JP2008517602A

JP2008517602A - 増幅を改善するための核酸の修復

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Publication number: JP2008517602A
Application number: JP2007538150A
Authority: JP
Inventors: エバンス，トーマス・シー; スラトコ，バートン; チヨン，リーシン; バイスバイラ，ロマルダス; クアン，チユーリー
Original assignee: ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド
Priority date: 2004-10-21
Filing date: 2005-10-20
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2025-10-20
Also published as: JP5063355B2; CA2584768A1; WO2006047461A1; EP1805327B1; CA2626094C; CA2626094A1; EP1805327A1; IL182572A0; AU2005299547A1

Abstract

例えば増幅反応において、改善された忠実度及び収率で効率的に合成することができるように、ポリヌクレオチドを修復する方法及び組成物を提供する。これは、リガーゼとＮＡＤ＋又はＡＴＰから選択される補因子とを含む反応混合物の使用及びエンドヌクレアーゼＶＩの非存在下でポリヌクレオチドを反応混合物と一緒にインキュベートすることを含む。反応混合物は、さらにＡＰエンドヌクレアーゼ及びポリメラーゼを含むことができる。これらの酵素は、増幅混合物に含めることができるように、高温に耐える能力に従って選択してもよい。好熱性ではない酵素を使用することができる場合には、反応混合物をポリヌクレオチド合成反応前に使用することができる。修復反応は、酵素混合物中でのインキュベーションの秒、分又は時間に関して時間の影響を受けない。

Description

塩基除去酵素を用いてＤＮＡを修復する種々の手法が報告されている。残念ながら、これらの異なる手法はＤＮＡにさらに損傷を与える。従来のＰＣＲ技術は、増幅を改善するためにある面で改変されてきた。米国特許第５，０３５，９９６号は、修飾ヌクレオチドｄＵＴＰを増幅反応に使用する、核酸増幅反応の汚染を抑制する方法を記載している。この方法は、ウラシルグリコシラーゼを用いて、ウラシルを含むＰＣＲ産物を除去して、後続のＰＣＲ反応の汚染を防止する。米国特許公開第２００４−００６７５５９号Ａ１も、増幅前のプライマーＤＮＡ中の修飾塩基に依拠し、例えば、単位複製配列への組み入れにｄＵＴＰを使用する。次いで、単位複製配列は、例えばウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）及びエンドヌクレアーゼ（Ｅｎｄｏ）ＩＶを添加することによって断片化することができる。

ＰＣＲ中のミスプライミング（ｍｉｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）を減少させるためにホットスタート核酸増幅が使用された。ホットスタート増幅の１タイプは、ＰＣＲ反応において存在するポリメラーゼによる伸長を防止するために３’末端をブロックしたＰＣＲプライマーの存在に依拠する（例えば米国特許公開第２００３−０１１９１５０号参照）。このプライマーは、＞３７℃で活性である耐熱性３’−５’エキソヌクレアーゼによってブロック解除される。したがって、ポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼが＞３７℃で３’末端をブロック解除した後にのみＰＣＲプライマーを伸長させる。或いは、Ｔａｑポリメラーゼがブロックされ、次いで増幅温度で活性化される。

Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：２２１６−２２２０（１９９４）は、増幅においてＴａｑポリメラーゼのみの使用を上回る改良として、ｖｅｎｔポリメラーゼとＴａｑポリメラーゼの使用を記載している。Ｇｈａｄｅｓｓｙ等は、損傷部位又は脱塩基部位によって停止されない変異Ｔａｑポリメラーゼを報告した（ＧｈａｄｅｓｓｙらＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２（６）：７５５−９（２００４））。

従来の増幅技術は、ＤＮＡが実質的に損傷を受けた場合には損なわれることが報告された（ＤｉＢｅｒｎａｒｄｏらＮｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３０：ｅ１６（２００２））。ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む環境及び微生物への暴露に起因するＤＮＡの分解及び／又は断片化は、科学捜査、診断テスト及び定常的な増幅において頻繁に起こる問題であり、増幅産物の忠実度及び収率に影響を及ぼす。また、分解ＤＮＡの問題は、凍結生物、絶滅生物又は極めて稀な生物から得られたＤＮＡを分析する研究者も直面する。

Ｆｒｏｍｅｎｔｙ，ＢらＮｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８（１１）：ｅ５０（２０００）及び国際公開第０１５１６５６号は、エキソヌクレアーゼ（Ｅｘｏ）ＩＩＩによってｌｏｎｇＰＣＲの収率が改善されることを報告した。Ｆｒｏｍｅｎｔｙは、ＤＮＡ＜５００ｂｐに対する単位複製配列の収率が減少することも報告した。ＥｘｏＩＩＩの使用に伴う問題の１つは、ＥｘｏＩＩＩがテンプレート及びプライマーを分解することである。

ＤｉＢｅｎａｒｄｏらＮｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３０（４）：ｅ１６（２００２）は、二本鎖ＤＮＡの架橋領域間の一本鎖ＤＮＡの短い領域を増幅するためのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４リガーゼ）及びＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼの使用を記載している。

損傷ＤＮＡを増幅する別の手法は、米国特許公開第２００３−００７７５８１号に記載されている。分解核酸を分解核酸と相同の配列を有する未分解核酸とハイブリッド形成させた。次いで、分解核酸の領域にヌクレオチド前駆体を埋め込んだ。次いで、断片化した鎖を、重合酵素及び／又は連結酵素を用いて共有結合的に連結した。

損傷ＤＮＡの増幅を改善する調製物は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ及びＱｂｉｏｇｅｎｅ、現在のＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡから商業的に入手することができる。これらの調製物の組成物は提供されていないが、ＥｘｏＩＩＩは調製物に含まれていると考えられる。これらの調製物は長さ５００塩基対未満のＤＮＡテンプレートに対しては推奨されない。

他の研究者は増幅前修復のＥ．ｃｏｌｉＤＮＡＰｏｌＩとＴ４リガーゼの併用を報告している（ＰｕｓｃｈらＮｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２６：８５７（１９９８））。しかし、Ｐｕｓｃｈらによれば、増幅前産物は増幅開始前に精製される。

本発明の一実施形態においては、損傷を受けたポリヌクレオチドの増幅産物の忠実度及び収率の少なくとも一方を向上させる方法を提供する。この方法は、（ａ）エンドヌクレアーゼ（Ｅｎｄｏ）ＶＩの非存在下で、リガーゼとＮＡＤ＋又はＡＴＰから選択される補因子とを含み、ＥｎｄｏＶＩを含まない反応混合物中で、ポリヌクレオチドをインキュベートする段階と、（ｂ）段階（ａ）中又は段階（ａ）後に増幅試薬を前記反応混合物に添加することによって、前記ポリヌクレオチドの増幅を前記反応混合物中で起こす段階と、（ｃ）段階（ａ）の非存在下よりも段階（ａ）の存在下で、増幅産物の忠実度又は収率の少なくとも一方を向上させる段階とを含む。

上記方法は、インキュベーションを秒、分又は時間単位で行うかどうかという点では、特に時間感応性ではない。本方法の実施形態に使用するリガーゼは、中温性でも好熱性でもよく、特定の状況下で有用であり得る好冷性リガーゼを除外しない。温度感受性に関するリガーゼの選択は、特定の反応条件セットに何が最適であるかによって決まる。例えば、増幅試薬をインキュベーション段階（ａ）中に添加する場合には、増幅中に利用する温度に耐える好熱性リガーゼを使用することが望ましいことがある。好熱性リガーゼの例はＴａｑＤＮＡリガーゼ（Ｔａｑリガーゼ）及び９°Ｎリガーゼである。ＴａｑリガーゼはＮＡＤ^＋補因子と一緒であるとより有効であり、９°ＮＤＮＡリガーゼ（９°Ｎリガーゼ）はＡＴＰ補因子と一緒であるとより有効である。中温性リガーゼは（ＡＴＰ補因子を用いた）Ｔ４リガーゼ及び（ＮＡＤ^＋補因子を用いた）Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ）である。

反応混合物は、さらに、タイプＩＩエンドヌクレアーゼなどのＡＰエンドヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼ（Ｅｎｄｏ）Ｉ若しくはその変異体又はＥｎｄｏＩＶを含むことができる。反応混合物は、これらとは別に、又はこれらに加えて、ポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼ、サーモミクロビウム（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）種ポリメラーゼ又は古細菌ポリメラーゼ若しくはＰｆｕ、Ｖｅｎｔ（登録商標）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（登録商標）、９°Ｎ、ＧＢＤポリメラーゼなどのその変異体を含むことができる。

本発明の実施形態においては、試薬混合物にさらに添加することができる酵素としては、Ｔ４ピリミジン２量体グリコシラーゼ、［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）などが挙げられ、ポリヌクレオチドが受ける損傷のタイプに応じた種々の組み合わせでＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤ、Ｃｈｏ、ＵＤＧ、Ａａｇ、ＥｎｄｏＩＩＩ及びＥｎｄｏＶの少なくとも１種類などが挙げられる。

本発明の一実施形態においては、場合によってはＤＮＡ１−１０００ｎｇに添加されていてもよい、エンドヌクレアーゼ約１−１００単位、ポリメラーゼ約０．０５−０．２５単位及びリガーゼ約５−５００単位を含む反応混合物を使用する。

ポリヌクレオチドに影響を及ぼし得る損傷のタイプとしては、脱プリン／ピリミジン（ＡＰ）部位、変異を誘発されたヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、ニック、ギャップ及びＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−タンパク質架橋などが挙げられる。

損傷を受けたポリヌクレオチドは、自然源、保存生体材料、法医学的証拠、古代のポリヌクレオチド、組織生検又は定常的生物学的操作から得ることができる。

本方法の実施形態によれば、ＤＮＡ増幅をＰＣＲ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、転写による増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅又は全ゲノム増幅のいずれかによって実施する。

ポリヌクレオチドが一本鎖ＲＮＡである場合には、増幅は逆転写酵素依存性増幅とすることができる。

本方法の一実施形態においては、ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅に対して５０ヌクレオチドから１００，０００ヌクレオチドの範囲の大きさの単位複製配列を生成することができる。

本発明の一実施形態においては、使用説明書及び１種類以上の酵素を含み、該酵素の少なくとも１種類はリガーゼであり、該１種類以上の酵素は、増幅混合物に添加して増幅を増強するために、又は増幅混合物の添加前に使用して増幅を増強するために処方される、増幅キットを提供する。

本発明の別の実施形態においては、リガーゼ、ポリメラーゼ及びＥｎｄｏＶＩを含まないＡＰエンドヌクレアーゼの有効量を含み、混合物が、組成物の非存在下でのポリヌクレオチドの増幅と比較して、該ポリヌクレオチドの増幅の収率及び忠実度の少なくとも一方を向上させることができる、組成物を提供する。例えば、組成物中の試薬の濃度は、例えば反応体積１０−１００μｌ中に含まれる、エンドヌクレアーゼ１−１００単位の濃度のＡＰエンドヌクレアーゼ、０．０５−０．２５単位のポリメラーゼ及びリガーゼ５−５００単位を含む。この処方をＤＮＡ修復用のＤＮＡ１−１０００ｎｇに適用することができる。より高濃度のＤＮＡに対しては、各酵素の量を比例して増加させるべきである。本発明の実施形態においては、Ｔ４ピリミジン２量体グリコシラーゼ、［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤ、Ｃｈｏ、ＵＤＧ、Ａａｇ、ＥｎｄｏＩＩＩ及びＥｎｄｏＶの１種類以上をポリヌクレオチドが受ける損傷のタイプに応じた種々の組み合わせで含む組成物に追加の酵素を含めることができる。

本発明の実施形態は、損傷を受けたポリヌクレオチドの合成の収率又は忠実度の少なくとも一方を向上させる方法を記述する。ポリヌクレオチド合成によってポリメラーゼ−依存性増幅がもたらされる場合には、約５００塩基長未満である（１００ｎｔもの短い）長い単位複製配列又は５００塩基を超える、若しくは約１００ｋｂもの長い単位複製配列を増幅することができる（ＰＣＲ増幅の場合）。ポリヌクレオチド合成の他のタイプとしては、増幅（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱＰＣＲ）、ゲノム増幅、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ヘリカーゼ−依存性増幅（ＨＤＡ）などのプライマー伸長反応、ＤＮＡ塩基配列決定反応などが挙げられる。本方法の実施形態は、分子生物学研究において、また、応用生物学における問題の解決において、例えば、科学捜査において、古代の源由来のＤＮＡを分析することが望ましい生物学的考古学において、ＢａｒｃｏｄｅｏｆＬｉｆｅＰｒｏｊｅｃｔに必要とされるものなど環境試料由来のＤＮＡを分析することが望ましい分類学に対して、疾患感受性又は疾患状態を決定する組織生検を含めた診断アッセイに対して、また、分子生物学研究に対して広範な有用性を有する。

損傷源及び損傷の程度
ポリヌクレオチド分子が受ける損傷は「正常」ポリヌクレオチドにおいてでも一般的であるが、損傷は保存組織、乾燥試料又は環境に曝されたポリヌクレオチドにおいてより重大である。損傷は、試料の古さ、その長さ、その出所又はその調製の結果として起こり得る。また、損傷は、高温段階を含むＰＣＲ増幅中に起こるなど、ポリヌクレオチド合成方法の適用中に起こり得る。

ポリヌクレオチドは多様な損傷を受ける。損傷の種々のタイプとしては、（ａ）例えば熱、エタノール中でのポリヌクレオチドの保存及びＨ_２Ｏ、ｐＨなど環境中の要因への暴露によって生じる、脱プリン又は脱ピリミジン損傷、（ｂ）例えば脱アミノ、アルキル化、酸化及び２量体化に起因する個々のヌクレオチドの改変、（ｃ）例えば熱、エタノール中でのポリヌクレオチドの保存及びＨ_２Ｏ、ｐＨなど環境中の要因への暴露によって生じる、ニック及びギャップ、（ｄ）例えばホルムアルデヒド、環境要因及びエタノール保存によって生じる架橋、（ｅ）例えばポリメラーゼによるヌクレオチドの誤取り込みによって生じるＤＮＡのミスマッチなどが挙げられる。

異なるポリヌクレオチド調製物は、例えばポリヌクレオチド調製物のインビトロでの保存又は取扱いに起因する、異なるタイプの損傷を受け、ポリヌクレオチドを含む、原核細胞、古細菌又は真核細胞の保存方法及びポリヌクレオチドを抽出した細胞の諸特性に依存し得る。

定義
「ポリヌクレオチド」という用語は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖、一本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＲＮＡを指す。

「修復酵素」とは、ポリヌクレオチドの修復方法に関与する好冷性、中温性又は好熱性酵素を指す。例えば、修復酵素は、ポリヌクレオチドの結合の切断を引き起こし、それによってポリヌクレオチドの損傷領域の除去を促進することができる。リガーゼ、ポリメラーゼなど合成上ある役割を有する酵素も修復酵素である。

ＤＮＡ修復酵素は科学文献に記載されている。例えば、Ｗｏｏｄ，Ｒ．Ｄ．，ｅｔａｌ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．５７７（１−２）：２７５−８３（２００５）及びＥｉｓｅｎ，Ｊ．Ａ．ａｎｄＨａｎａｗａｌｔ，Ｐ．Ｃ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４３５（３）：１７１−２１３（１９９９）を参照されたい。ヒト修復酵素の一覧を表１に示す。表１には記載していないが、列挙した酵素の相同体及び機能的に関係する他の酵素も修復酵素の定義に含まれる。上記酵素は天然でも、組換えでも、合成でもよい。上記酵素は、幾つかの活性を有する、自然の、又はインビトロで作製された、キメラとすることができる。上記酵素に加えて、保存配列モチーフを共有し、類似の酵素活性を有する、関係する他の酵素を特定するためにデータベースを検索する方法が当業者に公知である。例えば、ＮＣＢＩウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｃｏｍ）は、保存ドメインデータベースを提供している。例えば、ＥｎｄｏＩＶの相同体をデータベースで検索する場合には、７４個の配列一致が回収される。（リガーゼについては図６も参照されたい。）。

損傷ＤＮＡを修復する酵素混合物において使用する「ポリヌクレオチド開裂酵素」は、修復酵素の１クラスであり、塩基除去修復を担う、ＡＰエンドヌクレアーゼ、グリコシラーゼ、リアーゼなどが挙げられる。

損傷を受けた塩基は、デオキシリボース糖部分と塩基のＮ−グリコシル結合を加水分解するＤＮＡグリコシラーゼ酵素によって除去することができる。この反応の生成物は、正確に埋め込まれなければならない、脱プリン又は脱ピリミジン部位（ＡＰ部位）である。これは、ＡＰ部位に隣接する糖リン酸骨格に切れ目を入れるエンドヌクレアーゼによって実施することができる。脱塩基糖が除去され、新しいヌクレオチドがポリメラーゼ／リガーゼ活性によって挿入される。本発明に適用可能である一部の酵素は、１分子中にグリコシラーゼとＡＰエンドヌクレアーゼ活性を有する。これらの修復酵素は、原核生物及び真核細胞に存在する。脱塩基部位は、ＡＰエンドヌクレアーゼ及び／又はＡＰリアーゼによって認識し、開裂させることができる。クラスＩＩＡＰエンドヌクレアーゼはＡＰ部位において開裂して、ポリヌクレオチド重合に使用することができる３’ＯＨを残す。また、ＡＰエンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド重合を阻害する、３’ＯＨに結合した部分を除去することができる。例えば、３’リン酸は、Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶによって３’ＯＨに転化することができる。ＡＰエンドヌクレアーゼは、グリコシラーゼとともに働くことができる。

グリコシラーゼ特異性の例としては、ウラシル、ヒポキサンチン、３−メチルアデニン（３−ｍＡｄｅ）、ホルムアミドピリミジン及びヒドロキシメチルウラシルが挙げられる。ＤＮＡ中のウラシルの存在は、硫酸水素塩、亜硝酸又は自発的脱アミノによる、シトシンの誤取り込み又は脱アミノのために生じる。ヒポキサンチンは、亜硝酸又は自発的脱アミノによるアデニンの脱アミノのために生じる。３−ｍＡｄｅはアルキル化剤の生成物である。Ｅ．ｃｏｌｉは、ＴａｇＩ及びＴａｇＩＩと呼ばれる２種類の３−ｍＡｄｅグリコシラーゼを有する。ホルムアミドピリミジン（ＦＡＰＹ）（７−ｍＧｕａ）は、ＤＮＡのメチル化剤の最も一般的な生成物である。ガンマ線放射によって４．６−ジアミノ−５−ＦＡＰＹが生成する。この障害を修復するＥ．ｃｏｌｉグリコシラーゼはＦｐｇエンドヌクレアーゼである。ヒドロキシメチルウラシル（Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｕｒｉｃｉｌ）は、チミジンへの電離放射線又は酸化的損傷によって生成される。

リアーゼはポリヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合を切断する。

ＡＰエンドヌクレアーゼの例は４つのクラスに属する。

（Ｉ）３’−−＞３’−ＯＨ＋５’−Ｐ−に開裂し、関連するグリコシラーゼ活性を有する。

（ＩＩ）５’−−＞３’−ＯＨ＋５’−Ｐに開裂する。

（ＩＩＩ）３’−−＞３’−Ｐ＋５’−ＯＨに開裂する。

（ＩＶ）５’−−＞３’−Ｐ＋５’−ＯＨに開裂する。

協奏的（すなわち、ＡＰ部位を形成せずに）又は逐次的に連係して働く、ＡＰエンドヌクレアーゼ活性又はリアーゼ活性とグリコシラーゼ活性とを有すると考えられる幾つかの酵素を単離した。

増幅反応において収率及び忠実度の少なくとも一方を向上させるのに使用するポリヌクレオチド開裂酵素の例としては、１）Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ、ＴｔｈＥｎｄｏＩＶ、ヒトＡＰエンドヌクレアーゼなどのＡＰエンドヌクレアーゼ、２）ＵＤＧ、Ｅ．ｃｏｌｉＡｌｋＡ、ヒトＡａｇなどのグリコシラーゼ及び３）Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＶ、Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＶＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＦｐｇ、ヒトＯＧＧ１、Ｔ４ピリミジン２量体グリコシラーゼ（Ｔ４ｐｄｇ）、ヒトＡＰエンドヌクレアーゼなどのグリコシラーゼ／リアーゼが挙げられる。

（ＥｘｏＩＩＩとも称する）ＥｎｄｏＶＩは、ポリヌクレオチド中の損傷領域以外のポリヌクレオチドのかなりの部分を通常の反応条件下で数時間で分解することができ、損傷を受けたポリヌクレオチドを処理する酵素混合物中に含まれない。

本明細書の酵素混合物に使用する「ポリメラーゼ」とは、ポリメラーゼ活性を有する酵素を指す。修復とポリメラーゼを増幅することは、同じでも異なっていてもよい。

ポリメラーゼの例としては、Ｔａｑポリメラーゼなどの耐熱性細菌性ポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）、ｄｅｅｐＶｅｎｔ（登録商標）、Ｐｆｕなどの古細菌ポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｌＩ、サーモミクロビウムロゼウム（ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍｒｏｓｅｕｍ）ポリメラーゼ、サーモミクロビウムサーモフィラス（ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの熱不安定性酵素、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼなどのファージポリメラーゼ又はこれらの変異体、誘導体若しくは改変体が挙げられる。誘導体の例としては、Ｐｆｕｓｉｏｎ（商標）酵素（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）及び二本鎖結合タンパク質を１つ又は幾つかの出所から得られたポリメラーゼ配列と結合させる他のポリメラーゼが挙げられる。

本明細書に記載する酵素混合物中に使用する「リガーゼ」とは、ポリヌクレオチドの一本鎖の５’末端をポリヌクレオチドの別の一本鎖の３’末端に連結する酵素である。かかるリガーゼは、実質的に全ての真核細胞並びに原核細胞、ウイルス及び古細菌中に存在する。これらのリガーゼのいずれも、本明細書に記載の修復に使用することができる。リガーゼの例としては、９°Ｎリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、Ｔ４リガーゼ及びＴａｑリガーゼが挙げられる。他のリガーゼとしては、ＬＩＧＡ（ＮＰ−４１６９０６．１）、ＴｔｈＤＮＡＬＧＳ（ＡＡＡ２７４８６．１）、ＬＩＧ３（ＮＭ−０１３９７５）、ＬＩＧ４（ＮＭ−００２３１２）などが挙げられる。

本発明に有用性を有し得る他のリガーゼ又はリガーゼ様タンパク質は、データベースを検索するためのＴ４リガーゼ又はＥ．ｃｏｌｉリガーゼを用いたＧｅｎｂａｎｋ検索によって明らかになる（図６参照）。これらの公知のリガーゼと少なくとも６個の隣接アミノ酸を共有する任意の酵素を、本発明の実施形態による修復混合物に含めることができる。

あらゆる補因子の非存在下でＥｘｏＩＩＩと組み合わせたリガーゼの公開された使用とは逆に（米国特許公開第２００５−００２６１４７号）、ＮＡＤ＋又はＡＴＰは、リガーゼを含む酵素混合物に必要であることが判明した。より具体的には、Ｔａｑリガーゼ及びＥ．ｃｏｌｉリガーゼはＮＡＤ＋を必要とし、Ｔ４リガーゼ及び９°ＮリガーゼはＡＴＰを必要とする。

例示的なリガーゼ、ポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼは、２００５−２００６カタログの１０７−１１７ページ（リガーゼについては１０２−１０８ページ）を参照により本明細書に組み込まれるＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＩｎｃ．、米国仮出願第６０／７１７，２９６号及び国際公開第２００５／０５２１２４号から利用可能である。また、耐熱性修復酵素は、増幅前混合物中の熱不安定性修復酵素と区別なく使用することができる。耐熱性酵素は、４０℃を超える温度、より具体的には６５℃以上で活性である。

本方法の実施形態は、ポリヌクレオチド増幅又は他の合成反応から得られる産物の収率又は忠実度を改善する。これは、例えば、損傷を受けたポリヌクレオチドをプレインキュベーション混合物中で、及び／又は増幅中に、酵素の調製物で処理したときに達成することができる。

上記プレインキュベーションの利点を得ることができる増幅プロトコルとしては、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（米国特許第５，４５５，１６６号及び同５，４７０，７２３号）；ＨＤＡ（米国特許公開第２００４−００５８３７８−Ａ１号）；転写による増幅（ＴＭＡ）（ＧｕａｔｅｌｌｉらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１８７４−１８７８（１９９０））；インビボでのローリングサークルＤＮＡ複製から改作されたインビトロでのＤＮＡ増幅に使用する配列の複数のコピーを生成するローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（例えば、ＦｉｒｅａｎｄＸｕ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ９２：４６４１−４６４５（１９９５）；ＬｕｉらＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：１５８７−１５９４（１９９６）；ＬｉｚａｒｄｉらＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ１９：２２５−２３２（１９９８）参照）、全ゲノム増幅方法などが挙げられる。

汎用酵素混合物は、ポリヌクレオチドに対する損傷のタイプにかかわらず、損傷を受けたポリヌクレオチドを増幅前又は増幅中に修復する反応混合物に有用であることが判明した。汎用酵素混合物は、さらなる損傷を起こさずに、損傷ＤＮＡを修復する。

汎用酵素混合物は、リガーゼ及びＮＡＤ＋又はＡＴＰなどの補因子を含む。汎用酵素混合物は、好ましくは、Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、ＡｃｃｕＴａｑＬＡＤＮＡポリメラーゼ緩衝剤（ＴａｋａｒａＢｉｏＩｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）、任意の他の標準Ｔａｑ緩衝剤などの適切な緩衝剤中の上記ポリメラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼをさらに含む。種々の実施形態においては、汎用酵素混合物は、Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｌＩ又はＴａｑポリメラーゼ及び中温性ＥｎｄｏＩＶ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ、好熱性ＥｎｄｏＩＶ、例えば、ＴｔｈＥｎｄｏＩＶなどのＡＰエンドヌクレアーゼ及びＥ．ｃｏｌｉリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ又は９°Ｎリガーゼなどの古細菌リガーゼから選択されるリガーゼを含む。特定の実施形態においては、酵素混合物は、増幅前又は増幅中にＤＮＡ１−１０００ｎｇの修復に適切である、ＥｎｄｏＩＶ１−１００単位、Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｌＩ０．０５−０．２５単位及びリガーゼ５−５００単位を含む。上記汎用混合物において指定したもの以外のエンドヌクレアーゼ及びポリメラーゼの濃度範囲は、使用する酵素及び反応温度とともに変わり得ることを理解されたい。しかし、濃度範囲は、実施例に記載のアッセイによって容易に確認することができる。例えば、ラムダＤＮＡの標準調製物は、実施例１に従って熱処理することができる。次いで、ＤＮＡをリガーゼ及び補因子を含む一連の酵素混合物に供することができる。追加の酵素は、混合物中のその酵素の好ましい濃度を求めるために滴定することができる。このようにして、ＤＮＡ修復を最適化することができる。各試料の増幅後、増幅されたＤＮＡの量をゲル電気泳動によって求めることができ、試験酵素の好ましい濃度範囲を明らかにすることができる。

汎用酵素混合物は、ポリヌクレオチド増幅又は他の合成の前又はその最中に使用することができる。

実施例に示すように、損傷のタイプに応じて、ＤＮＡ損傷の性質に応じた追加の修復酵素を汎用酵素混合物に補充することが望ましい場合がある。個々の修復酵素又は修復酵素混合物の有用性は、特定のポリヌクレオチドの修復に適切であるかどうかを判定する、実施例及び図に記載のアッセイによって決定することができる。

ポリヌクレオチドに対する一般的又は特異的損傷の修復
（ａ）一般的損傷
ポリヌクレオチドにおける損傷の性質を決定することは時間がかかる。ポリヌクレオチドに対する何らかの形態の損傷が疑われる場合には、例えば、ポリヌクレオチドの増幅が不十分である場合には、障害を特定する必要がないことが好ましい。この状況では、増幅が改善するかどうかを判定するために、上述したものなどの汎用酵素混合物を利用することができる。汎用混合物を用いて改善が十分である場合には、それ以上の措置は不要である。改善が不十分である場合には、好ましい結果が得られるまで、本明細書に記載の混合物に追加の酵素を添加することができる。アッセイ全体は、９６ウェル皿などの単一の反応器で実施することができる。皿中の各マイクロウェルは、以下に概説する損傷の各クラスを扱うのに選択した汎用混合物＋酵素を含めて、異なる酵素混合物に利用可能である。

ＤＮＡの一般的損傷又は未知の損傷の修復用酵素を選択するプロトコルを図１２（フローチャート）及び実施例に記載のアッセイに示す。

（ｂ）特異的損傷
ポリヌクレオチドに対する損傷の性質が既知である場合もある。この状況においては、図１２の分析をせずに酵素混合物を選択することができる。

（ｉ）ＡＰ部位
塩基の損失はＤＮＡ損傷の最も一般的な自発的形態である。ポリメラーゼ及びポリメラーゼに基づく技術は、この脱塩基部位の存在によって悪影響を受ける。プライマー伸長反応の有効性は、ポリヌクレオチド中に存在する脱塩基部位を修復することによって向上する。修復は、一実施形態においては、脱塩基部位においてリン酸骨格を開裂させるＥｎｄｏＩＶ活性によって行われる。この開裂によって、伸長可能な３’ＯＨが、開裂した脱塩基部位に対して５’側のＤＮＡ断片上に残る。開裂によって、デオキシリボース−５’−リン酸（ｄＲ５Ｐ）も、開裂した脱塩基部位に対して３’側のＤＮＡ断片上に残る。ポリメラーゼは、遊離の３’ＯＨから伸長させ、開裂した脱塩基部位を正しいヌクレオチドで置換することができる。ｄＲ５Ｐは、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩなどのある種のポリメラーゼに存在するフラップエンドヌクレアーゼ活性又はＦＥＮＩなどのセパレートフラップ（ｓｅｐａｒａｔｅｆｌａｐ）エンドヌクレアーゼによってｄＲ５Ｐを特異的に標的とする酵素によって除去することができる。ｄＲ５Ｐの除去は、フラップエンドヌクレアーゼ活性によるこの基の下流の開裂によっても起こり得る。ｄＲ５Ｐを除去し、３’ＯＨに隣接する５’リン酸を生成した後、リガーゼは、このニックを塞いで、修復を終える（実施例１−３及び７参照）。

（ｉｉ）修飾ヌクレオチド
（ａ）チミジン２量体
光は、ピリミジン２量体の形成を引き起こすことによってＤＮＡに損傷を与え得る。ピリミジン２量体は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるＤＮＡ伸長反応を遮断し、したがってＤＮＡ増幅を阻害する（Ｗｅｌｌｉｎｇｅｒ，らＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４（８）：１５７８−７９（１９９６））。したがって、増幅前又は増幅中にピリミジンプライマーを修復することが望ましい。この修復は、ピリミジン２量体グリコシラーゼ／リアーゼ（ＶａｎｄｅＢｅｒｇ，らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（３２）：２０２７６−２０２８４（１９９８））を汎用酵素混合物に添加することによって実施することができる。ＤＮＡ骨格はピリミジン２量体に対して５’側で開裂し、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能である３’ヒドロキシル部分が残る。ある実施形態においては、３’ヒドロキシルにおける伸長と、それに続く、ＤＮＡ伸長中に生じる障害含有フラップの形成と切断とによって、ニックが生成する。ニックは、ニックを塞ぐことができる酵素によって塞がれる。フラップは、伸長ポリメラーゼ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩによって、又はフラップエンドヌクレアーゼの作用によって、切断することができる（（Ｘｕ，ＹらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２７）：２０９４９−２０９５５（２０００）、Ｌｉｕ，ＹらＡｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３：５８９−６１５（２００４））。

（ｂ）酸化的損傷
損傷を受けた塩基の反対側に望ましくないヌクレオチドが組み入れられるので、ＤＮＡ増幅反応の産物中に誤りが持ち込まれ得る（ＧｉｌｂｅｒｔらＡｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．７２：４８−６１（２００３）；ＨｏｆｒｅｉｔｅｒらＮｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２９：４７９３−９（２００１））。この誤りは、同じ試料を多数回増幅し、クローニングし、配列決定することによって発見することができる。塩基損傷による誤りは、変異原性ＤＮＡ障害の一般的なタイプの１つを除去する、ＵＤＧなどの酵素を用いた試料処理前後の配列データを比較することによって特定することもできる（ＨｏｆｒｅｉｔｅｒらＮｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ２９：４７９３−９（２００１））。しかし、ＵＤＧを用いた処理によって、プライマー伸長法によるＤＮＡ増幅を阻害する脱塩基部位がＤＮＡ内に生成する。このため、ＵＤＧ処理によって増幅し難くなる恐れがある希少ＤＮＡ試料では問題が生じる。

酸化的損傷の生成物である修飾ヌクレオチドは、Ｆｐｇ又はｈＯＧＧによってポリヌクレオチドから除去し、ブロックされたポリヌクレオチドを残すことができる。ブロックされたポリヌクレオチドは、ＥｎｄｏＩＶなどのＡＰエンドヌクレアーゼによって修復可能である。

ポリヌクレオチドに対する酸化的損傷を増幅前に修復する酵素前処理の有効性を実施例９で説明する。汎用酵素混合物は、プレインキュベーション混合物中でＦｐｇが補充されている。

シトシンがウラシルに、グアニンがキサンチンに、又はアデニンがヒポキサンチンに転化された、アルキル化塩基、脱アミノ塩基などの他の修飾ヌクレオチドは、誤った遺伝コードを伝える。これらの修飾ヌクレオチドを除去することが望ましい。これらの修飾塩基は、実施例１０に記載のようにＡｌｋＡ、ＵＤＧ又はＡａｇのいずれかによって除去し、ＡＰ部位を残すことができる。次いで、このＡＰ部位は、リガーゼと、好ましくはさらにＡＰエンドヌクレアーゼ及びポリメラーゼとを含む反応混合物によって修復することができる。ウラシルを除去すると、ポリメラーゼは、この部位で通常は停止する増幅反応において、ＤＮＡを増幅し続けることができる。例えば、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ活性は、ＤＮＡに挿入された不正確なウラシルによって阻害される。ウラシルを除去できると、ポリメラーゼはより有効になる。

（ｉｉｉ）ニック及びギャップ
ＤＮＡ骨格中のニック及びギャップは、短縮されたプライマー伸長産物をもたらし、増幅反応を阻害し得る。汎用酵素混合物中のリガーゼとポリメラーゼの協奏的作用は、ＤＮＡ中のニック及びギャップを修復し、したがってＤＮＡ増幅反応を促進する。

（ｉｖ）架橋
追加のヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）タンパク質（ＭｉｎｋｏらＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４４：３０００−３００９（２００５）；ＣｏｓｔａらＢｉｏｃｈｉｍｉｅ８５（１１）：１０８３−１０９９（２００３）；ＳａｎｃａｒＡｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ６５：４３−８１（１９９６））は、ホルムアルデヒド及びかさ高い付加体へのポリヌクレオチドの暴露に起因する損傷並びにＤＮＡ−タンパク質架橋を形成する化学修飾された塩基をもたらす損傷を修復する汎用酵素混合物に添加することができる。Ｅ．ｃｏｌｉＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、変異ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤ又はＣｈｏの少なくとも１種類（ＭｏｏｌｅｎａｒらＰｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ９９：１４６７−７２（２００２））を、損傷部位周囲の５’末端及び場合によっては３’末端に切り込みを入れるために使用することができる。これらの酵素の諸特性及び精製プロトコルについての詳細は（Ｚｏｕ，ＹらＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３：４１９６−４２０５（２００４））から得ることができる。修復プロセスは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ及び場合によってはフラップエンドヌクレアーゼを用いて完了することができる。

５’切り込み部位における３’ヒドロキシルの生成は、ＮＥＲ酵素がＤＮＡを開裂させるが、プライマー伸長を阻害するブロックされた３’末端がＤＮＡ上に残る場合には有用であり得る。例としては、ＮＥＲ酵素がＤＮＡを開裂させ、３’リン酸が残る場合が挙げられる。これは、例えばＥ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶによって３’リン酸を除去しない限り、公知のＤＮＡポリメラーゼによって伸長させることはできない。

ＮＥＲ酵素がＤＮＡ障害に対する５’及び３’を開裂させる場合には、新たに放出されたオリゴヌクレオチドがＤＮＡから解離するときに損傷が除去される。ポリメラーゼは、ＤＮＡの切除領域を単に埋めることができ、ニックを残す。次いで、ニックをリガーゼが塞いで修復を終える。ポリメラーゼがＤＮＡを埋め、次いで残りのＤＮＡ鎖を置換する場合もある。この状況においては、フラパーゼ（ｆｌａｐａｓｅ）活性を有する酵素は、リガーゼによって塞ぐことができるニックを形成することができる。ＮＥＲ酵素が損傷に対する５’のみを開裂させる場合には、ポリメラーゼは、好ましくは、損傷を過ぎるまで元のＤＮＡ鎖を置換する。その後、フラパーゼがＤＮＡフラップを開裂させて、連結可能なニックを生成する。フラパーゼは、ＤＮＡ障害に達する前後で活性であり得る。好ましくは、ポリメラーゼ及びフラパーゼ活性は、ＤＮＡ障害を最終的に置換し、除去して、連結可能なニックを残し、それによってＤＮＡテンプレートを修復するように働く。上記手法の有効性の例を実施例７に示す。

（ｖ）ミスマッチポリヌクレオチド
ヘテロ二重鎖ＤＮＡは、マルチテンプレートＰＣＲ及び均一テンプレートＰＣＲにおいて問題となり得る（Ｌｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｌ．＆Ｋｌｅｉｎ，Ｄ．Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２８：６７６−６８１（２０００）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．ＲらＮｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３０（９）：２０８３−２０８８（２００２）；Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．＆Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：６８４７−６８５０（１９９７））。Ｔ７ＥｎｄｏＩ又はその変異体は、リガーゼと一緒に使用して、ミスマッチ領域を除去することができる。この手法は、ＤＮＡの定量が不要であり、ＬｏｗｅｌｌらＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２８：６７６−６８１（２０００）及びＳｍｉｔｈらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：６８４７−６８５０（１９９７）によって必要とされる、ＰＣＲ反応後の余分な段階が回避される。これらの酵素の使用例を実施例８に示す。Ｔ７エンドヌクレアーゼ又は変異体：ＤＮＡ比の有用な範囲は、ヘテロ二重鎖開裂反応における非特異的開裂を最小にするＤＮＡリガーゼ活性を含めることによって拡張することができる。

実施例及び図の考察
実施例１及び図１によれば、ＰＣＲ増幅から得られる単位複製配列収率は、ある損傷しきい値（例えば、約９０秒の熱処理）を超えてテンプレートＤＮＡが損傷を受けたときに、実質的に負の影響を受ける（図１Ａ参照）。増幅に対するこの損傷の効果は、増幅前に酵素混合物と一緒にＤＮＡをインキュベートすることによって逆転し、単位複製配列収率は増加し得る（図１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄ参照）。さらに、「非損傷」ＤＮＡの単位複製配列収率も、上記酵素混合物を添加することによって増加させることができる。

実施例１によれば、ＤＮＡの増幅に対する酵素混合物の効果は、ＡＰエンドヌクレアーゼ又はリガーゼの単一のタイプに依存せず、代わりに複数の代替源からのエンドヌクレアーゼ又はリガーゼを使用することができる。例えば、耐熱性ＴｔｈＥｎｄｏＩＶはＥ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶと同様に有効であることが判明し、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼは耐熱性Ｔａｑリガーゼと同様に有効であった。

実施例２及び図２は、増幅収率に対する別のタイプのＤＮＡ損傷、すなわち、脱プリンの負の効果を示す。脱プリンは、熱及びクエン酸塩の存在下で引き起こされる。さらに、実施例２によれば、ＤＮＡ増幅に対する酵素混合物の効果は、ポリメラーゼの単一のタイプに依存せず、複数の代替源からのポリメラーゼを使用することができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｌＩをＴａｑＤＮＡポリメラーゼで、又はＴａｑとＶｅｎｔ（登録商標）の各ＤＮＡポリメラーゼの混合物で置換して、収率を増加させることができる。

実施例３及び図３によれば、増幅収率の増加を短い（２００ｂｐ）断片によって観察することができる。実際に、増幅収率の増加は、１００塩基ほども短いＤＮＡテンプレートから１００ｋｂほども長いＤＮＡテンプレートまで広いサイズ範囲で認められ、１００ｋｂよりもさらに大きいＤＮＡに対する増幅収率を達成できると考えられる。サイズの上限は、増幅混合物中のポリメラーゼによってのみ制限される。

図３は、ＤＮＡが天然のままの形態（例えば、生物自体が保存されている生物の細胞内）での保存によって損傷を受けたときでも、増幅前の酵素混合物の添加によって増幅収率がかなり増加することも示している。酵素混合物をテンプレートＤＮＡに増幅前に添加したが、類似の収率効果は、テンプレートＤＮＡを耐熱性等価物である酵素混合物と一緒に増幅中又は増幅前段階中にインキュベートするときにも見ることができる。

実施例４及び図４によれば、リガーゼ単体でも単位複製配列収率を増加させることができるが、ＡＰエンドヌクレアーゼの添加はさらに役立つ。この実施例では、リガーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼを増幅前に使用したときに、最良の結果が認められた。また、この実施例によれば、修復はＤＮＡサイズに依存しない。例えば、５ｋｂと１０ｋｂの各単位複製配列で類似の結果が得られた。

実施例５及び図５によれば、増幅収率はリガーゼを用いて増加させることができ、この効果は、単一のリガーゼ源に限定されずに得ることができる。図５によれば、ＴａｑリガーゼとＴ４リガーゼはどちらも、プレインキュベーション混合物中に追加の酵素なしで用いたときでも、増幅収率の増加に有効である。この効果は、（耐熱性であれば）リガーゼを増幅混合物に添加した場合にも生じると考えられる。図５は、損傷を与える種々の作用物質に自然界で曝された土壌試料から直接得られる環境ＤＮＡを増幅するこの手法の利点も示す。

本明細書で引用する全ての参考文献並びに２００４年１０月２１日に出願された米国仮出願第６０／６２０，８９６号、２００５年１月２４日に出願された同６０／６４６，７２８号及び２００５年４月２２日に出願された同６０／６７３，９２５号を参照により本明細書に組み込まれる。
実施例

種々の損傷度を有するＤＮＡの増幅収率の向上
増幅前にＤＮＡを修復するために選択試薬の使用を最適化するアッセイを開発した。

種々の熱損傷度の生成
熱処理によって種々のＤＮＡ損傷量を誘導した。これを以下の通り実施した。すなわち、０．５ｍｇ／ｍｌのラムダＤＮＡ（ＮＥＢ＃Ｎ３０１１，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１００μＬを別々の管に等分し、ＰＥ２７００サーマルサイクラー中で９９℃でそれぞれ３０秒、６０秒、９０秒、１２０秒及び１８０秒間熱処理した。試料を前処理せずに増幅用テンプレートとして用いた。

残りの損傷ＤＮＡを酵素混合物で以下の通り前処理した。すなわち、損傷ＤＮＡテンプレートを以下の混合物中で室温で１０分間インキュベートした。

ＤＮＡ（５ｎｇ、２ｎｇ及び１ｎｇ）、
１００μＭｄＮＴＰｓ（ＮＥＢ＃Ｍ０４４７，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、
１ｍＭＮＡＤ^＋（Ｓｉｇｍａ＃Ｎ−７００４，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、
Ｔａｑリガーゼ（ＮＥＢ＃Ｍ０２０８，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）８０単位又はＥ．ｃｏｌｉリガーゼ４０−１００単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｅ．ｃｏｌｉｐＰｏｌＩ）ＮＥＢ＃Ｍ０２０９，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）０．１単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ（ＮＥＢ＃Ｍ０３０４，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１０単位又はＴｔｈＥｎｄｏＩＶ１０単位、
１× ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤（ＮＥＢ＃Ｂ９００４，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）最終体積９６μＬ。

反応の最後に試料を氷に移し、次いで増幅した。

ＤＮＡ増幅反応
ラムダのＤＮＡ増幅を以下のプライマー、すなわち、ＣＧＡＡＣＧＴＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧ（Ｌ７２−５Ｒ）（配列番号１）及びＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣ（Ｌ３０３５０Ｆ）（配列番号２）を用いて、ＷａｎｇらＮｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３２：１１９７−１２０７（２００４）の方法に従って実施した。

増幅混合物４μｌを上記修復混合物９６μｌに添加した。増幅混合物は、ｄＮＴＰｓ１００μＭ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ５単位、Ｖｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼ０．１単位、５×１０−７ＭプライマーＬ７２−５Ｒ及び５×１０−７ＭプライマーＬ３０３５０Ｆの１× ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤溶液を含んだ。

酵素保存緩衝剤の効果を補正するために、修復酵素を反応から省略したときには、その保存緩衝剤の適切な量を反応物に添加した。いずれの場合においても、増幅反応物を以下のパラメータ、すなわち、９５℃２０秒１サイクル、続いて９４℃５秒、次いで７２℃５分２５サイクルでサーマルサイクラー中に置いた。増幅された単位複製配列サイズは５ｋｂであった。

ＤＮＡ（５ｋｂ）の増幅結果を１％アガロースゲル電気泳動によって求めた。６×添加色素（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３^ｒｄｅｄ．，ｅｄｓ．ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１，ｐｐ．５．４−５．１７）を増幅反応物１００μｌに添加した。次いで、この溶液２０μｌを、サイズ標準としての２−ｌｏｇｌａｄｄｅｒ（ＮＥＢ＃Ｎ３２００，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１μｇと一緒にアガロースゲルに載せた。

各試料の増幅ＤＮＡ量をゲル電気泳動によって比較した。結果を図１Ａに示す。熱処理後かつ増幅前に試料を酵素混合物で処理すると、増幅収率がかなり増加した（図１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄ）。

（クエン酸処理後の）誘導された脱塩基部位を有するＤＮＡからの、酵素混合物による前処理後の単位複製配列収率の増加
脱塩基部位に起因する種々の損傷度の生成
損傷ＤＮＡの修復度を評価するために、まず、種々の量のＤＮＡ損傷をクエン酸処理によって引き起こした。これを以下の通り実施した。

Ｉｄｅ，Ｈ．，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２（３２）：８２７６−８３（１９９３）に記載のようにＤＮＡを脱プリンした。ラムダＤＮＡ（ＮＥＢ＃Ｎ３０１１，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）をエタノール沈澱させた。ＤＮＡを脱プリン緩衝剤（１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ５．０）に０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁させ、７０℃で０、２０、４０、８０、１２０及び１６０分間インキュベートした。次いで、試料をエタノール沈澱させ、ＥＢ緩衝剤（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に再懸濁させた。ＤＮＡ含有溶液のＡ２６０を測定することによってＤＮＡ濃度を求めた。

酵素混合物によるＤＮＡの前処理
損傷ＤＮＡを以下の混合物中で室温で１０分間インキュベートした。

ＤＮＡ（２．５ｎｇ／１２０分損傷）、
１００μＭｄＮＴＰｓ、
１ｍＭＮＡＤ＋、
Ｔａｑリガーゼ８０単位、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．１単位又はＥ．ｃｏｌｉＰｏｌＩ（ＮＥＢ＃Ｍ０２０９，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ））０．１単位又はＴａｑ０．１単位：Ｖｅｎｔ（登録商標）Ｐｏｌ、（ＮＥＢ＃Ｍ０２５４，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ））０．００２単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ１０単位、
１× ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤最終体積９６μｌ。

上記混合物を室温で１０分間インキュベートし、次いで増幅前に氷に移した。

ＤＮＡ増幅反応
増幅を実施例１に記載のように実施して５ｋｂ単位複製配列を生成させた。脱塩基部位を含むラムダＤＮＡを酵素混合物で処理することによって、単位複製配列収率は負の対照よりも増加した（図２Ａ）。種々の酵素混合物を用いた一連の前処理の結果を図２Ｂに示す。酵素混合物をポリメラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｌＩ又はＴａｑ：Ｖｅｎｔ（登録商標））に関して変化させた。

防腐剤中に保存後、無処置の生物から抽出したＤＮＡの増幅収率の改善
Ｂｕｃｋｌｉｎ，Ａ．＆Ａｌｌｅｎ，Ｌ．Ｄ．Ｍｏｌ．ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔＥｖｏｌ．３０（３）：８７９−８８２（２００４）に記載のようにＭｅｇａｎｙｃｔｉｐｈａｎｅｓｎｏｒｖｅｇｉｃａ（クリール）からゲノムＤＮＡを単離した。クリールを１９９９年からエタノールに保存した。

クリールＤＮＡの酵素混合物による前処理を以下の通り実施した。

Ｍ．ｎｏｒｖｅｇｉｃａゲノムＤＮＡ５０ｎｇ、
１００ μＭｄＮＴＰｓ、
１ｍＭＮＡＤ＋、
Ｔａｑリガーゼ４０単位、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．５単位、Ｖｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼ０．２単位、又はＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．０５単位とＶｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ＋）０．００１単位を含むＴａｑ：Ｖｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ＋）混合物、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ１０単位、
１× Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤最終体積９６μｌ。

この反応物を室温で１５分間インキュベートした後、増幅段階に進んだ。

ＤＮＡ増幅反応
増幅プライマーは、Ｂｕｃｋｌｉｎ，Ａ．＆Ａｌｌｅｎ，Ｌ．Ｄ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔ．Ｅｖｏｌ．３０（３）：８７９−８２（２００４）に記載の５２Ｆ及び２３３Ｒに対応し、２００ｂｐ単位複製配列を生成した。

５２Ｆ：ＴＴＴＴＴＡＧＣＡＡＴＡＣＡＣＴＡＣＡＣＡＧＣＡＡ（配列番号３）
２３３Ｒ：ＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＴＣＡＣＧ（配列番号４）
プライマーを最終濃度０．５μＭまで添加し、各ｄＮＴＰを最終濃度２００μＭまで添加した。次いで、５０：１Ｔａｑ：Ｖｅｎｔ（登録商標）混合物（反応物に添加したＴａｑＤＮＡポリメラーゼ５単位及びＶｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼ０．１単位）１μｌを各反応物に最終体積１００μＬまで添加した。

対照反応（レーン１）では、ＥｎｄｏＩＶも、Ｔａｑリガーゼも、前処理ポリメラーゼも添加しなかった。したがって、体積を調節した。修復酵素を省略した反応物においては、緩衝剤効果を補正するために、適切な量の酵素保存緩衝剤を添加した。

サイクリング条件は以下の通りであった。９４℃で３０秒、５２℃で３０秒及び７２℃で１分４０秒を４０サイクル。上述したように、２５μＬ（反応物の１／４）を１％アガロースゲルに載せ、調製し、電気泳動させ、可視化した。

上記酵素混合物を用いた試料のプレインキュベーション後に、クリールゲノムＤＮＡからの単位複製配列収率の増加を認めた（図３）。

熱損傷ＤＮＡを用いた１０ｋｂ単位複製配列の収率増加
熱損傷ＤＮＡを実施例１に記載のように調製した。ラムダＤＮＡを９９℃に１８０秒間加熱した。

酵素混合物による損傷ＤＮＡの前処理を以下の通り実施した。

ラムダＤＮＡ（熱処理を１８０秒間受けたＤＮＡ１μｇ）、
１００ μＭｄＮＴＰｓ、
１ｍＭＮＡＤ＋、
Ｔａｑリガーゼ８０単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｌＩ０．１単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ１００単位、
１× ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤体積９６μＬまで。

混合物を増幅前に１０分間インキュベートした。

下記以外は実施例１に記載のようにＤＮＡ増幅を実施した。プライマーを上記プレインキュベーション混合物９６μｌに添加した。プライマーＬ７１−１０Ｒ（配列ＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＴＴＡＴＧＣＧＴＣＣＣＣＡＧＧ）（配列番号５）で実施例１のＬ７２−５Ｒを置換した。ｉｃｙｃｌｅｒサーマルサイクラープログラムは、９５℃２０秒１サイクル、９５℃５秒、７２℃１０分２５サイクル、次いで７２℃１０分１サイクルであった。単位複製配列サイズは１０ｋｂであった。

下記以外実施例１に記載のようにＤＮＡを可視化した。６×ローディングバッファー２０μｌを増幅反応物１００μｌに添加した。この溶液１０μｌをＨ_２Ｏ及び１×ローディングバッファーで１００μｌに希釈した。この溶液２０μｌを各レーンに添加した。ゲルは０．８％アガロースゲルであった。結果を図４に示す。

土壌試料から抽出したＤＮＡの増幅収率の改善
ＭｏＢｉｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ製ＵｌｔｒａＣｌｅａｎＳｏｉｌＤＮＡキット（カタログ＃１２８００−５０）を用いて土壌から環境ＤＮＡを単離した。

リガーゼによるＤＮＡの前処理
土壌から単離した環境ＤＮＡ０．６μｇと下記（ａ）及び（ｂ）の２種類のリガーゼのうち１種類とを含む最終体積１００μｌで反応混合物を形成した。次いで、この反応混合物を室温で１５分間インキュベートした。

（ａ）１× Ｔａｑリガーゼ緩衝剤（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）及びＴａｑリガーゼ８０単位。

（ｂ）１× Ｔ４リガーゼ緩衝剤（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）及びＴ４リガーゼ（ＮＥＢ＃Ｍ０２０２，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）８００単位。

反応混合物１μｌを下記増幅反応に使用した。

ＤＮＡ増幅反応
プライマーＧＧＧＧＧＸＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡ（配列番号６）及びＧＧＧＧＧＸＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ（配列番号７）（Ｍ＝Ｃ又はＡ、Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｘ＝８−オキソ−グアニン）を用いてＤＮＡ増幅を実施した。これらのプライマーは、単位複製配列サイズ１．６Ｋｂの１６ＳｒＤＮＡを標的にする。

反応物５０μｌは、プライマーの各々１０ｐｍｏｌ、修復した環境ＤＮＡ１μｌ、２００μＭｄＮＴＰｓ、１× ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１．２５単位を含んだ。以下のサイクリングパラメータを用いて増幅を実施した。９４℃５分１サイクル、９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃１分４０秒３２サイクル、次いで７２℃５分１サイクル。

ゲル電気泳動を実施例１に記載のように実施した。結果を図５に示す。

紫外光損傷ＤＮＡの増幅収率の改善
ＤＮＡ修復の有効性を評価する条件を決定するために、ラムダＤＮＡ（ＮＥＢ＃Ｎ３０１１，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）５０μｇをＴＥ緩衝剤（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で濃度５０μｇ／ｍｌに希釈し、３６Ｊ／ｍ^２のＵＶ光で０、１０、２０、３０、４０及び５０秒間照射した。

損傷ＤＮＡを以下の混合物中で室温で１５分間インキュベートした。

ＤＮＡ（０、１０、２０、３０、４０又は５０秒間損傷を受けたラムダＤＮＡ５０ｎｇ）、
２００ μＭｄＮＴＰｓ、
１ｍＭＮＡＤ＋、
Ｔａｑリガーゼ４００単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ０．１単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ１０単位、
（Ｔ４ＥｎｄｏＶとも称される）Ｔ４ｐｄｇ８０単位又は１０単位。（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、
Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤体積５０μｌまで。

１５分間インキュベーション後、反応混合物５０μｌを増幅溶液５０μｌに添加した。増幅溶液は、各プライマー（実施例１に記載のＬ７２−５Ｒ及びＬ３０３５０Ｆ又はＬ７２−２Ｒ（ＤＮＡ配列はＣＣＡＴＧＡＴＴＣＡＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＧであった。）（配列番号８）４０ｐｍｏｌ、１× Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤、１ｍＭＮＡＤ^＋、２００μＭｄＮＴＰｓ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ＃Ｍ０２６７，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）２．５単位及び最終体積５０μＬまでのＨ_２Ｏからなった。修復反応物５０μＬを増幅溶液５０μｌと混合して最終体積１００μｌとした。

この１００μｌ溶液をサーマルサイクラーに入れた。Ｌ７２−５ＲとＬ３０３５０Ｆプライマーの組み合わせの場合、
９４℃５分１サイクル；９４℃３０秒、５８℃６０秒及び７２℃４分３０サイクル；７２℃５分１サイクル。

Ｌ７２−２ＲとＬ３０３５０Ｆプライマーの組み合わせの場合、
９４℃５分１サイクル；９４℃３０秒、５８℃６０秒及び７２℃２分３０サイクル；７２℃５分１サイクル。

増幅産物の存在を、１．８％アガロースゲル上で臭化エチジウムを用いて可視化した。任意のバンドのサイズを２−ｌｏｇｌａｄｄｅｒ（ＮＥＢ＃Ｎ３２００Ｓ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）サイズ標準を含むレーンと比較した。結果を図８に示す。

ヌクレオチド除去修復タンパク質ＵｙｒＡ、ＵｙｒＢ及びＵｙｒＣを用いたＤＮＡの増幅収率の改善
ヌクレオチド除去修復に関与するタンパク質を含む酵素混合物を用いて試料をプレインキュベートした後に、クリールゲノムＤＮＡからの単位複製配列収率の増加を求める。

酵素混合物による保存ＤＮＡの前処理を以下の通り実施する。

保存ＤＮＡを以下の混合物中で４−３７℃で１−１８０分間インキュベートする。

ＤＮＡ：Ｍ．ｎｏｒｖｅｇｉｃａゲノムＤＮＡ５０ｎｇ、
１００ μＭｄＮＴＰｓ、
１ｍＭＡＴＰ、
Ｔａｑリガーゼ４００単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ０．１単位、
１０ｎＭＥ．ｃｏｌｉＵｖｒＡ、２５０ｎＭＥ．ｃｏｌｉＵｖｒＢ（又は変異体ＵｖｒＢ^＊）、＋又は−５０ｎＭＥ．ｃｏｌｉＵｖｒＣ。

１ＸＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤最終体積９６μｌ。

＊変異体ＵｖｒＢについては、Ｚｏｕ，Ｙ．，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３：４１９６−４２０５（２００４）を参照されたい。

ＤＮＡ増幅反応を実施例３に記載のように実施する。

ヘテロ二重鎖の酵素開裂によるＤＮＡ増幅反応物の配列の正確度の向上
実験条件
Ａ．ＴａｑリガーゼをＴ７ＥｎｄｏＩに添加すると、ＤＮＡを無作為に分解することなく、反応混合物中のＴ７ＥｎｄｏＩ：ＤＮＡ定量（ｒａｔｉｏｎ）が増加することが示された。この手法によって、増幅反応におけるミスマッチに起因する望ましくないヘテロ二重鎖を削減することができる。

アッセイは、十字構造を含むスーパーコイルＤＮＡを漸増量のＴ７ＥｎｄｏＩで処理することに依拠する。

Ｔ７ＥｎｄｏＩ（ＮＥＢ＃Ｍ０３０２，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）０、１．６、３．１、６．２、１２．５、２５、５０、１００、２００又は４００単位を、ｐＵＣ（ＡＴ）（Ｇｕａｎ，Ｃ．，ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３：４３１３−４３２２（２００４））１μｇ及び１× ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢ＃Ｂ７００２Ｓ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）で構成される反応物５０μｌに添加した。プラスミドｐＡＴ２５ｔｅｔＡをｐＵＣ（ＡＴ）の代わりに使用することができる（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．＆Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：１６９−１７８（１９９７））及びＢｏｗａｔｅｒ，Ｒ．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：９２６６−９２７５（１９９４））。別の反応セットを同時に設置し、上記と同じ成分に１ｍＭＮＡＤ^＋（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｎ−７００４，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び（ＮＥＢ＃Ｍ０２０８の原料を濃度１００ｕ／μｌで使用した）Ｔａｑリガーゼ１００単位を添加して使用した。全反応物を３７℃で６０分間インキュベートした。

反応物を０．９％ＴＢＥアガロースゲル上で泳動させ、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光で可視化することによって、結果を分析した（図９参照）。Ｔ７ＥｎｄｏＩなしでは、ｐＵＣ（ＡＴ）プラスミドは、ゲル上でスーパーコイル型（低バンド）及び弛緩型環状（ｒｅｌａｘｅｄｃｉｒｃｕｌａｒ）型（高バンド）に対応する２本のバンドが生成した。

Ｔ７ＥｎｄｏＩは、スーパーコイルｐＵＣ（ＡＴ）を弛緩型環状型と、スーパーコイル型と弛緩型環状型の中間である線状型とに分解した。ある１７ＥｎｄｏＩ：ＤＮＡ比では、バンドが尾を引き、Ｔ７ＥｎｄｏＩが非特異的酵素活性によってＤＮＡを分解したことが示された。Ｔａｑリガーゼの存在によって、使用可能なＴ７ＥｎｄｏＩとＤＮＡの比がかなり増加した。この比は、国際公開第２００５／０５２１２４号に記載の変異体Ｔ７ＥｎｄｏＩでＴ７ＥｎｄｏＩを置換することによってさらに改善する。

Ｂ．ＰＣＲ反応物からヘテロ二重鎖を除去するＴ７ＥｎｄｏＩ及びリガーゼ混合物の有効性を判定する実験条件
土壌からのＤＮＡの単離及び精製ＤＮＡの増幅を、Ｔ７ＥｎｄｏＩ又はその変異体５単位を任意で添加して実施例５に記載のように実施する。Ｔ７Ｅｎｄｏ１又はその変異体を添加するときには、増幅サイクルを追加する（３７℃１５分１サイクル）。最終段階は、形成されるヘテロ二重鎖をＡＰエンドヌクレアーゼによって開裂するものである。

ゲル電気泳動を実施例１に記載のように実施する。Ｌｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｌ．＆Ｋｌｅｉｎ，Ｄ．Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２８：６７６−６８１（２０００））に記載のように、ヘテロ二重鎖ＤＮＡをゲル上で可視化する。Ｔ７ＥｎｄｏＩ又はその変異体の存在下でヘテロ二重鎖ＤＮＡが存在しないことは、Ｔ７ＥｎｄｏＩ又はその変異体とリガーゼの有効性を示している。

単位の定義は、本明細書で引用した酵素の各々の製品説明と一緒に、ＮＥＢカタログ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ中に記述されている。例えば、Ｔ７ＥｎｄｏＩ又はその変異体の単位の定義は、スーパーコイルプラスミド１μｇの９０％を超えるスーパーコイルプラスミドを９０％を超える線状ＤＮＡに反応体積５０μｌ中で３７℃１時間で転化するのに必要な酵素量である。

Ｔ７ＥｎｄｏＩ：ＤＮＡ比は、リガーゼの存在下でＤＮＡの非特異的開裂を増加させずに増加させることができる。

酸化的損傷後のＤＮＡ増幅反応物の配列の正確度の向上
酸化的損傷を有するＤＮＡの作製
酸化的損傷を受けやすいＤＮＡはｐＷＢ４０７であった（Ｋｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，Ｍ．Ｂ．ｅｔａｌ．Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１：６１３９−４７（２００３））。既報のようにメチレンブルー（ＭＢ）と可視光の組み合わせを用いて損傷を起こした（Ｓａｔｔｌｅｒ，ｅｔａｌ．Ａｒｃｈ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ．３７６（１）：２６−３（２０００））。広げたパラフィルムにプラスミドＤＮＡ（蒸留水中２００μｇ／ｍｌ）を滴下した（液滴５０μｌ）。ＭＢを０から５０（０、３、６、１２．５、２５及び５０）μｇ／ｍｌの最終濃度まで液滴に添加した（最終体積１００μｌ）。これらのパラフィルムを載せたプレートを氷上に置き、１×１００−Ｗランプで８分間照射した。ＭＢ−光処理ＤＮＡを沈澱させ、乾燥させ、次いでＴＥ緩衝剤（ｐＨ８．０）５０μｌに再懸濁させた。最終ＤＮＡ濃度を２６０ｎｍにおける吸光度によって測定した。

ＤＮＡ増幅条件
ｌａｃＺ遺伝子を含むｐＷＢ４０７の一部をプライマー３１６−１３８、ＴＧＴＣＧＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＣ（配列番号９）及び３１６−１３７、ＣＧＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡ（配列番号１０）を用いて増幅した。プライマー３１６−１３８及び３１６−１３７は、それぞれ既報のプライマーＫｆｄ−２９及びＨ３Ｂｌａ３４を基にした（Ｋｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，Ｍ．Ｂ．ｅｔａｌ．Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１：６１３９−４７（２００３））。ＰＣＲ反応物１００μＬは、テンプレートＤＮＡ１０又は５０ｎｇ（必要に応じて示す。）及び各プライマー４０ピコモルを含んだ。使用するサイクリング条件を、増幅に用いた熱安定ポリメラーゼに応じて変えた。

ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０２６７Ｓ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いたときのサイクリング条件は、９４℃５分１サイクルの初期変性段階、次いで９４℃３０秒、５８℃６０秒及び７２℃３分３０秒３０サイクル、最後に７２℃５分であった。

ＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢｃａｔ＃Ｆ−５３０Ｓ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いたときのサイクリング条件は、９８℃３０秒１サイクルの初期変性段階、次いで９８℃１０秒、６２℃３０秒及び７２℃１分３０秒３０サイクル、最後に７２℃５分であった。

上述したように反応物２５μＬを１．６％アガロースゲルに載せ、調製し、電気泳動させ、可視化して、反応結果を分析した。使用したマーカーは２−ｌｏｇＤＮＡｌａｄｄｅｒ（ＮＥＢｃａｔ＃Ｎ３２００Ｓ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）であった。

増幅の正確度の測定
ｐＷＢ４０７テンプレートからのＤＮＡ増幅の正確度を、Ｂａｒｎｅｓ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｅ１１２：２９−３５（１９９２）及びＫｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，ｅｔａｌ．Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１：６１３９−４７（２００３）に記載のように求めた。ｌａｃＺ遺伝子を含む単位複製配列を、種々の量の酸化的損傷を受けたプラスミドｐＷＢ４０７から生成させた。メチレンブルーを用いて上述したように酸化的損傷を実施した。テンプレート５０ｎｇを用いて上述したようにＰＣＲ反応を実施した。サイクリング後、制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ１０単位をＰＣＲ反応物各１００μＬに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。この段階で元のテンプレートプラスミドを除去した。次に、生成した増幅産物をイソプロパノールを用いたフェノール／クロロホルム沈殿によって抽出した（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３^ｒｄｅｄ．，ｅｄｓ．ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１，ｐｐ．６．２５，Ａ８．１２−Ａ８．２４）。沈澱生成物をＨ_２Ｏに再懸濁させ、製造者（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）の推奨条件を用いて、制限エンドヌクレアーゼＳｔｙＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切断した。６５℃に２０分間加熱することによってＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｔｙＩ酵素を不活性化してＤＮＡ消化反応を停止した。制限酵素による消化産物をｍｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−１００カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて精製して短いＤＮＡ断片を除去した。

全量５０μｌの修復反応混合物は、ｐＷＢ４０７単位複製配列１０又は５０ｎｇ＋／−メチレンブルーインキュベーションを含んだ。修復反応物は、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８２５℃）、１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２ｍＭＭｇＳＯ_４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭＮＡＤ^＋、２００μＭｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ）及び種々の修復酵素混合物を含んだ。

別個に、又は種々の組み合わせで、総容積５０ｕｌで使用した修復酵素混合物は、
Ｆｐｇ０．４単位、ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０２４０Ｓ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、
Ｔａｑリガーゼ２００単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ０．１単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ１０単位、
１ｍＭＮＡＤ＋、
１００ μＭｄＮＴＰｓ、
１× Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤
であった。

反応物を２５℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＣＲ混合物（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８２５℃）、１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２ｍＭＭｇＳＯ_４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭＮＡＤ^＋、２００μＭｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ）５０μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０２６７Ｓ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）２．５単位を修復反応物５０μＬに添加し、この新しい溶液をＰＣＲ用サーマルサイクリング条件に供した。これらの反応物からの単位複製配列を精製し、他の上記単位複製配列に対して記述したように制限酵素で消化した。

単位複製配列をｐＷＢ４０７プラスミドにクローン化した。制限エンドヌクレアーゼＳｔｙＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、続いてａｎｔａｒｃｔｉｃｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０２８９Ｓ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のＤＮＡ１単位／μｇと一緒に３７℃で３０分間インキュベートすることによって、プラスミドｐＷＢ４０７を調製した。脱リン酸したｐＷＢ４０７ベクター骨格をアガロースゲル電気泳動によって精製した。ゲル抽出をＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって実施した。

消化した単位複製配列を、反応物３０μＬ中でベクターＤＮＡ約０．１μｇ及び単位複製配列約０．５μｇを用いて、調製したｐＷＢ４０７プラスミドに連結した。Ｔ４リガーゼを用いて、製造者（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の推奨条件に従って連結を実施した。連結産物をＥ．ｃｏｌｉ系統ＷＢ４４１（Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｇｅｎｅ１１２：２９−３５（１９９２））に電気穿孔により挿入した。用いた選択的表示プレートは、５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び８０ｕｇ／ｍｌＸｇａｌを含むＬＢプレートであった。プレーティング前に、細菌を濃厚なブロス中で３７℃で１時間インキュベートしてアンピシリン耐性を発現させた。リガーゼ処理していない対照形質転換はコロニーを生成しなかった。３７℃で１日及び２５℃で１日又は２日後にコロニーを青色について調べた。結果を図１０及び１１に示す。

脱アミノ損傷後のＤＮＡ増幅反応物の配列の正確度の向上
脱アミノＤＮＡの作製
脱アミノを受けやすいＤＮＡはｐＷＢ４０７であった（Ｋｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，ｅｔａｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２００３，Ｖｏｌ．３１：６１３９−４７）。Ｙａｎ，Ｗ．ｅｔａｌ．ＪＶｉｒｏｌ．２００３Ｆｅｂ；７７（４）：２６４０−５０に記載のように、亜硝酸を用いたランダム変異導入によって損傷を起こした。亜硝酸は、ＤＮＡ中のグアニンをキサンチンに、シトシンをウラシルに、アデニンをヒポキサンチンに脱アミノすることができる。

プラスミドＤＮＡ（２ｍｇ）を０．７ＭＮａＮｏ_２の１Ｍ酢酸緩衝剤溶液、ｐＨ４．６で処理した。氷冷１ＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．９４体積を添加して種々の時点で反応を停止した。プラスミドＤＮＡを沈澱させ、乾燥させ、次いでＴＥ緩衝剤１００ｍｌに再懸濁させた。

脱アミノ塩基を修復する前処理反応
別個に、又は種々の組み合わせで、総容積５０ｍｌで使用した修復酵素混合物は、以下の通りである。

（ａ）
ヒトＡａｇ１単位、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、
ＥｎｄｏＩＩＩ（ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０２６８Ｓ）２単位、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、
ＥｎｄｏＶ（ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０３０５Ｓ）２単位、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、
ＵＤＧ（ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０２８０Ｓ）２単位、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ２００単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ０．１単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ１０単位、
１ｍＭＮＡＤ＋、
１００ｍＭｄＮＴＰｓ、
１× Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤。

（ｂ）
ＥｎｄｏＶ（ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０３０５Ｓ）２単位、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、
ＵＤＧ（ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０２８０Ｓ）２単位、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ２００単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ０．１単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ１０単位、
１ｍＭＮＡＤ＋、
１００ｍＭｄＮＴＰｓ、
１× Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤。

（ｃ）
ＥｎｄｏＶ（ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０３０５Ｓ）２単位、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ２００単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ０．１単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ１０単位、
１ｍＭＮＡＤ＋、
１００ｍＭｄＮＴＰｓ、
１× Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤。

（ｄ）
ヒトＡａｇ１単位、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、
ＥｎｄｏＩＩＩ（ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０２６８Ｓ）２単位、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ２００単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ０．１単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ１０単位、
１ｍＭＮＡＤ＋、
１００ｍＭｄＮＴＰｓ、
１× Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤。

（ｅ）
ヒトＡａｇ１単位、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、
ＵＤＧ（ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０２８０Ｓ）２単位、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ２００単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ０．１単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ１０単位、
１ｍＭＮＡＤ＋、
１００ｍＭｄＮＴＰｓ、
１× Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤。

（ｆ）
ヒトＡａｇ１単位、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、
ＥｎｄｏＶ（ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０３０５Ｓ）２単位、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ２００単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ０．１単位、
Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ１０単位、
１ｍＭＮＡＤ＋、
１００ｍＭｄＮＴＰｓ、
１× Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤。

増幅反応条件及び増幅の正確度を実施例９に記載のように求めた。

単位の定義
好熱性リガーゼ単位
１単位は、全反応体積５０μｌ中で４５℃１５分間で、ＢｓｔＥＩＩによって消化されたラムダＤＮＡ１μｇの５０％連結を生じるのに必要な酵素量として定義される。

中温性リガーゼ単位
１単位は、全反応体積２０μｌ中で１６℃３０分間で、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたラムダＤＮＡ（５’ＤＮＡ末端濃度０．１２μＭ、３００μｇ／ｍｌ）の５０％連結を生じるのに必要な酵素量として定義される。

ＡＰエンドヌクレアーゼ単位
１単位は、全反応体積１０μｌ中で３７℃１時間で、単一のＡＰ部位を含む３４量体オリゴヌクレオチド二本鎖１ｐｍｏｌを開裂させるのに必要な酵素量として定義される。

中温性ポリメラーゼ単位
１単位は、［３Ｈ］−ｄＴＴＰを含む３３μＭｄＮＴＰｓ及び７０μｇ／ｍｌ変性ニシン精子ＤＮＡを用いて、全反応体積５０μｌ中で３７℃３０分間で、ｄＮＴＰ１０ｎｍｏｌを酸不溶性材料に取り込む酵素量として定義される。

好熱性ポリメラーゼ単位
１単位は、［３Ｈ］−ｄＴＴＰを含む２００μＭｄＮＴＰｓ及び２００μｇ／ｍｌ活性子ウシ胸腺ＤＮＡを用いて、全反応体積５０μｌ中で７５℃３０分間で、ｄＮＴＰ１０ｎｍｏｌを酸不溶性材料に取り込む酵素量として定義される。

ＵＤＧ及びＦｐｇの単位の定義については、（ＮＥＢカタログ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡを参照されたい。）。

指定の酵素と一緒にプレインキュベートした後、熱損傷を受けたラムダＤＮＡからの単位複製配列収率が増加したことを示す図である。図１Ａは、程度の異なる熱損傷を受けたＤＮＡテンプレート及びこの損傷のラムダＤＮＡの５ｋｂセグメントの増幅に対する効果を示す図である。ここで、熱処理を受けたラムダＤＮＡの５ｎｇ、２ｎｇ及び１ｎｇを、９９℃で０秒、３０秒、６０秒、９０秒、１２０秒又は１８０秒の熱処理による事前の損傷後に増幅した。増幅前には損傷ＤＮＡを酵素処理しなかった。増幅量を電気泳動後に求めた。増幅量は、１２０秒の熱処理によってかなり減少することが判明した。ゲル上の第１のレーン及び最終レーンは、２−ｌｏｇｌａｄｄｅｒサイズ標準（ＮＥＢ＃Ｎ３２００，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１μｇを含む。指定の酵素と一緒にプレインキュベートした後、熱損傷を受けたラムダＤＮＡからの単位複製配列収率が増加したことを示す図である。図１Ｂは、ラムダＤＮＡの５ｋｂセグメントの増幅に対してＴａｑリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ及びＥ．ｃｏｌｉＰｏｌＩを用いた、熱損傷を受けたラムダＤＮＡからの単位複製配列収率の増加を示す図である。ＤＮＡは図１Ａにおいて記述したように熱損傷を受けたが、増幅前に損傷ＤＮＡを酵素処理に供した。Ｔａｑリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ及びＥ．ｃｏｌｉＰｏｌＩを用いた１０分間の前処理反応後の増幅の結果を示す。単位複製配列収率は全体を通して増加したが、特に１２０秒及び１８０秒の熱損傷ＤＮＡで顕著であった。指定の酵素と一緒にプレインキュベートした後、熱損傷を受けたラムダＤＮＡからの単位複製配列収率が増加したことを示す図である。図１Ｃは、Ｔａｑリガーゼ、ＴｔｈＥｎｄｏＩＶ及びＥ．ｃｏｌｉＰｏｌＩによる、熱損傷を受けたラムダＤＮＡからの単位複製配列収率の増加を示す図である。増幅を図１Ｂに従って実施したが、増幅前の酵素処理はＥ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶの代わりにサーマスサーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＥｎｄｏＩＶを含んだ。サーマスアクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）リガーゼ、ＴｔｈＥｎｄｏＩＶ及びＥ．ｃｏｌｉＰｏｌＩを用いた１０分間の前処理反応後の増幅の結果を示す。単位複製配列収率は全体を通して増加したが、特に１２０秒及び１８０秒の熱損傷ＤＮＡで顕著であった。第１のレーンのみがサイズ標準（ｓｉｚｅｌａｄｄｅｒ）を含む。指定の酵素と一緒にプレインキュベートした後、熱損傷を受けたラムダＤＮＡからの単位複製配列収率が増加したことを示す図である。図１Ｄは、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ及びＥ．ｃｏｌｉＤＮＡＰｏｌＩによる、熱損傷を受けたラムダＤＮＡからの単位複製配列収率の増加を示す図である。増幅を図１Ｂに従って実施したが、増幅前の酵素処理はＴａｑリガーゼの代わりにＥ．ｃｏｌｉリガーゼを含んだ。９９℃に１８０秒間曝したラムダＤＮＡをテンプレートとして使用した。使用したテンプレートＤＮＡ量を各レーンの上部に示す。単位複製配列収率は、テンプレート量の各々について酵素前処理によって増加する。単位複製配列収率に対するテンプレートＤＮＡのクエン酸処理の効果を示す図である。図２Ａは、ラムダＤＮＡの５ｋｂセグメントの増幅結果を示す図である。ここで、ラムダＤＮＡをクエン酸緩衝剤中で７０℃に０、２０、４０、８０、１２０及び１６０分間加熱した。熱処理を受けた各試料５０ｎｇ、１０ｎｇ及び５ｎｇを増幅し、得られた生成物をゲル上で可視化して増幅度を求めた。増幅前には、選択した酵素でＤＮＡを処理しなかった。右側の最終レーンは、２−ｌｏｇｌａｄｄｅｒ１μｇを含む。単位複製配列収率に対するテンプレートＤＮＡのクエン酸処理の効果を示す図である。図２Ｂは、酵素混合物中で使用したポリメラーゼの種類にかかわらず、ラムダＤＮＡの５ｋｂ単位複製配列の収率増加を示す図である。熱／クエン酸による損傷を１２０分間受けたラムダＤＮＡを増幅前に種々の酵素で処理した。レーン１：２−ｌｏｇｌａｄｄｅｒ（ＮＥＢ＃Ｎ３２００，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１μｇ。レーン２：前処理なし。レーン３：Ｔａｑリガーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ及びＥ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶによる前処理。レーン４：Ｔａｑリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｌＩ及びＥ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶによる前処理。レーン５：Ｔａｑリガーゼ、Ｔａｑ：Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ混合物及びＥ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶによる前処理。クリールのエタノール保存試料から抽出し、増幅収率を増大させる種々のポリメラーゼ、リガーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼの１種類を含む酵素混合物で前処理したクリールゲノムの２００ｂｐセグメントの増幅結果を示す図である。レーン１：酵素によるクリールＤＮＡの前処理なし。レーン２：Ｔａｑリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ及びＴａｑポリメラーゼを用いてクリールＤＮＡを前処理。レーン３：Ｔａｑリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ及びＶｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼを用いてクリールＤＮＡを前処理。レーン４：Ｔａｑリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ及び５０：１Ｔａｑ：Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼを用いてクリールＤＮＡを前処理。熱損傷ＤＮＡからの１０ｋｂ単位複製配列の収率増加を示す図である。１８０秒熱損傷ＤＮＡを酵素混合物で前処理し、次いで増幅した。レーン１：２−ｌｏｇｌａｄｄｅｒサイズ標準（ＮＥＢ＃Ｎ３２００，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１μｇ。レーン２：Ｔａｑリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ及びＥ．ｃｏｌｉＰｏｌＩによる前処理。レーン３：Ｔａｑリガーゼ及びＥ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶによる前処理。レーン４：Ｔａｑリガーゼによる前処理。レーン５：対照−無処置のＤＮＡ。リガーゼ前処理によって環境ＤＮＡ（土壌試料抽出物）からの単位複製配列収率が増加することを示す図である。レーン１：２−ｌｏｇｌａｄｄｅｒサイズ標準（ＮＥＢ＃Ｎ３２００，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。レーン１：酵素前処理なし。レーン２：Ｔ４リガーゼによる前処理。レーン３：酵素前処理なし。レーン４：Ｔａｑリガーゼによる前処理。タンパク質がＴ４リガーゼと配列相同性を有することが明らかになったＧｅｎｂａｎｋ探索を示す図である。タンパク質がＴ４リガーゼと配列相同性を有することが明らかになったＧｅｎｂａｎｋ探索を示す図である。タンパク質がＴ４リガーゼと配列相同性を有することが明らかになったＧｅｎｂａｎｋ探索を示す図である。ＴｔｈＥｎｄｏＩＶのＤＮＡ配列（配列番号１１）を示す図である。ラムダＤＮＡをテンプレートとして用いてゲル電気泳動によって単位複製配列収率に対するＵＶ光の効果を示す図である。Ａ：ラムダＤＮＡに最高５０秒間ＵＶ照射すると、生成する２Ｋｂ単位複製配列の収率がわずかに減少する。Ｂ：ラムダＤＮＡに最高５０秒間ＵＶ照射すると、５Ｋｂ単位複製配列の収率が減少する。Ｃ：ＵＶ照射後の５ｋｂ単位複製配列の収率に対する、ラムダＤＮＡに添加した種々の反応混合物の効果を示す。レーン２−７は反応混合物の非存在下での対照である。レーン８−１３は、リガーゼ、ポリメラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼ＋Ｔ４ＰＤＧ１０単位を添加することの有益な効果の増大を示す。レーン１４−１９は、リガーゼ、ポリメラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼ＋Ｔ４ＰＤＧ８０単位を添加することの有益な効果の増大を示す。レーン１及び２０：２−ｌｏｇｌａｄｄｅｒサイズ標準（ＮＥＢ＃Ｎ３２００，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。ラムダＤＮＡをテンプレートとして用いてゲル電気泳動によって単位複製配列収率に対するＵＶ光の効果を示す図である。Ａ：ラムダＤＮＡに最高５０秒間ＵＶ照射すると、生成する２Ｋｂ単位複製配列の収率がわずかに減少する。Ｂ：ラムダＤＮＡに最高５０秒間ＵＶ照射すると、５Ｋｂ単位複製配列の収率が減少する。Ｃ：ＵＶ照射後の５ｋｂ単位複製配列の収率に対する、ラムダＤＮＡに添加した種々の反応混合物の効果を示す。レーン２−７は反応混合物の非存在下での対照である。レーン８−１３は、リガーゼ、ポリメラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼ＋Ｔ４ＰＤＧ１０単位を添加することの有益な効果の増大を示す。レーン１４−１９は、リガーゼ、ポリメラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼ＋Ｔ４ＰＤＧ８０単位を添加することの有益な効果の増大を示す。レーン１及び２０：２−ｌｏｇｌａｄｄｅｒサイズ標準（ＮＥＢ＃Ｎ３２００，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。ラムダＤＮＡをテンプレートとして用いてゲル電気泳動によって単位複製配列収率に対するＵＶ光の効果を示す図である。Ａ：ラムダＤＮＡに最高５０秒間ＵＶ照射すると、生成する２Ｋｂ単位複製配列の収率がわずかに減少する。Ｂ：ラムダＤＮＡに最高５０秒間ＵＶ照射すると、５Ｋｂ単位複製配列の収率が減少する。Ｃ：ＵＶ照射後の５ｋｂ単位複製配列の収率に対する、ラムダＤＮＡに添加した種々の反応混合物の効果を示す。レーン２−７は反応混合物の非存在下での対照である。レーン８−１３は、リガーゼ、ポリメラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼ＋Ｔ４ＰＤＧ１０単位を添加することの有益な効果の増大を示す。レーン１４−１９は、リガーゼ、ポリメラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼ＋Ｔ４ＰＤＧ８０単位を添加することの有益な効果の増大を示す。レーン１及び２０：２−ｌｏｇｌａｄｄｅｒサイズ標準（ＮＥＢ＃Ｎ３２００，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。リガーゼをＴ７ＥｎｄｏＩに添加することによって、正しい配列の比を増加させるために増幅混合物からのヘテロ二重鎖の除去を容易にする酵素：ＤＮＡ比の有用な範囲が拡大することを示す図である。Ｔａｑリガーゼ及びＴ７ＥｎｄｏＩをスーパーコイルＤＮＡに、各レーンに示す種々の量で添加した。図９ａは、Ｔａｑリガーゼを添加せずに、より多量のＴ７ＥｎｄｏＩを使用する対照を示す図である。スーパーコイルＤＮＡは、Ｔ７ＥｎｄｏＩ１２．５−２５単位を用いて、主に種々のサイズの断片に開裂する。図９ｂは、Ｔ７ＥｎｄｏＩ２００単位でも、リガーゼの非存在下では存在しない、線状ＤＮＡに対応するバンドが存在するように、Ｔａｑリガーゼ１００単位がＴ７ＥｎｄｏＩの存在下で非特異的開裂からＤＮＡを保護する仕方を示す図である。リガーゼをＴ７ＥｎｄｏＩに添加することによって、正しい配列の比を増加させるために増幅混合物からのヘテロ二重鎖の除去を容易にする酵素：ＤＮＡ比の有用な範囲が拡大することを示す図である。Ｔａｑリガーゼ及びＴ７ＥｎｄｏＩをスーパーコイルＤＮＡに、各レーンに示す種々の量で添加した。図９ａは、Ｔａｑリガーゼを添加せずに、より多量のＴ７ＥｎｄｏＩを使用する対照を示す図である。スーパーコイルＤＮＡは、Ｔ７ＥｎｄｏＩ１２．５−２５単位を用いて、主に種々のサイズの断片に開裂する。図９ｂは、Ｔ７ＥｎｄｏＩ２００単位でも、リガーゼの非存在下では存在しない、線状ＤＮＡに対応するバンドが存在するように、Ｔａｑリガーゼ１００単位がＴ７ＥｎｄｏＩの存在下で非特異的開裂からＤＮＡを保護する仕方を示す図である。酸化的に損傷を受けたＤＮＡ又は非損傷テンプレートからの単位複製配列収率に対する修復酵素処理の効果を示す図である。図１０Ａは、非損傷テンプレートｐＷＢ４０７への修復酵素の添加が単位複製配列収率に効果を示さないことを示す図である。図１０Ｂは、メチレンブルーの存在下でインキュベートした損傷テンプレート、プラスミドｐＷＢ４０７へのＦｐｇの添加が、収率に対して一貫した効果を有することを示す図である。Ｆｐｇの存在下又は非存在下でＴａｑリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ及びＥ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶを添加すると、単位複製配列収率は一貫して増加する。酸化的に損傷を受けたＤＮＡ又は非損傷テンプレートからの単位複製配列収率に対する修復酵素処理の効果を示す図である。図１０Ａは、非損傷テンプレートｐＷＢ４０７への修復酵素の添加が単位複製配列収率に効果を示さないことを示す図である。図１０Ｂは、メチレンブルーの存在下でインキュベートした損傷テンプレート、プラスミドｐＷＢ４０７へのＦｐｇの添加が、収率に対して一貫した効果を有することを示す図である。Ｆｐｇの存在下又は非存在下でＴａｑリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ及びＥ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶを添加すると、単位複製配列収率は一貫して増加する。修復酵素による処理後に損傷ＤＮＡからのＰＣＲ反応の正確度が向上することを示す図である。非損傷テンプレート、プラスミドｐＷＢ４０７のＰＣＲ前の修復酵素処理は、反応の正確度に大きな効果を示さない。メチレンブルーと一緒にインキュベートした損傷テンプレート、プラスミドｐＷＢ４０７を、Ｆｐｇ単体によって、又はＴａｑリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ及びＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼによっても処理すると、ＰＣＲの正確度が向上する。正確度の尺度は、以下で考察するｌａｃＺ含有単位複製配列をクローニングした後の白色コロニー数対青色コロニー数である。白色コロニーの割合が高いほど誤り率は高い。未知の損傷を受けたＤＮＡを処理して忠実度及び収率の少なくとも一方を向上させる流れ図である。

Claims

（ａ）エンドヌクレアーゼ（Ｅｎｄｏ）ＶＩの非存在下で、リガーゼとＮＡＤ＋又はＡＴＰから選択される補因子とを含む反応混合物中で、ポリヌクレオチドをインキュベートすること、
（ｂ）段階（ａ）中又は段階（ａ）後に増幅試薬を前記反応混合物に添加することによって、前記ポリヌクレオチドの増幅を前記反応混合物中で起こすこと、及び
（ｃ）段階（ａ）の非存在下よりも段階（ａ）の存在下で、増幅産物の忠実度又は収率の少なくとも一方を向上させること
を含む、損傷を受けたポリヌクレオチドの増幅産物の忠実度及び収率の少なくとも一方を向上させる方法。
段階（ｃ）が段階（ａ）におけるインキュベーション時間とは無関係である、請求項１に記載の方法。
リガーゼが耐熱性リガーゼである、請求項１に記載の方法。
前記損傷が、脱プリン／ピリミジン（ＡＰ）部位、変異を誘発されたヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、ニック、ギャップ及びＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−タンパク質架橋から選択される、請求項１に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが自然源から得られる、請求項１に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが保存生体材料から得られる、請求項１に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが法医学的証拠から得られる、請求項１に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが古代のものである、請求項１に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが組織生検から得られる、請求項１に記載の方法。
前記反応混合物が、さらにＴ７ＥｎｄｏＩ又はその変異体を含む、請求項１に記載の方法。
前記反応混合物が、さらにポリメラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の方法。
前記反応混合物が、さらにポリメラーゼ及びクラスＩＩＡＰエンドヌクレアーゼを含む、請求項２に記載の方法。
前記リガーゼがＴａｑリガーゼ及びＥ．ｃｏｌｉリガーゼから選択され、補因子がＮＡＤ＋である、請求項３に記載の方法。
前記ＡＰエンドヌクレアーゼがＴ４エンドヌクレアーゼ又はＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼを含む、請求項１１に記載の方法。
前記ＡＰエンドヌクレアーゼがＥ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶである、請求項１４に記載の方法。
前記ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼ若しくは古細菌ポリメラーゼ又はその変異体を含む、請求項１１に記載の方法。
古細菌ポリメラーゼがＰｆｕ、Ｖｅｎｔ（登録商標）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（登録商標）、９°Ｎｏｒｔｈ及びＧＢＤポリメラーゼから選択される、請求項１６に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、前記反応混合物が、ＤＮＡ１−１０００ｎｇに添加されたＥ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶ１−１００単位、Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｌＩ０．０５−０．２５単位及びリガーゼ５−５００単位を含む、請求項１１に記載の方法。
前記反応混合物がさらにＴ４ピリミジン２量体グリコシラーゼを含む、請求項１１、１２又は１８に記載の方法。
前記反応混合物がさらに［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）を含む、請求項１１、１２又は１８に記載の方法。
前記反応混合物がさらにＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤ及びＣｈｏの少なくとも１種類を含む、請求項１１、１２又は１８に記載の方法。
前記反応混合物がさらにＥｎｄｏＶ又はＥｎｄｏＩＩＩを含む、請求項１１、１２又は１８に記載の方法。
前記反応混合物がさらにＥｎｄｏＶとＵＤＧ及びＡａｇの少なくとも１種類とを、又はＥｎｄｏＩＩＩとＵＤＧ及びＡａｇの少なくとも１種類とを含む、請求項２２に記載の方法。
前記混合物がさらにＵＤＧ及びＡａｇを含む、請求項１１、１２又は１８に記載の方法。
前記増幅がＰＣＲ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、転写による増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅又は全ゲノム増幅である、請求項１に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが一本鎖ＲＮＡであり、前記増幅がＲＴ増幅である、請求項１に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドの増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応法において５０ヌクレオチドから１００，０００ヌクレオチドの範囲の大きさの単位複製配列を生成することができる、請求項１に記載の方法。
使用説明書及び１種類以上の酵素を含み、該酵素の少なくとも１種類はリガーゼであり、該１種類以上の酵素は、増幅混合物に添加して増幅を増強するために、又は増幅混合物の添加前に使用して増幅を増強するために処方される、増幅キット。
リガーゼ、ポリメラーゼ、及びＥｎｄｏＶＩを含まないＡＰエンドヌクレアーゼの有効量を含み、混合物が、組成物の非存在下でのポリヌクレオチドの増幅と比較して、該ポリヌクレオチドの増幅の収率及び忠実度の少なくとも一方を向上させることができる、
組成物。
増幅前混合物に使用するために体積１０−１００μｌ中に前記ＡＰエンドヌクレアーゼが１−１００単位の濃度で存在し、前記ポリメラーゼが０．０５−０．２５単位で存在し、前記リガーゼが５−５００単位で存在する、請求項２９に記載の組成物。
ＤＮＡ１−１０００ｎｇの修復に適切である、請求項３０に記載の組成物。
前記ＡＰエンドヌクレアーゼがタイプＩＩＡＰエンドヌクレアーゼである、請求項３１に記載の組成物。
前記ＡＰエンドヌクレアーゼがＥ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＩＶである、請求項３２に記載の組成物。
前記ポリメラーゼがＥ．ｃｏｌｉＰｏｌＩである、請求項２９に記載の組成物。
Ｔ４ピリミジン２量体グリコシラーゼをさらに含む、請求項２９に記載の組成物。
［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）をさらに含む、請求項２９に記載の組成物。
ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤ及びＣｈｏの少なくとも１種類をさらに含む、請求項２９に記載の組成物。
ＥｎｄｏＶ又はＥｎｄｏＩＩＩをさらに含む、請求項２９に記載の組成物。
ＥｎｄｏＶとＵＤＧ及びＡａｇの少なくとも１種類とを、又はＥｎｄｏＩＩＩとＵＤＧ及びＡａｇの少なくとも１種類とをさらに含む、請求項３３に記載の組成物。
ＵＤＧ及びＡａｇをさらに含む、請求項２９に記載の組成物。