JP2008517596A - 方法及び手段 - Google Patents
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Abstract
Description
被験化合物の存在下における、マクロファージによるアポトーシス細胞の摂取を刺激するアポEポリペプチドの能力を測定すること、
を含む、炎症活性の増加と関連した状態の治療又は予防のための化合物を同定及び/又は取得するための方法を提供する。
被験化合物の存在下における、アポE欠損マクロファージによる1つ以上のアポトーシスアポE欠損細胞の摂取を測定すること、
を含むことができる。
被験化合物の存在下における、アポトーシス細胞のマクロファージによる摂取を刺激する、アポEポリペプチドの能力を測定すること、
を含んでよい。
マクロファージによるアポトーシス細胞の摂取を測定すること、
を含むことができる。
本明細書に記載の方法を用いて、アポトーシス細胞食作用を刺激する化合物を同定及び/又は得て;そして
上記により同定された化合物を、医薬として許容可能な担体と混合する、
を含む。
i)本明細書に記載の方法を使用するなどして、アポトーシス細胞食作用を刺激する化合物を同定及び/または得ること、
ii)上記同定された化合物を合成すること、及び
iii)上記化合物を医薬組成物中に取り込むこと、
を含んでよい。
上記個体におけるアポEの発現及び/または活性を増加させることを含んでよい。
インビトロの食作用アッセイ
マウス腹腔マクロファージをすべての食作用アッセイのために使用した。マウス腹腔を氷温の滅菌Hank's溶液(Sigma)で洗浄することによって、マクロファージをC57B1/6(野生型)又はアポE-/-マウスのいずれかから無菌的に単離した。腹腔滲出細胞を予め冷却した滅菌ガラスチューブに保存し、その後RPMI培地で2回洗浄した(300g、10分で沈殿した)。細胞ペレットを最終的にRPMI+10%FCSに再懸濁し、そしてml当たり5×105細胞でプラスチック組織培養チャンバースライド(Nunc)上に蒔いた。マクロファージを37℃で2時間付着させ、そして単離の4〜10日後に食作用アッセイにおいて使用するまでRPMI+10%FCS中でインキュベーションする前に、冷Dulbecco's PBSで洗浄した。細胞の維持に使用したFCS中のウシアポEの存在による、いなかる可能性のある効果も除くために、血清を含まない条件下で、食作用アッセイにおいて使用するためのすべての細胞を完全に洗浄した。
成体雄性マウス(C57/Bl16、アポE-/-又はLDLR-/-マウスのいずれか(Ishibashi, S. et al 1994. J Clin Invest 93:1885);1群6匹)をCO2で窒息させてと殺し、そして血清の調製のために心臓穿刺によって血液を採取した。組織(肝臓の左葉、左肺及び脳の左辺縁)を解剖して迅速に氷温食塩水中にいれ、そしてOCT包埋媒体中に包埋し、−80℃で凍結した。食餌性脂肪負荷を受ける動物については、と殺前の10週間、通常の固形飼料を高脂肪含量固形飼料(1.25%コレステロール、7.5%飽和脂肪)に換えた。すべての他の動物は通常の固形飼料を受容し、そしてずっと水は自由摂取した。
すべての免疫蛍光染色は、Mosedale et alの記載の通りに、定量的免疫蛍光法のために最適化された条件下で実施した(Mosedale et al.上記)。すなわち、脂肪酸を含まないBSAを3%含むPBS中で30分間、切片を脱水し、そしてPBS/3%BSA中の一次抗体に18時間曝露した。PBS中での3分間の洗浄を3回した後、直接に標識した一次物を使用する以外は、スライドガラスを、PBS/3%BSA中25μg/mlの好適な蛍光標識した2次抗体に6時間曝露した。PBS中でさらに3回洗浄後、スライドガラスを水ですすぎ、空気乾燥してCitiflour AF-1下でマウントし、そして画像分析システムを用いて分析するまで、-20℃で保存した。以下の商業的に入手可能な一次抗体を使用した:抗マクロファージF4/80抗原抗体(MCAP497; Serotec; 25μg/ml);抗CD11b抗体(M1/70(MCA74G); Serotec; 25μg/ml);抗MHCクラスII抗体(I-Ab)(MCA1500F;Serotec; 20μg/ml);抗フィブリン抗体(ogen)(4440-8004;Biogenesis; 20μg/ml);抗マウスTNF-抗体(AB-410-NA;R&D Systems; 50μg/ml);抗PCNA抗体(M0879;Dako;12μg/ml)。すべての2次抗体は、最小交差反応性のロバ抗体(Jackson Immunoresearch)、すべての抗体溶液は、核を対比染色するためのブルーチャネル上で可視的なHoechst 33342(最終濃度1μg/ml)も含んだ。
先に記載されたとおり(Gavrieli, Y. et al 1992. J Cell Biol 119:493)、In Situ Cell Death Detectionキット(Roche)を製造者の指示にしたがって使用するTUNEL反応により、瀕死の細胞を検出した。ウシDNase I(Roche; 50mM Tris pH7.5、1mM MgCl2中最終濃度10μg/ml)を陽性対照として;フルオレッセイン標識dUTPを除いたものを陰性対照として使用して、切片を前処理した。マウス肝臓においては、約70%のTUNEL+細胞が(CM-1抗体を使用して)活性化カスパーゼ−3について陽性に染色し、Hoechst 33342の蛍光について見ると核の濃縮の兆候を示し、このキットを用いてTUNEL+と検出された細胞の大部分が、製造者により要求されたとおりのStadelmann & Lassmann (Stadelmann, C., and H. Lassmann. 2000. Cell Tissue Res 301:19)の定義による壊死とは対照的に アポトーシスを起こしていた。
プールした血清サンプルを、先に記載の通りに(Grainger, D. J. et al 1995. Nat Med 1:1067)Sepharose 6Bカラムを正確に使用するゲルろ過クロマトグラフィーにかけた。コレステロールオキシダーゼ法を用いて、得られた分画中にコレステロールを検出し、先に記載されたゲル電気泳動及びウエスタンブロッティング(Yokode, M. et al (1990) Science 250:1273)により分析したアポリポタンパク質溶出プロフィールに基づいてさまざまなリポタンパク質クラスに割り当てた。
インビトロのマクロファージによるアポトーシス細胞の取り込みに対するアポE欠損の効果
アポE−欠損マウス(E-/-)及び対照としての野生型(WT)マウスから、腹腔マクロファージを調製した。96時間培養後、E-/-及びWT細胞をそれぞれ蛍光標識したアポトーシス性WT胸腺細胞に提示し、これを37℃で1時間にわたって摂取させた。各マクロファージが摂取した胸腺細胞数を、アポトーシス小体を排除するマクロファージの能力の尺度として、免疫蛍光顕微鏡観察により定量した(図2A)。この期間に、WTマクロファージはそれぞれ1.65±0.12個のアポトーシス性WT胸腺細胞を摂取したが、生きた胸腺細胞を用いた場合には摂取は見られず(データは示さない)、このアッセイがアポトーシス小体の取り込み特異的であったことを確認した。対照的に、E-/-マクロファージは25%未満のアポトーシス性胸腺細胞を同じ期間内に摂取した(p<0.05、スチューデントの対のないt−検定;図2B)。
アポE−欠損マウス及び野生型同腹子対照中にインビボで存在するアポトーシス小体の数を分析した。肝臓の左葉の4mmにわたって250μmの間隔で凍結切片を調製し、瀕死の細胞及び細胞断片を、DNAの切断を標識するTUNEL 反応を用いて検出した。一般的なマクロファージマーカーF4/80との同時染色は、TUNEL陽性の細胞の大半(>98%)が野生型及びアポE欠損の肝臓の両方においてF4/80+であったことを明らかにした(ほとんどのTUNEL陽性細胞はマクロファージであった)。しかしながら、TUNEL標識がアポトーシス細胞だけでなく、組織調製の方法に依存して、壊死性細胞又はさらに健康な細胞をも染色するかもしれないことに注意することは重要である。しかしながら、われわれの切片では、Hoechst 蛍光について見た場合、多くのTUNEL+細胞がアポトーシス細胞の特徴を有した(すなわち、核のクロマチン濃縮及び空胞形成が明白であった)。さらに、TUNEL +細胞の60〜70%も活性カスパーゼ3に関して染色した。これらの観察を併せると、TUNEL染色は、肝臓におけるマクロファージ細胞の死の有用な指標であり、Stadelmann 及びLassmann (上記)の発見と一致することが示された。
肝臓サンプルを取得したと同じマウスの脳(左辺縁)及び左肺から凍結切片を調製した。肝臓中と同様に、アポE−欠損は肺胞マクロファージ集団のサイズを増加させ(図5A)、この増加に寄与する主要因子は、死んだ及び瀕死の細胞の蓄積である(図5B)。肺に見られる効果の大きさは肝臓に見られるものと非常によく類似していた。
アポE−欠損マウス及びそれらの野生型同腹子からの肝臓における2つの炎症マーカーの相対的レベルを測定するために、定量的免疫蛍光法を使用した。サイトカインTNF-αは、急性の炎症の間に上方制御されるが、正常では健康な肝臓の主に血管周囲領域に非常に低いレベルでのみ存在する(図6A)。TNF-αについての染色は、野生型同腹子に比べてアポE-欠損マウスにおいて1.5倍高かった(p<0.05;Mann-Whitney U-検定;図6B)。このサイトカインのレベルが両群において低かったにもかかわらず、アポE欠損は、統計学的にそしておそらく生物学的に有意な変化をTNF-αレベルにおいて導いた。
インビボにおいては、アポE欠損は非常に顕著なリポタンパク質代謝の制御ミスをもたらす。リポタンパク質代謝における変化が間接的にマクロファージ集団の動態に影響を及ぼすか否かを決定するために、我々はアポE欠失に依存しない、リポタンパク質代謝を変更するための2つの方法を使用した。先ず、我々は野生型マウスに高コレステロール食を10週間与える影響を調べ、これは、先に観察されたように、血漿LDL-及びVLDL-コレステロール濃度を増加させ、HDL-コレステロールを低下させ(図7A)、脂肪を与えたC57/Bl6マウスはアポE-欠損マウスのプロフィールに非常によく似ていた。この期間の最後には、肝臓マクロファージ集団における相違はなかった(p=0.94;正常の固形飼料を与えた野生型マウスに対するスチューデントの対のないt−検定;図7B)。同様に、LDL受容体の遺伝的欠失は、先に観察されたように、アポEの欠失後に見られた大きさに匹敵するリポタンパク質代謝の障害を引き起こしたにもかかわらず、肝臓中のマクロファージ集団にごくわずかな効果を及ぼし(p=0.07;スチューデントの対のないt−検定;図7D)、脳および肺の集団には効果がなかった(p=0.88、スチューデントt−検定;図7D)。我々は、リポタンパク質代謝における全身性の変化は、アポE-欠損マウスに見られたマクロファージ集団の動態の変化を引き起こすとは考えられず、そしてさらに、アポE:LDL受容体相互作用は、我々の観察したアポトーシス小体のクリアランスの減弱を仲介するとは考えられないと結論した。
Claims (39)
- 個体における減少した内因性アポE活性に関連する状態の治療のための化合物を同定及び/又は得るための方法であって、以下の:
被験化合物の存在下においてマクロファージによるアポトーシス細胞の摂取を測定する、
を含む、前記方法。 - 被験化合物の非存在下に対して被験化合物の存在下において増加したアポトーシス細胞の摂取が、該化合物が減少した内因性アポE活性に関連する状態の治療において有用でありうることの指標である、請求項1に記載の方法。
- 前記病気の状態が、アルツハイマー病、動脈硬化、脳卒中及び骨粗鬆症から成る群から選ばれる、請求項1又は2に記載の方法。
- 摂取がアポEの非存在下で測定される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 摂取がアポEの存在下で測定される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 増加した炎症活性に関連する状態の治療又は予防のための化合物を同定及び/又は得るための方法であって、以下の:
被験化合物の存在下における、マクロファージによるアポトーシス細胞の摂取を刺激するアポEポリペプチドの能力を測定する、
を含む、前記方法。 - 増加した炎症活性に関連する状態の治療又は予防のための化合物を同定及び/又は得るための方法であって、以下の:
被験化合物の存在下における、アポE欠損マクロファージによる1つ以上のアポトーシス性アポE欠損細胞の摂取を測定する、
を含む、前記方法。 - 被験化合物の非存在下に対して被験化合物の存在下において増加したアポトーシス細胞の摂取が、該化合物が増加した炎症活性に関連する状態の治療において有用でありうることの指標である、請求項6又は7に記載の方法。
- 前記増加した炎症活性に関連する状態が、多発性硬化症、リューマチ関節炎、過敏性腸症候群、クローン病、脳卒中、心筋梗塞、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、乾癬又は接触性過敏性皮膚炎である、請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
- アポトーシス細胞の蓄積に関連する状態の治療のための化合物を同定及び/又は得るための方法であって、以下の:
被験化合物の存在下における、マクロファージによるアポトーシス細胞の摂取を刺激するアポEポリペプチドの能力を測定すること、
を含む、前記方法。 - アポトーシス細胞の蓄積に関連する状態の治療のための化合物を同定及び/又は得るための方法であって、以下の:
被験化合物の存在下で、アポE欠損マクロファージを1つ以上のアポトーシス性アポE欠損細胞と接触させ、そして
前記マクロファージによる前記アポトーシス細胞の摂取を測定すること、
を含む、前記方法。 - 被験化合物の非存在下に対する被験化合物の存在下におけるアポトーシス細胞の摂取の増加が、前記化合物が、アポトーシス細胞の蓄積に関連する状態の治療において有用でありうることの指標である、請求項10又は11に記載の方法。
- 前記状態が、組織外傷、外傷性脳損傷、急性呼吸窮迫症候群、細菌性敗血症、膵炎又は心膜炎である、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記被験化合物がヒトアポEのペプチド断片又はそのアナログである、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 被験化合物を、アポトーシス細胞食作用を刺激する剤として同定することを含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記被験化合物を単離することを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記被験化合物を合成及び/又は製造することを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記化合物を、その医薬として性質を最適化するために修飾することを含む、請求項15〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記化合物を医薬として許容可能な賦形剤を含む組成物に製剤することを含む、請求項15〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 減少した内因性のアポE活性、増加した炎症活性またはアポトーシス細胞の蓄積に関連する状態を治療するために使用される医薬組成物の製造方法であって、以下の:
請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法を用いて、アポトーシス細胞食作用を刺激する化合物を同定及び/又は得て;そして
それにより同定された化合物を医薬として許容可能な担体と混合する、
を含む、前記方法。 - 個体におけるアポトーシス細胞の蓄積に関連する状態の治療方法であって、以下の:
前記個体におけるアポEの発現及び/又は活性を増加させる、
を含む、前記方法。 - アポEポリペプチド又はその模倣剤を前記個体に投与することにより、アポE活性が増加される、請求項21に記載の方法。
- 前記アポEポリペプチドがヒトアポEのペプチド断片である、請求項22に記載の方法。
- 前記アポトーシス細胞の蓄積に関連する状態が、組織外傷、外傷性脳損傷、急性呼吸窮迫症候群、細菌性敗血症、膵炎及び心膜炎から成る群から選ばれる、請求項21〜23のいずれか1項に記載の方法。
- アポトーシス細胞の蓄積に関連する状態の治療に使用される医薬の製造における、アポEポリペプチド又はその模倣剤の使用。
- 前記アポEポリペプチドが、ヒトアポEのペプチド断片である、請求項25に記載の使用。
- 個体における内因性のアポEの減少に関連する状態の治療方法であって、アポトーシス細胞食作用を刺激する化合物を投与することを含む、前記方法。
- 前記化合物がヒトアポEのペプチド断片又はそのアナログ又は誘導体である、請求項27に記載の方法。
- 前記病気の状態が、アルツハイマー病、動脈硬化、脳卒中及び骨粗鬆症からなる群から選ばれる、請求項27又は28に記載の方法。
- 減少した内因性アポEに関連する状態の治療のための医薬の製造における、アポトーシス細胞食作用を刺激する化合物の使用。
- 前記化合物がヒトアポEのペプチド断片又はそのアナログ又は誘導体である、請求項30に記載の方法。
- 前記病気の状態が、アルツハイマー病、動脈硬化、脳卒中及び骨粗鬆症からなる群から選ばれる、請求項30又は31に記載の方法。
- 個体における増加した炎症活性に関連する状態の治療方法であって、アポトーシス細胞食作用を刺激する化合物を投与することを含む、前記方法。
- 前記化合物が、ヒトアポEのペプチド断片又はそのアナログ又は誘導体である、請求項33に記載の方法。
- 前記増加した炎症活性に関連する状態が、多発性硬化症、リューマチ関節炎、過敏性腸症候群、クローン病、脳卒中、心筋梗塞、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、乾癬又接触性過敏性皮膚炎である、請求項33または34に記載の方法。
- 増加した炎症活性に関連する状態の治療のための医薬の製造における、アポトーシス細胞食作用を刺激する化合物の使用。
- 前記化合物が、ヒトアポEのペプチド断片である、請求項36に記載の使用。
- 前記増加した炎症活性に関連する状態が、多発性硬化症、リューマチ関節炎、過敏性腸症候群、クローン病、脳卒中、心筋梗塞、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、乾癬又接触性過敏性皮膚炎である、請求項36または37に記載の方法。
- 食作用の効率を調節する化合物の同定方法であって、以下の:
(a)培養マクロファージを、アポE由来ペプチド、模倣剤又は他の被験化合物に曝露し;
(b)前記マクロファージとアポトーシス細胞の懸濁液を接触させ;そして
(c)前記マクロファージにより摂取されたアポトーシス細胞数を測定する、
を含む、前記方法。
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