JP2008517593A - 酵素−基質反応のモニタリング - Google Patents
酵素−基質反応のモニタリング Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008517593A JP2008517593A JP2007537392A JP2007537392A JP2008517593A JP 2008517593 A JP2008517593 A JP 2008517593A JP 2007537392 A JP2007537392 A JP 2007537392A JP 2007537392 A JP2007537392 A JP 2007537392A JP 2008517593 A JP2008517593 A JP 2008517593A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- substrate
- enzyme
- redox
- tagged
- modification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims abstract description 145
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title abstract description 37
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 104
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 104
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 24
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 23
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 23
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 14
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 claims abstract description 10
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 21
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 16
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 12
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 10
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 9
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 7
- 238000003487 electrochemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 6
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N C60 fullerene Chemical compound C12=C3C(C4=C56)=C7C8=C5C5=C9C%10=C6C6=C4C1=C1C4=C6C6=C%10C%10=C9C9=C%11C5=C8C5=C8C7=C3C3=C7C2=C1C1=C2C4=C6C4=C%10C6=C9C9=C%11C5=C5C8=C3C3=C7C1=C1C2=C4C6=C2C9=C5C3=C12 XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910003472 fullerene Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims 2
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 claims 1
- 238000007128 oxidoreductase reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 238000001075 voltammogram Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 3
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 3
- 238000004502 linear sweep voltammetry Methods 0.000 description 3
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 3
- -1 9-fluorenylmethylcarbonyl Chemical group 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 102000001332 SRC Human genes 0.000 description 2
- 108060006706 SRC Proteins 0.000 description 2
- 101800001838 Serine protease/helicase NS3 Proteins 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 2
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 102000029330 CSK Tyrosine-Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010069682 CSK Tyrosine-Protein Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000000840 electrochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/30—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving catalase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
酵素−基質反応を電気化学的にモニターする方法を記載する。基質は、酸化還元活性基によりタグ付される。次いで、酵素による基質の修飾が、酸化還元活性基により電気化学的にモニターされうる。このような方法は、特に、非酸化還元酵素反応、例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、又はプロテアーゼの反応をモニターするために使用されうる。但し、酸化還元酵素の反応もこのような方法によってモニターされうる。酵素活性のモジュレーター又は新規酵素基質を同定するためのスクリーニング・アッセイ法も記載される。
Description
本発明は、酵素−基質反応のモニター方法に、酵素活性のモジュレーター又は新規酵素基質を同定するためのスクリーニング・アッセイ法に、そして当該方法及びアッセイ法における使用のための基質及び電気化学的反応チャンバーに、関する。
酸化還元酵素により触媒される反応は、電気化学的にモニターされうる。例えば、Barker PD,Hill Ha.Prog clin Biol Res.1988;277:419-33:Direct electrochemical probes of redox protein and redox enzyme structure and functionを参照のこと。シトクロームＣの電気化学は、Allen et al.（J.Electroanal.Chem.178（1984）69-86）、及びChristensen and Hamnett（Techniques and Mechanisms in Electrochemistry（1994）356-373）によりレビューされている。シトクロームＰ４５０活性をアッセイするための電気化学的システムは、ＷＯ ００／２２１５８中に、及びその中で引用された文献中に記載される。しかしながら、非酸化還元酵素により触媒される反応は、電気化学的には容易にモニターされることができない。なぜなら、反応の進行とともに、酸化還元状態を変化させる明らかに好適な化学基が存在しないからである。
本発明に従えば、基質が酸化還元活性基によりタグ付されている場合には、非酸化還元酵素反応は電気化学的にモニターされうることが判明した。タグ付された基質の使用は非酸化還元酵素反応に制限されないことも判明した。本発明は、酸化還元酵素にも適用されることができ、そしてそれゆえ、酸化還元酵素反応をモニターする新規方法をも提供する。
本発明に従って、酵素による基質の修飾をモニターする方法であって、以下のステップ：酸化還元活性基によりタグ付された基質と当該基質を修飾する酵素を提供し；上記酵素による上記基質の修飾のための条件下で上記酵素とともに上記基質をインキュベートし；そして上記酸化還元活性基により上記酵素による上記基質の修飾を電気化学的にモニターする、を含む前記方法が提供される。
上記酸化還元活性基は、標準的な電気化学技術を用いて、酵素に対して、動態試験が実施されることを可能にする。例えば、ボルタンメトリー波特性は、当業者に周知のリニアースイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）又はサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）の如き方法を用いて生成されうる。生成されたボルタンメトリー波特性は、例えば、酵素の触媒活性、酵素反応の速度、酵素への基質又は阻害剤の結合定数を測定するために、又は競争阻害試験を実施し、熱力学応答を計測し、酵素活性のモジュレーターをスクリーニングし、又は薬物交差反応性を計測するために、使用されうる。
用語「酸化還元活性基」は、本明細書中に使用するとき、基質にタグ付けされることができ、かつ、酵素が触媒として活性である条件下、その酸化状態を変化させる（すなわち、電子又はプロトンを獲得し又は損失する）ことができるいずれかの基を意味する。電圧が加えられ、そして時間の線形関数として変化されるとき、基質にタグ付けされた酸化還元活性基の酸化状態の変化は、電流が、加えられた電極電圧に対してプロットされるとき、ボルタンメトリー波特性を生成するであろう。
本発明に従って、本発明に係る方法において使用するための酸化還元活性基でタグ付けされた基質も提供される。
基質は、酸化還元活性基を基質に、好ましくは共有結合により、カップリングさせることにより、当該酸化還元活性基にタグ付けされることができる。酸化還元活性基は、直接に、又はリンカーを介して、基質に結合されることができる。リンカーが使用されるとき、リンカーのサイズ及び化学的性質は、リンカーによる酵素による基質の修飾の妨害を最小化するように選択されるべきである。
酸化還元活性基は、モニターされるべき反応が進行する条件下で良好な電気化学的信号を与えるように選択されるべきである。酸化還元活性基は、またそれが基質に結合されるために要求される化学的操作に適合するものでなくはならない。
酸化還元活性基は当業者に周知である。好適な基の例は、フェロセン（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅｓ）、フラーレン（ｆｕｌｌｅｒｅｎｅｓ）、及びキノン（ｑｕｉｎｏｎｅｓ）を含む。
基質は、酵素の完全長の天然基質に、又は天然基質の一部のみに対応する基質を含むか又はそれから成ることができる。但し、使用される基質は、適当な条件下で酵素により未だ修飾されることができる。例えば、酵素の天然基質がタンパク質又はペプチドである場合、本発明に従って使用される基質は、完全長のタンパク質又はペプチドに、又は当該タンパク質又はペプチドの断片に、相当するものであることができる。基質は、組換えペプチド又はタンパク質を含むか又はそれから成ることができる。
基質は、２以上の酸化還元活性基でタグ付けされることができる。酸化還元活性基は、酵素による当該基質の修飾を妨害しない限り、当該基質のいずれかの好適な部分に結合されることができる。基質がペプチド又はタンパク質である場合、典型的には、酸化還元活性基は、当該ペプチド又はタンパク質のアミノ−及び／又はカルボキシ−末端アミノ酸残基に共有結合によりカップリングされるであろう。
本発明の好ましい局面においては、酵素は、非酸化還元酵素である。本発明の特別に好ましい局面に例えば、酵素はキナーゼ又はホスファターゼである。酵素がキナーゼである場合、基質は、適当な条件下でキナーゼによりリン酸化されるアミノ酸残基を含む。酵素がホスファターゼである場合、基質は、適当な条件下でホスファターゼにより脱リン酸化される、リン酸化されたアミノ酸残基を含む。
キナーゼにより触媒される反応は、図１（ａ）に概説される。四角は、基質ペプチド鎖のアミノ酸残基を表す。キナーゼは、典型的には、キナーゼにより特異的に認識される１０〜２０アミノ酸残基のモチーフ内にある、特定のアミノ酸残基にリン酸（丸で表される）を付加する。
キナーゼとホスファターゼにより触媒される反応は、電気化学的に容易に追跡されることはできない。なぜなら、当該反応を追跡するために使用されることができる明らかに好適な化学基は存在しないからである。しかしながら、基質分子が、好適な酸化還元活性基、例えば、フェロセン、フラーレン、又はキノンでタグ付けされる場合、当該反応は追跡されることができる（図１（ｂ））。リン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）基は２つの負電荷を担持するので、この基の付加又は除去は、基質上の電荷を２変化される。これは、基質のボルタンメトリー波特性の検出可能な変化を生じさせ、そして標準的なボルタンメトリー技術を用いて、未変換の基質量が定量されることを可能にする（以下の実施例１を参照のこと）。
酸化還元活性基でタグ付けされる基質は、完全な基質タンパク質であっても、又はキナーゼ又はホスファターゼにより認識される基質タンパク質の断片に相当するものであってもよい。例えば、基質は、酵素により特異的に認識されるモチーフのアミノ酸配列を含みうる。
キナーゼ又はホスファターゼの基質は、２以上の酸化還元活性基でタグ付けされることができる。１の態様においては、基質は、そのアミノ末端において第１の酸化還元活性タグでタグ付けされ、そしてそのカルボキシ末端において第２の酸化還元活性基でタグ付けされる。
酵素がキナーゼである場合、好ましくは、基質にタグ付けされた酸化還元活性基は、キナーゼにより付加されるリン酸基との電気的カップリングを形成する。酵素がホスファターゼである場合、好ましくは、基質にタグ付けされる酸化還元活性基は、ホスファターゼにより除去される基質のリン酸基と電気的カップリングを形成する。リン酸基と酸化還元基の間の電気的カップリングの形成は、未変換の基質と完全に変換された生成物に関して得られるボルタンメトリー波特性の間の差を増加させると予想される。これは、未変換基質の量が定量化されるところの精度を高めるはずである。
本発明の他の特に好ましい局面においては、酵素は、適当な条件下、解裂部位において基質を解裂させるプロテアーゼである。プロテアーゼは、図２（ａ）に図示するものと、本質的な同じ反応を触媒する。生理学的条件下、基質と反応生成物は、アミノ末端に正電荷を、そしてカルボキシ末端に負電荷をもつ双生イオン状態を採用するが、全体としてゼロの電荷を保持する（側鎖の電荷を無視すれば、反応の左手側と右手側の間で一定のままである）。
プロテアーゼにより触媒される反応は、電気化学的に容易に追跡されることはできない。なぜなら、反応の進行に伴ってそれらの酸化還元状態を変化させる基質及び生成物内に明らかに好適な化学基が存在しないからである。しかしながら、基質ペプチドが、酸化還元基でそのアミノ−及びカルボキシ末端においてタグ付けされる場合には電気化学的にモニターされうる（図２（ｂ））。未解裂のタグ付け基質は、未だ全体としてゼロの電荷をもつが、解裂産物はそうではない。一方は追加の正電荷をもち、そして他方は追加の負電荷をもつ。
解裂産物のボルタンメトリー波特性は、基質のボルタンメトリー波特性とは実質的に異なる。これは、標準的なボルタンメトリー技術を用いて、解裂された基質の量が定量化されることを可能にする（以下の、実施例２を参照のこと）。
本発明の上記局面の他の態様においては、プロテアーゼ基質は（アミノ末端にある正電荷と、カルボキシ末端にある負電荷が残るように）アミノ−及びカルボキシ−末端から離れて１以上の酸化還元活性基によりタグ付けされることもできる。しかしながら、酸化還元活性基は基質のアミノ−及び／又はカルボキシ−末端に存在することが好ましい。なぜなら、これは、未解裂の基質と解裂産物の間の識別を改善すると予想されるからである。
本発明の上記局面の他の態様においては、プロテアーゼ基質は、１つの酸化還元活性基によりタグ付けされうる。しかしながら、両解裂産物がその後電気化学的に検出されうるように、解裂の両側で酸化還元基によりタグ付けされることが好ましい。
酸化還元活性基の間で操作されうる電機又はＨａｒｏｕｇｈ−ｓｐａｃｅエネルギー・カップリングは、基質と解裂産物について得られたボルタンメトリー波特性の間の差をさらに増加させると予想され、そしてそれゆえ、解裂産物の量が定量されるところの精度も高められる。
第１酸化還元活性基と第２酸化還元活性基は同一の化学基であることができるが、基質が解裂されるとき検出される電気化学的信号の変化を最大化するために、好ましくは異なる化学基である。
本発明の他の局面に従えば、酵素は酸化還元酵素である。この局面は、酸化還元酵素をモニター新たな方法を提供する。この局面の利点は、（酵素又は基質以外の、試薬、例えばＮＡＤ+／ＮＡＤＨのボルタンメトリー波特性をモニターすることによる）慣用方法によるような間接的なものではなくむしろ（基質のボルタンメトリー波特性をモニターすることにより）直接的に酵素反応がモニターされるということである。
ある態様においては、２以上の酵素により認識されうる酸化還元活性基タグ付け基質を提供することが望ましい。例えば、同じクラスの異なる酵素、例えば、異なるキナーゼ酵素により認識される異なるモチーフを含むアミノ酸配列を有するペプチド基質が提供されうる。これは、同じ基質を用いて異なる酵素に対して電気化学的試薬が行われることを可能にする。
他の態様においては、酸化還元活性基タグ付け基質ペプチドであって、２以上の異なるクラスの酵素、例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、及びプロテアーゼ酵素により認識されうるものが提供される。これは、同じ基質を用いて異なるクラスの酵素に対して電気化学的試験が行われることを可能にする。
本発明の方法は、酵素の動態試験のために、又は酵素の活性のモジュレーターを同定するために、又は酵素の基質を同定するために、使用されうる。
本発明によれば、酵素の活性のモジュレーターを同定するためのスクリーニング・アッセイ法であって、以下のステップ：
酸化還元活性基でタグ付けされた基質と当該基質を修飾する酵素を提供し；
上記酵素による上記基質の修飾のための条件下で上記酵素とともに上記タグ付け基質をインキュベートし；
上記酵素の活性の候補モジュレーターの存在下で、上記酸化還元活性タグにより、上記酵素による上記基質の修飾を電気化学的にモニターし；そして
上記候補モジュレーターが上記酵素の活性を調節するか否かを測定する、
を含むアッセイ法が提供される。
酸化還元活性基でタグ付けされた基質と当該基質を修飾する酵素を提供し；
上記酵素による上記基質の修飾のための条件下で上記酵素とともに上記タグ付け基質をインキュベートし；
上記酵素の活性の候補モジュレーターの存在下で、上記酸化還元活性タグにより、上記酵素による上記基質の修飾を電気化学的にモニターし；そして
上記候補モジュレーターが上記酵素の活性を調節するか否かを測定する、
を含むアッセイ法が提供される。
典型的には、候補モジュレーターの存在下での酵素による基質の修飾を、候補モジュレーターの不在下での酵素による基質の修飾と比較することにより、当該候補モジュレーターが酵素の活性を調節するか否かが測定される。
候補モジュレーターは、酵素の活性の、阻害物質、活性化物質、又は強化物質であることができる。
本発明によれば、酵素の基質を同定するためのスクリーニング・アッセイ法であって、以下のステップ：
酵素と、当該酵素の候補基質であって酸化還元活性基でタグ付けされたものを提供し；
上記酵素の既知の基質の、当該酵素による修飾を許容する条件下で上記候補基質とともに上記酵素をインキュベートし；そして
上記酵素が上記候補基質を修飾するか否かを酸化還元活性タグにより電気化学的に測定する、
を含むアッセイ法が提供される。
酵素と、当該酵素の候補基質であって酸化還元活性基でタグ付けされたものを提供し；
上記酵素の既知の基質の、当該酵素による修飾を許容する条件下で上記候補基質とともに上記酵素をインキュベートし；そして
上記酵素が上記候補基質を修飾するか否かを酸化還元活性タグにより電気化学的に測定する、
を含むアッセイ法が提供される。
本発明によれば、酸化還元活性基を基質にカップリングすることを含む、酸化還元基によりタグ付けされた基質を製造する方法もさらに提供される。
自動化ペプチド合成装置に適したカップリング手順が好ましい。なぜなら、タグ付基質は、このような手順を用いて容易に製造されうるからである。Ｆmoc（９−フルオレニルメチルカルボニル）又はｔ−Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）カップリング反応が特に好ましい。
本発明によれば、酸化還元活性基でタグ付けされた、酵素の基質、及び場合により当該基質を修飾することができる酵素を含む電気化学的反応チャンバーも提供される。
本発明によれば、酵素による基質の修飾をモニターするためのキットであって、酸化還元活性基でタグ付された基質と、当該基質を修飾する酵素を含むものに、さらに提供される。
本発明に係る方法の重要な利点は、それが自動化されることができ、そしてマイクロ流動電気化学センサー・デバイスを用いて実行されることができるということである。これは、高スループット・プロセス、例えば、酵素活性の候補モジュレーターの高スループット・スクリーニング、又はいくつかの異なる条件下で（例えば、酵素の阻害剤の遂次希釈の下で）同一酵素−基質反応についての同時データ採取を可能にする。本発明に係る方法は、酵素に対していくらかの活性をもつことが、化合物ライブラリーの高スループット・スクリーニングにより先に同定されている候補医薬化合物の２次スクリーニングのために特に有用できることができる。２次スクリーニングは、活性を確認し、効果を計測し、そして候補医薬化合物の選択性を評価するために使用されることができる。医薬発見の間に使用される２次スクリーニングのほとんどは、手動で実行され、そしてそれゆえ、かなりの資源を消費する。本発明に係る方法は、高スループットの自動化されたスクリーニングが実行されることを可能にする。
本発明に係る方法は、最良の安全性と効果特性をもつ化合物への候補医薬化合物のリード最適化のためにも使用されうる。本発明に係る方法を用いて、再び高スループットの自動化されたリード最適化が実行されうる。
本発明に係る方法は、酵素に対して活性である候補医薬化合物を同定するための、化合物のライブラリーの高スループットの自動化された１次スクリーニングのためにさえ使用されうる。
実施例１
電気化学的キナーゼ／ホスファターゼ・アッセイ
（ｉ）そのアミノ末端、又は（ｉｉ）そのカルボキシ末端で、酸化還元活性フェロセンでタグ付されたチロシン・キナーゼ、ｃ−Ｓｒｃのペプチド基質を以下に示す：
電気化学的キナーゼ／ホスファターゼ・アッセイ
（ｉ）そのアミノ末端、又は（ｉｉ）そのカルボキシ末端で、酸化還元活性フェロセンでタグ付されたチロシン・キナーゼ、ｃ−Ｓｒｃのペプチド基質を以下に示す：
ｃ−Ｓｒｃによりリン酸化されたチロシン残基は、白色の箱で表される。タグ付基質の側鎖は全て、アッセイ条件下でイオン化しているので、上記チロシン残基のリン酸化は、−１から−３までタグ付基質上の合計電荷を変化させるであろう。
ｃ−Ｓｒｃによるタグ付基質の修飾を電気化学的にモニターするために、電気化学的反応チャンバー内で、ＡＴＰの存在下、（生理学的条件に酷似するｐＨ、温度、及びイオン濃度で）水性溶液中で反応を実行した。（作用電極と参照電極を用いて）上記電気化学的反応チャンバーに電圧を加え、そして（上記作用電極と補助電極を用いて）電流応答を計測する。リニアスイープボルタンメトリーを用いて、ボルタンモグラムを作成する。図３（ａ）は、得られうる推定ボルタンモグラムを示す。
たとえ、リン酸と酸化還元タグの間に電荷の直接転位が存在しえないとしても、分子電荷の合計変化は、電極に向かうときそれが受ける引力又は反発力を変化させるであろう。それゆえ、波プロットの形状が変化しないかもしれないが、それは、基質ペプチドのリン酸化の程度に正比例する量で「横道（ｓｉｄｅｗａｙｓ）」をシフトさせるであろう。（図３（ａ）を参照のこと）。
ペプチドが、全くリン酸化されていない状態から完全にリン酸化された状態に変化するとき、ボルタンモグラム内の波曲線は、（図３（ａ）中の明るい実線と暗い実線により表される）２つの十分に定められた限界の間をシフトする。この応答は、ペプチドがリン酸化される程度を追跡するために使用され、そしてそれゆえ、酵素により触媒される反応速度をモニターするために使用されることができる。
酵素は、通常、図３（ｂ）内の上の暗い線により示される反応速度をもつかもしれない。候補医薬がこの反応を阻害することができる場合、所定の時間内に作られる修飾された基質の量は、図３（ｂ）内の下の薄い線で示されるように、低下されるであろう。利用しうる基質ペプチドの大過剰が常に存在するので、反応を追跡するこの方法は特に確固としたものである。なぜなら、所定の時間における上記２本の線の値の比は、一定のままであるはずであり、そして結果の精度は、より長い間アッセイを単に実行することにより、改善されることができるからである。
実施例２
電気化学的プロテアーゼ・アッセイ
フェロセン及びフラーレンでタグ付された肝炎ＮＳ３プロテアーゼのペプチド基質を以下に示す（プロテアーゼが基質を解裂させる部位を矢印で示す）：
電気化学的プロテアーゼ・アッセイ
フェロセン及びフラーレンでタグ付された肝炎ＮＳ３プロテアーゼのペプチド基質を以下に示す（プロテアーゼが基質を解裂させる部位を矢印で示す）：
プロテアーゼによる基質の解裂は、２つの生成物、アミノ末端に正電荷をもつものと、カルボキシ末端に負電荷をもつものを、作り出す。
ＮＳ３プロテアーゼによるタグ付基質の修飾を電気化学的にモニターするために、電気化学的反応チャンバー内で、（生理学的条件に酷似するｐＨ、温度、及びイオン濃度で）水性溶液中で反応を実行した。（作用電極と参照電極を用いて）上記電気化学的反応チャンバーに電圧を加え、そして（上記作用電極と補助電極を用いて）電流応答を計測する。リニアスイープボルタンメトリーを用いて、ボルタンモグラムを作成する。図４（ａ）は、得られうる推定ボルタンモグラムを示す。
たとえ、上記２つの酸化還元タグの間に電荷の直接転位が存在しえないとしても、解裂産物は、電極に向かうとき基質に比較して実質的に異なる引力又は反発力を受けるであろう。それゆえ、波プロットの形状は、基質が解裂する程度に正比例する量で変化するであろう。（図４（ａ）を参照のこと）。
基質が解裂するとき、ボルタンモグラム内の曲線は、基質と解裂産物の電気化学的特性により定められる限界の間をシフトするであろう（図４（ａ）中の明るい実線と暗い実線を参照のこと）。この応答は、基質が解裂する程度を追跡するために使用され、そしてそれゆえ、酵素により触媒される反応速度をモニターするために使用されることができる。
酵素は、通常、図４（ｂ）内の上の暗い線により示される反応速度をもつかもしれない。候補医薬がこの反応を阻害することができる場合、所定の時間内に解裂する基質の量は、図４（ｂ）内の下の薄い線で示されるように、低下されるであろう。利用しうる基質ペプチドの大過剰が常に存在するので、反応を追跡するこの方法は特に確固としたものである。なぜなら、所定の時間における上記２本の線の値の比は、一定のままであるはずであり、そして結果の精度は、より長い間アッセイを単に実行することにより、改善されることができるからである。上記線の実際の勾配は変化しうるかもしれないが、上記の比は、候補医薬の挙動により測定され、そして酵素の濃度に依存しない。これは、アッセイが実行されるところのセンサーが、製造変動に対して高い許容性をもつことを意味する。
候補医薬の濃度を単に変化させることにより、実施例１と２に記載したアプローチを用いて、安全な結合速度試験を実施することができる。例えば、この種の実験は、マイクロタイター・プレートのウェルの列に沿っての逐次稀釈を行い、そして同時に２４個のデータ点を採取するような２４プロブ・チップのデザインを使用し、それにより簡単な計測で安全な速度データセットを作成することを含むことができるであろう。医薬候補を混合し又は反応温度、ｐＨ等を変化させることにより、競争阻害、熱力学応答、及び医薬交差反応性の如き他の試験も同様に、容易に実行されうる。
以下の添付図面を参照して、上記実施例に本発明の態様を説明した。
Claims (21)
- 酵素による基質の修飾をモニターする方法であって、以下のステップ：
酸化還元活性基によりタグ付された基質と、当該基質を修飾する酵素とを提供し；
上記酵素による上記基質の修飾のための条件下で上記基質を上記酵素とともにインキュベートし；そして
上記酸化還元基により、上記酵素による上記基質の修飾を電気化学的にモニターする；
を含む前記方法。 - 前記酵素は非酸化還元酵素である、請求項１に記載の方法。
- 前記酵素はキナーゼである、請求項２に記載の方法。
- 前記酵素はホスファターゼである、請求項２に記載の方法。
- 前記酸化還元基は、前記キナーゼにより添加される基質のリン酸塩基と電気的カップリングを形成する請求項３に記載の方法、又は前記ホスファターゼにより除去される基質のリン酸塩基と、電気的カップリングを形成する請求項４に記載の方法。
- 前記酵素はプロテアーゼである、請求項２に記載の方法。
- 前記基質は、ペプチドのアミノ末端において第１酸化還元基で、そして当該ペプチドのカルボキシ末端基において第２酸化還元基で、タグ付されたペプチドを含む、請求項６に記載の方法。
- 前記第１酸化還元基と第２酸化還元基は、異なる化学基である、請求項７に記載の方法。
- 前記各酸化還元基は、フェロセン（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ）、フラーレン（ｆｕｌｌｅｒｅｎｅ）、又はキノン（ｑｕｉｎｏｎｅ）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記酵素による前記基質の修飾は、前記酵素の活性化のモジュレーターの存在又は不在下でモニターされる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記酵素による前記基質の修飾は、２以上の異なる濃度モジュレーターの存在下で、モニターされる、請求項１０に記載の方法。
- 前記酵素の触媒活性を測定するための、前記酵素の活性のモジュレーターを同定するための、前記酵素の動態試験のための、又は前記酵素の薬物交差反応性の評価のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法の使用。
- 酵素の活性化のモジュレーターを同定するためのスクリーニング・アッセイ法であって、以下のステップ：
酸化還元基によりタグ付された基質と、当該基質を修飾する酵素とを提供し；
上記酵素による上記基質の修飾のための条件下で、上記基質を上記酵素とともにインキュベートし；
上記酵素の活性の候補モジュレーターの存在下で、上記酸化還元タグにより、上記酵素による上記基質の修飾を電気化学的にモニターし；そして
上記修飾モジュレーターが、上記酵素の活性を調節するか否かを測定する；
を含む前記スクリーニング・アッセイ法。 - 前記候補モジュレーターの存在下での上記酵素による上記基質の修飾が、上記候補モジュレーターの不在下での上記酵素による上記基質の修飾と比較される、請求項１３に記載のスクリーニング・アッセイ法。
- 前記候補モジュレーターは候補阻害剤である、請求項１３又は１４に記載のアッセイ法。
- 酵素の基質を同定するためのスクリーニング・アッセイ法であって、以下のステップ：
酵素と酸化還元基によりタグ付された当該酵素のための基質とを提供し；
上記酵素のための既知の基質の酵素による修飾を許容する条件下で、上記酵素を、上記候補基質とともにインキュベートし；そして
上記酵素が上記候補基質を修飾するか否かを、上記酸化還元活性タグにより、電気化学的に測定する、前記スクリーニング・アッセイ法。 - 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法において、又は請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のスクリーニング・アッセイ法において、使用されるための酸化還元基によりタグ付された基質。
- 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法における、又は請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のアッセイ法における、請求項１７に記載の基質の使用。
- 酸化還元基を基質にカップリングさせることを含む、酸化還元基によりタグ付された基質の製造方法。
- 酸化還元基によりタグ付された、酵素のための基質、及び場合により、当該基質を修飾することができる酵素を含む、電気化学的反応チャンバー。
- 酵素による基質の修飾をモニターするためのキットであって、酸化還元基によりタグ付された基質、及び当該基質を修飾する酵素を含む前記キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0423561A GB2419880B (en) | 2004-10-22 | 2004-10-22 | Monitoring enzyme-substrate reactions |
| PCT/GB2005/004089 WO2006043095A2 (en) | 2004-10-22 | 2005-10-21 | Monitoring enzyme-substrate reactions |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008517593A true JP2008517593A (ja) | 2008-05-29 |
Family
ID=33485082
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007537392A Pending JP2008517593A (ja) | 2004-10-22 | 2005-10-21 | 酵素−基質反応のモニタリング |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20080160550A1 (ja) |
| EP (1) | EP1805321A2 (ja) |
| JP (1) | JP2008517593A (ja) |
| CN (1) | CN101061233A (ja) |
| AU (1) | AU2005297094A1 (ja) |
| GB (1) | GB2419880B (ja) |
| HK (1) | HK1090955A1 (ja) |
| WO (1) | WO2006043095A2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102703574B (zh) * | 2012-06-08 | 2015-05-13 | 厦门大学 | 一种筛选辅酶依赖型氧化还原酶的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55144899A (en) * | 1979-04-24 | 1980-11-12 | Jozefonvicz Marcel | Measuring of protease and antiiprotease |
| JPH0843348A (ja) * | 1994-07-29 | 1996-02-16 | Iatron Lab Inc | アルカリホスファターゼの検出方法 |
| JP2002542154A (ja) * | 1999-02-23 | 2002-12-10 | ペンタファルム アクチェンゲゼルシャフト | プロテアーゼ活性の電気化学的測定のためのオリゴペプチド誘導体 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0018002B1 (de) * | 1979-04-24 | 1983-02-09 | Marcel Jozefonvicz | Neues Bestimmungsverfahren für Proteasen und Antiproteasen |
| CA1220818A (en) * | 1983-05-05 | 1987-04-21 | Hugh A.O. Hill | Assay techniques utilising specific binding agents |
| GB8504522D0 (en) * | 1985-02-21 | 1985-03-27 | Genetics Int Inc | Electrochemistry of mediators |
| US5427912A (en) * | 1993-08-27 | 1995-06-27 | Boehringer Mannheim Corporation | Electrochemical enzymatic complementation immunoassay |
| AU4318599A (en) * | 1998-06-08 | 1999-12-30 | Xanthon, Inc. | Electrochemical probes for detection of molecular interactions and drug discovery |
| DE19917052A1 (de) * | 1999-04-15 | 2000-10-19 | Wolfgang Schuhmann | Vorrichtung und Verfahren zur Bestimmung chem. und biochem. Analyten mittels amplifizierter mikro-elektrochem. Detektion |
| GB0205455D0 (en) * | 2002-03-07 | 2002-04-24 | Molecular Sensing Plc | Nucleic acid probes, their synthesis and use |
| GB0316075D0 (en) * | 2003-07-09 | 2003-08-13 | Molecular Sensing Plc | Protease detection assay |
-
2004
- 2004-10-22 GB GB0423561A patent/GB2419880B/en active Active
-
2005
- 2005-10-21 AU AU2005297094A patent/AU2005297094A1/en not_active Abandoned
- 2005-10-21 CN CNA2005800393601A patent/CN101061233A/zh active Pending
- 2005-10-21 JP JP2007537392A patent/JP2008517593A/ja active Pending
- 2005-10-21 WO PCT/GB2005/004089 patent/WO2006043095A2/en active Application Filing
- 2005-10-21 EP EP05796141A patent/EP1805321A2/en not_active Withdrawn
- 2005-10-21 US US11/665,650 patent/US20080160550A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-11-08 HK HK06112282A patent/HK1090955A1/xx not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55144899A (en) * | 1979-04-24 | 1980-11-12 | Jozefonvicz Marcel | Measuring of protease and antiiprotease |
| JPH0843348A (ja) * | 1994-07-29 | 1996-02-16 | Iatron Lab Inc | アルカリホスファターゼの検出方法 |
| JP2002542154A (ja) * | 1999-02-23 | 2002-12-10 | ペンタファルム アクチェンゲゼルシャフト | プロテアーゼ活性の電気化学的測定のためのオリゴペプチド誘導体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101061233A (zh) | 2007-10-24 |
| GB0423561D0 (en) | 2004-11-24 |
| WO2006043095A8 (en) | 2006-07-27 |
| US20080160550A1 (en) | 2008-07-03 |
| GB2419880B (en) | 2008-04-30 |
| AU2005297094A1 (en) | 2006-04-27 |
| EP1805321A2 (en) | 2007-07-11 |
| HK1090955A1 (en) | 2007-01-05 |
| WO2006043095A3 (en) | 2006-07-06 |
| GB2419880A (en) | 2006-05-10 |
| WO2006043095A2 (en) | 2006-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hewitt et al. | Application of lanthanide luminescence in probing enzyme activity | |
| US8802390B2 (en) | Electrochemical assay for the detection of enzymes | |
| Kerman et al. | Gold nanoparticle-based electrochemical detection of protein phosphorylation | |
| Liu et al. | Selective sensing of phosphorylated peptides and monitoring kinase and phosphatase activity with a supramolecular tandem assay | |
| JP2011502245A5 (ja) | ||
| US20120129248A1 (en) | Assay tools and methods of use | |
| JP5085320B2 (ja) | 生体反応又は生体内状態変化の複数同時解析法 | |
| WO2014018899A1 (en) | Electric measurement of monolayers following pro-cleave detection of presence and activity of enzymes and other target analytes | |
| Hu et al. | Coenzyme-mediated electro-RAFT polymerization for amplified electrochemical interrogation of trypsin activity | |
| Park et al. | Washing-free and label-free onsite assay for inorganic pyrophosphatase activity using a personal glucose meter | |
| US20070238143A1 (en) | Metal ion mediated fluorescence superquenching assays, kits and reagents | |
| JP2008517593A (ja) | 酵素−基質反応のモニタリング | |
| Noble et al. | Fluorescent peptide probes for high-throughput measurement of protein phosphatases | |
| Ott et al. | Cell lysate-based AlphaLISA Deubiquitinase assay platform for identification of small molecule inhibitors | |
| An et al. | Conjugated polyelectrolytes as new platforms for drug screening | |
| Eskonen et al. | Thermal Dissociation Assay for Time-Resolved Fluorescence Detection of Protein Post-Translational Modifications | |
| US20110165603A1 (en) | Small molecule fluorescent sensors for detection of post-translationalmodifications and protein interactions in bioassays | |
| Jung et al. | Protein arrays for quantitative enzymatic profiling and serodiagnosis | |
| US7674600B2 (en) | Assays for measuring phosphate modification enzyme activity | |
| EP0671625B1 (en) | A process for detecting biomolecules by means of an enzymatic amplification system | |
| US7521188B2 (en) | Optical monitoring of cleaving enzyme activity | |
| JP2023540164A (ja) | 電極表面近傍の溶液のｐＨの電子制御 | |
| Somasundaram | Development of Oligonucleotide, Small Molecule, and Protein Assays Using Square-Wave Voltammetry with Electrode-Bound Nucleic Acid Nanostructures | |
| JP2005095144A (ja) | 生物学的分子に結合した化学基を測定する方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20081020 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110719 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120110 |