JP2008522619A5

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Publication number: JP2008522619A5
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Filing date: 2005-12-06
Publication date: 2008-11-13

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[0086] 非特異的Ｔ４Ｄａｍ−ＤＮＡ−ＡｄｏＨｃｙ複合体の構造：ＡｄｏＨｃｙおよび合成１２塩基対ＤＮＡ（ＡＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＴ（配列番号２））（Ｔ４Ｄａｍの最小基質）の両方を有するＴ４Ｄａｍの３要素複合体を結晶化した（ＨａｔｔｍａｎａｎｄＭａｌｙｇｉｎ、２００４）。結晶において、ＤＮＡ２本鎖は逆向きに重なり、疑似連続ＤＮＡ２本鎖を形成する。図３Ａ。驚くべきことに、配列特異的Ｔ４ＤａｍはＧＡＴＣ部位には結合しない。図３Ａ〜Ｃ。むしろ、それは、合成２本鎖当たり２個のＤａｍ単量体を含有するＤＮＡに、非特異的な「緩い」様式で結合する。図３Ａ〜Ｂ。

[0088] 半特異的複合体の構造：ＡｄｅおよびＴｈｙが結合部で塩基対になるように、平滑末端ＧＡＴＣ含有１２塩基ＤＮＡに加えて、１本の鎖（ＡＣＣＡＴＧＡＴＣＴＧＡＣ（配列番号３））に５’オーバーハングＡｄｅを有し、他方の鎖（ＴＧＴＣＡＧＡＴＣＡＴＧＧ（配列番号４））に５’−オーバーハングＴｈｙを有する１３塩基特異的ＤＮＡを使用した。２個のＤＮＡ分子のらせん軸が互いに約１２Åずれていること以外は、非特異的結合と同様に、２個のＤａｍ分子は１個のＤＮＡ２本鎖に結合する（図４Ａ）。Ｔ４ＤａｍはＤＮＡ結合部に結合し、３位のＧ：Ｃ塩基対でＲ１１６を介してＧｕａと水素結合相互作用を形成する（図４Ｂ〜Ｃ）。驚くべきことに、次の２位のＧ：Ｃ対および１位のオーバーハングＡｄｅは（ＤＮＡの溶解を通じて）開かれている（図４Ｂ）。隣のＤＮＡ分子のオーバーハングＴｈｙが接近し、らせんからはみ出て、Ｇ：Ｃ対のＣｙｔと重なり、他方、Ｆ１１１のフェニル環は別の側に重なる（図４Ｂ）。Ｔｈｙのメチル基は、Ｐ１２６とのファンデルワールス力で接触し、他方、Ｏ４原子はＭ１１４と接触する（図４Ｃ）。相互作用に関与する残基（Ｒ１１６、Ｆ１１１、Ｐ１２６およびＭ１１４）は、ＧＡＴＣＭＴアーゼのファミリーで高度に保存されたアミノ酸である（図２Ｃ参照）。特定の理論に結びつけることは望まないが、この分子は認識配列の一部を結合部の配列に模倣させていると考えられる。

[0089] 半特異的接触および特異的接触の両方を含む３要素複合体の構造：１２塩基および１３塩基に加えて、認識配列の一部を模倣している末端配列を有する１５塩基オリゴ（ＴＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧ（配列番号５））を構築した。さらに、ＤＮＡに対するタンパク質の割合も減少させた。以下のことが観察された。（１）隣接したＤＮＡ分子の間の結合部はいずれもＤａｍ分子（図５Ａの分子Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）によって占有される。２個のＤＮＡ分子の重なりはＦ１１１を介して媒介され、Ｆ１１１は、２個の隣接するＤＮＡ分子の５’Ｔｈｙ塩基と重なる（図５Ｂ）。（２）より特異的な相互作用はオリゴヌクレオチドの結合部に認められ、Ｒ１１６、Ｐ１２６およびＭ１１４は半分の部位と相互作用し、Ｓ１１２およびＲ１３０はもう半分の部位と相互作用する（図５Ｃ）。（３）ＤＮＡに対するタンパク質の比が減少するので、分子１個のみ（図５Ａの分子Ｆ）がオリゴの中央の特異的ＧＡＴＣ部位に結合し、２本鎖ＤＮＡからフリッピングした標的Ａｄｅと特異的に相互作用する（示さず）。表２および３に、様々なＴ４Ｄａｍ−ＤＮＡ−ＡｄｏＨｃｙ結晶の特性の概要を示す。

[00120] 部位特異的変異誘発は、文献（ＪｅｌｔｓｃｈａｎｄＬａｎｉｏ、２００２）に記載のように実施した。ＥｃｏＤａｍ野生型およびその変異体は、文献（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）に記載のように精製した。ＤＮＡ結合は、ＢｉａＣｏｒｅＸ装置で表面プラズモン共鳴を使用して、文献（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）に記載のように分析した。オリゴヌクレオチド基質（精製型をＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙから購入）のメチル化は、文献（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）に記載のように実施した。メチル化実験は、［メチル−^３Ｈ］ＡｄｏＭｅｔ（ＮＥＮ）０．７６μｍを含有するＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）５０ｍＭ、ＮａＣｌ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、ＤＴＴ０．５ｍＭ、ＢＳＡ０．２μｇ／μｌ中、３７℃で、文献（ＲｏｔｈａｎｄＪｅｌｔｓｃｈ、２０００）に記載のように行い、特異性分析のためにオリゴヌクレオチド基質０．５μＭおよび酵素０．６μＭを用いて（図１５Ｂ〜Ｃ）、また、ヘミメチル化ＤＮＡとの相互作用の研究のために酵素０．２５μＭを用いて（図１８）、シングルターンオーバー条件下で実施した。２０塩基オリゴヌクレオチド基質の配列は、ＭがＮ６−メチル−Ａｄｅである５’−ＧＣＧＡＣＡＧＴＧＡＴＣＧＧＣＣＴＧＴＣ−３’（配列番号６）および５’−ＧＡＣＡＧＧＣＣＧＭＴＣＡＣＴＧＴＣＧＣ−３’（配列番号７）の２本鎖であった。さらに、第１、第３また第４の位置のＧＡＴＣとは１塩基対異なる、ニアコグネイト部位を備えた９種の基質を使用した。様々な変異体による標的配列の第１の位置の認識を比較するために、特異性因子は、その他の位置で改変された全てのニアコグネイト部位のメチル化速度と第１の位置で改変された基質のメチル化速度との比、すなわち、
[00121]
と定義した。

[00124] 大腸菌Ｄａｍ結晶を生成することは困難で、特にＤＮＡ無しでは困難である。うまく結晶化したＴ４Ｄａｍから得られた知識を利用して、以下の特性、（１）結晶充填格子におけるＤＮＡ媒介タンパク質−タンパク質接触を最大化するのに最適な長さ、および（２）２個のＤＮＡ２本鎖が逆向きに重なる場合にＧＡＴＣ部位を模倣するオリゴヌクレオチドの２個の末端配列を有するオリゴヌクレオチドを設計した。したがって、１２塩基ＤＮＡ５’−ＴＣＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡ−３’（配列番号８）を使用する。さらに、隣接するＤＮＡ２本鎖の間の結合部全てと、中央ＧＡＴＣ部位とがＤａｍ分子によって占められるように、タンパク質対ＤＮＡ比（＞２：１）を変化させる。これらの特性によって、ＤＮＡおよびＡｄｏＨｃｙと複合体になったＥｃｏＤａｍをうまく結晶化させた。この結晶は、高い分解能でＸ線を回折した。特に、ａ＝４４．８Å、ｂ＝７０．２Å、ｃ＝９６．５Åの単位セルを有する斜方晶形態（空間群Ｐ２_１２_１２_１）は、ＰＥＧ４００５〜１５％、ＫＣｌ１００ｍＭ、ＭｇＳＯ_４１０ｍＭおよび緩衝液（ＭＥＳまたはＨＥＰＥＳ）１００ｍＭｐＨ６．６〜７．４で成長した。分解能１．８９Åまで回折したデータセットを表５に示す。この構造を、初期検索モデルとしてＴ４Ｄａｍを使用して分子置換法によって解析し、このモデルをＲ因子０．１８６およびＲ−ｆｒｅｅ０．２１５まで精密に調べた（図１３）。

[00126] ＥｃｏＤａｍの全体構造：２個のＥｃｏＤａｍモノマー（分子ＡおよびＢ）および１個のＤＮＡ２本鎖は、結晶学的に対称な単位に含まれる。ＥｃｏＤｍａ分子Ａは、主として１個のＤＮＡ２本鎖に結合し、他方、ＥｃｏＤａｍ分子Ｂは、２個のＤＮＡ２本鎖の間の結合部に結合する（図１４Ｂ）。Ｔ４Ｄａｍ（Ｙａｎｇ他、２００３）のようなＥｃｏＤａｍは、２個のドメイン、すなわち、ＡｄｏＨｃｙの結合部位を有する７本鎖触媒ドメイン、および５個のヘリックス束およびＧＡＴＣ関連ＭＴアーゼオルソログのファミリーに保存されている（残基１１８〜１３９、図１４Ｂおよび１４Ｃの赤）β−ヘアピンループから成るＤＮＡ結合ドメイン、を含有する（Ｙａｎｇ他、２００３）。２個のタンパク質分子は、Ｃα原子の２４１対と比較して非常に類似しており、標準偏差は０．０７Åである。２個の領域、すなわち、活性部位Ｄ１８１−Ｐ−Ｐ−Ｙ１８４モチーフ（配列番号１）直後（β４鎖の後）の残基１８８〜１９７、およびβ６とβ７鎖の間の残基２４７〜２５９、が両分子中で不規則になっている（図１４Ｃおよび１４Ｄ）。

[00132] 標的Ａｄｅと塩基フリッピングとの相互作用：合成オリゴデオキシヌクレオチド２本鎖へのヌクレオチドアナログ２−アミノプリン（２ＡＰ）の組み込みは、２ＡＰ蛍光が、２重らせんＤＮＡの重なった環境から除去されると劇的に増加する（Ｗａｒｄ他、１９６９）ことから、塩基フリッピングなどの立体構造変化を詳しく調べるために広く使用されている（Ａｌｌａｎ他、１９９８、ＡｌｌａｎａｎｄＲｅｉｃｈ、１９９６、Ｈｏｌｚ他、１９９８、Ｓｔｉｖｅｒｓ、１９９８）。標的Ａｄｅの位置に２ＡＰを有するヘミメチル化Ｇ−２ＡＰ−ＴＣ基質の蛍光変化は、ＥｃｏＤａｍによる塩基フリッピングと関連していた（Ｌｉｅｂｅｒｔ他、２００４）。ＥｃｏＤａｍによる塩基フリッピングには、（ｉ）ＤＮＡらせんの外に標的塩基がフリッピングするステップ、および（ｉｉ）フリッピングした塩基が、（Ｄ１８１−Ｐ−Ｐ−Ｙ１８４モチーフ（配列番号１）によって形成された）酵素の活性部位ポケットに結合するステップ、の２つのステップが含まれる。標的塩基のフリッピングによって、蛍光の強い増加を引き起こす、隣接塩基とＡｄｅとの重なり相互作用の完全な消失がもたらされる。フリッピングした塩基が活性部位ポケットに結合する間に、芳香族残基に重なり、それによってこの捕捉ステップの間に２ＡＰ蛍光の減少が引き起こされる（Ｌｉｅｂｅｒｔ他、２００４）。ヘミメチル化Ｇ−２ＡＰ−ＴＣ基質による迅速な反応速度論的測定によって、ＡｄｏＭｅｔの存在下では、ＥｃｏＤａｍによる塩基フリッピングは２相性のプロセスであることが示された（図１７Ｃ）。最初のフリッピングは非常に速かったが、フリッピングした塩基の活性部位ポケットへの挿入は遅かった。しかし、補酵素ＡｄｏＭｅｔの非存在下、またはＡｄｏＨＣｙの存在下では、ゆっくりした蛍光減少は認められなかった。このことは、フリッピングした標的塩基の活性部位ポケットへの結合は、ＡｄｏＭｅｔがこの酵素に結合しなければ起こらないことを示唆している（Ｌｉｅｂｅｒｔ他、２００４）。

ＤａｍによるＤＮＡアデニンメチル化を示す図である。Ｄａｍは、ＧＡＴＣ配列のアデニン残基において、ＡｄｏＭｅｔからＮ６原子へのメチル基の転移を触媒する。Ｔ４Ｄａｍ−ＡｄｏＨｃｙ構造を示す図である。Ａ．ＡｄｏＨｃｙと複合体を形成しているＴ４Ｄａｍの２次構造をリボンで表した図である（ボールスティックモデル）。Ｂ．ヘアピンループは、ＤＮＡ（配列特異的および非特異的）相互作用に関連する保存された残基を有する。Ｃ．選択されたＤａｍＭＴアーゼオルソログのヘアピンループの配列アラインメント（上から順に配列番号２２〜２９）。Ｓｔｙ：サルモネラ・チフィムリウム、Ｓｍａ：セラチア・マルセッセンス、Ｙｐｅ：エルシニア・ペスティス、Ｖｃｈ：ビブリオ・コレラ。Ｔ４Ｄａｍ−ＡｄｏＨｃｙ−１２塩基ＤＮＡ構造を示す図である。Ｄａｍ複合体の１２塩基ＤＮＡへの非特異的結合の２つの直交投影図。Ａ．分子Ａは、１個のＤＮＡ分子に結合し、分子Ｂは２個のＤＮＡ分子の結合部に結合する。Ｂ．ＤＮＡのらせん軸の下視図である。Ｃ．分子Ｂのヘアピンループは、ＤＮＡ結合部の近くにあるが、ＤＮＡとは特異的な接触を行わない。Ｔ４Ｄａｍ−ＡｄｏＨｃｙ−１３塩基ＤＮＡの３次構造を示す図である。この構造は登録されている（ＰＤＢ１ＹＦ３）。Ａ．２個のＤＮＡ分子（右側に示す。らせん軸はページから突き出ている。）は、互いに相手のＤＮＡ軸に対して垂直にずれている。Ｂ．非特異的複合体（分子Ａ）および１／４−部位認識複合体（分子Ｂ）におけるタンパク質−ＤＮＡ接触の概略を示す図である（上側の配列はいずれも配列番号４に、下側の配列はいずれも配列番号３に示されている）。Ｃ．結合部に結合したＤａｍ（分子Ｂ）のヘアピンループのＦ１１１は５’Ｔｈｙに重なる（上側の配列はいずれも配列番号４に、下側の配列はいずれも配列番号３に示されている）。Ｄ．Ｒ１１６−Ｇｕａ、Ｐ１２６−ＴｈｙおよびＭ１１４−Ｔｈｙでは、特異的相互反応が認められる。Ｔ４Ｄａｍ−ＡｄｏＨｃｙ−１５塩基ＤＮＡの構造を示す図である。この構造は登録されている（ＰＤＢ１ＹＦＪ）。Ａ．２個のＤＮＡ２本鎖（いずれの配列も配列番号５に示されている。）の間の結合部は全て、ＣまたはＤとして示されたＤａｍ分子によって占有され、他方、１個の特異的ＧＡＴＣ部位のみが分子Ｅと結合する。Ｂ．Ｄａｍ分子ＣのヘアピンループのＦ１１１は、２個の５’Ｔｈｙに重なる。Ｃ．Ｒ１１６、Ｐ１２６、Ｍ１１４、Ｓ１１２、Ｇ１２８およびＲ１３０によって特異的相互作用が媒介される。Ｔ４ＤａｍＦ１１１の挿入を示す図である。（Ａ）分子Ｅと標準ＧＡＴＣ部位との間の相互作用。水色の破線の円は、フリッピングしたＡｄｅを示す。Ｔ４ＤａｍのＤＮＡへの挿入領域は、濃青色の破線の円で示し、右図に拡大して示す。分子ＥのＦ１１１はＡＴ塩基対とＴｈｙ：Ｓ１１２「塩基−アミノ酸」対の間に挿入する。（Ｂ）ＡｄｏＭｅｔ、ＡｄｏＨｃｙおよびシネフンギンの化学構造。（Ｃ）シネフンギン存在下での活性部位の立体構造（ＰＤＢコード１ＹＦＬ）。変化しないＮ末端残基Ｋ１１は、Ｄ１７１およびＹ１７４の側鎖ならびにＧ９の主鎖カルボニル酸素と相互作用し、同様のＤ１７１−Ｋ１１−Ｙ１７４相互作用は、Ｔ４Ｄａｍ−ＡｄｏＨｃｙの２次構造においても認められた（Ｙａｎｇ他、２００３）。Ｋ１１Ｓ置換により実質的に酵素活性が消失するので、このＤ１７１−Ｋ１１−Ｙ１７４相互作用は正常な機能に必須なようである（Ｖ．Ｇ、Ｋｏｓｓｙｋｈ、Ｓ．Ｌ．ＳｃｈｌａｇｍａｎａｎｄＳ．Ｈ．、未公表データ）。Ｋ１１のアミノ基はまた、標的Ａｄｅの環Ｎ１原子に隣接する。Ｍ．ＥｃｏＲＶの対応するＬｙｓの変異体（Ｋ１６Ｒ）は、標的塩基に対する特異性の改変を示した（ＲｏｔｈａｎｄＪｅｌｔｓｃｈ、２００１）。非標準部位との相互作用を示す図である。（Ａ）オレンジ色で示したＤＮＡ分子（いずれの配列も配列番号５に示されている。）の中央ＡＴ重なりへの分子ＥによるＦ１１１の挿入は、１塩基対の延長を効果的に引き起こす。この延長は、隣接する２本鎖（赤紫）の２個の不規則なヌクレオチド（影付き）を生じる。（Ｂ）分子Ｄと非標準部位との間の相互作用。赤紫ＤＮＡのオーバーハングした５’−Ｔｈｙが突出して、外見上不規則になり、次の塩基対のＣｙｔがＤａｍ分子ＤのＦ１１１と重なることになる。（Ｃ）Ｒ１３０および外部Ｇ：Ｃ塩基対、並びにＳ１１２−Ｃｙｔの詳細な相互作用。ＥｃｏＤａｍ変異体の生化学分析を示す図である。（Ａ）特定の複合体におけるタンパク質−ＤＮＡ塩基接触の概略およびＴ４Ｄａｍ（Ｇ１１０−Ｔ１３１、認識配列ＧＡＴＣ）（配列番号２２）、ＥｃｏＤａｍ（Ｇ１１８−Ｋ１３９、認識配列ＧＡＴＣ）（配列番号２３）およびＥｃｏＲＶ（Ｃ１２２−Ｐ１４３、認識配列ＧＡＴＡＴＣ）（配列番号２４）のβヘアピンループの配列アラインメント。フリッピングした標的塩基は影付きＸで示す。ＥｃｏＤａｍに生じた点突然変異を示す（残基の番号の違いに注意）。Ｔ４Ｄａｍのｉｎｖｉｖｏにおける通常の基質は、Ｃｙｔの代わりにグリコシル化５−ヒドロキシメチル−Ｃｙｔ（ｈｍＣｙｔ）を有するファージＤＮＡであることに注意されたい。ファージｈｍＣｙｔ含有ＤＮＡ（グリコシル化があってもなくてもよい。）は、ＥｃｏＤａｍによってメチル化されない（Ｈａｔｔｍａｎ、１９７０）。本明細書に示した構造から明らかなように、回文構造のＧＡＴＣ部位においてＣｙｔ塩基（Ｃｙｔ１またはＣｙｔ４）はいずれもＴ４Ｄａｍとは接触しない。特定の複合体では、タンパク質とこれらの塩基との間の最短距離は、Ｃｙｔ４からＶ１７８までの６．３Å、およびＣｙｔ１からＫ１２９までの７．７Åである。この点に関して、ＥｃｏＤａｍは両方の位置、すなわち、Ｖ１７８に隣接した６個の追加的残基およびＫ１２９に隣接した２個の追加的残基に挿入物を有する（Ｙａｎｇ他、２００３の図１参照）。ＥｃｏＤａｍのこれらの追加的残基は、いずれかのｈｍＣｙｔ塩基（または両方）のヒドロキシメチル基と立体的に衝突し、ＤＮＡのメチル化から酵素を防御することができる。野生型ＥｃｏＤａｍおよびその変異体のシングルターンオーバーＤＮＡメチル化速度（Ｂ）およびＤＮＡ結合親和性（Ｃ）。ＥｃｏＤａｍ変異体はクローニングされ、大腸菌で発現し、均一に精製された。ＥｃｏＤａｍの特異性プロファイルを示す図である。（Ａ〜Ｅ）野生型および変異体のシングルターンオーバーメチル化速度を、コグネイトＧＡＴＣ（水色の棒）およびニアコグネイト基質９種全てについて示す。水平軸上には、変異したＧＡＴＣ部位の３個の位置を示す（Ｇ＝ＧＡＴＣ、Ｔ＝ＧＡＴＣ、Ｃ＝ＧＡＴＣ）。右の軸には、各位置に導入された新たな塩基を明記する（一例については図１２参照）。酵素および基質の各々の対のメチル化速度を垂直軸に示す。（Ａ）野生型、（Ｂ）Ｒ１２４Ａ、（Ｃ）Ｐ１３４Ａ、（Ｄ）Ｐ１３４Ｇおよび（Ｅ）Ｌ１２２Ａ。（Ｆ〜Ｈ）ＧＡＴＣ配列の４番目（Ｓ４）（Ｆ）および３番目（Ｓ３）の位置の認識に関するＥｃｏＤａｍ変異体の特異性因子および全特異性因子（Ｈ）。値は全て、野生型に対する相対的変化で示す。野生型ＥｃｏＤａｍの特異性因子は５４０であり、この値はＬ１２２Ａ変異体の場合少なくとも３０倍に増加した。Ｌ１２２Ａ変異体ではニアコグネイト部位で活性が検出されなかったので、ここに挙げた特異性因子が下限であり、矢印で示してある。Ｒ１２４Ａ、Ｐ１３４ＡおよびＰ１３４Ｇ変異体の特異性は劇的に減少した。その他の変異体全ての特異性因子は、野生型酵素と比較して大きな変動を示さなかった。ＤＮＡ軸に対するタンパク質ヘアピンループの向きによって示されたＴ４Ｄａｍ−ＤＮＡ複合体構造のスナップ写真を示す図である。（Ａ）リン酸接触に関与するＲ１３０との非特異的複合体。（Ｂ）リン酸接触に関与するＲ１１６との非特異的複合体。（Ｃ）塩基特異的接触に関与するＲ１１６、リン酸接触におけるＮ１１８およびＲ１３０との１／４部位複合体（上側の配列はいずれも配列番号４に、下側の配列はいずれも配列番号３に示されている）。（Ｄ）塩基特異的接触に関与するＲ１１６およびＲ１３０、リン酸接触におけるＮ１１８との３／４部位複合体（いずれの配列も配列番号５に示されている）。（Ｅ）非標準部位との相互作用、および（Ｆ）全部位複合体。（Ａ）３／４部位複合体、（Ｂ）非標準部位および（Ｃ）特異的全部位（配列番号３０）におけるタンパク質−ＤＮＡ接触の概略を示す図である。ＥｃｏＤａｍ変異体の特異性プロファイルを示す図である。ＷＴＥｃｏＤａｍおよびＹ１１９Ａ、Ｎ１２０ＡおよびＳ、Ｒ１３７Ａ、Ｙ１３８ＡおよびＫ１３９Ａ変異体の特異性プロファイルを示す。この図では、野生型および変異体のシングルターンオーバーメチル化速度を、コグネイトＧＡＴＣ（水色の棒）およびニアコグネイト基質９種全てについて示す。水平軸上には、変異したＧＡＴＣ部位の３個の位置を示す（Ｇ＝ＧＡＴＣ、Ｔ＝ＧＡＴＣ、Ｃ＝ＧＡＴＣ）。右の軸には、各位置に導入された新たな塩基を明記する。酵素および基質の各々の対のメチル化速度を垂直軸に示す。ＥｃｏＤａｍ−ＡｄｏＨｃｙ−１２塩基ＤＮＡの構造を示す図である。明確化のために、第２のＤＮＡ分子は示していない。（Ｂ）はＤＮＡ分子のらせん軸の下視図である。ＥｃｏＤａｍ−ＡｄｏＨｃｙ−１２塩基ＤＮＡの構造を示す図である。（Ａ）２個のＤＮＡ２本鎖（いずれの配列も配列番号８に示されている。）（太字のものおよび太字でないもの）は逆向きに重なり合い、１個のＧＡＴＣ部位は各２本鎖の中央にあり、もう１個は２個の２本鎖の結合部位にある。らせん外の位置のヌクレオチドは、青丸の中に影をつけてある。（Ｂ）分子Ａは、各ＤＮＡ２本鎖の中央のＧＡＴＣ部位に結合し、他方、ＥｃｏＤａｍ分子Ｂは２個のＤＮＡ２本鎖の結合部に結合する。（Ｃ）ＥｃｏＤａｍは２個のドメイン、すなわちＡｄｏＨｃｙの結合部位（スティックモデルで表す。）を備えた７本鎖触媒ドメイン、ならびに５本のヘリックスの束、およびＧＡＴＣ関連ＭＴアーゼオルソログのファミリーで保存されているβヘアピンループから成るＤＮＡ結合ドメインを含有する。青緑色のＮ末端残基７〜１０はまた、ＤＮＡと相互作用する（Ｅ参照）。（Ｄ）ＥｃｏＤａｍおよびＴ４Ｄａｍの比較。Ｔ４Ｄａｍでは、残基６個分短い活性部位ループが弁の閉じた（ｃｌｏｓｅｄ−ｆｌａｐ）補因子結合部位の形成に関与し（Ｙａｎｇ他、２００３）、他方、β６鎖とβ７鎖との間の残基は不規則であり（Ｙａｎｇ他、２００３）、結晶充填接触に関与するときにのみ規則正しくなる（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）。（Ｅ）分子Ａ（赤）および分子Ｂ（灰色）のタンパク質−ＤＮＡ接触の概要。相互作用を媒介する主鎖は、主鎖アミン（Ｎ）またはカルボニル（Ｏ）で示されている。簡単にするために、相互作用を媒介する水（ｗ）を１個のみ示す。１組のＤＮＡ２本鎖（青）（配列番号８）に注目すると、２２個のリン酸基のうち２０個は３個のＥｃｏＤａｍ分子（Ａ、Ｂ、および対称性を有する分子Ｂ）と相互作用する。したがって、最適な結晶化のために使用したオリゴヌクレオチドの選択された長さ（１２塩基対）および末端配列は、充填の結晶格子におけるＤＮＡ−タンパク質相互作用およびＤＮＡ媒介タンパク質−タンパク質相互作用を最大化した。ＥｃｏＤａｍ相互作用に関与しないリン酸基は２個だけであり、これは中央ＧＡＴＣ部位の２個のＴｈｙの５’リン酸であり、これらは結合部のＧＡＴＣ部位において失われたリン酸である。オーファンＴｈｙのすぐ側のリン酸基は、Ｓ１９８（高い熱Ｂ因子を有する）、すなわち構造化されていないループ（残基１８８〜１９７）の後ろの最初の規則正しい残基と全く相互作用しない（５’リン酸）か、または弱く相互作用する（３’リン酸）のみである。束縛の少ない立体構造によって、オーファン部位のＤＮＡ主鎖の周りの結合回転が可能であり、Ｔｈｙはらせん外の位置に移動し、Ｔｈｙ−Ｎ１２０相互作用を妨害する。ＥｃｏＤａｍ−ＤＮＡ塩基相互作用を示す図である。（Ａ）標的Ａｄｅは、ＤＰＰＹモチーフ（配列番号１）により形成された活性部位ポケットの外側の端で、選択的ヌクレオチド結合部位に結合している（左図）。この標的Ａｄｅは、平均を３．５σ上回る輪郭を描いた電子密度地図略図（塩基およびリボースを省く。）と重なる（中図）。ＤＮＡ主鎖の３個の結合の周りが大きく回転することによって、Ａｄｅは活性部位に挿入される（右図）。Ｍ．Ｔａｑｌ−ＤＮＡ複合体で示されたように（Ｇｏｅｄｅｃｋｅ他、２００１）、ＡｄｏＨｃｙの硫黄原子上に付けられた転移可能なメチル基は、Ａｄｅ塩基の平面の外に横たわり、標的窒素原子の脱共役孤立電子対と符合し、直線方向へのメチル基転移（矢印で示した。）のための位置を取る。（Ｂ）中央ＧＡＴＣ部位を有する青ＤＮＡ２本鎖の主溝中の分子Ａ（赤）のヘアピンループ。（Ｃ）ＧＡＴＣの第１塩基対（Ｇ：Ｃ）との相互作用。点線は水素結合を表す。（Ｄ）平均を３．５σ上回る輪郭を描いた電子密度地図略図と重なり、Ｒ１３７の側鎖と重なったフリッピングオーファンＴｈｙ。オーファン塩基の局所的立体構造変化はまた、Ｍ．ＨａｅＩＩＩ−ＤＮＡ（塩基修復）（Ｇｏｅｄｅｃｋｅ他、２００１、Ｒｅｉｎｉｓｃｈ他、１９９５）およびＭ．ＴａｑＩ−ＤＮＡ構造（らせんの中央への塩基移動）（Ｇｏｅｄｅｃｋｅ他、２００１、Ｒｅｉｎｉｓｃｈ他、１９９５）において認められた。２個の塩基フリッピングは、ＤＮＡ修復酵素エンドヌクレアーゼＩＶおよびそのＤＮＡ基質の構造（Ｈｏｓｆｉｅｌｄ他、１９９９）ならびに２ＡＰ−含有ＤＮＡを使用したＭｕｔＹアデニンＤＮＡグリコシラーゼによるストップトフロー蛍光研究（Ｂｅｒｎａｒｄｓ他、２００２）において既に認められている。しかし、ＭｕｔＹ−ＤＮＡ損傷含有複合体の構造において、ｏｘｏＧ損傷は完全にＤＮＡ複合体中にあり、他方、Ａｄｅはフリッピングした（Ｆｒｏｍｍｅ他、２００４）。これらのことを考えると、これらの研究は、ＥｃｏＤａｍに結合したオーファンＴｈｙのように、ｏｘｏＧはらせん内部またはらせん外部のいずれかに位置することができることを示唆している。（Ｅ）ＧＡＴＣの第３塩基対（Ｔ：Ａ）との相互作用。メチル基はＡｄｅの環外アミノ窒素Ｎ６原子上に付けられている。両矢印はファンデルワールス接触を示す。（Ｆ）ＧＡＴＣの第４塩基対（Ｃ：Ｇ）との相互作用。（Ｇ）２個のＤＮＡ２本鎖の結合部におけるオーファンＴｈｙ−Ｎ１２０の相互作用。このＴｈｙ−Ｎ１２０相互作用は、Ｔ４ＤａｍのＴｈｙ−Ｓ１１２（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）、Ｍ．ＨｈａＩのＧｕａ−Ｑ２３７（Ｋｌｉｍａｓａｕｓｋａｓ他、１９９４）など、塩基フリッピング酵素のタンパク質側鎖−オーファン塩基相互作用と同様である。（Ｈ）２本のＤＮＡ分子（緑および青）の結合部における分子Ｂ（赤）のヘアピンループ。第１、第３および第４塩基対の相互作用は、分子Ａ（図Ｂ参照）のものと同一である。Ｎ末端Ｋ９による第１塩基対の認識を示す図である。（Ａ）２つの領域、βヘアピンループおよびＮ末端ループにおけるＥｃｏＤａｍ（上から順に配列番号２３、３１）およびＴ４Ｄａｍ（上から順に配列番号２２、３２）のペアワイズ配列アラインメント。赤色の残基は、部位特異的変異誘発の標的である。（Ｂ〜Ｃ）ＥｃｏＤａｍ野生型（Ｂ）およびＫ９Ａ変異体（Ｃ）の特異性プロファイル。野生型およびＫ９Ａ変異体のシングルターンオーバーメチル化速度を、コグネイトのヘミメチル化ＧＡＴＣ基質（水色の棒）およびニアコグネイトヘミメチル化基質９種全てについて示す。水平軸上には、変異したＧＡＴＣ部位の３個の位置を示す（Ｇ＝ＧＡＴＣ、Ｔ＝ＧＡＴＣ、Ｃ＝ＧＡＴＣ、Ｍ＝Ｎ６ｍＡ）。右の軸には、各位置に導入された新たな塩基を明記する。酵素および基質の各々の対のメチル化速度を垂直軸に示す（対数目盛に注意）。（Ｄ）ＧＡＴＣ配列の最初の位置（Ｓ１）の認識に関するＥｃｏＤａｍ変異体の特異性因子（実験方法で定義した）。この値は、野生型に対する相対的変化で示す。ＧＡＴＣの第３または第４塩基対がＫ９Ａ変異体で改変されたニアコグネイト部位では活性が検出されなかったので、ここに挙げたＳ１因子が下限であり、矢印で示した。野生型ＥｃｏＤａｍおよびＫ９Ａの特異性因子は、図ＢおよびＣに挙げたデータを用いて計算し、その他の全変異体のデータはＨｏｒｔｏｎ他、２００５から得た。ＥｃｏＤａｍおよびその変異体の塩基フリッピングを示す図である。（Ａ）ＥｃｏＤａｍ存在下でのいくつかのＤＮＡ基質の蛍光強度。この図は、標的Ａｄｅ（青色の曲線）、オーファンＴｈｙ（オレンジ色の曲線）、最初の対のＧｕａ１位置（緑色の曲線）およびＧＡＴＣのすぐ隣の５’位（赤色の曲線）の位置の２ＡＰの蛍光を示す。ピンク色の曲線は、対照のフリーなＤＮＡ（ヘミメチル化Ｇ−２ＡＰ−ＴＣ）を示し、黒色の曲線はフリーな酵素を示す。（Ｂ）ＥｃｏＤａｍおよびその変異体の結合中のヘミメチル化Ｇ−２ＡＰ−ＴＣの相対的蛍光変化。（Ｃ）標的Ａｄｅ（青色の曲線）およびオーファンＴｈｙ（オレンジ色の曲線）の位置に２ＡＰプローブを含有する基質を使用した塩基フリッピングのストップトフロー研究。この青色の曲線は、最初の１００ｍｓｅｃの間に蛍光が増加し、続いて１秒後に蛍光が減少する２相性反応を示す。（Ｄ）標的位置に２ＡＰを含有する基質（青色の曲線）、および認識部位の第１（ピンク色の曲線）、第３（緑色の曲線）または第４（赤色の曲線）の塩基対に１個の塩基対置換を有する３種のニアコグネイト基質を使用した塩基フリッピングのストップトフロー研究。（Ｅ〜Ｇ）様々な基質：（Ｅ）Ｒ１２４Ａ、（Ｆ）Ｐ１３４Ｇおよび（Ｇ）Ｋ９ＡによるＥｃｏＤａｍ変異体の塩基フリッピングのストップトフロー研究。非メチル化とヘミメチル化ＤＮＡとの間の区別を示す図である。非メチル化（四角）およびヘミメチル化（菱形）オリゴヌクレオチド基質の（Ａ）ＥｃｏＤａｍ（ＷＴ）および（Ｂ）Ｌ１２２Ａ変異体によるメチル化。非標準複合体の構造を示す図である。（Ａ）ＥｃｏＤａｍ分子Ｃは、改変された認識部位を模倣した２個のＤＮＡ２本鎖の結合部に優先的に結合し、Ｔ４Ｄａｍの構造データ（Ｈｏｒｔｏｎ他、２００５）およびその他のＤＮＡＭＴアーゼの生化学データ（ＣｈｅｎｇａｎｄＲｏｂｅｒｔｓ、２００１、ＫｌｉｍａｓａｕｓｋａｓａｎｄＲｏｂｅｒｔｓ、１９９５）と合致する。ここでは、部分的認識部位（特に、５’Ｇ：Ｃ塩基対）が存在すれば、ＥｃｏＤａｍによる安定な複合体形成に十分である。青色の円は不規則なＡｄｅを示す。（Ｂ）タンパク質−ＤＮＡ接触の概要。２個のＤＮＡ２本鎖（緑および青）は逆向きに重なり合い、２個の２本鎖の結合部に１個のＴ：Ｔ誤対合がある。相互作用を媒介する主鎖は、主鎖アミン（Ｎ）またはカルボニル（Ｏ）で示される。（Ｃ〜Ｈ）ＥｃｏＤａｍ分子ＣとのＤＮＡ相互作用の詳細。（Ｉ）非標準部位およびＰａｐＧＡＴＣ隣接配列のＤＮＡ配列比較。（Ｊ）ｐａｐ調節配列（左から順に配列番号３３、３４）の構成。数字（１〜６）は、６個のロイシン応答調節タンパク質（Ｌｒｐ）結合部位を示す（Ｈｅｒｎｄａｙ他、２００３）。６個のＬｒｐ結合部位の中で、部位２および５はＧＡＴＣ配列を含有する（上図）。それぞれの標的Ａｄｅ（赤または緑の影付き）をメチル化するためにＤＮＡに沿って移動するＤａｍ分子（赤または緑の円）のモデルは、非コグネイト部位（赤または緑の箱）の１つで捉えられる。標準および非標準複合体の構造比較を示す図である。（Ａ）標準複合体（灰色の分子Ａおよび青色のＤＮＡ）と非標準複合体（分子Ｃ）を重ね合わせ、４個の塩基対およびＲ１２４との相互作用を示す。Ｇ：Ｃ対の塩基原子およびＲ１２４の側鎖原子のみが重ね合わせに使用された。（Ｂ）標準複合体のＤＮＡ主鎖は青色で、非標準複合体は赤紫色である。Ｒ１２４−Ｇｕａ４相互作用は、右側のＤＮＡで生じる。Ｙ１１９による挿入によって、非標準複合体の左側のＤＮＡはらせん軸に沿って１塩基対長くなるように移動する（矢印で示した）。（Ｃ）２個の複合体におけるＤＮＡの比較（重ね合わせのために右側部分を使用）。左側の部分の非標準２本鎖は、らせん軸の周りに約３０°回転する。（Ａ）ｐａｐ調節配列の構成。６個のＬｒｐ結合部位は、分岐ｐａｐＢＡピリンおよびｐａｐｌプロモーターの間に位置する（Ｈｅｒｎｄａｙ他、２００３から改作）。（Ｂ）６個のｐａｐ部位の中で、部位２（配列番号３５）および部位５（配列番号３６）はＧＡＴＣ配列を含有する（囲いの中）。（Ｃ）ｐａｐ部位のメチル化における連続性の欠如に基づいた分子研究のための実験設計。構造をベースにしたインシリコスクリーニングの概略を示す流れ図である。補因子ＡｄｏＨｃｙ結合を示す図である。Ｔ４ＤａｍおよびＤＩＭ−５において実験的に決定されたＡｄｏＨｃｙ立体構造の重ね合わせ。Ｔ４ＤａｍにおけるＡｄｏＨｃｙは、ＤＮＡＭＴアーゼなどの広範囲に及ぶＩ型ＭＴアーゼにおいて最も頻繁に認められる伸長型立体構造である（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ他、２００３）。しかし、この伸長型立体構造は、ＤＩＭ−５などのヒストンＬｙｓＭＴアーゼ（ＨＫＭＴ）のＳＥＴドメインで認められる折り畳み立体構造とは著しく異なる。補因子のこのように異なる立体構造は、Ｖ型（ＳＥＴＨＫＭＴ）ＭＴアーゼに対してＩ型（Ｔ４Ｄａｍ、ＤＮＭＴおよびＰＲＭＴ）に選択的な阻害剤を設計するためのよい標的となる。補因子から生じた球体の中心は、（Ｂ）ＤＩＭ−５（左）およびＴ４Ｄａｍ（右）におけるＡｄｏＨｃｙの実験的に決定された結合様式を再現することができる。（Ａ）Ｔ４Ｄａｍの２個のドメイン構造：触媒ドメイン（濃い）およびＤＮＡ結合ドメイン（薄い）。２個のドメインの間には深いくぼみがある（点によって表された球体中心によって示される）。予備ＤＯＣＫスクリーニングによって、ＡｄｏＨｃｙ結合ポケット（上）または２個のドメインの間のくぼみ（下）のいずれかに結合できる特有の小分子（ＮＳＣ４８６９３およびＮＳＣ１５９１６５）が明らかになった。（Ｂ）Ｔ４Ｄａｍ−ＡｄｏＨｃｙ（上）およびＭ．ＤｐｎＩＩ−ＡｄｏＭｅｔ（下）の間の小さいが、重要な構造の違い。（Ｃ）補因子アナログＡｄｏＨｃｙ上への補因子結合部位の上位３０ヒットの重ね合わせ。ＤＩＭ−５のＤＯＣＫ結果を示す図である。（Ａ）ＡｄｏＨｃｙ結合部位、（Ｂ）ＡｄｏＨｃｙ結合部位にドッキングした小分子ＮＳＣ１０６２２１、（Ｃ）標的Ｌｙｓ含有ペプチド結合部位、（Ｄ）Ｌｙｓ結合チャンネルにドッキングした小分子ＮＳＣ３２２９２１。最初のＩＳＳで使用したＮＣＩ「ＤｉｖｅｒｓｉｔｙＳｅｔ」の約２０００個の化合物の概要を示す図である。各項（ｅｎｔｒｙ）は、ＮＳＣ識別子、ならびに原子結合および結合の種類の情報を含有するＳＭＩＬＥＳ列（ｓｔｒｉｎｇ）を有する１化合物に対応する。ＩＳＳによって同定され、より詳細に調べられた８２個の化合物の概要を示す図である。各項は、ＮＳＣ識別子、分子量および化学構造図を有する１化合物に対応する。ＤＩＭ−５阻害化合物は１〜３６番に対応し、Ｄａｍ阻害候補は４１〜８０番に対応する。ヒスタミンメチルトランスフェラーゼ阻害剤は３７〜４０番および８１〜８２番である（示さず）。ＩＳＳから得られた、上位１００個の化合物のエネルギースコア順位。各項には、ＮＳＣ識別子およびエネルギースコアが記載されている。（Ａ）および（Ｂ）はＤＩＭ−５阻害剤のスコア、（Ｃ）および（Ｄ）はＤａｍ阻害剤のスコアである。リード化合物ＮＳＣ６５９３９０との構造類似性について選択された他の化合物のリストを示す図である。ＥＰＥＣは、宿主上皮細胞表面のアクチンで満たされた膜の突出の形成原因となる。蛍光顕微鏡下では、ＥＰＥＣは緑色に標識され、アクチンはオレンジ色に、ＤＮＡ（細菌および核の両方）は青色に標識される。縮尺の長さは１０ミクロンである。（Ａ）非感染３Ｔ３細胞および（Ｂ〜Ｃ）感染３Ｔ３細胞の顕微鏡画像。（Ｃ）の細胞をＧ６（化合物＃７８−ＮＳＣ６５９３９０）２０μＭで処理し、アクチンをＦＩＴＣファロイジンで染色して標識し（中央列およびマージの緑）、３Ｔ３および細菌の核をＤＡＰＩで染色して標識した（左列およびマージの青）。アクチン台座構造は、明るいアクチン染色部として認められる（例えば、矢印）。アクチンの台座構造は、Ｇ６では認められない。縮尺の長さは２０μｍである。Ｇ６化合物２０μＭを添加した、もしくは添加しない、またはＢ１１（化合物＃２３−抗生物質）２０μＭを添加したＥＰＥＣの増殖曲線。Ｇ６は、抗生物質と比較して細菌増殖に全く影響を与えなかった。ＥＰＥＣビルレンスに対するＧ６の効果を示す図である。（ａ〜ｄ）は非感染３Ｔ３細胞、（ｅ〜ｈ）はＥＰＥＣに感染した３Ｔ３細胞、（ｉ〜ｌ）は、ＥＰＥＣに感染し、また、Ｇ６２０μＭで処理した３Ｔ３細胞である。細胞は、アクチンをＦＩＴＣファロイジンで染色し、細菌をＤＡＰＩで染色して標識し、細菌ビルレンス因子Ｔｉｒ（宿主細胞に分泌される。）をα−ＴｉｒｐＡｂ−Ｃｙ３で染色して標識した。Ｔｉｒ染色（ｇの矢印参照、蛍光顕微鏡下で赤色に認められる。）は、アクチン台座構造の先端にはっきりと現れている（ｆの矢印、蛍光顕微鏡下では緑色に認められる）。Ｇ６で処理すると、台座構造（ｊ）もＴｉｒ染色（ｋ）も、付着した細菌の側には認められない（（ｉ）の矢印）。縮尺、１０μｍ。（Ａ）化合物で処理した細菌から単離されたｐＵＣ１９ＤＮＡのメチル化感受性消化。（Ｂ）より感受性が高いハイスループットの細菌をベースにしたアッセイの設計。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＥＰＥＣまたはＣ．ロデンティウムを感染させた。結腸組織の細菌負荷は、感染後（ｐｉ）７日目に、結腸片を破砕し、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天に載せ、結腸組織１グラム当たりのコロニー数（コロニー形成単位（ＣＦＵ）を計測することによって測定する。ＥＯＥＣもＣ．ロデンティウムも非感染マウスでは検出されなかった。（Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスをストレプトマイシン２０ｍｇで予備処理した後、Ｃ．ロデンティウムまたはＥＰＥＣを感染させた。結腸組織をｐｉ７日目のマウスから採集し、Ｈ＆Ｅ染色によって分析した（縮尺線＝２００μｍ）。（Ｃ）ＥＰＥＣまたはＣ．ロデンティウムに感染したマウスの結腸（１４日目）を採取し、ミエロペルオキシダーゼ活性、結腸の好中球動員の指標を分析した。^＊非感染結腸と比較してｐ＜０．０５。選択されたＤａｍＭＴアーゼオルソログ（Ｙａｎｇ他、ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙ１０：８４９〜８５５、２００３の図１より）、バクテリオファージＴ４（Ｔ４Ｄａｍ）（配列番号３７）、大腸菌（ＥｃｏＤａｍ）（配列番号３８）、制限−修飾ＭＴアーゼＥｃｏＲＶ（配列番号３９）、およびＤｐｎＩＩＡ（配列番号４０）の配列データを示す図である。不変の残基および保存された残基はそれぞれ、強調された白色文字および太文字で示す。Ｔ４Ｄａｍの２次構造は、配列の上に示す（円柱はヘリックス、矢印は鎖）。ＥｃｏＤａｍの三次元座標構造を示す図である。この図は、実施例に記載のように、ＥｃｏＤａｍ３要素（ＥｃｏＤａｍ−ＡｄｏＭｅｔ−１２塩基ＤＮＡ）複合体（順に配列番号４１〜４５、４３）のＸ線座標を示し、Ｄａｍ阻害剤候補を同定するＩＳＳに使用される。

Claims

前記活性部位が、ＡｄｏＨｃｙ結合部位のＡｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒモチーフ（配列番号１）を含む、請求項８に記載の方法。