカフォールドを形成する。
オリゴ(ポリ(エチレングリコール)フマレート)(OPF)は、Jo他著「官能基化されたポリマーネットワークの調製のためのGRGDペプチドによるオリゴ(ポリ(エチレングリコール)フマレート)マクロマーの修飾」(Biomacromolecules 2001;2(1):255-61)で公表される方法に従って、10kDaの初期分子量を有するポリエチレングリコール(PEG)(Aldrichから入手可能)を使用して合成した。図1Aも参照されたい。簡潔に述べると、PEG 50gをトルエン中で共沸蒸留させて、残留水を除去した後、蒸留塩化メチレン500ミリリットル中に溶解した。得られたPEGを氷浴に入れて、窒素で10分間パージして、続いてPEG1モル当たりトリエチルアミン(TEA、Aldrich)0.9モル、及びPEG1モル当たり蒸留塩化フマリル(Acros)1.8モルを滴下した。反応は、窒素環境下で維持した。続いて、反応容器を氷浴から取り出して、室温で48時間攪拌した。精製のために、ロータリーエバポレータにより塩化メチレンを除去した。得られたOPFを酢酸エチル中に溶解して、濾過して、TEAと塩化物との反応由来の塩を除去した。OPFは、酢酸エチル中で再結晶させて、一晩かけて真空乾燥した。
OPFマクロマー及び合成に使用されるPEGの分子量は、モデル515HPLCポンプ及びモデル2410屈折率検出器に接続したWaters 717 PlusオートサンプラーGPCシステムにより測定した。テトラヒドロフラン中に溶解した後、20mg/mlの濃度のポリマー溶液20μlを、1ml/分の流速で、styragel HR 4Eカラム(7.8×300mm、Waters)と直列に存在するstyragel HTガードカラム(7.8×300mm、Waters)から成るカラムへ注入した。0.474、6.69、18.6及び38KDaのMn並びに1.1未満の多分散を有する単分散ポリスチレン標準物質(Polysciences,Warrington,PA)を較正曲線に使用した。各材料の3つのサンプルを分析した。
ヒドロゲルは、0.05%(w/w)Irgacure(登録商標)2959ラジカル光開始剤(Ciba-Specialty Chemicalsから入手可能)及び種々の濃度でのコモノマーとしての且つ光架橋促進剤としてのN−ビニルピロリジノン(NVP)を含有する脱イオン水中に、最終濃度33%及び25%(w/w)でOPFマクロマーを溶解させることにより作製された(表1を参照)。Irgacure(登録商標)2959の製品シートには、Irgacure(登録商標)2959は、1−[4−(2−ヒドロキシエトキシ)フェニル]−2−ヒドロキシ−2−メチル−1−プロパン−1−オンであるとして、また下記構造を有するものとして記載されている:
架橋されたOPFヒドロゲルは、FT−IR及びNMRを使用して特性評価を行った。架橋されたOPFフィルムのFT−IRは、減圧下での乾燥後、及び蒸留水中での平衡膨潤後にNicolet 550分光計により取得した。OPFマクロマーの13C核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、TMSを含有するCDCl3溶液を使用してVarian Mercury Plus分光計(13C=100.6Hz)で取得した。光架橋されたヒドロゲルの固相13CNMRスペクトルは、サンプルを乾燥させた後にVarian Inova分光計(600MHZ)を使用して得られた。
1.圧縮試験
架橋後、ヒドロゲルを、穿孔器で直径10mmの円板へ切断して、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で24時間膨潤させた。様々な膨潤ヒドロゲルの圧縮弾性率は、4N/分の速度で動的機械的分析機(DMA−2980、TA Instruments)を使用して測定した。弾性率は、低歪(20%未満)での応力対歪曲線の傾きとして求められた。
OPFヒドロゲルの10ミリリットル円板を上述するように調製して、PBS中で37℃で平衡膨潤へ膨潤させた(24時間)。図6を参照されたい。
ヒドロゲルの円板を、PBS 2.5ミリリットルを含有する12ウェル組織培養プレートのウェルに入れて、オービタルシェーカー上で37℃でインキュベートした。PBSは、第1週目は1日おきに、それ以降は週に一度取り替えた。ヒドロゲルの膨潤比は、上述したように7日目、14日目及び21日目に測定した。
クローンマウス軟骨形成細胞系であるATDC細胞(RIKEN Cell Bank,Tsukuba,Ibaraki,Japan)を、5%ウシ胎児血清(Invitrogen)、10μg/mlヒトトランスフェリン(Roche)及び3×10-8M亜セレン酸ナトリウム(sodium selnite)(Sigma)を補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Gibco BRL,Rockville,NY,USA)並びにハムF12培地(Nissui Pharmaceutical,Japan)の1:1の混合物中で標準的な培養フラスコで集密になるまで成長させた。細胞は、5%CO2の加湿雰囲気中で維持した。培養培地は、2日毎に取り替えた。続いて、細胞をトリプシン処理して、接着実験で使用した。
細胞送達に関するヒドロゲルの適切性を確定するために、ラット骨髄間質細胞及びマウス軟骨細胞(ATDC−5)をゲルへ封入して、それらの生存率を試験した。ATDC細胞を、33wt%マクロマーから製造されるN5及びN10ヒドロゲル内に播種して、培養液中で0日目、1日目、3日目、7日目及び21日目に試験して、細胞が重合プロセスを生き延びて、これらの材料における培養中に依然として生存可能であるか否かを判定した。生存細胞(95%を超える)は、21日の培養期間中の全ての時点でヒドロゲル全体にわたって観察された(図10)。さらに、生存率における差は、培養期間中のいずれの時点においてもヒドロゲルスカフォールドの厚さにわたって観察されなかった。図10を参照されたい(ここでは、生細胞は緑色に染色された(これは、図10における明るい領域として現れている))。
多孔質ヒドロゲルは、失われた機能の臓器に取って代わるために大量の細胞を体内に移植するための適正な構造及び表面積を提供する。骨髄間質細胞(MSC)(骨成長細胞)は、骨欠損部を充填するため、又は新たな骨全体を調製するために本発明で使用することができる。多孔質OPFヒドロゲルは、所望の形状及びサイズへ切断して、且つカテーテルにより骨欠損部へ送達させることができ、当該欠損部中で適切に位置付けられると再膨張する。必要であれば、接着剤を使用して、骨欠損部内でスポンジを骨へ接着させることができる。その後、MSCはコラーゲン中に懸濁されて、スポンジへ注入される。続いて、コラーゲンは凝固して、細胞を維持し、続いて骨組織に成長して、骨欠損部を充填する。
多孔質ヒドロゲル(スポンジ)は、ポロゲンとしてNaClを使用して作製した。簡潔に述べると、OPFマクロマーを、0.05%(w/w)の光開始剤(Irgacure2959、Ciba-Specialty Chemicals)及び0.33%(w/w) N−ビニルピロリジノン(NVP)を含有する脱イオン水中に最終濃度33%(w/w)へ希釈した。多孔率75%、80%及び85%を有するヒドロゲルを得るために、マクロマー溶液1ミリリットルを、それぞれ塩化ナトリウム粒子(直径100〜500μm)の3グラム、4グラム及び5.7グラムと混合して、10分間、およそ8mW/cm2の強度で365nmのUV光(Blak−Ray)を使用して重合させた。塩は、ポリマーをdH2O中に48時間、3回交換しながら浸漬させて、光架橋されたポリマーから浸出させた。
図12aは、75%のポロゲン率を有する多孔質ヒドロゲルのSEM画像を示す。この写真は、孔が高度に相互接続されていることを明らかにする。図12b及び図12cは、代表的なmicro−MR横断面及びこのスカフォールドのその膨潤状態での対応する孔−固体描写を示す。MR画像解析により、孔が高度に相互接続されていること、及び画像から算出される多孔率は、実験的ポロゲン濃度と良好に相関することが示された。
MSCは、既に記載されている方法に従って雄スプラーグ・ドーリーラットの大腿骨及び脛骨から単離した。(Maniatopoulos他著「若年成体ラットの骨髄から得られる間質細胞によるin vitroでの骨形成(Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats)」(Cell Tissue Res.1988;254:317-330)を参照)。細胞播種に先立って、サンプルを70%エタノールで30分間消毒した。続いて、エタノールを吸引して、サンプルを滅菌PBS中で1時間、3回交換しながら浸漬させた後、培地をさらに2回交換して、一晩かけてインキュベートした。225000個の細胞を含有する細胞懸濁液の25μサンプルを、24ウェルプレートにおいてヒドロゲルフォームの最上部上へ播種して、3時間インキュベートして、細胞を付着させた。続いて、骨形成原培地1ミリリットルを各ウェルへ添加して、培地は、2〜3日毎に交換した。1日目、4日目及び14日目に、サンプルをPBSで3回洗浄して、dH2O 1ミリリットル中で−80℃にて凍結させた。サンプルには、分析に先立って各サイクル後に30分間の氷上での超音波処理を伴う2回の凍結/解凍サイクルを受けさせた。細胞数は、製造業者の指示書に従ってPicoGreen DNAキット(Molecular probes,Eugene,OR)により決定された。
OPFヒドロゲルは、材料及び方法で既に記載されているように架橋させた。架橋後、ヒドロゲルを直径10mmの円板へ切断して、70%エタノールで消毒した後、滅菌PBSで3回洗浄した。消毒後、ヒドロゲル円板を骨髄間質細胞(MSC)培地中に入れて、48時間インキュベートした。OPFヒドロゲルからの浸出可能な生成物を抽出するのに使用される培地の容量は、ISO/EN10935ガイドラインに従って決定した(例えば、培地1ml/検体3cm2)。既に記載されているように、同時に、MSCを96ウェルプレートに播種して、20000個の細胞/cm2を24時間培養した。24時間浸出させた後、OPF抽出培地を10%の希釈及び100%で使用して、付着されたMSCを全ての抽出濃度へ暴露させた。細胞生存率(代謝活性)は、製造業者のガイドライン(Promega)に従ったMTSアッセイを使用して分析した。各処理の相対的な生存は、490nmの波長での各サンプルの吸光度を対照の吸光度で除算したものとして算出した。
最終濃度33%(w/w)を有するOPFマクロマーを、既に記載されるように0.05%(w/w)Irgacure 2959(Ciba-Specialty Chemicals)及び種々の濃度のNVPを含有するPBS中に溶解した(表1を参照)。この溶液を15×106個の細胞MSC/mlと混合して、1mmスペーサを有する滅菌スライドガラス間へピペットで取り、10分間、およそ8mW/cm2の強度で365nmのUV光(Blak−Rayモデル100AP)を使用して重合させた。得られたヒドロゲル−細胞構築物(直径5ミリメートル及び厚さ1mm)を、MSC培地2.5mlを有する12ウェル組織培養プレートに入れて、5%CO2を有する湿潤環境中でインキュベートした。構築物を1日後、7日後及び21日後に収集して、封入された細胞の生存率を、生/死・生存率/細胞毒性キット(Molecular Probes,L3224)を使用して求めた。
in vivoでの軟骨組織再生を導くために、細胞スカフォールドは、再生位置に必要とされる初期機械特性及び化学特性を提供するように設計されなくてはならないが、同時に組織堆積用に経時的に増大する空間を付与しなければならない。本研究では、本発明者らは、架橋されたOPFヒドロゲルの機械特性及び化学特性を操作することにより両方の設計要件を果たすことを目指した。特に分解速度の関数としてのこれらのOPFネットワークの構造的特徴は、組織生成を支持するよう意図された。本発明者らの結果は、溶液中のマクロマー及びNVP架橋剤のパーセントを変更させることにより、ゲル特性を有意に変更させることができることを示した。図5及び図7に見られるように、より低い架橋密度を有するヒドロゲルに関してより大きな膨潤比が得られたのに対して、弾性率は、架橋密度の減少に伴って減少した。本発明者らはまた、ヒドロゲル分解速度が架橋レベルと相関することを実証した。図8で示されるN5及びN10サンプルのゾル分率並びに平衡膨潤は、14日後に増大した。平衡膨潤のこの増大は、フマレートエステル結合の加水分解に起因する架橋密度の減少に起因するようである。この加水分解は、細胞外マトリックス(ECM)分泌のための開いた空間を創出することができる。ヒドロゲル分解速度の調節は、新たな組織再生速度に適合させる機会を提供し、残存スカフォールドの機械特性を維持しながら組織内部成長のための適切な空間を可能にする。
Claims (30)
- オリゴ(ポリ(エチレングリコール)フマレート)と、
不飽和ピロリジノンモノマーと、
光開始剤と
を含む、光架橋性の生分解性材料。 - 前記モノマーがN−ビニルピロリジノンである、請求項1記載の光架橋性の生分解性材料。
- 注入可能である、請求項1記載の光架橋性の生分解性材料。
- 1つ又は複数の生理活性剤をさらに含む、請求項1記載の光架橋性の生分解性材料。
- 軟骨形成細胞及び骨形成原細胞から成る群から選択される細胞をさらに含む、請求項1記載の光架橋性の生分解性材料。
- ポロゲンをさらに含む、請求項1記載の光架橋性の生分解性材料。
- 前記光開始剤が細胞適合性である、請求項1記載の光架橋性の生分解性材料。
- 30℃〜45℃の温度範囲で光架橋する、請求項1記載の光架橋性の生分解性材料。
- 前記材料におけるオリゴ(ポリ(エチレングリコール)フマレート)対ピロリジノンモノマーの重量比が1:0.01〜1:0.5の範囲である、請求項1記載の光架橋性の生分解性材料。
- 前記オリゴ(ポリ(エチレングリコール)フマレート)20重量%〜40重量%を含む、請求項1記載の光架橋性の生分解性材料。
- オリゴ(ポリ(エチレングリコール)フマレート)と、
軟骨形成細胞及び骨形成原細胞から成る群から選択される細胞と、
光開始剤と
を含む、光架橋性の生分解性材料。 - オリゴ(ポリ(エチレングリコール)フマレート)及び不飽和ピロリジノンモノマーを光架橋することにより調製される生分解性ヒドロゲル。
- 95重量パーセント以上の水を含む、請求項12記載の生分解性ヒドロゲル。
- 1つ又は複数の生理活性剤を含む、請求項12記載の生分解性ヒドロゲル。
- 水溶液中で光架橋される、請求項12記載の生分解性ヒドロゲル。
- 光架橋前のオリゴ(ポリ(エチレングリコール)フマレート)対ピロリジノンモノマーの重量比が1:0.01〜1:0.5の範囲である、請求項12記載の生分解性ヒドロゲル。
- オリゴ(ポリ(エチレングリコール)フマレート)を光架橋することにより調製されるヒドロゲルを含む生分解性マトリックスと、
軟骨形成細胞及び骨形成原細胞から成る群から選択される細胞と
を含む、組織再生用スカフォールド。 - 前記ヒドロゲルが、オリゴ(ポリ(エチレングリコール)フマレート)及び不飽和ピロリジノンモノマーを光架橋することにより調製される、請求項17記載の組織再生用スカフォールド。
- 前記細胞が前記マトリックス中に封入される、請求項17記載の組織再生用スカフォールド。
- 前記細胞が前記マトリックスの表面に付着される、請求項17記載の組織再生用スカフォールド。
- 前記細胞が球状形態を有する、請求項20記載の組織再生用スカフォールド。
- 前記細胞が平板状形態を有する、請求項20記載の組織再生用スカフォールド。
- 多孔質である、請求項17記載の組織再生用スカフォールド。
- 前記ヒドロゲルが、ポロゲンの存在下でオリゴ(ポリ(エチレングリコール)フマレート)を光架橋することにより調製される、請求項23記載の組織再生用スカフォールド。
- 多孔率70%〜90%を有する、請求項23記載の組織再生用スカフォールド。
- 前記細胞が軟骨形成細胞である、請求項17記載の組織再生用スカフォールド。
- 前記細胞が骨形成原細胞である、請求項17記載の組織再生用スカフォールド。
- 前記細胞がコラーゲン又はコラーゲン誘導体中に懸濁される、請求項17記載の組織再生用スカフォールド。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の材料を、患者の体内へ注入すること、及び
前記材料を光架橋すること
を含む、組織再生方法。 - 請求項17〜28のいずれか1項に記載のスカフォールドを、患者の体内へ移植すること
を含む、組織再生方法。
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