JP2008515801A

JP2008515801A - モルヒネおよびモルヒネ前駆体

Info

Publication number: JP2008515801A
Application number: JP2007534882A
Authority: JP
Inventors: ジョージビー．ステファノ; パトリックカデット; カークジェイ．マンティオン; ウェイジュ
Original assignee: ザリサーチファウンデーションオブステイトユニヴァーシティオブニューヨーク
Priority date: 2004-10-01
Filing date: 2005-09-30
Publication date: 2008-05-15
Also published as: US8481559B2; US20140348953A1; AU2005292184A1; CA2582346A1; WO2006039691A2; US20080221143A1; WO2006039691A3; US20140128420A1; US20060088607A1; US9474749B2; US20110130356A1; US8865696B2; US20130309326A1; EP1809283A2

Abstract

疾患を処置するため、炎症を減少させるため、または正常な機能を回復するために、モルヒネ、モルヒネ前駆体(たとえば、レチクリン)、およびモルヒネの合成または活性の阻害剤を使用することに関する方法、ならびに材料が提供される。

Description

1.技術分野
本文書は、哺乳動物を処置するために、モルヒネ、モルヒネ前駆体(たとえば、レチクリン)、モルヒネ-6β-グルクロニド、およびモルヒネ合成または活性の阻害剤を使用する工程を含む方法、ならびに材料に関する。

連邦政府によって支援された研究に関する陳述
本明細書に記述された研究のための資金提供は、連邦政府によって提供されており、連邦政府は、本発明に一定の権利を有し得る。

2.背景情報
多くの人々が、うつ病、神経変性疾患(たとえば、アルツハイマー病)、炎症誘発性疾患、自己免疫障害、およびアテローム性動脈硬化症などの状態に罹患する。多くの場合、これらの人々にとって、好結果の処置が利用できることは、あるとしてもわずかである。

モルヒネは、ヒトにおける疼痛を減少させるために日常的に使用される強力な鎮痛薬である。たとえば、外科手術患者は、外科的手技によって生じる疼痛を軽減するために、典型的には1人あたり5〜10mgのモルヒネを服用するように指示される。場合によっては、極度の疼痛に冒されている患者(たとえば、火傷被害者または癌患者)は、高用量のモルヒネを服用するように指示される。中等度から重度の疼痛のために最適な筋肉内投薬量は、4時間ごとに70kgの体重あたり10mgであると考えられている。典型的な用量範囲は、疼痛の重症度に応じて、4時間ごとに5〜20mgである。経口用量範囲は、8〜20mgの間であるが、経口投与されたモルヒネは、実質的に鎮痛効力がより少なくなる。経口投与されたモルヒネは、吸収後にこれが肝臓を通過すると迅速に破壊されるので、経口投与されたモルヒネは、モルヒネの皮下注射によって生じる効果の約1/10を示し得る。主に重篤な術後疼痛に対して、または緊急時には、静脈内経路が使用される。このような場合、用量範囲は、4〜10mgの間であり、鎮痛効果は、ほぼ即座に生じる。

概要
本文書は、疾患を処置するため、炎症を減少させるため、または正常な機能を回復するために、モルヒネ、モルヒネ-6β-グルクロニド、モルヒネ前駆体(たとえば、レチクリン)、モルヒネ合成または活性の阻害剤、およびドーパミン合成の阻害剤を使用することに関する方法、ならびに材料を提供する。たとえば、本文書は、モルヒネ、モルヒネ-6β-グルクロニド、モルヒネ前駆体、モルヒネ合成の阻害剤、モルヒネ活性の阻害剤、ドーパミン合成の阻害剤、またはこれらの組み合わせを含む組成物を提供する。本文書は、このような組成物を使用するための方法(たとえば、哺乳動物に対して長期の、低レベルのモルヒネを提供するための方法)もまた提供する。本明細書に記述したとおり、長期の、低レベルのモルヒネは、哺乳動物において、繰り返し低用量のモルヒネを投与することによって、モルヒネ前駆体を繰り返し投与することによって、またはモルヒネおよびモルヒネ前駆体の組み合わせを繰り返し投与することによって達成することができる。場合によっては、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ阻害剤などの阻害剤を使用してアドレナリン合成におけるノルエピネフリン工程にドーパミンを阻害することができ、これにより、内因性ドーパミンレベルの増大、ならびに内因性モルヒネレベルの増大を生じ得る。

哺乳動物に対して長期の、低レベルのモルヒネを提供することにより、哺乳動物に行動変化(たとえば、全般に総体的に落ち着いた感情)を経験させることができる。加えて、哺乳動物に対して長期の、低レベルのモルヒネを提供することにより、哺乳動物に炎症反応の減少を経験させることができ、哺乳動物に構成的一酸化窒素放出の基礎レベルを増大させたままに維持させることができる。場合によっては、本明細書において提供された組成物は、哺乳動物内で産生される一酸化窒素を介して免疫、血管、神経、および胃腸組織をダウンレギュレートするために使用することができる。たとえば、本明細書において提供された組成物は、クローン病を有する哺乳動物における炎症を起こした胃腸組織の興奮状態を減少させるために使用することができる。

本明細書に提供される方法および材料は、神経状態(たとえば、精神分裂症、慢性痛、躁病、うつ病、精神病、偏執症、自閉症、ストレス、アルツハイマー病、またはパーキンソン病)、免疫状態(たとえば、炎症誘発性疾患、自己免疫障害、組織分解延髄細網症、狼蒼、または関節炎)、血管状態(たとえば、アテローム性動脈硬化症またはニューロン脈管障害)、胃腸状態(たとえば、大腸炎、クローン病、または過敏性大腸症候群)、または依存症(たとえば、アヘン依存症)を処置する(たとえば、症候の重症度を減少させる)ために使用することもできる。たとえば、モルヒネ、またはレチクリン、ノルラウダノソリン、L-DOPA、もしくはコデインなどのモルヒネ前駆体は、視床下部ホルモン分泌(たとえば、生殖および増殖ホルモン)を含む神経血管変化などの神経状態を処置するために使用することができる。

本明細書に開示したとおり、低用量のモルヒネでの長期処置により、同じ有益効果を達成するために、時間とともにモルヒネ投薬量を増やす必要なく、一酸化窒素放出などのモルヒネのポジティブ効果を継続させることができる。加えて、低用量のモルヒネの使用により、起こりうるモルヒネのネガティブ効果(たとえば、依存症または強力な無痛)を経験しないで、患者がモルヒネの有益効果を経験することができる。同様に、レチクリンなどのモルヒネ前駆体で患者を処置することにより、起こりうるモルヒネのネガティブ効果(たとえば、依存症または強力な無痛)を経験しないで、患者がモルヒネの有益効果を経験することができる。たとえば、レチクリンなどのモルヒネ前駆体を使用することにより、患者は低用量のモルヒネを間接的に受けることができ、過量摂取のリスクが減少される。

一般に、本文書の一つの局面は、哺乳動物において、細胞からの一酸化窒素放出を誘導するための方法を特徴とする。本方法は、ある量で、週に1回よりも頻繁な頻度で、かつ1ヶ月よりも長期間の間、組成物を哺乳動物に投与する工程を含むか、またはその工程から本質的になり、組成物は、モルヒネもしくはモルヒネ-6β-グルクロニドを含むか、またはそれらから本質的になり、ここで、組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.05mg未満のモルヒネもしくはモルヒネ-6β-グルクロニドが哺乳動物に投与されることとなる。細胞は、免疫細胞であり得る。哺乳動物は、ヒトであり得る。組成物は、モルヒネ前駆体を含むことができる。組成物は、錠剤の形態であることができる。組成物は、セレンを含むことができる。組成物は、アルギニン(たとえば、L-アルギニン)を含むことができる。組成物は、カルシウム供与源を含むことができる。組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.025mg未満のモルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドが哺乳動物に投与されるようにすることができる。組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.01mg未満のモルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドが哺乳動物に投与されるようにすることができる。頻度は、週に4回よりも頻繁であることができる。頻度は、日に2〜5回の間であることができる。頻度は、日に1回であることができる。期間は、2ヶ月よりも長くてもよい。期間は、3ヶ月より長くてもよい。組成物は、モルヒネを含むことができる。組成物は、モルヒネ-6β-グルクロニドを含むことができる。組成物は、モルヒネおよびモルヒネ-6β-グルクロニドを含むことができる。

もう一つの態様において、本文書は、哺乳動物における細胞からの一酸化窒素放出を誘導するための方法を特徴とする。本方法は、ある量で、週に1回よりも頻繁な頻度で、かつ1ヶ月よりも長期間の間、組成物を哺乳動物に投与する工程を含むか、またはその工程から本質的になり、組成物は、テバインまたはコデインを含み、ここで、組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.05mg未満のテバインまたはコデインが哺乳動物に投与されることとなる。細胞は、免疫細胞であり得る。哺乳動物は、ヒトであり得る。組成物は、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.05mg未満のモルヒネが哺乳動物に投与されることとなる量でモルヒネを含むことができる。組成物は、錠剤の形態であることができる。組成物は、セレンを含むことができる。組成物は、アルギニン(たとえば、L-アルギニン)を含むことができる。組成物は、カルシウム供与源を含むことができる。組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.01mg未満のテバインまたはコデインが哺乳動物に投与されるようにすることができる。組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.005mg未満のテバインまたはコデインが哺乳動物に投与されるようにすることができる。頻度は、週に4回よりも頻繁であることができる。頻度は、日に2〜5回の間であることができる。頻度は、日に1回であることができる。期間は、2ヶ月よりも長くてもよい。期間は、3ヶ月より長くてもよい。組成物は、テバインを含むことができる。組成物は、コデインを含むことができる。組成物は、テバインおよびコデインを含むことができる。

もう一つの態様において、本文書は、哺乳動物において、細胞からの一酸化窒素放出を誘導するための方法を特徴とする。本方法は、ある量で、週に1回よりも頻繁な頻度で、かつ1ヶ月よりも長期間の間、組成物を哺乳動物に投与する工程を含むか、またはその工程から本質的になり、組成物は、レチクリン、ノルラウダノソリン、およびサルタリジンからなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含み、ここで、組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、1mg未満の1つまたは複数の薬剤が哺乳動物に投与されることとなる。細胞は、免疫細胞であり得る。哺乳動物は、ヒトであり得る。組成物は、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.05mg未満のモルヒネが哺乳動物に投与されることとなる量でモルヒネを含むことができる。組成物は、錠剤の形態であることができる。組成物は、セレンを含むことができる。組成物は、アルギニン(たとえば、L-アルギニン)を含むことができる。組成物は、カルシウム供与源を含むことができる。組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.5mg未満の1つまたは複数の薬剤が哺乳動物に投与されるようにすることができる。組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.05mg未満の1つまたは複数の薬剤が哺乳動物に投与されるようにすることができる。頻度は、週に4回より頻繁であることができる。頻度は、日に2〜5回の間であることができる。頻度は、日に1回であることができる。期間は、2ヶ月よりも長くてもよい。期間は、3ヶ月よりも長くてもよい。組成物は、レチクリン、ノルラウダノソリン、およびサルタリジンを含むことができる。

もう一つの態様において、本文書は、哺乳動物において細胞からの一酸化窒素放出を誘導するための方法を特徴とする。本方法は、ある量で、週に1回よりも頻繁な頻度で、かつ1ヶ月よりも長期間の間、組成物を哺乳動物に投与する工程を含むか、またはその工程から本質的になり、組成物は、ドーパミンまたはL-DOPAを含み、ここで、組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、1μg未満のドーパミンまたはL-DOPAが哺乳動物に投与されることとなる。細胞は、免疫細胞であり得る。哺乳動物は、ヒトであり得る。組成物は、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.05mg未満のモルヒネが哺乳動物に投与されることとなる量でモルヒネを含むことができる。組成物は、錠剤の形態であることができる。組成物は、セレンを含むことができる。組成物は、アルギニン(たとえば、L-アルギニン)を含むことができる。組成物は、カルシウム供与源を含むことができる。組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.5mg未満の1つまたは複数の薬剤が哺乳動物に投与されるようにすることができる。組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.05mg未満の1つまたは複数の薬剤が哺乳動物に投与されるようにすることができる。頻度は、週に4回よりも頻繁であることができる。頻度は、日に2〜5回の間であることができる。頻度は、日に1回であることができる。期間は、2ヶ月よりも長くてもよい。期間は、3ヶ月よりも長くてもよい。組成物は、レチクリン、ノルラウダノソリン、およびサルタリジンを含むことができる。

もう一つの局面において、本文書は、モルヒネおよびセレンを含むか、またはそれらから本質的になる組成物を特徴とする。組成物は、35μg〜700μgの間のモルヒネを含むことができる。組成物は、55μg〜300μgの間のセレンを含むことができる。組成物は、アルギニン(たとえば、L-アルギニン)を含むことができる。組成物は、1mg〜500mgの間のアルギニンを含む。組成物は、カルシウム供与源を含むことができる。組成物は、250μg〜1.5gの間(たとえば、1g〜1.3gの間)のカルシウム供与源を含むことができる。カルシウム供与源は、クエン酸カルシウムであることができる。組成物は、チロシン、チラミン、フェニルアラニン、3,4ジヒドロキシフェニルピルベート、ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、ドーパミン、L-DOPA、レチクリン、ノルラウダノソリン、サルタリジン、テバイン、およびコデインからなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含むことができる。組成物は、CYP2D6およびCYP2D7阻害剤からなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含むことができる。

もう一つの態様において、本文書は、モルヒネおよびアルギニン(たとえば、L-アルギニン)を含むか、またはそれらから本質的になる組成物を特徴とする。組成物は、35μg〜700μgの間のモルヒネを含むことができる。組成物は、1mg〜500mgの間のアルギニンを含むことができる。組成物は、カルシウム供与源を含むことができる。組成物は、250μg〜1.5gの間(たとえば、1g〜1.3gの間)のカルシウム供与源を含むことができる。カルシウム供与源は、クエン酸カルシウムであることができる。組成物は、チロシン、チラミン、フェニルアラニン、3,4ジヒドロキシフェニルピルベート、ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、ドーパミン、L-DOPA、レチクリン、ノルラウダノソリン、サルタリジン、テバイン、およびコデインからなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含むことができる。組成物は、CYP2D6およびCYP2D7阻害剤からなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含むことができる。

もう一つの態様において、本文書は、細胞において産生されるモルヒネのレベルを減少させるための組成物を特徴とし、組成物は、L-DOPAおよびドーパミンを含むか、またはそれらから本質的になる。組成物は、25mg〜500mgの間(たとえば、250mg)のL-DOPAを含むことができる。組成物は、25mg〜500mgの間(たとえば、250mg)のドーパミンを含むことができる。組成物は、同量のL-DOPAおよびドーパミンを含むことができる。

もう一つの局面において、本文書は、哺乳動物におけるモルヒネの産生を増大するための方法を特徴とする。本方法は、哺乳動物内で細胞によって産生されるモルヒネの量を増大するのに有効な条件下で哺乳動物に組成物を投与する工程を含み、またはその工程から本質的になり、組成物は、レチクリン、ノルラウダノソリン、サルタリジン、テバイン、およびコデインからなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含む。細胞は、免疫細胞であり得る。哺乳動物は、ヒトであり得る。組成物は、モルヒネを含むことができる。組成物は、錠剤の形態であることができる。組成物は、セレンを含むことができる。組成物は、アルギニン(たとえば、L-アルギニン)を含むことができる。組成物は、カルシウム供与源を含むことができる。本方法は、投与する工程の前に、哺乳動物がモルヒネの増大を必要とすると同定する工程を含むことができる。本方法は、投与する工程の後に、モルヒネの増大を確認するために哺乳動物をモニターする工程を含むことができる。本方法は、月に1回よりも頻繁な頻度で哺乳動物に組成物を投与する工程を含むことができる。本方法は、週に1回よりも頻繁な頻度で哺乳動物に組成物を投与する工程を含むことができる。本方法は、日に1回〜5回の間の頻度で哺乳動物に組成物を投与する工程を含むことができる。本方法は、週に1回よりも頻繁な頻度で、かつ1ヶ月よりも長期間の間、哺乳動物に組成物を投与する工程を含むことができる。期間は、3ヶ月よりも長くてもよい。

もう一つの態様において、本文書は、精神分裂症、躁病、うつ病、精神病、慢性痛、偏執症、自閉症、ストレス、アルツハイマー病、パーキンソン病、炎症誘発性疾患、自己免疫障害、組織分解延髄細網症、狼蒼、関節炎、アテローム性動脈硬化症、ニューロン脈管障害、胃腸状態、および依存症からなる群より選択される状態を有する哺乳動物を処置するための方法を特徴とする。本方法は、状態の症候の重症度が減少される条件下で哺乳動物に組成物を投与する工程を含むか、またはその工程から本質的になり、組成物は、レチクリン、ノルラウダノソリン、サルタリジン、テバイン、およびコデインからなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含む。本方法は、投与する工程の前に、哺乳動物が状態を有すると同定する工程を含むことができる。本方法は、投与する工程の後で、重症度が減少されたことを確認するために哺乳動物をモニターする工程を含むことができる。哺乳動物は、ヒトであり得る。組成物は、経口投与することができる。組成物は、哺乳動物の体重の1kgあたり、哺乳動物が約1〜5mgの1つまたは複数の薬剤の少なくとも1つを受けるような量で哺乳動物に投与されることができる。組成物は、月に1回よりも頻繁な頻度で哺乳動物に投与することができる。組成物は、日または週に1回〜5回の間の頻度で哺乳動物に投与することができる。

もう一つの態様において、本文書は、精神分裂症、躁病、うつ病、精神病、慢性痛、偏執症、自閉症、ストレス、アルツハイマー病、パーキンソン病、炎症誘発性疾患、自己免疫障害、組織分解延髄細網症、狼蒼、関節炎、アテローム性動脈硬化症、ニューロン脈管障害、胃腸状態、および依存症からなる群より選択される状態を有する哺乳動物を処置するための方法を特徴とする。本方法は、ある量で、週に1回よりも頻繁な頻度で、かつ1ヶ月よりも長期間の間、組成物を哺乳動物に投与する工程を含むか、またはその工程から本質的になり、組成物は、モルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドを含み、ここで、組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.05mg未満のモルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドが哺乳動物に投与されることとなる。本方法は、投与する工程の前に、哺乳動物が状態を有すると同定する工程を含むことができる。状態の症候の重症度は、最初の投与の少なくとも1ヶ月後の時点で減少され得る。本方法は、投与する工程の後で、状態の症候の重症度の減少を確認するために哺乳動物を評価する工程を含むことができる。哺乳動物は、ヒトであり得る。組成物は、経口投与することができる。組成物は、週に1回よりも頻繁な頻度で哺乳動物に投与することができる。組成物は、日または週に1回〜5回の間の頻度で哺乳動物に投与することができる。組成物は、モルヒネを含むことができる。組成物は、モルヒネ-6β-グルクロニドを含むことができる。組成物は、モルヒネおよびモルヒネ-6β-グルクロニドを含むことができる。

もう一つの局面において、本文書は、セレン、モルヒネ、およびアルギニン(たとえば、L-アルギニン)を含むか、またはそれらから本質的になる栄養補助食品を特徴とする。本組成物は、モルヒネ前駆体またはカルシウム供与源などの、本明細書に記述した任意のさらなる成分を含むことができる。

他に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記述したものと同様の、または同等な方法および材料は、本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を下記に記述してある。本明細書において言及した全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参照は、これらの全体が参照として組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。加えて、材料、方法、および実施例は、例証であり、限定することは企図されない。

本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかであると考えられる。

詳細な説明
本文書は、疾患を処置するため、炎症を減少させるため、または正常な機能を回復するための、モルヒネ、モルヒネ前駆体(たとえば、チロシン、チラミン、フェニルアラニン、3,4ジヒドロキシフェニルピルベート、ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、ドーパミン、L-DOPA、レチクリン、ノルラウダノソリン、サルタリジン、テバイン、またはコデイン)、モルヒネ-6β-グルクロニド、モルヒネ合成もしくは活性の阻害剤、およびドーパミン合成の阻害剤の使用に関連した方法、ならびに材料を提供する。たとえば、本文書は、モルヒネ、モルヒネ前駆体、モルヒネ-6β-グルクロニド、モルヒネ合成の阻害剤、モルヒネ活性の阻害剤、ドーパミン合成の阻害剤、またはこれらの組み合わせを含む組成物を提供する。また、本文書は、このような組成物を使用するための方法を提供する。

本文書は、モルヒネ、モルヒネ前駆体、モルヒネ-6β-グルクロニド、またはこれらの組み合わせを含む組成物を提供する。モルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドは、哺乳動物に対して低用量のモルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドを送達するようにデザインされた組成物内に調剤することができる。典型的には、低用量のモルヒネは、哺乳動物の疼痛を軽減するために投与される用量を下回る用量である。たとえば、低用量のモルヒネは、1日あたり体重の1kgあたり0.5〜10μgの間(たとえば、1〜9μgの間、1〜8μgの間、1〜7μgの間、1〜6μgの間、1〜5μg、2〜10μgの間、3〜10μg間、4〜10μg間、または5〜10μgの間)であることができる。低レベルのモルヒネ-6β-グルクロニドは、モルヒネと同様であることができる。たとえば、低用量のモルヒネ-6β-グルクロニドは、1日あたり体重の1kgあたり1〜10μgの間(たとえば、1〜9μgの間、1〜8μgの間、1〜7μgの間、1〜6μgの間、1〜5μgの間、2〜10μgの間、3〜10μgの間、4〜10μgの間、または5〜10μgの間)であることができる。場合によっては、モルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドは、70kgの個体に対して35〜700μgの間のモルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドを送達するように調剤することができる。場合によっては、低用量は、哺乳動物内の細胞に一酸化窒素を放出させるほど十分に高いけれども、哺乳動物に無痛を経験させないほど十分に低い任意の量であることができる。このような用量は、限定されるわけではないが、1日あたり体重の1kgあたり約5μgである。

経口的に投与されるときは、モルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドは、10〜1000μgの間(たとえば、10〜900μgの間、10〜800μgの間、10〜700μgの間、10〜600μgの間、10〜500μgの間、30〜1000μgの間、35〜1000μgの間、40〜1000μgの間、50〜1000μgの間、35〜700μgの間、または35〜500μgの間)のモルヒネもしくはモルヒネ-6β-グルクロニドを含む丸剤または錠剤に調剤することができる。たとえば、錠剤は、100μgのモルヒネを含むようにデザインすることができる。これらの場合、約70kgの重量の哺乳動物は、1日あたり1〜3個の間の丸剤または錠剤を摂取するように指示され得る。70kgよりも多い、または少ない重量の哺乳動物は、同様の終濃度を達成するために適した数の丸剤または錠剤を摂取するように指示され得る。本明細書に使用される「モルヒネ」という用語は、ジヒドロモルフィン、硫酸モルヒネ、塩酸モルヒネ、および酢酸モルヒネを含む。

本明細書に提供される組成物は、モルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドを含まずに、1つまたは複数(たとえば、2、3、4、5つ、またはそれ以上)のモルヒネ前駆体を含むことができる。モルヒネ前駆体の例は、チロシン、チラミン、ドーパミン、L-DOPA、3,4ジヒドロキシフェニルピルベート、ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、フェニルアラニン、レチクリン、ノルラウダノソリン、サルタリジン、テバイン、およびコデインを含むが、これらに限定されるわけではない。本明細書に記述したとおり、組成物は、チロシン、チラミン、ドーパミン、L-DOPA、3,4ジヒドロキシフェニルピルベート、ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、フェニルアラニン、レチクリン、ノルラウダノソリン、サルタリジン、テバイン、コデイン、またはこれらの組み合わせを含むようにデザインすることができる。このような組成物は、約70kgの重量の人あたり1〜10mgの間の量などの、任意の量のモルヒネ前駆体を含むことができる。たとえば、組成物は、1〜10mgの間のレチクリンを含むことができる。

本明細書に提供される組成物は、モルヒネもしくはモルヒネ-6β-グルクロニドに加えて、またはモルヒネとモルヒネ-6β-グルクロニドとの組み合わせに加えて、1つまたは複数(たとえば、2、3、4、5つ、またはそれ以上)のモルヒネ前駆体を含むことができる。場合によっては、組成物は、モルヒネおよびレチクリンを含むことができる。モルヒネおよびモルヒネ前駆体を含む組成物、ならびにモルヒネ-6β-グルクロニドおよびモルヒネ前駆体を含む組成物は、0.1〜100mgの間(たとえば、0.1〜90mgの間、0.1〜75mgの間、0.1〜50mgの間、0.1〜25mgの間、0.1〜10mgの間、0.5〜100mgの間、1〜100mgの間、1〜50mgの間、または1〜10mgの間)のモルヒネ前駆体など、任意の量のモルヒネ前駆体を含むことができる。たとえば、組成物は、10〜100μgの間のモルヒネ、10〜100μgの間のモルヒネ-6β-グルクロニド、および1〜10mgの間のレチクリンを含むことができる。

低用量のモルヒネを送達するようにデザインされたか、低用量のモルヒネ-6β-グルクロニドを送達するようにデザインされたか、1つもしくは複数のモルヒネ前駆体を含むようにデザインされたか、またはそれらの任意の組み合わせ(たとえば、モルヒネおよび1つまたは複数のモルヒネ前駆体の両方)を含むようにデザインされた組成物(たとえば、丸剤または錠剤)は、L-アルギニン、セレン、およびCa⁺⁺などのさらなる成分を含むように調剤することができる。細胞がL-アルギニン代謝からの一酸化窒素合成を介してモルヒネに応答して一酸化窒素を放出する能力を促進するために、L-アルギニンを含めることができる。μ3オピエート受容体遺伝子発現を増強するために、セレンを添加することができる。カルシウム依存性構成的一酸化窒素シンターゼを介したL-アルギニンの一酸化窒素への代謝の促進を補助するために、クエン酸カルシウムまたはCaCO₃などのカルシウム供与源を添加することができる。経口適用における酸逆流問題を減少させるために、カルシウム供与源としてCaCO₃を使用することができる。場合によっては、低用量のモルヒネを送達するようにデザインされた丸剤または錠剤は、35〜700μgのモルヒネ(たとえば、0.1mgのモルヒネ)、1mg〜500mgのL-アルギニン(たとえば、300mgのL-アルギニン)、55μg〜200μgのセレン(たとえば、100μgのセレン)、および1000〜1300mgのCa⁺⁺(たとえば、1000mgのCa⁺⁺)を含むように調剤することができる。場合によっては、丸剤または錠剤は、1〜10mgのレチクリン(たとえば、5mgのレチクリン)、1mg〜500mgのL-アルギニン(たとえば、300mgのL-アルギニン)55μg〜200μgのセレン(たとえば、100μgのセレン)、および1000〜1300mgのCa⁺⁺(たとえば、1000mgのCa⁺⁺)を含むように調剤することができる。本明細書に提供される組成物に含めることができるその他の成分は、薬学的に許容される水性ビヒクル、薬学的に許容される固体ビヒクル、ステロイド、抗菌薬、抗炎症薬、免疫抑制薬、拡張薬、血管収縮薬、抗コリン作用剤、抗ヒスタミン、抗酸化剤、およびそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されるわけではない。

場合によっては、低用量のモルヒネを送達するようにデザインされたか、低用量のモルヒネ-6β-グルクロニドを送達するようにデザインされたか、1つもしくは複数のモルヒネ前駆体を含むようにデザインされたか、またはこれらの任意の組み合わせ(たとえば、モルヒネおよび1つまたは複数のモルヒネ前駆体の両方)を含むようにデザインされた組成物(たとえば、丸剤または錠剤)は、モルヒネ合成(たとえば、CYP2D6またはCYP2D7阻害剤)もしくは活性(たとえば、ナロキソン)の1つもしくは複数の阻害剤、ドーパミン合成もしくは活性の1つもしくは複数の阻害剤、またはそれらの組み合わせを含むように調剤することができる。CYP2D6阻害剤の例は、アミオダロン、クロロキン、シメチジン、クロミプラミン、ジフェンヒドラミン、デュロキセチン、フルオキセチン、ヒドロキシクロロキン、パロキセチン、プロパフェノン、プロポキシフェン、およびキニジン、テルビナフィンを含むが、それらに限定されるわけではない。

薬学的に許容される水性ビヒクルは、たとえばモルヒネまたはモルヒネ前駆体(たとえば、レチクリン)を溶解することができ、かつ組成物を受ける特定の個体に対して有毒ではない任意の溶液であり得る。薬学的に許容される水性ビヒクルの例は、塩水、水、および酢酸を含むが、それらに限定されるわけではない。典型的には、薬学的に許容される水性ビヒクルは、無菌である。薬学的に許容される固体ビヒクルは、モルヒネまたはモルヒネ前駆体が経口投与に適しているように調剤することができる。たとえば、カプセルまたは錠剤は、腸溶性形態でレチクリンを含むことができる。有効量には、1つもしくは複数のいずれかのカプセルまたは錠剤を投与することによって到達させることができるので、それぞれのカプセルまたは錠剤によって供給される用量は変動し得る。ゼラチンおよびセルロース誘導体などの任意の周知の薬学的に許容される材料を薬学的に許容される固体ビヒクルとして使用することができる。加えて、薬学的に許容される固体ビヒクルは、デンプン、糖、またはベントナイトを含むが、それらに限定されるわけではない固体キャリアであり得る。さらに、モルヒネもしくはモルヒネ前駆体の錠剤または丸剤製剤は、固体キャリア、潤滑剤等を使用する従来の手順に従うことができる。

ステロイドは、ヒドロシクロペンタノフェナントレン環構造を含む任意の化合物であり得る。ステロイドの例には、プレドニゾン、デキサメサゾン、およびヒドロコルチゾンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。抗菌薬は、ペニシリン、エリスロマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン、およびクリンダマイシンなどの、細菌に対して活性である任意の化合物であり得る。抗炎症剤は、イブプロフェンおよびサリチル酸などの、炎症に対抗する任意の化合物であり得る。免疫抑制薬は、シクロスポリンなどの、正常な免疫機能を抑制するか、または妨害する任意の化合物であり得る。拡張薬は、アルブテロールなどの開口部の拡張を生じさせる任意の化合物であり得る。血管収縮薬は、塩酸フェニレフリン、コカイン、およびエピネフリンなどの、血管を収縮させるか、または狭くする任意の化合物であり得る。抗コリン薬は、臭化イプラトロピウムなどの、副交感神経インパルスを遮断する任意の化合物であり得る。抗ヒスタミン剤は、テルフェナジンおよびアステミゾールなどの、ヒスタミンの作用または細胞(たとえば、肥満細胞)からのヒスタミンの放出を妨害する任意の化合物であり得る。

モルヒネ、モルヒネ-6β-グルクロニド、モルヒネ前駆体、または本明細書に提供される組成物の任意のさらなる成分を得るために、任意の方法を使用することができる。場合によっては、本明細書に提供される組成物の成分は、通常の化学的な抽出、単離、または合成技術を使用して得ることができる。たとえば、レチクリンは、他に記述されたとおりに(Brochmann-Hanssen and Nielsen, Tetrahedron Lett., 18：1271-4 (1965)および米国特許第3,894,027号)得ることができる。場合によっては、本明細書に提供される組成物の成分は、商業的供給業者から得ることができる。たとえば、モルヒネ、モルヒネ-6β-グルクロニド、コデイン、ノルラウダノソリン、およびサルタリジンは、Sigma, Inc.に注文することができる。

任意の方法を使用して、本明細書に提供される組成物を調剤することができる。たとえば、通常の製剤混合および調製技術を使用して、本明細書に記述された成分を有する組成物を作製することができる。加えて、本明細書に提供される組成物は、任意の形態であることができる。たとえば、本明細書に提供される組成物は、粉末、結晶性物質、ゲル、ペースト、軟膏、膏薬、クリーム、溶液、懸濁液、部分的液体、スプレー、噴霧剤、ミスト、噴霧された吸入剤、チンキ、丸剤、カプセル、錠剤、およびジェルカップを含むが、それらに限定されるわけではない固体、液体、および/またはエアロゾルの形態であることができる。場合によっては、組成物は、栄養補助食品であってもよい。一部の態様において、モルヒネ、1つもしくは複数のモルヒネ前駆体、またはこれらの組み合わせを含む組成物は、成分を以下の1つまたは複数と混合することにより、経口投与用に調製することができる：充填剤、結合剤、崩壊薬、潤滑剤、および着色剤。乳糖、コーンスターチ、ショ糖、グルコース、ソルビトール、結晶セルロース、二酸化ケイ素等は、充填剤として使用することができる。ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アカシア、トラガカンタ、ゼラチン、セラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、クエン酸カルシウム、デキストリン、またはペクチンは、結合剤として使用することができる。ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、または硬化された植物油は、潤滑剤として使用することができる。薬学的に許容される着色剤は、着色剤として使用することができる。また、ココア粉末、ハッカ水、芳香族酸、ハッカ油、ボルネオール、または桂皮末も添加することができる。場合によっては、モルヒネ、1つもしくは複数のモルヒネ前駆体、またはこれらの組み合わせを含む組成物は、成分を以下の1つまたは複数と混合することにより、注射用に調製することができる：pH調整薬、緩衝液、安定剤、および溶解剤。

本明細書に提供される組成物は、任意の哺乳動物(たとえば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、サル、またはヒト)に投与することができる。加えて、本明細書に提供される組成物を哺乳動物に投与するために、任意の投与経路(たとえば、経口または非経口投与)を使用することができる。たとえばモルヒネまたはレチクリンを含む組成物を経口投与または非経口投与(たとえば、皮下、筋肉内、眼窩内、関節内、髄腔内、胸骨内、または静脈内注射)することができる。

いずれか特定の作用機序に限定されるわけではないが、本明細書に提供される組成物は、細胞(たとえば、μ3オピエート受容体を発現する細胞)による一酸化窒素放出の基礎レベルを増大し、または維持するために使用することができる。哺乳動物に対するレチクリンなどのモルヒネ前駆体の投与により、モルヒネ前駆体のモルヒネへの変換を引き起こすことができる。モルヒネ前駆体から産生されるモルヒネもしくはモルヒネを含む組成物によって直接提供されるモルヒネ、またはモルヒネ-6β-グルクロニドを含む組成物によって直接提供されるモルヒネ-6β-グルクロニドは、一酸化窒素放出に共役したμ3オピエート受容体を活性化することができ、かつ哺乳動物内の組織の活性化状態をダウンレギュレートし、これらの興奮性をより少なくすることができる。たとえば、モルヒネまたはレチクリンを投与することにより、望ましくない興奮を制限することができ、哺乳動物内の基礎活性レベルを回復することができる。加えて、特定の哺乳動物では、通常それらの興奮状態(たとえば、暴走(run-away)炎症誘発性状態、精神障害、血管障害)をダウンレギュレートするためにこの材料を使用する過程における要求を満たすほど十分な内因性モルヒネを産生しない可能性がある。レチクリンなどのモルヒネ前駆体を投与することにより、制御物質を投与することなく、興奮状態をダウンレギュレートするために必要なモルヒネを哺乳動物に提供することができる。低用量にて直接モルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドを投与することにより、投与されたモルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドに対する耐性を誘発することなく、興奮状態をダウンレギュレートするために必要なモルヒネを哺乳動物に提供することができる。たとえば、本明細書に記述したように、モルヒネを、常習的に(たとえば、長期間)低用量にて、経時的なモルヒネの効果(たとえば、一酸化窒素放出)の減少を観察することなく投与することができる。加えて、モルヒネ-6β-グルクロニドは、血液脳関門を超える能力に制限を示すので、モルヒネ-6β-グルクロニドを投与することにより、脳ではなく末梢において、哺乳動物に一酸化窒素放出を提供することができる。

本明細書に提供される組成物は、任意の量で、任意の頻度で、および任意の期間の間、哺乳動物に投与することができる。典型的には、本明細書に提供される組成物は、哺乳動物において一酸化窒素放出を誘導するために有効な量で、頻度で、かつ期間の間、哺乳動物に投与することができる。場合によっては、本明細書に提供される組成物は、疾患または状態(たとえば、精神分裂症、躁病、うつ病、精神病、慢性痛、偏執症、自閉症、ストレス、アルツハイマー病、パーキンソン病、炎症誘発性疾患、自己免疫障害、組織分解延髄細網症、狼蒼、関節炎、アテローム性動脈硬化症、ニューロン脈管障害、または依存症)の症候の重症度を減少させるために有効な量で、頻度で、かつ期間の間、哺乳動物に投与することができる。

本明細書に提供される組成物の、またはモルヒネの、もしくはモルヒネ前駆体(たとえば、レチクリン)の有効量は、哺乳動物に対して有意な毒性を生じることなく、細胞が一酸化窒素を放出するように誘導する任意の量であることができる。場合によっては、本明細書に提供される組成物の、またはモルヒネの、もしくはモルヒネ前駆体(たとえば、レチクリン)の有効量は、哺乳動物に対して有意な毒性を生じることなく、哺乳動物に投与することにより、疾患もしくは状態の症候を減少させ、防止し、または除去する任意の量であることができる。モルヒネ前駆体を含む一部の場合には、有効量は、組織試料内で検出可能な量のモルヒネの産生を生じる任意の量であることができる。

一方、本明細書に提供される組成物は、任意の量で哺乳動物に投与することができる。一部の態様において、本明細書に提供される組成物の、またはモルヒネの、もしくはモルヒネ前駆体(たとえば、レチクリン)の量は、0.01mg/kg体重よりも多くてもよい。場合によっては、本明細書に提供される組成物の、またはモルヒネの、もしくはモルヒネ前駆体(たとえば、レチクリン)の量は、約0.01〜約50mg/kg体重の間(たとえば、約0.01〜約45mg/kgの間；約0.1〜約25mg/kgの間；または約1〜約5mg/kgの間)でもよい。有効量は、処置される疾患(もしあれば)、投与部位、および処置される哺乳動物に応じて変更され得る。このような有効量は、本明細書に提供される方法および材料を使用して決定することができる。たとえば、モルヒネ産生のレベルは、インビトロまたはインビボでのルーチン試験を使用して評価することができる。たとえば、特定の状態を有する患者が、5mg/kg体重のレチクリンを受けることができる。患者が、モルヒネに応答すること、または産生することができない場合には、たとえば、量を10倍増大することができる。このより高濃度を受けた後に、処置および毒性症候に対する両方の応答性について患者をモニターし、それに応じて調整を行うことができる。

種々の因子が、特定の適用のために使用される実際の量に影響し得る。たとえば、投与の頻度、処置の期間、他剤の組み合わせ、投与の部位、病期(存在するならば)、および処置した領域の解剖学的配置により、投与される実際の量の増減が必要なこともある。

本明細書に提供される組成物の投与の頻度は、任意の頻度であることができる。たとえば、投与の頻度は、日に約4回〜月に約1回、またはより具体的には、日に約２回〜週に約1回であることができる。加えて、投与の頻度は、一定のままであってもよく、または処置期間の間に変更可能であってもよい。投与される量と同様に、種々の因子が、特定の適用のために使用される投与の実際の頻度に影響し得る。たとえば量、処置の期間、薬剤の組み合わせ、投与の部位、病期(存在するならば)、および処置される領域の解剖学的配置により、投与頻度の増減が必要であるかもしれない。一つの態様において、レチクリンを含む組成物は、体重1kgあたり約1〜約5mgのレチクリンの用量にて、毎日投与することができる。

本明細書に提供される組成物の投与の期間は、任意の期間であり得る。たとえば、本明細書に提供される組成物の投与の期間は、1週間、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、1年、2年、または3年よりも長くてもよい。場合によっては、有効な期間は、哺乳動物に対して有意な毒性を生じることなく、哺乳動物に投与することにより、疾患の症候を減少させ、防止し、または除去する任意の期間であり得る。このような有効な期間は、数日〜数週間、月、または年で変動し得る。一般に、急性疾患の処置のための有効な期間は、数日〜数ヶ月まで期間の範囲に及ぶことができる。しかし、一旦組成物の投与が止められると、疾患症候が戻ってしまうかもしれない。このような場合、一定の状態を予防するための有効な期間は、個体が生きている限り続き得る。

複数の因子が、特定の処置または予防措置のために使用される実際の期間に影響し得る。たとえば、有効な期間は、投与の頻度、投与される量、複数の薬剤の組み合わせ、投与の部位、疾患の状態(存在するならば)、および処置される領域の解剖学的配置により変更することができる。

本明細書に提供される組成物(たとえば、レチクリンを含む組成物)の投与が有毒な場合、投与された組成物から生じるモルヒネの産生を阻害するために、L-DOPAおよびドーパミンの組み合わせにより哺乳動物を処置することができる。たとえば、組成物の投与後に通常産生されるモルヒネの95、90、80、70、60、50、40、30、20、10、またはそれ以下のパーセントだけが実際に産生されるように、L-DOPAおよびドーパミンの組み合わせを使用して、モルヒネ前駆体を含む組成物から産生されるモルヒネの量を減少させることができる。

本文書は、細胞からの一酸化窒素放出を誘導するための方法も提供する。このような細胞は、インビトロのまたはインビボのものであり得る。加えて、細胞は、ニューロン細胞、血管細胞、呼吸器細胞、免疫細胞、または消化器細胞を含むが、それらに限定されるわけではない任意の細胞のタイプであることができる。細胞からの一酸化窒素放出を誘導するために、本明細書に提供される組成物を、本明細書に記述したように投与することができる。たとえば、モルヒネを含む組成物は、哺乳動物が1ヶ月を超える(たとえば、2、3、4、5、6、7、8、9ヶ月、またはそれ以上を超える)期間の間に１日あたり体重の1kgあたり0.5μg〜10μgの間のモルヒネを受けるような量、かつ頻度で、哺乳動物に投与することができる。

加えて、本文書は、本明細書に提供される組成物を使用して、疾患または状態を有する哺乳動物を処置するための方法を提供する。本明細書に提供される組成物を使用して処置することができる疾患または状態の例には、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、ベーチェット病、動脈周囲炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、活動性慢性肝炎、糸球体腎炎、自己免疫疾患、骨関節炎、痛風、アテローム性動脈硬化症、乾癬、アトピー性皮膚炎、肉芽腫を伴う肺疾患、脳炎、内毒素ショック、敗血症、炎症性大腸炎、糖尿病、急性骨髄性白血病、肺炎、心臓移植術、脳脊髄炎、摂食障害、急性肝炎、慢性肝炎、薬物性肝損傷、アルコール性肝炎、ウイルス性肝炎、黄疸、肝硬変、肝不全、心房粘液腫、カースルマン症候群、多発性骨髄腫、レナートTリンパ腫症、糸球体間質腎炎、腎細胞癌、サイトメガロウイルス肝炎、サイトメガロウイルス網膜症、アデノウイルスかぜ症候群、アデノウイルス咽頭結膜熱、アデノウイルス眼炎、AIDS、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、糖尿病に関連した脈管障害、躁病、うつ病、慢性痛、精神分裂症、精神病、および偏執症を含むが、それらに限定されるわけではない。このような疾患または状態を有する哺乳動物を処置するために、本明細書に提供される組成物を、本明細書に記述したように投与することができる。たとえば、モルヒネを含む組成物は、哺乳動物が1ヶ月を超える(たとえば、2、3、4、5、6、7、8、9ヶ月またはそれ以上を超える)期間の間に1日あたり体重の1kgあたり0.5μg〜10μgの間のモルヒネを受けるような量、かつ頻度で、哺乳動物に投与することができる。場合によっては、本明細書に提供される組成物は、疾患もしくは状態の症候の重症度を減少させ、または疾患もしくは状態の発病もしくは発症を予防するために使用することができる。

本発明は、以下の実施例にさらに記述されており、これらは、特許請求の範囲に記述された本発明の範囲を限定しない。

実施例
実施例1−無脊椎動物神経節に対するレチクリン曝露は、内因性モルヒネレベルを増大する
以下の実験は、組織をオピエートアルカロイド前駆体のレチクリンに対して曝露することにより、内因性モルヒネレベルの増大を生じるかどうかを決定するために行われた。

材料および方法
Long Island Soundの地方の水域から収集されたムラサキイガイ(Mytilus edulis)を、実験に使用する少なくとも14日前に実験条件下で維持した。イガイを、以前に記載されたとおり(Stefano et al., Electro-Magnetobiol., 13：123-36 (1994))、30PSUの塩分にて、かつ18℃の温度にて、人工海水(Instant Ocean, Aquarium Systems, Mentor, Ohio)中で保持した。

レチクリン曝露のためには、400匹の動物を人工海水中に24℃にて置いて維持し、一方、対照動物(100)は、ビヒクル(PBS)に曝露した。生化学的解析のためには、20匹の動物群を、レチクリンとのインキュベーション後の種々の時間にこれらの足神経節を切除した。

抽出プロトコルは、内部または外部モルヒネ標準を使用して、部屋内で行い、ここでは、モルヒネ混入を避けるために動物を維持しなかった。モルヒネの損失を防止するために、使い捨てのシリコン処理したチューブを使用した。また、外部からのモルヒネ混入を回避するために、ムラサキイガイ足神経節をPBS(0.01M NaCl、0.132mM, NH₄HCO₃ 0.132mM；pH 7.2)で広範に洗浄(3回)した後に抽出した(1000rpmにて1分の遠心分離、続いてPBSの廃棄を3回)。組織を1N HClに溶解して、Fisher scientific sonic dismembrator 60(Fisher Scientific, USA)を使用して超音波処理した。生じたホモジネートを5mLのクロロホルム/イソプロパノール9：1で抽出した。

室温にて5分後、ホモジネートを3000rpmにて15分間遠心分離した。3つの相を以下の順序で分離した：1)有機相に対応する最下層；2)沈殿したタンパク質に対応する中間相；および3)モルヒネを含む上部水性上清相。上清を収集して、Centrivap Console (Labconco, Kansas City, Missouri)で乾燥させた。次いで、乾燥抽出物を、固相抽出前に0.05%のトリフルオロ酢酸(TFA)水に溶解した。試料を事前に100%のアセトニトリルで活性化して0.05%のTFA-水で洗浄したWaters Sep-Pak Plus C-18 カートリッジに充填した。モルヒネ溶出は、10%のアセトニトリル溶液で行った(水/アセトニトリル/TFA、89.5%：10%：0.05%(v/v/v)。溶出した試料をCentrivap Consoleで乾燥して、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)解析の前に溶解した。

モルヒネラジオイムノアッセイ(RIA)測定は、¹²⁵I標識したモルヒネを抗体結合部位に対して試験試料中のモルヒネと一定期間競合するという固相の定量的RIAであった。使用した市販のキットは、Diagnostic Products Corporation(USA)からのものであった。抗体をポリプロピレンチューブの壁面に固定させたので、競合を終結するため、および放射標識したモルヒネの抗体結合画分を単離するためには、単に液相をデカントするだけで十分であった。次いで、材料をWallac, 3’’, 1480ガンマカウンター(Perkin Elmer, USA)でカウントした。検量線に対してカウントを比較することにより、試験試料中に存在するモルヒネの量を得て、ミリリットルあたりのモルヒネのナノグラムとして表した。キャリブレータは、それぞれ、PBS中に1ミリリットルあたり0、2.5、10、25、75、および250ナノグラムのモルヒネ(ng/mL)を含んだ。レチクリンおよびサルタリジンは、抗体と交差反応しなかった。検出限界は、0.5ng/mLであった。

HPLC解析を、Waters 626ポンプ(Waters, Milford, MA)およびC-18 Unijet小口径カラム(BAS)で行った。小口径カラムのために必要とされる低容積流速を提供するために、フロースプリッター(BAS)を使用した。分割比は、1/9であった。0.5mL/分にてポンプを操作することにより、50μL/分の小口径カラム流速を得た。注入体積は、5μLであった。モルヒネ検出は、アンペロメトリック検出器LC-4C(BAS, West Lafayette, Indiana)で行った。小口径カラムは、デッドボリュームを最小限にするために、検知セルに直接連結した。電気化学的検出システムには、グラッシーカーボン-作用電極(3mm)および0.02Hzのフィルター(500mV；レンジ10nA)を使用した。セル容積は、16μmガスケットによって減少させた。クロマトグラフィー・システムは、Waters Millennium³² Chromatography Manager V3.2ソフトウェアによって制御し、クロマトグラムは、Chromatographソフトウェア(Waters)で統合した。

モルヒネは、他に記述されたとおりに(Zhu et al., Brain Res. Mol. Brain Res.(88)：155-60(2001))、組織中で定量化した。簡潔には、移動相は、以下のとおりであった：緩衝液A：10mM塩化ナトリウム、0.5mM EDTA、100mM酢酸ナトリウム、pH 5.0；緩衝液B：10mM塩化ナトリウム、0.5mM EDTA、100mM酢酸ナトリウム、50% アセトニトリル、pH 5.0。注入体積は、5μLであった。試験条件は、以下のとおりであった：0分0%緩衝液Bから；10分、5%緩衝液B；25分にて50%緩衝液B；30分にて100%緩衝液B。緩衝液AおよびBは両方とも、Waters 0.22μmフィルターを通して濾過して、システム全体の温度を25℃に維持した。カラムに残っている残留モルヒネ混入を防止するために、それぞれの試料間に数回のHPLC精製を行った。さらに、外套組織をネガティブ対照として試験し、混入がないことを証明した(Zhu et al., Mol. Brain Res. (117)：83-90(2003))。

一酸化窒素アッセイのために、ムラサキイガイから切開した10個の足神経節(測定あたり)を1mLの無菌のリン酸緩衝食塩水(PBS)に浸した。実験には、10^-6 Mの終濃度のモルヒネを、10^-6 Mのナロキソンを、および1μgのレチクリンを使用した。オピエート受容体アンタゴニスト実験のためには、神経節をレチクリン添加前に10分間ナロキソンで前処置した。NO放出は、World Precision Instruments(Sarasota, FL)によって製造されたNO選択的微小プローブでモニターした。センサーは、それぞれの組織表面よりおよそ100μm上に置いた。電気化学的センサーの較正は、他に記述したとおり(Liu et al., Brain Res., 722：125-31 (1996))、種々の濃度のニトロソチオールドナーのS-ニトロソ-N-アセチル-DL-ペニシラミン(SNAP)を使用することによって行った。NO検出システムは、毎日較正した。プローブは、組織を含まないインキュベーション培地中で10分間平衡化させた後、さらに5分間神経節を含むバイアルへ移した。神経節の操作および取扱いは、ガラス機器でのみ行った。データは、Apollo-4000フリーラジカルアナライザー(World Precision Instruments, Sarasota, FL)を使用して取得した。次いで、グラフィック表示および評価のために、実験値をSigma-Plot および -Stat(Jandel, CA)に移行した。結合実験のためには、NO放出に連関したμ3オピエート受容体サブタイプは、ヒト単球のRT-PCRおよびノーザンブロット解析によって同定されたので(Cadet et al., J. Immunol., 170：5118-23 (2003))、これらの細胞をポジティブ対照として役立てた。単球は、Long Island Blood Center(Melville, Long Island)から得て、他に記述されたとおりに処理した(Stefano et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90：11099-103 (1993)； Bilfinger et al., Adv. Neuroimmunol., 3：277-88 (1993)；およびMagazine et al., J. Immunol. 156：4845-50 (1996))。

さらなる100個の切除された足神経節およびヒト単球を別々に洗浄して、Brinkmann polytron(30秒、5番に設定する)を使用して50体積の0.32Mショ糖(pH 7.4)中で4℃にてホモジナイズした。粗製ホモジネートを900×gにて10分間4℃で遠心分離して、上清を氷上に貯蔵した。白っぽい粗製ペレットを30体積の0.32Mショ糖/Tris-HCl緩衝液(pH 7.4)中でのホモジナイゼーション(15秒、5番に設定する)によって再懸濁して、900×gにて10分間遠心分離した。抽出手順をもう1回繰り返して、合わせた上清を900×gにて10分間遠心分離した。生じる上清(S1’)を直ちに使用した。結合実験の前に、S1’上清を30,000×gにて15分間遠心分離して、ペレット(P2)を50体積のショ糖/Tris-HCl中での遠心分離によって1回洗浄した。次いで、P2ペレットをDounce携帯ホモジナイザー(10ストローク)で100体積の緩衝液中に再懸濁した。次いで、結合解析を細胞膜懸濁液で行った。

膜懸濁液(0.2mL、0.12mgの膜タンパク質)のアリコートを、デキストロファン(dextrorphan)(10mM)またはレボルファノール(10mM)の存在下において、0.1% BSAおよび150mM KClを含む10mM Tris-HCl緩衝液、pH 7.4中で適切な放射標識したリガンドと共に22℃にて40分間、3回インキュベートした。遊離リガンドをGF/Bグラスファイバーフィルター(Whatman)；フィルターは0.5% BSAを含む緩衝液中に予浸した(45分、4℃)を通して減圧下で濾過することによって、膜に結合した標識したリガンドから分離した。フィルターを、2% ポリエチレングリコール6000(Baker)を含むインキュベーション緩衝液(4℃)の2.5mLのアリコートで迅速に洗浄した。これらを液体シンチレーション分光測定(Packard 460)によってアッセイした。立体特異的結合は、10mMデキストロファンの存在下における結合引く10mMレボルファノールの存在下における結合として定義した。タンパク質濃度は、膜懸濁液中で決定した(BSA非存在下において調製した)。

IC₅₀決定(特異的³H-ジヒドロモルフィン結合(μ3に対する)の最大半減阻害を誘発する薬物の濃度として定義される)については、他に記述したとおり(Stefano et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90：11099-103 (1993))、それぞれの組織膜懸濁液のアリコートを、6つの異なる濃度にて非放射性オピオイド化合物と共に22℃にて10分間、次いで、³H-ジヒドロモルフィンと共に4℃にて60分間インキュベートした。3回の実験の平均+/-S.E.M.をそれぞれの化合物について記録した。Tyr-D-Pen-Gly-Phe-D-Pen(DPDPE)およびナルトレキソンは、Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)から得た。

結果
モルヒネは、液体および固体抽出物に続くアセトニトリルの勾配を使用する逆相HPLCによる神経節抽出物中に同定され、信頼のおける標準と比較した(図1)。材料は、信頼のおけるモルヒネと同じ滞留時間を示した。モルヒネの電気化学的検出感度は、80ピコグラムであった。モルヒネの濃度は、外部標準について算出したピーク面積から推定される、Chromatogram Manager 3.2市販ソフトウェア(Millemmium³², Waters, Milford, MA)によって決定すると、1.43±0.41ng/mg±SEM神経節湿重量であった。50ngのレチクリンと共に1時間インキュベートした神経節は、これらの内因性モルヒネレベルの統計的増大を示した(6.7±0.7ng/mg 組織湿重量；P＜0.01；図1)。

電気化学的結果は、1.33±0.61ng/mgの組織湿重量±SEMのモルヒネの対照神経節レベルを生じるRIA定量化と矛盾しない(図2)。種々の濃度のレチクリンとのインキュベーションでは、濃度依存的様式で、1時間後に神経節モルヒネレベルを増大する(図2)。100ngのレチクリンに対して切除した神経節を曝露すると、約14.53±4.6ng/mg モルヒネを得た(図2；P＜0.001)。神経節モルヒネレベルの増大は、レチクリン添加の10分後で始まり、60分のインキュベーション期間を通して段階的に生じた(図3)。これらの研究から、添加したレチクリンの約24パーセントがモルヒネに変換された。モルヒネHPLC測定の間の空試験では、RIAでモルヒネ残基を示さなかったし、その存在のいずれの徴候も外套組織では生じなかった。50ngのレチクリンの外套組織とのインキュベーションでは、検出可能なモルヒネを生じなかった。

μオピエート受容体を含む足神経節は、ナロキソンおよびL-NAME感受性の様式で構成的一酸化窒素シンターゼに由来するNOを放出することによってモルヒネ曝露に対して応答する(Stefano et al., Brain Res., 763：63-8 (1997) および Cadet et al., Mol. Brain Res., 74：242-6 (1999))。さらに新たに合成されたモルヒネの同一性を実証する試みにおいて、神経節を、これらがレチクリン曝露に応答してNOを放出する能力について調べた(図4；表1)。レチクリン(10^-7M)は、神経節に対するその適用の直後にNOを放出し、5分間持続するというモルヒネ(10^-6 M)のものと似た様式で神経節NO放出を刺激しなかった(図4；表1)。その代わりに、レチクリンでは、3分の遅延があり、これが長期にわたる放出期間続き、17分を超えて生じた(図4)。このレチクリンで刺激される放出は、レチクリンがモルヒネに変換されたために生じ、レチクリン曝露後のモルヒネ増大の時間経過によって示されるとおり、新たに合成されたモルヒネが、検出されたNO放出の原因であった(図3)。

(表１)足神経節からのNO放出

10nMにて上昇するNO産生前のレチクリンおよびサルタリジンNOピーク時間および潜時は、モルヒネおよびジヒドロモルフィンについて記録されたこれらの値と統計学的に異なった(P＜0.01)。

レチクリンもサルタリジンも、足神経節μ3オピエート受容体サブタイプに対する結合親和性を示さなかった(表2)。この知見を、μ3オピエート受容体サブタイプをクローン化したヒト単球のポジティブ対照を使用してさらに実証した。この結果は、レチクリンがμ3オピエート受容体に対する親和性を有さないため、レチクリン(10^-7M)で刺激されるNOの放出を遮断するナロキソン(10^-6 M)(図4)で神経節を前処置することにより、この前駆体がモルヒネに変換されることを介して生じることを示す(表2)。

(表２)種々の組織膜懸濁液におけるオピオイドリガンドによる³H-ジヒドロモルフィン(DHM；nmol-L^-1)の置換

DPDPE=(D-Pen²、D-Pen⁵)-エンケファリン

本明細書に提供した結果は、(1)モルヒネがイガイ足神経節に存在すること；(2)足神経節をレチクリンに曝露すると、濃度および時間依存的様式で神経節のモルヒネレベルの有意な増大を生じること；(3)レチクリンは、それがモルヒネに変換されるのと一致した様式で潜時後に神経節NO産生を刺激すること；および(4)レチクリンがμ3オピエート受容体に対して親和性を示さないことを証明し、また、NO放出がレチクリンのモルヒネへの変換により生じることを示唆する。

実施例2−哺乳動物細胞はレチクリンからモルヒネを産生する
ヒト細胞(NCI-H295R)は、副腎皮質の癌腫に由来するNCI-H295多能性副腎皮質癌腫株化細胞(ATCC CRL-10296)から適応された。原細胞を培地に適応させ、これにより5日から2日に集団倍加時間が減少した。原細胞は、懸濁液中で増殖したが、適応された細胞は、単層中で増殖するように選択した。これらの細胞は、副腎アンドロゲンを産生する能力を保持しており、アンジオテンシンIIおよびカリウムイオンに応答した。これらの細胞を増殖するために、培地は、15mM HEPES、0.00625mg/mL インスリン、0.00625mg/mL トランスフェリン、6.25ng/mL セレン、1.25mg/mL ウシ血清アルブミン、および0.00535mg/mL リノール酸(97.5%)；Nu-Serum I、2.5%を含むダルベッコ変法イーグル培地とハムF12培地との1：1混合物であった。たとえば、Rainey et al., Mol. Cell. Endocrinol., 100：45-50 (1994)； Gazdar et al., Cancer Res., 50：5488-5496 (1990)；および Bird et al., Endocrinology, 133：1555-1561 (1993)を参照されたい。

細胞は、実験の24時間前に6ウェル細胞培養クラスター(Corning Inc.)において二次培養した。細胞の量は、Microscope(Nickon inc)によって決定した。種々の量のレチクリンを細胞に添加して、細胞をNAPCOインキュベーターで培養した。24時間後に10N HClを添加することによってインキュベーションを終了させた。細胞および培地中のモルヒネは、Diagnostic Products Cooperation, CA, USA.から購入したRIAキットで検出した。

細胞内のモルヒネレベルは、レチクリンと共にインキュベートしたときに、有意に高かった。100ngのレチクリンと共にインキュベートした500,000個の細胞では、約28±5.4ngのモルヒネを産生した。対照細胞では、約9.6±3.5ngのモルヒネを産生するだけであった。培地は、試験においてネガティブであった。これらの結果は、ヒト細胞がレチクリンからモルヒネを産生することができることを示す。

実施例3−L-DOPAおよびドーパミンの組み合わせは、内因性モルヒネ産生を阻害する
イガイ足神経節を得て、10μg L-DOPA単独、10μgドーパミン単独、または10μg L-DOPAに加えて10μg ドーパミンと共にインキュベートした。対照神経節は、L-DOPAまたはドーパミンと共にインキュベートしておらず、11.9ng/mLのモルヒネを示した。L-DOPA単独またはドーパミン単独と共にインキュベートした神経節は、それぞれ9.31および8.82ng/mLのモルヒネを示した。対照的に、L-DOPAおよびドーパミンの両方と共にインキュベートした神経節は、5.52ng/mLのモルヒネを示した。これらの結果は、L-DOPAおよびドーパミンの両方での処置によりモルヒネ産生を減少させることができることを示す。

実施例4−L-DOPAは、モルヒネの産生を増大する
Long Island Soundの地方の水域から収集されたムラサキイガイを、以前に記載されたとおり(Stefano et al., Electro-Magnetobiol., 13：123-36 (1994))、30PSUの塩分にて、かつ18℃の温度にて、人工海水中で保持した。インビトロでの神経節アッセイのためには、10匹の動物群からこれらの足神経節を削除し、L-DOPAまたはレチクリンの添加後の種々の時間帯にて、および種々の濃度のこれらのモルヒネ前駆体にて、これらのモルヒネレベルについて調べた。実施例1で提供された結果では、レチクリンが内因性神経節モルヒネレベルを増大することを示しているので、インビトロでのレチクリンとのインキュベーションをポジティブ対照として役立てた。L-DOPAを1〜100ng/mLの範囲の濃度にて、および種々の時間にて、神経節と共にインキュベートした。

インビボ前駆体注射実験のために、動物の足にレチクリンまたはL-DOPA(それぞれ、0.1および1μg/注射)を注射した。26G針をもつBD 1 ccシリンジによって化学薬品を注射した。それぞれの針を足神経節の少し上の足の根本に挿入した。

モルヒネ測定、固相抽出物
本明細書に記述したとおり、インビトロおよびインビボの実験から得て、別々に試験した、切開してプールした神経節を使用して、モルヒネ抽出プロトコルを行った。

次いで、固相抽出の前に、乾燥抽出物を0.05%のトリフルオロ酢酸(TFA)水に溶解した。試料は、事前に100%のアセトニトリルで活性化して0.05%のTFA-水で洗浄したWaters Sep-Pak Plus C-18 カートリッジに充填した。モルヒネ溶出は、10%のアセトニトリル溶液で行った(水/アセトニトリル/TFA、89.5%：10%：0.05%(v/v/v)。溶出した試料をCentrivap Consoleで乾燥して、HPLC解析の前に溶解した。

ラジオイムノアッセイ(RIA)測定
モルヒネRIA測定は、¹²⁵I標識したモルヒネを抗体結合部位に対して試験試料中のモルヒネと一定期間競合するという固相の定量的RIAであった。使用した市販のキットは、Diagnostic Products Corporation(USA)から得た。検出限界は、0.5ng/mLであった。

試料中のモルヒネのHPLCおよび電気化学的検出
HPLC解析は、Waters 626ポンプ(Waters, Milford, MA)およびC-18 Unijet小口径カラム(BAS)で行った。小口径カラムのために必要とされる低容積流速を提供するために、フロースプリッター(BAS)を使用した。分割比は、1/9であった。0.5mL/分にてポンプを操作することにより、50μL/分の小口径カラム流速を得た。注入体積は、5μLであった。モルヒネ検出は、アンペロメトリック検出器LC-4C(BAS, West Lafayette, Indiana)で行った。小口径カラムは、デッドボリュームを最小限にするために、検知セルに直接連結した。電気化学的検出システムには、グラッシーカーボン-作用電極(3mm)および0.02Hzのフィルター(500mV；レンジ10nA)を使用した。セル容積は、16μmガスケットによって減少させた。クロマトグラフィー・システムは、Waters Millennium³² Chromatography Manager V3.2ソフトウェアによって制御し、クロマトグラムは、Chromatographソフトウェア(Waters)で統合した。

モルヒネは、他に記述された方法を使用して(Zhu et al., Brain Res. Mol. Brain Res.(88)：155-60(2001))、組織中で定量化した。カラムに残っている残留モルヒネ混入を防止するために、それぞれの試料間に数回のHPLC精製を行った。さらに、外套組織をネガティブ対照として試験し、混入がないことを証明した。モルヒネは、これらの実験に使用した溶液のいずれにおいても見いだされなかった。さらにまた、5-ヒドロキシトリプトファンを注射した動物またはこのセロトニン前駆体と共にインキュベートした神経節は、これらの内因性神経節モルヒネレベルに何らの変化も示さなかった。

結果
インビトロにおける種々の濃度のL-DOPAまたはレチクリンとの足神経節のインキュベーションにより、時間および濃度依存的な様式で神経節モルヒネレベルが増大した(図5および6)。ビヒクルまたは5-ヒドロキシトリプトファン(1μg/gm組織)(セロトニン前駆体)に曝露した対照神経節では、それぞれ神経節湿重量あたり2.1±0.44および2.1±0.41ngモルヒネを示したが、L-DOPAに曝露したものは、神経節あたり3.6±0.45ngモルヒネを示し、統計学的に有意な増大を表している(P＜0.05)。100ngのレチクリンに対する切除した神経節の曝露では、mg神経節あたり約5.0±0.47ngモルヒネを生じた(図5および6；P＜0.001)。L-DOPA曝露後の神経節モルヒネレベルの増大は、曝露の10分後に始まり、60分のインキュベーション期間を通して段階的に生じた(図6)。これらの結果から、約5%のL-DOPAがモルヒネに変換されたと思われる。モルヒネHPLC測定の間の空試験ならびにネガティブ組織対照、すなわち外套を試験しても、RIAでモルヒネ残留物は見えなかった。また、プロトコルに使用した海水および種々の化学薬品の解析でもモルヒネがなかった。

無処置の健康な動物内へのこれらの同じ前駆体の注射により、モルヒネレベルの増大を生じるかどうか決定するために、以下を行った。レチクリンまたはL-DOPAを動物に注射すると、1時間後に足神経節モルヒネレベルを有意に増大し(図7)、モルヒネ合成が生じたことを示した。5-ヒドロキシトリプトファンの注射は、神経節のモルヒネレベルを増大することができなかった。これらの結果は、動物がさらなるモルヒネを産生することができるように、レチクリンおよびL-DOPAを動物に投与することができることを示す。

本明細書に提供した結果は、L-DOPAが両方のモルヒネ作動性ならびにドーパミン作動性経路に使用することができることも示す。最終産物のモルヒネにより近く、したがって、モルヒネ合成のためにより多くが供されるレチクリンの約25パーセントと比較して、両経路の合成スキームの初期に生じるL-DOPAの約5パーセントが、モルヒネ合成のために使用されると思われる。

加えて、これらの結果は、実施例4の結果と共に、高用量のL-DOPAにより、モルヒネ産生を阻害することができるが、低用量のL-DOPAにより、モルヒネ産生の増大を生じさせることができることを示すと思われる。1つの可能性のあるメカニズムは、高用量のL-DOPAにより、阻害閾値を上回り、これにより、モルヒネ産生の阻害を生じることである。低L-DOPA用量では、この阻害閾値を迂回することができる。

実施例5−ノルラウダノソリンは、モルヒネの産生を増大する
Long Island Soundの地方の水域から収集されたムラサキイガイを他に記述されたとおりに(Stefano et al., Electro-Magnetobiol., 13：123-36 (1994))維持した。生化学的解析のために、20匹の動物群を種々の時間帯にてこれらの足神経節を切除して、1〜100ng/mLの範囲の種々の濃度のノルラウダノソリンと共にインキュベートした。

モルヒネ測定、固相抽出物
本明細書に記述したとおりに、モルヒネ抽出プロトコルをプールした神経節において行った。次いで、固相抽出の前に、乾燥抽出物を0.05%のトリフルオロ酢酸(TFA)水に溶解した。試料は、事前に100%のアセトニトリルで活性化して0.05%のTFA-水で洗浄したWaters Sep-Pak Plus C-18 カートリッジに充填した。モルヒネ溶出は、10%のアセトニトリル溶液で行った(水/アセトニトリル/TFA、89.5%：10%：0.05%(v/v/v)。溶出した試料をCentrivap Consoleで乾燥して、HPLC解析の前に溶解した。

モルヒネは、他に記述された方法を使用して(Zhu et al., Brain Res. Mol. Brain Res.(88)：155-60(2001))、組織中で定量化した。カラムに残っている残留モルヒネ混入を防止するために、それぞれの試料間に数回のHPLC精製を行った。さらに、外套組織をネガティブ対照として試験し、混入がないことを証明した。

結果
インビトロにおける種々の濃度のノルラウダノソリン(テトラヒドロパポベリン(THP)とも呼ばれる)との足神経節のインキュベーションにより、濃度および時間依存的な様式で神経節モルヒネレベルが増大した(図8および9；P＜0.01)。ノルラウダノソリン曝露後の神経節モルヒネレベルの増大は、60分のインキュベーション期間を通して段階的に生じた(図9)。約20パーセントのノルラウダノソリンがモルヒネに変換されたと思われる。モルヒネHPLC測定の間の空試験ならびにネガティブ組織対照、すなわち外套を試験しても、RIAでモルヒネ残留物は見えなかった。また、プロトコルに使用した海水および種々の化学薬品の解析では、モルヒネがないことを証明した。

実施例6−ヒト細胞におけるモルヒネ産生
ヒト末梢血細胞は、Long Island Blood Services (Melville, New York)から得た。ACK溶解緩衝液(8.29g NH₄Cl、0.15M；1g KHCO₃、1.0mM、37.2mg Na₂EDTA、0.1 mM、800mL H₂Oを添加し、1N HClでpHを7.2〜7.4に合わせる)；0.2μmフィルターを通して滅菌濾過し、室温にて貯蔵した)を使用して、白血球を含むバフィーコートから全ての赤血球を除去した。細胞を溶解緩衝液中で室温にて5分間インキュベートして、RPMI培地(ATCC)を使用して溶解反応を止め、続いて200gにて10分間遠心分離した。上清をデカントして、ペレットをRPMI培地で洗浄した。白血球をピペット操作によってRPMI培地に再懸濁した。

多形核細胞(PMN)を他に記述されたとおりに単離して(1.077〜1.080g/mLのFicoll-Hypaque密度)(Magazine et al., J. Immunol., 156：4845 (1996)； Stefano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：9316 (1992)；およびMakman et al., J. Immunol., 154：1323 (1995))、細胞を顕微鏡によって調べた。トリパンブルー排除によって決定すると、95パーセントを超える細胞が生存可能であった。

細胞に対する前駆体曝露後の統計解析のために、二元配置ANOVAを使用した。それぞれの実験は、4回行った。平均値は、4回のその他の繰り返しから得た平均値と組み合わせた。SEMは、平均値の平均の変分を表す。全ての薬物は、ブフラロール以外(これは、BD Biosciences Clontech(Mountain View, CA)から購入した)、Sigma Chemical CO.(St. Louis, MO)から購入した。

次いで、PMNを含む培地を、異なる濃度にて1時間の前駆体の曝露の前後に分離した。細胞を洗浄して、内因性モルヒネ含量を測定した。細胞がない培地も、モルヒネの存在について調べた。

モルヒネ測定
モルヒネ抽出プロトコルは、他に記述したとおり(Zhu et al., Brain Res. Mol. Brain Res., 88：155 (2001)； Zhu et al., Eur. J. Mass Spect., 7：25 (2001)； Zhu et al., Neuroendocrinol. Lett., 23：329 (2002)； Zhu et al., Mol. Brain Res., 117：83 (2003)；およびZhu and Stefano, Neuro. Endocrinol. Lett., 25：323 (2004))、インキュベーション期間後に洗浄してペレットにしたWBCおよびPMNにより行った。固相抽出の前に、乾燥抽出物を0.05%のトリフルオロ酢酸(TFA)水に溶解した。試料は、事前に100%のアセトニトリルで活性化して0.05%のTFA-水で洗浄したWaters Sep-Pak Plus C-18 カートリッジに充填した。モルヒネ溶出は、10%のアセトニトリル溶液で行った(水/アセトニトリル/TFA、89.5%：10%：0.05%(v/v/v)。溶出した試料をCentrivap Consoleで乾燥して、HPLC解析の前に溶解した。

HPLC解析は、Waters 626ポンプ(Waters, Milford, MA)およびC-18 Unijet小口径カラム(BAS)で行った。小口径カラムのために必要とされる低容積流速を提供するために、フロースプリッター(BAS)を使用した。分割比は、1/9であった。0.5mL/分にてポンプを操作することにより、50μL/分の小口径カラム流速を得た。注入体積は、5μLであった。モルヒネ検出は、アンペロメトリック検出器LC-4C(BAS, West Lafayette, Indiana)で行った。小口径カラムは、デッドボリュームを最小限にするために、検知セルに直接連結した。電気化学的検出システムには、グラッシーカーボン-作用電極(3mm)および0.02Hzのフィルター(500mV；レンジ10nA)を使用した。セル容積は、16μmガスケットによって減少させた。クロマトグラフィー・システムは、Waters Millennium³² Chromatography Manager V3.2ソフトウェアによって制御し、クロマトグラムは、Chromatographソフトウェア(Waters)で統合した。

PMNにおけるモルヒネのレベルは、他に記述されたとおりに(Zhu et al., Brain Res. Mol. Brain Res., 88：155 (2001))定量化した。カラムに残っている残留モルヒネ混入を防止するために、それぞれの試料間に数回のHPLC精製を行った。さらに、外套組織をネガティブ対照として試験し、混入がないことを証明した。全ての溶液、培地、その他を、あらゆるモルヒネの存在について調べた。これらの試験の結果は、モルヒネ混入のないことを明らかにした。

CYP2D6分子証明
ボランティア供血者から得たヒトのヘパリン処置した全血(Long Island Blood Services； Melville, NY)を1-Step Polymorphs(Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY)勾配媒質を使用して直ちに分離した。5mLのヘパリン処置した血液を14mLの丸底チューブ内の5mLの多形核球に重層し、次いで、500×gでスインギングバケットローターにおいて18℃にて35分間遠心分離した。遠心分離後、単核細胞(MN)からなる試料/培地界面の上部バンドと、多形核細胞(PMN)からなる下部バンドとを14mLチューブに収集し、次いで400×gにて10分間遠心分離することによってPBS(Invitrogen, Carlsbad, CA)で洗浄した。

総RNAの単離
MNおよびPMN細胞(5×10⁶)を遠心分離によってペレットにして、総RNAをRNeasy Protect Mini Kit(Qiagen, Stanford, CA)で単離した。ペレットにした細胞を緩衝液RLTに再懸濁して、可溶化液をシリンジに装着した20ゲージ針に5回通すことによってホモジナイズした。次いで、試料を製造業者の説明書に従って処理した。最終工程では、10,000rpmにて1分間遠心分離することによって、50μLのRNaseを含まない水でRNAを溶出した。

逆転写共役ポリメラーゼ連鎖反応法(RT-PCR)
第1鎖cDNA合成は、ランダムプライマー(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用して行った。1μgの総RNAを95℃にて変性させ、Superscript III Rnase H-RT(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用して40℃にて1時間逆転写した。10マイクロリットルのRT産物をCYP2D6遺伝子に特異的なプライマーおよびPlatinum Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen, Carlsbad, CA)を含むPCR混合物に添加した。フォワードプライマー配列は、

であり、リバースプライマーは、

であった。PCR反応は、94℃にて5分間変性させ、続いて95℃にて1分間、60℃にて1分間、および72℃にて1分間を40サイクル、次いで72℃にて10分間の伸長工程サイクルとした。PCR産物は、臭化エチジウムで染色した2%アガロースゲル(SIGMA, St. Louis, MO)で解析した。PCR産物の予想されるサイズは、他に記述されたとおり(Zhuge and Yu, World J. Gastroenterol., 10：3356 (2004))、700bp、300bp、およびその他であった。

コンピューターを利用した細胞活性解析
本明細書に記述されたとおりに得られたPMNを、他に記述されたとおり(Schon et al., Adv. Neuroimmunol., 1：252 (1991))、細胞高次構造の画像解析のためにも処理した。PMNの形態学的測定は、画像解析ソフトウェア(Compix, Mars, PA)を使用することにより、細胞面積および周囲長測定に基づいた。形状因子(FF)算出は、他に記述されたとおり行った(Stefano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：9316 (1992)； Stefano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90：11099 (1993)；およびStefano et al., J. Neuroimmunol., 47：189 (1993))。測定決定およびフレーム取り込みのために使用した観察領域は、直径0.4μmであった。コンピューターを利用した画像解析システム(ノマルスキーおよび位相差オプティクスを装着したZeiss Axiophot)は、他に記述されたものと同じであった(Stefano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：9316 (1992)； Stefano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90：11099 (1993)；およびStefano et al., J. Neuroinnnunol., 47：189 (1993))。

細胞を、活性化(アメーバ様かつ可動)または阻害(円形かつ静止)を示唆する形態の変化について解析した(Stefano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：9316 (1992)； Stefano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90：11099 (1993)；およびStefano et al., J. Neuroimmunol., 47：189 (1993))。FF数が低いほど、周辺長がより長く、およびアメーバ様の細胞形状がより多い。活性化された細胞の比率は、他に記述されたとおり決定した(Stefano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：9316 (1992)； Stefano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90：11099 (1993)；およびStefano et al., J. Neuroimmunol., 47：189 (1993))。

全ての薬物は、Biochemicals Incorporated (Natick, MA)またはSigma (St. Louis, MO)から購入した。

結果
対照(ビヒクル曝露した)白血球(WBC)では、モルヒネが、12.33±5.64pg/1,000,000細胞±SEMのレベルにて同定された(図10)。これらの細胞を無血清RPMI培地中で広範に洗浄し、細胞に見いだされ得るあらゆる血漿モルヒネを制限した。しかし、細胞は、血漿から非特異的にモルヒネを蓄積したかもしれない。WBCが内因性合成によってモルヒネを含むかどうかを決定するために、細胞を、アミノ酸チラミンを含む特異的モルヒネ前駆体と共にインキュベートした。チラミン、ノルラウダノソリン(THP)、レチクリン、およびL-DOPAは、未処置細胞において見いだされるものを上回ってWBCモルヒネ濃度を有意に増大した(ANOVA検定、P＜0.001；図11)。前駆体と共にインキュベートした細胞におけるモルヒネ濃度は、THP、レチクリン、およびL-DOPAで1時間処置後に、それぞれ90.25±10.42pg、136.04±8.71pg、および136.5±12.43pg/1,000,000細胞であった。さらにまた、モルヒネ濃度は、濃度依存的様式で前駆体に対する曝露と共に増大した(図11)。これらの結果は、WBCが、低いものの、モルヒネの生理的に有意な量を含むこと、およびモルヒネ前駆体に対するこれらの細胞の曝露により、モルヒネ合成を増大することができることを示す。

モルヒネを合成することができるWBCの特定の集団を同定するために、PMNを調べた。モルヒネは、11.2±4.21pg/100万細胞のレベルで、これらの細胞において見いだされた(図12)。PMNを、WBCにおけるモルヒネ産生を増大させたレベルでチラミンを含むモルヒネ前駆体に対して曝露することにより、統計学的に有意なPMNにおけるモルヒネ濃度の増大を生じた(図12および13)。

CYP2D6がPMNにおけるモルヒネ合成に関与するかどうかを決定するために、PMNをチラミンおよびCYP2D6基質(ブフラロール)と共にインキュベートした。チラミンおよびブフラロールの両方での処置により、モルヒネの合成の有意な減少を生じた(前駆体増強レベルと比較して、P＜0.001；図12)。加えて、CYP2D6阻害剤のキニジンは、PMNをチラミン、THP、またはコデインで処置したときにモルヒネ合成を遮断し、CYP2D6がモルヒネの合成に関与することをさらに示している(図13)。さらに、CYP2D6は、RT-PCR発現解析によって酵素に対応する306bp断片の増幅を生じたことによって証明されるように、PMNに発現されることが見いだされた。この断片の配列解析により、ヒトCYP2D6との100パーセントの相同性が明らかになった。これらの結果は、CYP2D6がヒトPMNに発現されていること、およびこれがモルヒネ合成に関与することを示す。

PMNで見いだされるモルヒネが、モルヒネ前駆体に対する曝露後のPMNインキュベーション培地においても見いだされるかどうかを決定するために、PMNインキュベーション培地を評価した。THP(100μg)、レチクリン(50μg)、L-DOPA(100μg)、またはL-チロシン(100μg)で処置したPMN(3× 10⁶細胞)からの培地中で検出されるモルヒネのレベルは、未処置の細胞からの培地中で検出されるレベルよりも有意に高かった(一元配置ANOVA、P＜0.05)(表3)。

(表３)細胞を除去した後の培地中のモルヒネレベル

PMNに由来したモルヒネの生理的役割の可能性を調べるために、前駆体で処置したPMNを異なる実験プロトコルに曝露されたその他のPMNと共にインキュベートした。このインキュベーションの後、PMNを、コンピューターを利用した画像解析によってこれらの活性レベルについて評価した。未処置のPMNは、1時間後にIL-1β(2ng/mL)で処置した細胞についての43.4±5.7%の活性化のレベルと比較して、7.3±2.1%の活性化のレベル(FF＞0.6)を示した。L-DOPA(10^-6 M；10⁶細胞)と共にインキュベートしたPMNは、3.7±0.4%の活性化のレベルを示した。PMNを別々に洗浄して、集団(L-DOPA処置したものとIL-1β処置したもの)を1：1の比で混合した後には、活性化された細胞のパーセントが混合したPMN集団において12.5±3.7%に減少した(図14)。同じ実験を行うが、IL-1β処置した細胞をナロキソンで同時処置し、次いでこれらをL-DOPAを処置したPMNと混合すると、細胞は、35.2±6.3%の活性化のレベルを示し、ナロキソンがモルヒネの作用を有意に遮断したためにモルヒネが活性化のレベルの減少を媒介したことを示している。

まとめると、これらの結果は、PMNなどの正常なヒト白血球が内因性モルヒネを含有し、モルヒネを合成する能力を有し、かつそれらの環境にモルヒネを放出することができることを示す。加えて、モルヒネ前駆体に曝露したPMNなどの細胞は、これらの環境にモルヒネを放出することができ、これが同じ細胞、ならびに前駆体に曝露されていないその他の細胞の活性状態に影響を及ぼし得る。また、これらの結果は、WBCがCYP2D6(チラミン、ノルラウダノソリン、およびコデインからモルヒネを合成することができる酵素)を発現することを示す。加えて、本明細書に提供した結果は、L-DOPAを経た別の経路によってモルヒネを合成することができることを示し、ドーパミンおよびモルヒネ生合成経路が結合していることを示している(図15)。まとめると、本明細書に提供した結果は、モルヒネを2つの開始点から作製することができること、およびいずれかの経路を別々に阻害すると、他方の経路が阻害を打ち消すことができるので、見かけ上モルヒネ合成を続けることを示す。

実施例7−チロシンおよびチラミンは、インビトロおよびインビボで、モルヒネおよびドーパミンレベルを増大する
Long Island Soundの地方の水域から収集されたムラサキイガイを本明細書に記述したとおりに維持した。ドーパミン(DA)またはモルヒネの生化学的インビトロ解析のために、20匹の動物群を種々の時間帯にて切除して、これらの足神経節を1〜100ng/mLの範囲の種々の濃度のチロシンまたはチラミンと共にインキュベートした。神経節は、煮沸した無細胞人工海水とInstant Ocean(Boston, MA)との50：50混合物中で維持した。足神経節をキニジン、CYP2D6阻害剤、およびチロシン水酸化酵素を阻害するαメチルパラチロシン(AMPT)の存在下において、チロシンまたはチラミンの存在下または非存在下においてインキュベートした。

インビボ処置のために、動物の足(処置あたり20匹の動物)にチロシン(10^-5M)、チラミン(10^-5M)、または塩類溶液を注射した。その他の動物を酵素阻害剤AMPTまたはキニジンに対して単独で、またはそれぞれの足注射直後に曝露した。海水中で室温にて1時間のインキュベーション後、本明細書に記述したHPLCおよびRIA方法によって神経節モルヒネレベルを決定した。全ての化学薬品は、Sigma (St. Louis, MO)から購入した。

DAの抽出およびHPLC UV検出
ドーパミンは、神経節(処置あたり20匹の足神経節；4回繰り返す)および血リンパ(処置あたり10mL；4回繰り返す)の両方から抽出した。神経節の切開後、神経節を1つのエッペンドルフチューブにプールし、1mlの1N HClを添加して、組織をソニック・ディスメンバレーター(sonic dismemberator：Fisher scientific, USA)によって超音波処理した。次いで、ホモジナイズした組織を15mLのポリプロピレン遠心管(Fisher Scientific, PA, USA)へ移した。5mLのクロロホルム/イソプロパノール(9：1、v/v)を添加して、チューブの内容物を室温で5分間勢いよくボルテックスした。チューブを4000rpmにて15分間4℃にて遠心分離した。上清(水溶性層)を事前にシリコン処理した1.5チューブ(Midwest Scientific)へと手早く処理して、HPLC測定のために即座に使用するために4℃にて保持するか、またはさらなる解析のために-80℃に貯蔵した。

HPLCは、waterts626ポンプおよび2487デュアルλ吸光度検出器で行った。ドーパミンを精製するために、5μサイズ粒子をもつXterra RP18カラムを使用した。アイソクラチック移動相には、1つの緩衝液を適用した(1mM CH₃COONH₄、98% 蒸留水および2% HPLC等級のアセトニトリル(Fisher Scientific))。流速は、0.5mL/分に設定した。濃度曲線は、種々の濃度のドーパミンを流すことによって得た。検出限界は、0.5μg/mLであった。

CYP2D6分子証明および総RNAの単離
足神経節(100)を切開後直ちに処理した。神経節を1.5mLのチューブ内に置き、次いでPBS(Invitrogen, Carlsbad, CA)で洗浄した。総RNAをRNeasyミニキット(Qiagen、Valencia, Ca)を使用して単離した。神経節を600μL緩衝液RLT中でホモジナイズした。試料を製造業者の説明書に従って処理した。最終工程では、10,000rpmにて1分間遠心分離することにより、50μLのRNaseを含まない水でRNAを溶出した。

逆転写共役ポリメラーゼ連鎖反応法(RT-PCR)
第1鎖cDNA合成は、ランダムプライマー(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用して行った。1μgの総RNAを95℃にて変性させ、Superscript III Rnase H-RT(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用して40℃にて1時間逆転写した。10マイクロリットルのRT産物をCYP2D6およびCYP2D7遺伝子特異的プライマーおよびPlatinum Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen, Carlsbad, CA)を含むPCR混合物に添加した。フォワードプライマー配列は、

であり、リバースプライマーは、

であった。PCR反応は、95℃にて5分間変性させ、続いて95℃にて30秒、60℃にて30秒、および72℃にて1分間を40サイクル、次いで72℃にて10分間の伸長工程サイクルとした。PCR産物は、臭化エチジウムで染色した2%アガロースゲル(Sigma, St. Louis, MO)で解析した。PCR産物の予想されるサイズは、CYP2D6については282bpおよびCYP2D7については340bpであった。

DNAシーケンシング
PCR産物をゲルから切除した後、Qiaquickゲル抽出キット(Qiagen)でDNA精製を行った。PCR産物を35μL H₂Oに溶解して、直接シーケンシングのためにLark Technologies, Inc.(Houston, TX)に送付した。

結果
イガイ足神経節をチロシンまたはチラミンと共にインビトロでインキュベートしたところ、これらの両方共が、濃度および時間依存的様式で神経節モルヒネレベルの増大を生じた(図16；P＜0.001、チラミンについて1.08±0.27ng/g神経節湿重量〜2.51±0.36ng/g、およびチロシンについて0.96±0.31ng/g〜2.39±0.64ng/g)。チロシンおよびチラミン曝露後の神経節モルヒネレベルの増大は、60分のインキュベーション期間を通して徐々に生じた(図16B)。約7パーセントのチロシンまたはチラミンは、これらのインビトロ条件下でモルヒネに変換されたと思われる。モルヒネHPLC測定の間の空試験ならびにネガティブ組織対照、たとえば外套膜を試験しても、HPLC共役RIAでモルヒネ残留物は見えなかった。また、プロトコルに使用した海水および種々の化学薬品の解析では、モルヒネがないことを証明した。

キニジンおよびチラミンで処置した神経節は、チラミンのみで処置した神経節で観察されたレベルよりも、少ないチラミンで誘導されるモルヒネ産生を示した(図17)。このモルヒネ産生の阻害は、キニジン濃度依存的であった(図17)。同様に、AMPTおよびチロシンで処置した神経節は、チロシンのみで処置した神経節で観察されたレベルよりもチロシンで誘導されるモルヒネ産生が少ないことを示した(図18)。このモルヒネ産生の阻害は、AMPT濃度依存的であった(図18)。いずれかの酵素阻害剤単独に対する曝露では、曝露されていない神経節のレベルを下回るモルヒネレベルに有意に減少しなかった(図17および18)。しかし、両酵素阻害剤に対する足神経節の曝露では、対照のもの(それぞれ、0.99および0.92ng/gの湿重量)を下回って、神経節モルヒネレベルが有意に減少し(0.23±0.16ng/g湿重量±SEM；P＜0.01)、両経路が同時に作用して他方のものの阻害を補っていることを示した。

ドーパミン工程に対するチラミンを調べるために、神経節および血リンパにおけるドーパミン(DA)レベルを、チラミン添加、続くキニジンによるCYP2D6阻害の前後で調べた。チラミン注射により、神経節(4.98± 0.27μg/g 〜9.17±1.21μg/gの湿重量；P＜0.01)および血リンパ(10.13±1.24μg/mL〜16.47±1.28μg/mL、P＜0.05)DAレベルを有意に増大した(図19および20)。神経節および血リンパDAレベルの増大は、キニジン曝露によって遮断され、CYP2D6酵素がこの工程を媒介していたことを示している。また、神経節をTHP、レチクリン、DA、またはコデインに曝露した。それぞれにより、有意にモルヒネレベルの増強を生じ、また、キニジン曝露によって有意に遮断されたという現象は、再びモルヒネ生合成経路の第2の部分におけるCYP2D6の役割を証明した(図15および20)。

神経節におけるCYP2D6の関与についての薬理学的証拠を確認するために、分子解析を行った。簡潔には、RT-PCRを使用して、イガイ組織から282bp断片を増幅した。この断片の配列は、GenBankアクセッション番号M20403に記載されたヒトチトクロームP450、ファミリー2、サブファミリーD、ポリペプチド6 mRNA配列と約94パーセント類似することが見いだされた(図21)。

インビボ実験において、動物の足にチロシン(10^-5M)またはチラミン(10^-5M)を注射した。注射の1時間後に、神経節を解剖して、モルヒネ解析のために抽出した。両前駆体は、対照値と比較して、神経節モルヒネレベルを有意に増強した(対照1.02±0.24ng/gと比較してチロシンについて2.46±0.22ng/gの湿重量およびチラミンについて3.28±0.45ng/g；P＜0.001；図22)。10^-7〜10^-6 M濃度では統計的有意性が達成されなかったが、10^-5Mの濃度では達成された(図22)。加えて、薬物プロトコルあたり20匹の動物に、AMPT(10^-4M)またはキニジン(10^-4M)を、足を介して注射した。これらの動物は、AMPTおよびキニジンを同時投与したときでも、モルヒネレベルになんら変化を示さなかった。これは、基礎モルヒネレベルが、モルヒネ貯蔵によって維持されていたのか、または阻害剤が神経節に到達しなかったことを示す。塩類溶液を注射した対照と比較して、チロシンおよびチラミン動物は、これらの足にそれぞれのアミノ酸を注射した後で、それぞれの酵素阻害剤を無傷の動物の足神経節に局所的に適用したときに、神経節モルヒネレベルの有意な減少を示した(それぞれ、30および25パーセントの減少；P＜0.01；図22)。この点に関して、注射したアミノ酸の1〜2パーセントだけがモルヒネ生合成に向けられることが推定された。

まとめると、これらの結果は、チロシンおよびチラミンが、部分的に、ドーパミンに、次いでモルヒネに変換されること、およびこの過程をCYP2D6またはチロシン水酸化酵素の一方または両方を変化させることによって阻害することができることを示す。この過程は、一方の経路の阻害によっても、他方のものがモルヒネ合成を続けることができるという点で動的であると思われる。さらに、ドーパミンおよびモルヒネ合成は、連関していると思われる(図15)。特に、これらの結果は、モルヒネ合成がチロシンおよび/またはチラミンによって引き起こすことができ、モルヒネ合成が環境を問わず生じる可能性が非常に高くなっていることを示す。示したように、AMPTまたはキニジンはいずれも、単独で投与したときに、対照のものを下回る内因性モルヒネレベルには減少せず、モルヒネの貯蔵プールの存在を示唆している。AMPTおよびキニジンの同時投与は、対照のものを下回って内因性モルヒネレベルを減少させた。これらの結果は、一方の経路が遮断された場合に、他方のドーパミンへの相補経路が機能的なままであるために、全体の経路が継続したことを示す。このドーパミン作動性過程との連関は、生物医学的意味を有し得る。たとえば、DA成分は、怒りを含む興奮状態を調整することができるが、モルヒネ作動性成分は、リラクセーションおよび報酬と関連する鎮静作用を生じ得る。この関連により、興奮感情状態に続く鎮静効果を説明することができる。

実施例8−低用量モルヒネの使用
以下の実験は、低用量のモルヒネが生物学的効果を及ぼす能力を評価するために行った。全てのイガイ動物には、注射によって塩類溶液またはモルヒネ(10^-6〜10^-10M)を処置した。5分のインキュベーション後、血リンパを収集して、LPS(1μg/mL)と共にインキュベートした。10^-7〜10^-10Mのモルヒネで前処置した動物からの細胞では、塩類溶液で処置した動物から得られたLPSで処置した細胞で観察される細胞活性化のレベルの減少を示さなかった(図23)。モルヒネ(10^-6 M)で前処置した動物からの細胞は、19.3±3.8パーセントの活性化を示した。したがって、より低い用量のモルヒネでは、ほぼ同時様式で投与したときに、免疫細胞に対するLPS刺激作用をあまり変化させなかった。

全てのイガイ動物を塩類溶液またはモルヒネ(10^-6〜10^-10M)を注射によって4日間毎日処置した。5分のインキュベーション後、血リンパを収集して、LPS(1μg/mL)と共にインキュベートした。10^-7〜10^-9Mのモルヒネで前処置した動物からの細胞では、塩類溶液で処置した動物から得られるLPSで処置した細胞で観察される細胞活性化のレベルの減少を示した(図24)。モルヒネ(10^-10M)で前処置した動物からの細胞は、細胞活性化のレベルの減少を示さなかった。したがって、より低い用量のモルヒネ(たとえば、10^-7〜10^-9M)では、興奮活性化を制限して、全期間にわたって投与されたときに、おそらく既存の活性化を減少させることができる。

100匹の健康なイガイ動物を注射によって10U/mLのTNF-αで処置した。4日後に、TNFを処置した動物の約20パーセントが死亡した(図25)。低用量(10^-7M)のモルヒネを毎日注射して4日間前処置すると、死亡した動物の数が減少した(図25)。これらの結果は、低用量のモルヒネの繰り返し投与により、TNF-αで誘導される動物内の炎症のレベルを見かけ上減少させることにより、TNF-αで誘導される死亡から保護することができることを示す。

別の実験において、COS-1細胞にヒトμ3オピエート受容体の発現を指揮する核酸をトランスフェクトした。次いで、安定にトランスフェクトされた細胞をモルヒネと共にインキュベートして、細胞から放出される一酸化窒素(NO)の量を電流測定によって測定した。10^-7Mおよび10^-8Mのモルヒネで処置した細胞は、それぞれ、モルヒネ添加の2分以内に9±2nMおよび18±3nMのNOを放出した。これらの結果は、μ3オピエート受容体が、モルヒネに共役したno放出を媒介することを示す。

別の実験において、ヒト伏在静脈をモルヒネで処置して、NO放出について評価した。2×10^-7 Mモルヒネで処置した組織は、7±2nMのNOを放出した。モルヒネを添加する10分前に、10^-6MのCTOP(μ受容体に特異的なオピエート受容体阻害剤)で前処置したときは、NO放出が検出されなかった。これらの結果は、NO放出がオピエート受容体を介して媒介されたことを示す。

イガイ動物を3群に分けた。第1群は、対照群であり、それぞれの動物を塩類溶液の単回投与を受ける前に未処置にした。動物の第2および第3群は、毎日、足を介してそれぞれ1μMおよび0.01μMのモルヒネの注射を受けさせた。注射2時間後、足神経節を動物から得て、μ3オピエート受容体結合密度について評価した。この実験をそれぞれイガイ動物の別個のセットで5回繰り返した。

1μMのモルヒネでの処置により、μ3オピエート受容体結合の減少を生じたが、0.01μMのモルヒネでの処置では減少を生じなかった(図27)。これらの結果は、低用量のモルヒネが、結合部位密度を変化させることなく有効であることを示す。

45匹のイガイ動物を3群に分けた。第1群は、対照群であり、それぞれの動物に塩類溶液のモック注射を受けさせた。動物の第2および第3群は、毎日、足を介してそれぞれ4日間まで1μMおよび0.01μMのモルヒネの注射を受けさせた。注射2時間後、NO放出を測定した。この実験をそれぞれイガイ動物の別個のセットで5回繰り返した。

1μMモルヒネを受けている動物は、1日目にNO放出を示した(図28)。しかし、4日間1μMモルヒネを受けている動物についてのNO放出のレベルは、実質的に、1μMモルヒネでの処置の1日後に観察されたNO放出のレベルよりも低かった。10μMモルヒネに曝露したときに、4日間1μMモルヒネを受けている動物は、1日間1μMモルヒネを受けている動物で観察されるNO放出の約半分の量を示した。これらの結果は、1μMモルヒネの繰り返し投与を受けている動物は、モルヒネに対する耐性を生じることを示す。また、0.01μMモルヒネを受けている動物は、2日、3日、および4日後に観察されたものと同様のレベルにて、1日目にNO放出を示した(図28)。これらの結果は、0.01μMモルヒネの繰り返し投与を受けている動物は、モルヒネに対して検出可能か、または有意な耐性を生じることなくモルヒネ投与に応答し続けることを示す。

別の実験において、ヒトSH-SY5Y細胞を96ウェルプレート(ウェルあたり250,000細胞)で培養した。細胞を10^-8Mまたは10^-6 Mの硫酸モルヒネに継続的に曝露した。種々の時点(最初、ならびに1、2、および7日)にて、細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)中で洗浄した、250μL PBS中に置き、NO放出について評価した。NO放出は、Apollo-4000フリーラジカルアナライザーを使用して30μmのプローブで測定した。プローブは、SNAPで毎日較正した。それぞれのアッセイを、4回同じく行った。平均±標準誤差をそれぞれの時点についてグラフにした。対照細胞は、10^-6 Mのモルヒネに曝露するまで未処置のままであった。

10^-6 Mの高モルヒネ用量で処置した細胞は、これらの初期レベルのNO放出がなくなったが、一方、10^-8Mの低モルヒネ用量で処置した細胞は、モルヒネに応答してNOを放出することができるままであった(図29および30)。6日間10^-6 Mのモルヒネで毎日処置し、７日目に10^-6Mのモルヒネを投与した細胞は、3.4nMのNO放出を示した。これらの結果は、耐性が高用量のみにて生じることを示す。

実施例9−モルヒネ-6β-グルクロニドは、μ3オピエート受容体発現レベルを増大する
ヒト血液細胞(単核細胞および多形核細胞)を10^-7Mのモルヒネ-6β-グルクロニド(M6G)と共に30分間インキュベートして、リアルタイムRT-PCR(Applied Biosystems 5700 SDS)を使用して、μ3オピエート受容体配列の相対的遺伝子発現レベルから評価した。加えて、M6Gを添加する前に、細胞を10^-6 M CTOPの存在下または非存在下のいずれかにおいて10分間インキュベートした。

単核細胞および多形核細胞は両方とも、M6Gで処置したときにμ3オピエート受容体発現の増大を示した(図31)。いずれの場合においても、μ3オピエート受容体発現レベルの増大は、CTOP前処置によって遮断された(図31)。これらの結果は、μ3オピエート受容体発現レベルの増大が、M6Gによって媒介されていることを示す。

実施例10−モルヒネは、一酸化窒素を介して6-アミロイド代謝を調整して、アルツハイマー病におけるモルヒネに対する保護メカニズムを提供する
脳における細胞内および細胞外β-アミロイドペプチド(Aβ)の沈着は、よく見られる神経変性障害であるアルツハイマー病(AD)の病的特色である。以下の実験は、ADの症候を生じさせる際のAβの役割をより理解するために行った。

方法および材料
SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞(ATCC, USA)は、ダルベッコ変法イーグル培地/ハム栄養剤混合物(DMEM-F12)(Invitrogen, USA)中で培養し、HTB-11ヒト神経芽腫細胞(ATCC, USA)は、最小必須培地アルファ培地(MEM-α)(Invitrogen, USA)中で培養した。細胞は、5% CO₂/95% 空気ガスを供給した37℃のインキュベーター(Napco)内に保持した。全ての処置は、無菌フード下で行った。

逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、SH-SY5YおよびHTB-11細胞におけるBACE-1およびBACE-2 mRNA発現に対するAβ_1-42、モルヒネ、およびSNAP処置の効果を解析した。処置時間の後、細胞を収集し、RNeasy RNA Isolationキット(Qiagen)を使用して製造業者の手順に従って総RNAを抽出した。総RNA収率は、分光光度計 RNA/DNA計算機(Pharmacia Biotech)を使用して決定した。次いで、総RNA濃度を半定量的RT-PCRのために標準化し、これは、Geneamp Thermocycler PCR System 9700(P.E. Applied Biosystems)で行った。PCRのために使用したプライマーは、以下のとおりであった：BACE-1について、

、ならびにBACE-2について、

予想される産物長は、両方のプライマーセットについて556bpであった。次いで、PCR産物および100 bp DNAマーカーを臭化エチジウムで染色した2%アガロースゲルに充填した。ゲル電気泳動は、一定アンペア数で110Vに設定した電源(E-C Apparatus Corp.)を使用して1.5時間行った。次いで、Gel Documentation System(UVP)を使用してゲルを撮影し、P4 Windowsマシン上でGel-Pro Analyzer(MediaCybernetics)を使用してバンドを解析した。発現レベルは、以下のプライマーを使用して、参照遺伝子(サイクロフィリン)に対して標準化した：

。

SH-SY5Y細胞におけるNOの産生は、Apollo 4000 Free Radical Analyzer(World Precision Instruments)を使用して検出した。SH-SY5Y細胞をトリプシン処理して、6ウェルプレートにおいて48時間培養した。L字状の電流測定用NO特異的プローブをApollo Analyzerに接続し、予測可能な量のNOを放出するSNAP+ CuCl₂溶液を使用して較正した。細胞を10および25μM Aβで30分および24時間前処置した。処置時点の最後に、培地を除去して、プローブと非反応性である37℃浴にて温めたPBSと置き換えた。プローブを細胞の約1.5mm上に挿入して、5分間平衡化させた。次いで、モルヒネ-6β-グルクロニド(M6G)を1μMの濃度にてそれぞれのプレートに添加した。M6Gは、SH-SY5Y細胞上のGタンパク質結合μ3受容体に付着し、cNOSを活性化するCa⁺²イオンの放出を刺激し、これにより、通常数分以内に神経芽腫細胞から構成的NOを放出する(Cadet et al., Frontiers in Bioscience, 9：3176-86 (2004))。プローブを、NO「スパイク」の産生についてリアルタイムでモニターした。NOデータは、Free Radical Analyzer(World Precision Instruments)を使用して記録した。次いで、細胞を廃棄した。

Aβ_1-42、ニトロ-L-アルギニンメチルエステル(L-NAME)、臭化エチジウム、およびトリプシン-EDTAは、Sigma-Aldrich, USAから購入した。0.1Mジチオスレイトール(DTT)、10×Polymerase Chain Reaction(PCR)緩衝液、Superscript逆転写酵素、TAQポリメラーゼ、50μM MgCl₂、5×First Strand Buffer、カスタムPCRプライマー、およびランダムプライマーは、Invitrogen, USAから購入して、-20℃にて貯蔵した。また、リン酸塩緩衝食塩水は、Invitrogen, USAから購入して、室温にて貯蔵した。ヌクレオチド(dNTP)は、Amershar Pharmacia Biotech, USAから購入して、25μM濃度で-20℃にて貯蔵した。RNeasy RNA Isolation試薬およびカラムは、Qiagen, USAから購入した。Aβ_1-42ペプチドの保存液は、1mMの濃度に調製して、-20℃にて凍結保存した。電気泳動等級アガロースは、Fisher Biotech, USAから購入して、室温で貯蔵した。細胞処置およびNO検出器較正の両方のために使用したS-ニトロソ-N-アセチル-D、L-ペニシラミン(SNAP)は、World Precision Instruments, USAから購入した。

結果
未処置のHTB-11細胞は、BACE-1およびBACE-2 mRNAを構成的に発現する。これらの細胞に対するモルヒネ曝露は、24時間後に、濃度依存的様式でBACE-1の発現をダウンレギュレートする(1μM投薬量では、5μMよりも優れた効果を有し、18%と比較して44%である；図32)。同時に、モルヒネは、HTB-11細胞におけるBACE-2発現の発現をアップレギュレートし、Aβ_1-42の存在下において効果が増強した(図33)。BACE-1は、Aβ_1-42の産生を促進し、BACE-2は、これを阻害するので、BACE酵素のモルヒネ調整がAβ_1-42の産生を減少させるであろうから、モルヒネは神経保護的であり得る。BACE-1およびBACE-2発現に対するモルヒネの効果は、ナロキソンによって遮断され(図34)、モルヒネの神経保護作用は、μ3オピエート受容体に対するその結合に直接関連があることを立証している。

内因性モルヒネの主要な生理作用の1つは、μ3オピエート受容体サブタイプ共役を介したcNOSに由来するNO放出である。Aβ経路に対するモルヒネの神経保護効果がNO依存的であったかどうかを決定するために、HTB-11細胞をcNOS阻害剤のL-NAMEで処置した。L-NAMEは、モルヒネの効果を有意に遮断し(図35)、NO放出がBACE-1および-2のモルヒネの神経保護調節に関与していることを示している。HTB-11細胞をNOドナーのSNAPに曝露し、次いで、BACE発現レベルを解析した。4および24時間の曝露後、SNAPで処置した細胞は、モルヒネで観察されたものと同様に、濃度依存的様式でBACE-1発現の減少を示し、またAβ_1-42の存在下においても増強された(図36および37)。また、SNAPは、モルヒネと同様に、4-および24時間の両方の時点にて、濃度依存的様式でBACE-2発現をアップレギュレートした(図38および39)。Aβ_1-42の存在下において、SNAPは、用量依存的にBACE-2発現を増大した(図38および39)。

RT-PCR手順の半定量的精度を検証するため、およびBACE発現に対するSNAPの効果が4時間よりも早期に生じるかどうかを調査するために、BACE-1およびBACE-2の遺伝子発現を2時間のさらなるmRNA発現実験で解析した(図40)。BACE-1およびBACE-2発現レベルは、SNAPで2時間処置した細胞において変化し、BACE-1発現がダウンレギュレートされて、BACE-2発現がアップレギュレートされた。参照遺伝子β-アクチンの発現は、影響を受けなかった。

SH-SY5Y神経芽腫細胞は、通常モルヒネまたはその代謝産物(M6G)の処理に応答して、cNOSを介してNOを放出する。Aβ_1-42がこの過程を中断させるかどうかどうかを決定するために、SH-SY5Y細胞をAβ_1-42の濃度を変化させて1時間前処置した。M6Gの添加後、Aβ_1-42で処置した細胞は、NO放出の用量依存的減少を示し、Aβ_1-42が構成的NOの放出を用量依存的に阻害することを示す(図41)。また、cNOS阻害剤のL-NAME(10^-4M)での4分間の前処置により、M6Gで誘導されるNO放出が妨げられ、M6Gが、迅速な結合の時間経過でならばcNOSを介してNOの放出を誘導していたことを立証している(図41；パネルG)。Aβ_1-42処置後に放出されるM6Gで誘導されるNOの減少は、Aβ_1-42が(a)直接cNOSの活性化を阻害するか、または(b)μ3オピエート受容体に対するM6Gの結合を妨害するかのいずれかでもあることを示唆しており、これらは両方とも、ADにかかったヒト脳における基礎NOのレベルに潜在的に影響を与えるであろう。さらにまた、SH-SY5Y細胞は、ヒト免疫および欠陥組織と比較して、低レベルにてNOを放出する(10^-6 Mにてモルヒネで処置したときの26〜29nMと比較して3〜4nM)。

これらの結果は、モルヒネが、濃度および時間依存的様式でBACE-2発現をアップレギュレートし、一方、同時にBACE-1発現をダウンレギュレートすることを示す。この現象は、オピエート受容体アンタゴニストのナロキソンで細胞を処置することによって遮断することができる。このモルヒネを媒介した過程は、cNOSに由来するNO放出に連関しており、これは、NOS阻害剤のL-NAMEで組織を処置することによって確認された。NO単独により、この効果を媒介することができ、この観察をさらに実証している。加えて、Aβ_1-42の存在下では、モルヒネおよびNOの両方の効果が増強される。Aβ_1-42単独では、より高濃度にてcNOSに由来するNO放出を阻害する能力を有すると思われる。Aβ_1-42およびモルヒネ/NOの二方向の関係が存在すると思われる。モルヒネ/NOは、Aβの産生に関与する2つのポリペプチドの発現を修飾しており、BACE-1発現をダウンレギュレートして、BACE-2発現をアップレギュレートする。加えて、長期インキュベーション後に、Aβ_1-42は、NOがBACE発現を修飾する能力を増強すると思われる。まとめると、モルヒネは、BACE-2アップレギュレーションを促進し、これがAβ異化反応を増強して、AβがNO産生を阻害する効果を回避するので、モルヒネは、NOに対する結合を介して神経保護的であると思われる。

本明細書に提供した結果は、ADの原因に関して、以下の経路を支持し得る(図42)。内因性モルヒネまたはその他のcNOS活性化因子/スカベンジャーの欠乏を想定すると、時間と共に基礎NOのレベルの減少が生じ得る。NOレベルが減少されると、BACE-1発現の増大およびBACE-2発現の減少を生じ得る。次いで、APPをAβに切断するためにより多くのBACE-1を利用できるようになり、Aβのレベルが増大する。次いで、Aβは、細胞外に分泌されて、アミロイドプラークへと凝集し得るし、可溶性Aβレベルが細胞内で増大する。内在化したAβは、細胞によるNO放出を阻害し、次いで、NOレベルのさらなる減少を生じさせて、BACE遺伝子の制御を緩和し、これが再びAβの産生を増大するという悪循環を生じ得る。同時に、Aβは慢性および次第に増大する炎症反応を促進し、血管および神経の損傷を開始し得る。ADの病態が続くにつれ、脳の低灌流が慢性的に破壊的になってしまう程度にまで、NOレベルが減少し得る。脳細胞では、酸化的ストレスが増大し得るし、ニューロンがアポトーシスを受け得る。結果として、ニューロン機能が全体的に減少して、記憶喪失、認知障害、およびADのその他の典型的症候を生じ得る。

実施例 11−モルヒネ共役NO放出を介したユビキチン-プロテアソーム複合体の調整
以下の実験は、モルヒネおよびNOが、タンパク質代謝を介して細胞ストレスの予防において役割を担っているかどうかを決定するために行った。特に、以下の実験は、モルヒネが、NOの産生の刺激を介して、細胞ストレスの誘導およびタンパク質代謝の不均衡を減らすことによって神経細胞を保護するかどうかを決定するために行った。

方法および材料
ヒトSK-N-SH神経芽細胞腫株化細胞(ATCC #HTB-11)を細胞モデルとして使用した。細胞は、10% ウシ胎児血清(FBS)、2% ペニシリン/ストレプトマイシン、1.5g/L NaHCO₃、および1.0mMピルビン酸を含む最小必須培地アルファ(MEMα)中で増殖させた。温度およびpHの維持のために、37℃の5% CO_２インキュベータ(NAPCO)を使用した。トリプシン-EDTA溶液(0.25% トリプシン、0.03% EDTA)を使用して接着細胞を吸引し、ペレットにした(室温にて5分間400G)。必要なときに、血球計数器を使用して細胞を6または12ウェルプレートにプレートにまいた(6ウェルプレートに2×10⁵細胞/ウェルまたは12ウェルプレートに1×10⁵細胞/ウェル)。実験操作は、細胞がプレートの底面に付着した後、薄層気流フード下にて無菌条件下で行った。

化合物を、原子天秤を使用して正確に量り、無菌条件下にて溶媒で溶出した。ロテノン(Sigma)、ミトコンドリア複合体I阻害剤、およびIFNγ(Endogen)を使用して酸化的および炎症性ストレスを刺激した。硫酸モルヒネ(Sigma)は、ナロキソン(μ3オピエート受容体アンタゴニスト)およびL-NAME(NO合成酵素阻害剤)と共に溶液中に得た。

細胞生存度は、トリパンブルー排除によって決定した。細胞を観察するために、位相差フィルターを備えた倒立光学顕微鏡(Nikon)を使用した。細胞の画像は、顕微鏡接眼鏡に付着したデジタルカメラ(Optronix)によって撮影した。画像をImagePro Plus Software(Applied Biosystems)にアップロードして、ここで、視野をカバーする細胞の数および染料により死んだものとして存在する細胞の両者に基づいて細胞生存度を算出した。加えて、細胞の形態を決定するためにImagePro Plusを使用した。面積および周辺長を見いだし、式(4π^*面積)/(周辺長)²に使用して、0(直線)と1(完全な円)との間の値を生じた。

総RNAの単離は、RNA MiniPrepキット(QIAGEN)によって行った。RNAの濃度は、A260値に希釈比および核酸定数(0.04)を掛けることによって、GeneQuant II Spectrophotometer(Pharmacia Biotech)によって決定した。アガロースゲル電気泳動(1%)を使用して、RNA品質を調べた。

RTおよびPCR反応は、逆転写酵素およびTaq DNA Polymeraseを使用してGeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)で行った。20Sプロテアソームおよび免疫プロテアソームの種々のサブユニット免疫プロテアソームのためのフォワードおよびリバース遺伝子特異的プライマーは、文献から得るか、またはPrimer Express Software 2.0(Applied Biosystems)(表4)によってデザインした。また、NMDA受容体サブユニットプライマーもデザインした(表4)。NMDA受容体発現は、神経変性疾患のマーカーとして使用した。

(表４)遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマー

全てのプライマーをアニーリング温度およびサイクルについて最適化した(表5)。ゲル電気泳動(2% アガロース、0.01% 臭化エチジウム)を行い、UVトランスイルミネータ(UVP)およびGelPro Analyzer Software(Applied Biosystems)を使用して解析した。相対的バンド強度をβ-アクチン参照遺伝子で正規化した。

(表５)プライマー最適化

タンパク質濃度を測定するために、以下の緩衝液を使用してタンパク質を収集した：20mM Hepes(Sigma)、100mM NaCl(Fisher)、10mM NaF(Sigma)、1% トリトンX-100(Sigma)、1mMオルトバナジウム酸ナトリウム(Sigma)、10mM EDTA(Sigma)、pH 7.4、0.1% プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma)、およびddH₂O。ホモジナイズした試料を10,000Gにて20分間4℃にて超遠心機で回転させた。濃度は、標準曲線に対してウシ血清アルブミン(BSA、Sigma)を使用して、Bradfordアッセイ(Bio-Rad)によって測定した。任意のピペット操作の誤りの可能性を排除するために、試料および標準を3回読み込んだ。

ウエスタンブロット法は、以下のとおりに行った。SDS-ポリアクリルアミドゲル(分離のために12%およびスタッキングのために5%)を、Mini Trans-Blot Cell(Bio-Rad)を使用して作製した。タンパク質濃度測定アッセイからの濃度に基づいて、タンパク質を24μLの最終体積に対して2×タンパク質重点緩衝液(0.2M DTT)と共に混合した。トリス-グリシン電気泳動緩衝液(1×)をSDS-PAGEに使用して、タンパク質を一定のアンペア数(35mA)にて分離した。

その後のニトロセルロース膜へのタンパク質の転写には、定電圧(100V)にて40分間作動するMini Trans-Blot Cell装置の使用を含んだ。TBST緩衝液に溶解した5% 脱脂粉乳中において4℃にて一晩ブロッキングを行った。一次および二次抗体を使用した(表6)。一次インキュベーションを1時間続け、続いて、TBST緩衝液で4回、それぞれ10分洗浄液した。二次インキュベーションを1時間続けて、TBST緩衝液で3回、それぞれ15分洗浄した。

(表６)一次抗体および二次抗体

化学発光を刺激する手段として基質(Pierce)を投与した。ブロットを発色させて、その後、Gel-Proソフトウェア(Applied Biosystems)を使用して相対的バンド強度を解析した。

タンパク質分解のレベルの調整を調べる試みにおいて、プロテアソーム機能アッセイを行った。Kotamraju et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100：10653-8 (2003))から適応した手順を使用して、26Sプロテアソームのキモトリプシン活性、ならびに20Sプロテアソーム全体の活性の両方について蛍光定量的アッセイを行った。蛍光発生化合物の4-アミド-7メチルクマリン(AMC)の365nMの励起および460nMの発光は、Spectrofluoroscence Detector(McPherson)を使用して測定した。

一酸化窒素放出は、硫酸モルヒネを神経芽腫細胞に投与して、Apollo 4000フリーラジカル検出器(WPI Sarasota, FL)を使用することによって測定した。電流測定NOプローブは、NOドナーであるS-ニトロソ-N-アセチル-L-ペニシラミン(SNAP)を10μM、20μM、40μM、および80μMの濃度にて使用して、0.2M CuCl₂の溶液に基づいて較正した。モルヒネがプローブと反応しなかったことを確認するために、ネガティブ対照にPBSを使用して行った。

細胞生存度および細胞形態実験からの全てのデータは、平均値の標準誤差(±SEM)で正規化した。RT-PCRデータは、β-アクチン参照遺伝子発現で、その後に、3回の試行の経過を通じて得られた平均からの±SEMで正規化した。ウエスタンブロット法には、バンド強度に基づいたタンパク質の発現の濃度測定解析を含んだ。プロテアソーム活性のための機能的アッセイは、3回の試行に対して±SEMで正規化した。全ての実験について、2変数t検定を使用して処置間の有意水準を比較した。

結果
モルヒネで刺激された、cNOSに由来するNO放出が、神経芽腫細胞において生じた(図43AおよびB；22.3nM±0.85のピーク値、ベースライン2nM NOと比較してp＜0.001、ベースラインは、ネガティブ対照と比較したときに有意ではなかった)。ナロキソン(10^-6 M)およびL-NAME(10^-4M)は、10^-6 Mモルヒネによって誘導されるNO放出を遮断した(それぞれ、3.2nM NOおよび0.3nM NO)。

細胞内レベルにて酸化的ストレスを誘導する薬剤のロテノンは、神経芽腫細胞を処置するために使用したときに細胞死を刺激した(LD₅₀ = 30nM)。細胞生存度実験(図44AおよびB)には、24時間の硫酸モルヒネ(5μM)の前処置およびその後の48時間のロテノン(30nM)とのインキュベーションを含んだ。これにより、約45%の集密度を示したロテノンを処置した細胞と、約78%の集密度まで増大を示したモルヒネ前処置した細胞との間で、有意なレベルの保護を生じた(p＜0.01)。

細胞の形態を、細胞活性化の指標として使用し、形状因子により算出した(FF；FF = 1は、静止している円形細胞であり、0.7未満は、細長い付着細胞を示す；図44C)。FF決定により、モルヒネが24時間のロテノンでの前処置の毒性に対して神経保護効果を生じることを証明した(細胞は、円形であり、不活性であった)(p＜0.003；図44C)。ナロキソン(10μM)、オピエート受容体アンタゴニスト、およびNOの阻害剤であるL-NAME(10μM)での処置によってモルヒネ神経保護の逆転が達成され、NOがモルヒネの保護作用に関与することを示唆している。

以下の実験は、保護過程に関与する分子事象を測定するためにデザインした。相対的バンド強度は、コンピューターを利用したイメージングシステムによって任意単位(AU)で測定した。ロテノンを、これが神経変性疾患についての分子マーカーであるNMDA受容体の発現の不均衡を誘導する能力について調べた。ロテノンで誘導される不均衡は、NMDA受容体(NR1およびNR2Bサブユニット)mRNA発現において観察され、モルヒネは、この指標の不均衡を逆転させた。対照におけるNR1発現(1.57±0.072AU)は、ロテノンで1.22±0.010AU(LD₅₀、30nM)および1.21±0.028AUに減少した(40nM；対照と比較してp＜0.003)(図45A)。モルヒネ(5μM)は、ロテノンのLD₅₀にて、NR1発現を1.40±0.056AUに有意に増大した(p＜0.035)。NR2B発現は、それぞれ30nM(LD₅₀)および40nMのロテノンでの1.22±0.08AUおよび1.49±0.02AUと比較して、対照において0.98±0.02であった(両方について、対照と比較してp＜0.001)(図45B)。モルヒネ(5μM)投与によるNR2B発現の1.09±0.06AUおよび1.17±0.04AUへの有意な減少は、30nMおよび40nMロテノンで観察された。それぞれ、ロテノン値と比較してp＜0.042およびp＜0.018。

20Sプロテアソームの種々のサブユニットの発現の検査には、最初にプロテアソームの非触媒C2およびC3αサブユニットならびに触媒X(β5)サブユニットのmRNA発現についての試験を含んだが、それはこれが効果の照準であり得るためである。αサブユニットの発現レベルに変化は観察されなかった。

神経保護を示すXサブユニット発現の制御は、ロテノンおよびモルヒネで観察された(図46)。モルヒネは、4および24時間の両方にて、用量依存的様式でプロテアソームのXサブユニットの発現レベルを増大した(4時間にてp＜0.014および24時にて0.716±0.015AU対照〜0.868±0.007AU 5μM、p＜0.009)。モルヒネ(5μM)で誘導される神経保護は、Xサブユニット発現の用量依存的減少の際に観察され、これは、ロテノン単独での処置と比較したときに有意であった(4時間にてp＜0.01および24時間にてp＜0.012)。

モルヒネは、LMP7免疫プロテアソームサブユニットのmRNA発現の減少も刺激し、ロテノンによって生じるLMP7 mRNAのわずかな上昇を遮断した(図47)。1μMモルヒネのロテノン対照の値(p＜0.026)から5μMモルヒネにて0.792±0.001AU(p＜0.018)へ、LMP7発現の有意な用量依存的減少があった。

mRNA発現に関する上記のデータは、Xサブユニットタンパク質レベルのウエスタンブロット検出によって補強された。相対的バンド強度は、コンピューターを利用したイメージングシステムによって任意単位で測定した。モルヒネ処置での時間経過(図48A)は、モルヒネ投与(1μMおよび5μM)後24時間にて、用量依存的な有意なXサブユニットの発現レベルの増大を示す(対照と比較して1μMでp＜0.01および5μMのときにp＜0.001)。また、同時にロテノン処置およびモルヒネ曝露後のXサブユニットの発現を調べた(図48B)。以前のmRNA結果(図46から)では、モルヒネ神経保護の徴候を示すタンパク質発現の変化によって確認された。149AUの対照バンド強度は、162AUおよび188AUまで増大した(それぞれ、1μMおよび5μMモルヒネ)。ロテノンは、対照値から182AUまで発現の増大を生じた。182AUから168AU(1μMモルヒネ)まで、およびその後に154AU(p＜0.028)まで、モルヒネで誘導される神経保護の際に減少が示された。

20Sプロテアソームの調整および26Sプロテアソームのキモトリプシン活性を測定する実験により、差次的制御が明らかとなった(図49)。ロテノンは、キモトリプシンの機能的26S活性部位の活性を減少させたが(221±4.8pMの対照値から236±4.8pMに；p＜0.043)、モルヒネ(5μM)は、対照値を277±8.0pM(p＜0.021)に増大した。モルヒネおよびロテノンの同時処置により、キモトリプシン活性の回復を生じた(p＜0.050；図49A)。これらの結果は、26Sキモトリプシン活性の増大を介して、モルヒネが、酸化されたおよび誤って折り畳まれたタンパク質の分解に関与する20S活性を減少することによって(図49B)20S活性の増大の必要をなくすことができたことを示す。

ウエスタンブロット法により、モルヒネが44AUの対照値から64AUおよび125AU(それぞれ、1μMおよび5μM)へと遊離ユビキチンのレベルの用量依存的増大を生じることが明らかになった。遊離ユビキチンの有意ではないが、わずかな減少が、ロテノンで観察され、これがモルヒネおよびロテノンの同時投与により有意に逆転された(p＜0.039；図50)。モルヒネによって刺激されるタンパク質に結合していないユビキチンである遊離ユビキチン発現の増大およびその後のロテノンによって引き起こされる発現の減少に対する反作用は、モルヒネ神経保護の機能的価値におけるさらなる証拠を提供する。

神経炎症の効果を理解するために、インターフェロン(IFN)γを使用して免疫応答、すなわち炎症誘発をシミュレートした。IFNγは、有意な細胞死を生じさせなかった。しかし、IFNγは、神経炎症性ストレスを指し示す細胞の形態の変化を生じさせた。0.54±0.02から0.76±0.02へのFF増大が、対照とIFNγ処置との間で観察された(p＜0.014)。モルヒネおよびIFNγの同時処置により、FFの減少が生じた(FF 0.76±0.02〜0.58±0.01、細胞の伸長が明らか)。ナロキソンおよびL-NAMEの処置により、有意ではないモルヒネ神経保護の逆転が観察された。

LMP7のIFNγ誘導を調べた。IFNγは、24時間後に0.29±0.01の対照値から0.93±0.06へとLMP7発現の増大を生じさせ(p＜0.001)、神経炎症性ストレスを示している。モルヒネは、IFNγによって誘導されるLMP7増大を遮断した(p＜0.034；図51)。

LMP7についてのウエスタンブロット法では、IFNγがその発現を刺激した後に、モルヒネ曝露により36および48時の両方においてこの作用を遮断することが明らかになった(図52；処置#2と処置#3との間の比較についてp＜0.001；処置#5と処置#6との間の比についてp＜0.001)。

これらの結果は、モルヒネが、細胞の酸化的ストレスを開始し、これにより高い割合の細胞死を誘導する化合物であるロテノンの投与後に、神経保護作用を及ぼすことを示している。モルヒネは、IFNγによって活性化された免疫組織に関してと同じ保護メカニズムを及ぼし、また有害作用も及ぼす。加えて、モルヒネは、神経芽細胞におけるcNOS由来のNOの産生を刺激することを示した。まとめると、モルヒネは、構成的NO放出を介してその保護作用を及ぼすようであり、この場合、NOは、抗酸化剤として作用し得る。

ミトコンドリア複合体Iの阻害剤であるロテノンは、ROSの産生を刺激し、細胞死を生じさせる。ロテノン曝露前にモルヒネで処置した細胞は、細胞死の有意な回復を示す。さらに、ロテノンは、NR1とNR2Bサブユニットとの間の分子不均衡を変化させることができ、細胞ストレスまたは酸化損傷が生じたことを示している。モルヒネは、この不均衡を修正した。

ユビキチン-プロテアソーム複合体のmRNAおよびタンパク質発現に関して、モルヒネは、用量依存的様式でXサブユニット発現を増大した。興味深いことに、ロテノンは、またXサブユニット発現の増大を刺激し、これは、モルヒネによって遮断されて、発現を対照のレベルに戻す変化を生じさせる。加えて、実験では、免疫プロテアソーム触媒サブユニットのLMP7の発現について試験に行った。これらの実験により、モルヒネによって遮断されたLMP7 mRNA発現の増大が明らかになり、さらにモルヒネが酸化的ストレスだけでなく、同様に炎症性ストレスに対しても神経保護を誘導したことを示す。

プロテアソーム酵素活性、すなわち実際のタンパク質分解を観察するために、プロテアソーム機能アッセイを行った。ロテノンは、26Sキモトリプシン活性部位の活性の減少と共に、20Sプロテアソームの活性の増大を生じさせた。26Sキモトリプシン活性の減少は、おそらく酸化されたタンパク質の表面疎水性が増大して、19S調節粒子内への取り込みを防げたためであろう。したがって、20S活性は、酸化されたタンパク質を分解するために増大した。この点に関して、モルヒネは、26Sキモトリプシン活性の増大および20S活性の減少を刺激した。この異なる効果は、酸化されたタンパク質のニトロ化を介して達成された可能性がある。NOは、ニトロ化されたタンパク質に特異的であるキモトリプシン活性部位を経た分解のためにタンパク質をマークした可能性がある。より多くのタンパク質が、26Sプロテアソームを介して分解されるほど、酸化されたタンパク質の量が減少されるため、20S活性の減少が生じる。したがって、プロテアソーム機能アッセイから、モルヒネ神経保護は、ROSの阻止のためだけでなく、26Sプロテアソーム上のキモトリプシン活性部位の分解に対するタンパク質の特異的なターゲティングも介し得る。

タンパク質分解のマーカーである遊離ユビキチンを調べると、より多くのユビキチン分子が酸化されたタンパク質をマークするために使用されたために、ロテノンでの処置後に低レベルなことが明らかになった。興味深いことに、モルヒネは、ユビキチンタンパク質発現の用量依存的な増大を生じさせた。これは、モルヒネでの処置により、よりわずかなタンパク質が酸化されたおよび誤って折り畳まれたことを意味し、さらにモルヒネで刺激される神経保護を裏付ける。

LMP7 mRNAおよびタンパク質発現の調査により、モルヒネがこの免疫プロテアソームサブユニットの誘導を阻害することが明らかになった。ウエスタンブロット法により、IFN-γがX発現の減少、ならびにLMP7発現の増大の両方を生じさせることが明らかになった。この効果は、IFN-γ曝露後にモルヒネによって遮断した。

まとめると、これらの結果は、モルヒネがNOを介して単に抗酸化剤として作用することによるだけでなく、26Sプロテアソームを介して、酸化されたおよび誤って折り畳まれたタンパク質を分解のための標的にすることによっても神経保護を生じることを示す。したがって、内在性モルヒネシグナリングは、通常、細胞ストレス過程を克服するように機能し得るので、神経変性障害を処置するための新たな薬理学的方法が明らかになり得る。

その他の態様
本発明は、これらの詳細な説明と組み合わせて記述したが、前述の記述が、例証すること、および添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しないことを企図することが理解される。その他の局面、利点、および改変も特許請求項の範囲内である。

神経節抽出物のHPLCクロマトグラムである。0.5μgのレチクリンと共に1時間インキュベートした神経節の上段のクロマトグラムは、5ng/mgのモルヒネ組織湿重量におけるレベルを示す。中段のクロマトグラムは、対照神経節についてのものである。下段のクロマトグラムは、モルヒネ標準物質(15ng)についてのものである。ムラサキイガイ神経節と共にインキュベートしたレチクリンの量に対してモルヒネレベルをプロットしているグラフである。神経節を1.0、10、50、または100ngのレチクリン(神経節あたり)と共に60分間インキュベートした。モルヒネ濃度は、RIAによって得た。一元配置ANOVA解析は、レチクリンと共にインキュベートした神経節におけるモルヒネレベルが、50および100ngのレチクリンにて対照よりも有意に高いことを示した。1つの神経節は、約1.7mgの重さである。ムラサキイガイ神経節をレチクリン(50ng/神経節)と共にインキュベートした時間に対してモルヒネレベルをプロットしているグラフである。モルヒネ濃度の結果は、RIAによって得た。一元配置ANOVA解析は、レチクリンと共にインキュベートした神経節におけるモルヒネレベルが、60分において対照よりも有意に高いことを示した。レチクリン(10^-7M単独)、モルヒネ(10^-6 M)単独、またはナロキソン(10^-6 M)に加えてレチクリン(10^-7M)で処置した神経節について、時間に対してNO放出をプロットしているグラフである。インビトロにて1.0、10、50、もしくは100ngのL-dopa、またはレチクリンで60分間処置したムラサキイガイ足神経節について検出されたモルヒネレベルをプロットしているグラフである。それぞれの前駆体とのインキュベーション前後にビヒクル処置した神経節モルヒネレベルを測定した(それぞれ、2.1±0.44および2.3±0.31ng/神経節)。一元配置ANOVA解析により、レチクリン(50および100ng)またはL-DOPA(50および100ng)と共にインキュベートした神経節におけるモルヒネレベルが、対照神経節で測定したものよりも有意に高かったことが明らかになった(50ng量についてP＜0.01および100ng量についてP＜0.001)。1つの神経節は、約1.7mgの重さである。全ての測定は、4回繰り返し、平均±SEMを示してある。ムラサキイガイ神経節をレチクリンまたはL-DOPA(1μg/10神経節)と共にインキュベートした時間に対してモルヒネレベルをプロットしているグラフである。一元配置ANOVA解析により、モルヒネ前駆体と共にインキュベートした神経節における神経節モルヒネレベルが、30および60分において対照よりも有意に高かったことが明らかになった(P＜0.01)。全ての測定は、4回繰り返し、平均±SEMを示してある。イガイ足の底面にレチクリンまたはL-DOPA(1μg/動物)の注射を受けた1時間後の動物におけるモルヒネ(ng/神経節)のレベルをプロットしている棒グラフである。モルヒネレベルは、対照レベルと比較して有意に増大された(P＜0.01；一元配置ANOVA解析)。全ての測定は、4回繰り返し、平均±SEMを示してある。インビトロにて1.0、10、50、または100ngのノルラウダノソリンで60分間処置したムラサキイガイ足神経節について検出されたモルヒネレベルをプロットしているグラフである。一元配置ANOVA解析法により、ノルラウダノソリンと共にインキュベートした神経節におけるモルヒネレベルは、50および100ngのノルラウダノソリンにて対照よりも有意に高いことが明らかになった。全ての測定は4回繰り返して、平均±SEMをグラフにした。ムラサキイガイ神経節をノルラウダノソリン(100ng/神経節)と共にインキュベートした時間に対してモルヒネレベルをプロットしているグラフである。一元配置ANOVA解析により、ノルラウダノソリンと共にインキュベートした神経節におけるモルヒネレベルは、30および60分にて対照よりも有意に高いことが明らかになった。全ての測定は4回繰り返して、平均±SEMをグラフにした(P＜0.01)。 HPLC画分から抽出した真正のモルヒネのQ-TOF解析である(挿入図)。WBCモルヒネは、真正の材料と同じMSを示した。図11Aは、バフィーコートから得て、示した量のチラミンと共に1時間インキュベートしたヒトWBCから産生されるモルヒネの量をプロットしているグラフである(P＜0.001、10^-7〜10^-6 Mの濃度での一元配置ANOVA)。図11Bは、バフィーコートから得て、示した量のノルラウダノソリン(THP)、レチクリン、またはL-DOPAと共に1時間インキュベートしたヒトWBCから産生されるモルヒネの量をプロットしている棒グラフを含む(P＜0.001、10^-7〜10^-6 Mの濃度での一元配置ANOVA)。それぞれの実験は、3回繰り返し、平均±SEMを示してある。バフィーコートから得て、チラミン(T；10^-6 M)および示した量のブフラロールと共にインキュベートしたヒトPMNから産生されるモルヒネの量をプロットしているグラフである。チラミンで誘導されるモルヒネレベルは、ブフラロールの濃度の増大に伴って有意に減少した(P＜0.001、一元配置ANOVA)。それぞれの実験は、3回繰り返し、平均±SEMを示してある。バフィーコートから得て、キニジン(10^-6 M)またはパロキセチン(10^-6 M)のいずれかと共にチラミン(T；10^-6 M)、ノルラウダノソリン(THP；10^-7M)、またはコデインと共にインキュベートしたヒトPMNから産生されるモルヒネの量をプロットしているグラフである。チラミンおよびTHPで誘導されるモルヒネレベルは、キニジン処置によって減少した(P＜0.001、それぞれ、チラミンおよびTHPで刺激したモルヒネレベルと比較した一元配置ANOVA)。それぞれの実験は、5回繰り返し、平均±SEMを示してある。以下のとおりに処置した細胞について、PMN活性化のレベルをプロットしているグラフである：1、処置なしの60分後のPMN活性レベル；2、IL-1βと共にインキュベートしたPMN；3、L-DOPA(10^-6 M)と共にインキュベートしたPMN；4、1時間50% L-DOPAに曝露した細胞および50% IL-1βに曝露した細胞との混合培養；5、1時間50% L-DOPAに曝露した細胞および50% IL-1βに曝露した細胞との混合培養(混合培養に添加する5分前に、IL-1βに曝露した細胞をナロキソン(10^-6 M)に曝露した)。2つの群からの処置を伴わずに混合した細胞は、これらのそれぞれの対照のものを上回って6%の増大のみを示した。それぞれの実験は、4回繰り返し、平均±SEMを示してある。モルヒネおよびカテコールアミンを産生するための生合成経路の図である。図16Aは、示した量のチロシンまたはチラミンで60分間処置したムラサキイガイ神経節におけるモルヒネレベルをプロットしているグラフである。10^-7および10^-6 Mの濃度では、未処置の神経節と比較して、平均値が統計学的に有意であった(P＜0.001)。図16Bは、ムラサキイガイ神経節をチロシンまたはチラミン(10^-6 M)と共にインキュベートした時間に対してモルヒネレベルをプロットしているグラフである。45分および60分のインキュベーションでは、未処置の神経節と比較して、平均値が統計学的に有意であった(P＜0.001)。全ての測定は、3回繰り返して、平均±SEMをグラフで示した。チラミン(T；10^-6 M)および示した量のキニジンと共にインキュベートしたムラサキイガイ神経節から産生されるモルヒネの量をプロットしているグラフである。チラミンで誘導されるモルヒネレベルは、キニジンの濃度の増大に伴って有意に減少した(P＜0.001、一元配置ANOVA)。それぞれの実験は、5回繰り返し、平均±SEMを示してある。チロシン(T；10^-6 M)および示した量のα-メチル-para-チロシン(AMPT)と共にインキュベートしたムラサキイガイ神経節から産生されるモルヒネの量をプロットしているグラフである。チロシンで誘導されるモルヒネレベルは、AMPTの濃度の増大に伴って有意に減少した(P＜0.001、一元配置ANOVA)。それぞれの実験は、4回繰り返し、平均±SEMを示してある。神経節および血リンパドーパミン(DA)レベルは、チラミンおよびキニジン(10^-6 M)曝露によって調整することができることを示す代表的なHPLCクロマトグラムを含む。神経節(パネルA)：チラミン注射(100μg/動物、足の下)では、9.17±1.21μgのDA/gを生じた。神経節(パネルB)：チラミンおよびキニジン注射(100μg/動物)では、2.57±0.32μgのDA/gを生じた。神経節(パネルC)：PBS注射では、4.78±0.27μgのDA/gを生じた。血リンパ(パネルA)：PBSインキュベーションでは、10.13±0.34μgのDA/mLを生じた。血リンパ(パネルB)：足神経節に対するチラミン(100μg/mL)およびキニジン(10μg/mL)曝露では、10.24μgのDA/mLを生じた。血リンパ(パネルC)：チラミン(100μg/mL)インキュベーションでは、16.47±2.28μgのDA/mLを生じた。図20Aは、未処置の動物、またはチラミン(10^-6 M)もしくはチラミン(10^-6 M)に加えてキニジン(10^-6 M)で処置した動物からの神経節または血リンパにおいて検出されたDAのレベルをプロットしているグラフである。キニジンは、チラミン(P＜0.001)単独に対する足神経節の曝露によって生じる内因性神経節および血リンパDAレベルの増大を遮断した。図20Bは、未処置の動物、またはコデイン(10^-6 M)もしくはコデインに加えてキニジン(10^-6 M)で処置した動物からの神経節において検出されたモルヒネのレベルをプロットしているグラフである。キニジンは、コデイン曝露によって刺激される内因性神経節モルヒネレベルの増大を遮断した(t検定、P＜0.001)。図20Cは、未処置の動物、または単独もしくはキニジン(10^-6 M)と組み合わせて、ノルラウダノソリン(THP；10^-6 M)、レチクリン(10^-6 M)、もしくはDA(10^-6 M)で処置した動物からの神経節において検出されたモルヒネのレベルをプロットしているグラフである。キニジンは、ノルラウダノソリン、レチクリン、またはDA曝露によって刺激される内因性神経節のモルヒネレベルの増大を遮断した(t検定、P＜0.001)。 GenBankアクセッション番号M20403に記載された配列のうちのヌクレオチド843位〜1107位(上段鎖；SEQ ID NO：2)と共に整列させた、神経節組織から増幅される核酸の部分配列の配列整列である(下段鎖；SEQ ID NO：1)。太字は、ミスマッチ、n、およびギャップを表す。チロシン(T；10^-5 M)もしくはチラミン(Ty；10^-5 M)を未処置の健康な動物の足、またはその足神経節を注射後15分間AMPT(10^-4M)もしくはキニジン(10^-4 M)に曝露した健康な動物の足に注射した後のムラサキイガイ足神経節におけるモルヒネの量をプロットしているグラフである。示した量のモルヒネの存在下または非存在下において1回前処置した動物からのLPSで活性化された細胞のパーセントをプロットしているグラフである。示した量のモルヒネの存在下または非存在下において、4日間毎日前処置した動物からのLPSで活性化された細胞のパーセントをプロットしているグラフである。モルヒネ(10^-7M)の存在下または非存在下において、4日間毎日前処置し、TNF-αで処置した動物の死亡率をプロットしているグラフである。 LPS刺激の前に示した時間50nM(実線)、または50μM(破線)のモルヒネと共にプレインキュベートした血液試料のチャネル蛍光の中央値をプロットしているグラフである。統計分析により、LPS刺激単独(0分モルヒネ)と比較したときに、任意の時間間隔でのNF-κB核結合に対するモルヒネの有意な効果が明らかになった。塩水(対照)、1μMモルヒネ、または0.01μMモルヒネで処置した動物について、示した日数における膜タンパク質のグラムあたりのμ3オピエート受容体活性(膜組織のBmax pg/g)をプロットしているグラフである。塩水(対照)、10^-6 Mモルヒネ、または10^-8Mモルヒネで処置した動物について、示した日数における足神経節からの一酸化窒素放出をプロットしているグラフである。 10^-6 Mモルヒネ(灰色棒)、10^-6 Mモルヒネ(黒棒)、または10^-8 Mモルヒネ(白棒)で処置したSH-SY5Y細胞からの一酸化窒素放出をプロットしているグラフである。一酸化窒素放出を測定する前に10^-6 Mモルヒネ(灰色棒)に曝露した未処置のSH-SY5Y細胞から、または10^-6 Mモルヒネ(黒棒)もしくは10^-8Mのモルヒネ(白棒)で処置したSH-SY5Y細胞からの一酸化窒素放出をプロットしているグラフを含む。上段、中段、および下段パネルの結果は、それぞれ1、2、または7日間示したとおりに処置した細胞についてのものであった。 10^-7 Mモルヒネ-6-グルクロニド単独または10^-7Mモルヒネ-6-グルクロニドおよび10^-6 M CTOPで処置した、単核細胞(MN)ならびに多形核細胞(PMN)における相対的μ3オピエート受容体遺伝子発現をプロットしているグラフである。 HTB-11神経芽腫細胞におけるBACE-1遺伝子発現についてのバンド強度をプロットしているグラフである。レーン1：未処置の細胞；レーン2：1μMモルヒネで24時間処置；レーン3：5μMモルヒネで24時間処置。以下のとおりに24時間処置したHTB-11神経芽腫細胞におけるBACE-2遺伝子発現についてのバンド強度をプロットしているグラフである。レーン1：未処置；レーン2：1μMモルヒネ；レーン3および4：10μMおよび25μM Aβ_1-42；レーン5および6：10μMおよび25μM Aβ_1-42と共に1μMモルヒネ。図34(上段)は、以下のとおりに24時間処置したHTB-11神経芽腫細胞におけるBACE-1およびBACE-2遺伝子発現についてのバンド強度をプロットしているグラフである。レーン1および4：未処置；レーン2および5：1μMモルヒネ；レーン3および6：10μMナロキソンで20分間前処置した1μMモルヒネ。レーン1〜3は、BACE-1に対して特異的なプライマーで増幅された産物を含み、一方、レーン4〜6は、BACE-2に対して特異的なプライマーで増幅された産物を含む。図34(下段)は、サイクロフィリン発現に対して標準化したBACE発現レベルをプロットしているグラフである。図35(上段)は、以下のとおりに24時間処置したHTB-11神経芽腫細胞におけるBACE-1およびBACE-2遺伝子発現についてのバンド強度をプロットしているグラフである。レーン1および4：未処置；レーン2および5：1μMモルヒネ；レーン3および6：10μM L-NAMEで20分間前処置した1μMモルヒネ。レーン1〜3は、BACE-1に対して特異的なプライマーで増幅された産物を含み、一方、レーン4〜6は、BACE-2に対して特異的なプライマーで増幅された産物を含む。図35(下段)は、サイクロフィリン発現に対して標準化したBACE発現レベルをプロットしているグラフである以下のとおりに4時間処置したHTB-11神経芽腫細胞におけるBACE-1遺伝子発現についてのバンド強度をプロットしているグラフである。レーン1：未処置；レーン2、3、および4：1μM、5μM、および10μM SNAP；レーン5：1μM SNAPと共に25μM Aβ_1-42；レーン6：10μM SNAPと共に25μM Aβ_1-42。以下のとおりに24時間処置したHTB-11神経芽腫細胞におけるBACE-1遺伝子発現についてのバンド強度をプロットしているグラフである。レーン1：未処置；レーン2、3、および4：1μM、5μM、および10μM SNAP；レーン5：1μM SNAPと共に25μM Aβ_1-42；レーン6：10μM SNAPと共に25μM Aβ_1-42。以下のとおりに4時間処置したHTB-11神経芽腫細胞におけるBACE-2遺伝子発現についてのバンド強度をプロットしているグラフである。レーン1：未処置；レーン2、3、および4：1μM、5μM、および10μM SNAP；レーン5：1μM SNAPと共に25μM Aβ_1-42；レーン6：10μM SNAPと共に25μM Aβ_1-42。以下のとおりに24時間処置したHTB-11神経芽腫細胞におけるBACE-2遺伝子発現についてのバンド強度をプロットしているグラフである。レーン1：未処置；レーン2、3、および4：1μM、5μM、および10μM SNAP；レーン5：1μM SNAPと共に25μM Aβ_1-42；レーン6：10μM SNAPと共に25μM Aβ_1-42。以下のとおりに2時間処置したHTB-11神経芽腫細胞におけるBACE-1およびBACE-2遺伝子発現についてのバンド強度をプロットしているグラフである。レーン1および4：未処置；レーン2および5：1μM SNAP；レーン3および6：5μM SNAP。レーン1〜3は、BACE-1に対して特異的なプライマーで増幅された産物を含み、一方、レーン4〜6は、BACE-2に対して特異的なプライマーで増幅された産物を含む。図40(下段)は、β-アクチン発現に対して標準化したBACE発現レベルをプロットしているグラフである。以下の量のAβ_1-42で1時間前処置し、次いでt = 0にて1μM M6Gを使用して刺激したSH-SY5Y神経芽腫細胞からのリアルタイムNO放出をプロットしているグラフを含む。パネルA：対照、0 Aβ_1-42；パネルB：1μ Aβ_1-42；パネルC：5μM Aβ_1-42；パネルD：10μM Aβ_1-42；パネルE：15μM Aβ_1-42；パネルF：25mM Aβ_1-42；パネルG：M6Gの4分前にL-NAMEを添加した対照。アルツハイマー病において可能性のあるNOの役割の図である。図43Aは、時間に対して硫酸モルヒネ(5μM)で処置したヒト神経芽腫細胞からのNO放出をプロットしているグラフである。図43Bは、硫酸モルヒネ(5μM)またはPBSで処置したヒト神経芽腫細胞について、ピークNO放出をプロットしている棒グラフである。対照は、モルヒネを添加する前の細胞からのNO放出のピーク値(すなわち、基礎NO放出)である。ピーク値は、22.3nM ± 0.85である(対照と比較したときにp＜0.001) 図44Aは、示した処置および0、15、30、40、50、または70μMのいずれかのロテノンを48時間受けている細胞についてのパーセント細胞生存度をプロットしているグラフである。図44Bは、示したとおりに処置した細胞についての細胞生存度をプロットしている棒グラフである。図44Cは、示したとおりに処置した細胞についての平均形状因子測定をプロットしているグラフである。図44の写真1〜6は、図44Cに示した処置に対応する細胞の画像である。図45Aは、NR1発現レベルをプロットしているグラフであり、一方、図45Bは、以下の処置に対するNR2B発現レベルをプロットしているグラフである：処置#1：対照；処置#2：モルヒネ(5μM)；処置#3：ロテノン(30nM、LD₅₀)；処置#4：ロテノン(40nM)；処置#5：モルヒネ+ロテノン(30nM)；および処置#6：モルヒネ+ロテノン(40nM)。ロテノン処置により、NR1発現の用量依存的減少を生じた(p＜0.003、3および4の両方を1と比較した)。モルヒネは、LD₅₀にてNR1発現を増大した(p＜0.035、5を3と比較した)。ロテノンにより、NR2B発現の用量依存的な増大を生じた(p＜0.001、3を1と比較した)。モルヒネは、NR2B発現を減少させ、用量依存的様式でロテノンの効果に対抗した(それぞれ、p＜0.042、5を3と比較し、p＜0.018、6を4と比較した)。示したとおりに4または24時間処置した細胞におけるプロテアソームの触媒Xサブユニット発現レベルをプロットしているグラフである。モルヒネは、用量依存的様式でXサブユニットの発現レベルを増大した。ロテノンの存在下における5μMモルヒネ処置は、Xサブユニットの発現を有意に減少させ、ロテノン単独と比較したときに有意であった(4時間にてp＜0.014および24時間にてp＜0.009)。また、ロテノンは、Xサブユニット発現のレベルを増大した(4時間にてp＜0.006)および(24時間にてp＜0.033)。神経保護が観察され、プロテアソームの触媒Xサブユニット発現のレベルの用量依存的減少は、ロテノン単独での処置と比較したときに、5μMのモルヒネにて有意であった(4時間にてp＜0.01および24時間にてp＜0.012)。5μMのモルヒネに加えて30nMロテノンで得られた値は、統計学的に対照値と異ならなかった。示したとおりに24時間処置した細胞におけるLMP7免疫プロテアソームサブユニットのmRNA発現をプロットしているグラフである。ロテノンは、発現の有意な増大を生じさせなかったが(p＜0.068)、モルヒネ投与では、ロテノン値をモルヒネ+ロテノン値と比較したときに、有意なLMP7発現の用量依存的減少があった：1μMモルヒネでp＜0.026および5μMモルヒネでp＜0.018。示したとおりに処置した細胞における20SプロテアソームXサブユニットポリペプチドの発現レベルをプロットしているウエスタンブロットの写真およびグラフを含む。モルヒネは、処置の24時間後に有意な用量依存的Xサブユニットの発現の増大を誘導した、p＜0.01(対照と比較した1μMモルヒネ)およびp＜0.001(対照と比較した5μMモルヒネ)。ロテノン対照(と比較したときに、5μMモルヒネで有意な神経保護が観察されたp<0.028)。さらに、この処置、5μMモルヒネ+30nMロテノンは、統計学的に対照と異ならなかった(p＜0.065)。図49Aは、26sキモトリプシン活性をプロットしているグラフであり、一方、図49Bは、20Sプロテアソーム活性をプロットしているグラフである。細胞をモルヒネ(5μM)、ロテノン(30nM)、ナロキソン(10μM)、およびL-NAME(10μM)の存在下または非存在下において処置した。キモトリプシン26S活性の有意な減少がロテノンによって生じた(p＜0.043)。キモトリプシン活性の有意な増大がモルヒネによって生じた(5μM)(p＜0.021)。モルヒネおよびロテノンの同時処置により、対照に対して統計学的に有意ではない点までキモトリプシン活性の回復を生じた。ロテノンに対する曝露により、20Sプロテアソームの活性の有意な増大が観察された(p＜0.046)。モルヒネで誘導される20Sプロテアソーム機能の減少と連関して(p＜0.050)、20S活性の有意な減少があった(p＜0.034)。ウエスタンブロット解析を使用して、示したとおりに処置した細胞における遊離ユビキチンのレベルをプロットしているグラフである。モルヒネ処置では、遊離ユビキチンのレベルの有意な用量依存的増大が観察された(5μMモルヒネでp＜0.001)。ロテノン処置ではユビキチンのレベルの減少が観察され(p＜0.064)、これは、モルヒネの投与で逆転した(p＜0.039、ロテノン処置と比較した場合)。示したとおりに処置した細胞におけるLMP7 mRNA発現のレベルをプロットしているグラフである。IFNγ(20ng/mL)は、LMP7免疫プロテアソームサブユニットの発現の増大を生じさせた(p＜0.001)。IFNγとの同時モルヒネ投与により、有意な神経保護(p＜0.034)を生じた。示したとおりに処置した細胞におけるLMP7ポリペプチド発現のレベルをプロットしているグラフである。IFNγは、LMP7ポリペプチド発現の増大を生じさせた(p＜0.001)。モルヒネは、IFNγとの同時処置時に、この効果に対抗することができた(p＜0.001、36時間および48時間の両方にてIFNγと比較した)。

Claims

ある量で、週に1回よりも頻繁な頻度で、かつ1ヶ月よりも長期間の間、組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において細胞からの一酸化窒素放出を誘導するための方法であって、該組成物は、モルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドを含み、および該組成物の該量により、1日あたり該哺乳動物の体重の1kgあたり、0.05mg未満の該モルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドが該哺乳動物に投与されることとなる、方法。
細胞が免疫細胞である、請求項1記載の方法。
哺乳動物がヒトである、請求項1記載の方法。
組成物がモルヒネ前駆体を含む、請求項1記載の方法。
組成物が錠剤の形態である、請求項1記載の方法。
組成物がセレンを含む、請求項1記載の方法。
組成物がL-アルギニンを含む、請求項1記載の方法。
組成物がカルシウム供与源を含む、請求項1記載の方法。
組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.025mg未満のモルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドが該哺乳動物に投与されることとなる、請求項1記載の方法。
組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.01mg未満のモルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドが該哺乳動物に投与されることとなる、請求項1記載の方法。
頻度が週4回よりも頻繁である、請求項1記載の方法。
頻度が日に2〜5回の間である、請求項1記載の方法。
頻度が日に1回である、請求項1記載の方法。
期間が2ヶ月よりも長い、請求項1記載の方法。
期間が3ヶ月よりも長い、請求項1記載の方法。
組成物がモルヒネを含む、請求項1記載の方法。
組成物がモルヒネ-6β-グルクロニドを含む、請求項1記載の方法。
組成物がモルヒネおよびモルヒネ-6β-グルクロニドを含む、請求項1記載の方法。
ある量で、週に1回よりも頻繁な頻度で、かつ1ヶ月よりも長期間の間、組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において細胞からの一酸化窒素放出を誘導するための方法であって、該組成物は、テバインまたはコデインを含み、および該組成物の該量により、1日あたり該哺乳動物の体重の1kgあたり、0.05mg未満の該テバインまたはコデインが該哺乳動物に投与されることとなる、方法。
細胞が免疫細胞である、請求項19記載の方法。
哺乳動物がヒトである、請求項19記載の方法。
組成物が、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.05mg未満のモルヒネが該哺乳動物に投与されることとなる量でモルヒネを含む、請求項19記載の方法。
組成物が錠剤の形態である、請求項19記載の方法。
組成物がセレンを含む、請求項19記載の方法。
組成物がL-アルギニンを含む、請求項19記載の方法。
組成物がカルシウム供与源を含む、請求項19記載の方法。
組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.01mg未満のテバインまたはコデインが該哺乳動物に投与されることとなる、請求項19記載の方法。
組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.005mg未満のテバインまたはコデインが該哺乳動物に投与されることとなる、請求項19記載の方法。
頻度が週4回よりも頻繁である、請求項19記載の方法。
頻度が日に2〜5回の間である、請求項19記載の方法。
頻度が日に1回である、請求項19記載の方法。
期間が2ヶ月よりも長い、請求項19記載の方法。
期間が3ヶ月よりも長い、請求項19記載の方法。
組成物がテバインを含む、請求項19記載の方法。
組成物がコデインを含む、請求項19記載の方法。
組成物がテバインおよびコデインを含む、請求項19記載の方法。
ある量で、週に1回よりも頻繁な頻度で、かつ1ヶ月よりも長期間の間、組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において細胞からの一酸化窒素放出を誘導するための方法であって、該組成物は、レチクリン、ノルラウダノソリン、およびサルタリジンからなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含み、該組成物の該量により、1日あたり該哺乳動物の体重の1kgあたり、1mg未満の該1つまたは複数の薬剤が該哺乳動物に投与されることとなる、方法。
細胞が免疫細胞である、請求項37記載の方法。
哺乳動物がヒトである、請求項37記載の方法。
組成物が、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.05mg未満のモルヒネが該哺乳動物に投与される量でモルヒネを含む、請求項37記載の方法。
組成物が錠剤の形態である、請求項37記載の方法。
組成物がセレンを含む、請求項37記載の方法。
組成物がL-アルギニンを含む、請求項37記載の方法。
組成物がカルシウム供与源を含む、請求項37記載の方法。
組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.5mg未満の1つまたは複数の薬剤が該哺乳動物に投与されることとなる、請求項37記載の方法。
組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.05mg未満の1つまたは複数の薬剤が該哺乳動物に投与されることとなる、請求項37記載の方法。
頻度が週4回よりも頻繁である、請求項37記載の方法。
頻度が日に2〜5回の間である、請求項37記載の方法。
頻度が日に1回である、請求項37記載の方法。
期間が2ヶ月よりも長い、請求項37記載の方法。
期間が3ヶ月よりも長い、請求項37記載の方法。
組成物がレチクリン、ノルラウダノソリン、およびサルタリジンを含む、請求項37記載の方法。
ある量で、週に1回よりも頻繁な頻度で、かつ1ヶ月よりも長期間の間、組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において細胞からの一酸化窒素放出を誘導するための方法であって、該組成物は、ドーパミンまたはL-DOPAを含み、および該組成物の該量により、1日あたり該哺乳動物の体重の1kgあたり、1μg未満の該ドーパミンまたはL-DOPAが該哺乳動物に投与されることとなる、方法。
細胞が免疫細胞である、請求項53記載の方法。
哺乳動物がヒトである、請求項53記載の方法。
組成物が、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.05mg未満のモルヒネが該哺乳動物に投与されることとなる量でモルヒネを含む、請求項53記載の方法。
組成物が錠剤の形態である、請求項53記載の方法。
組成物がセレンを含む、請求項53記載の方法。
組成物がL-アルギニンを含む、請求項53記載の方法。
組成物がカルシウム供与源を含む、請求項53記載の方法。
組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.5mg未満の1つまたは複数の薬剤が該哺乳動物に投与されることとなる、請求項53記載の方法。
組成物の量により、1日あたり哺乳動物の体重の1kgあたり、0.05mg未満の1つまたは複数の薬剤が該哺乳動物に投与されることとなる、請求項53記載の方法。
頻度が週4回よりも頻繁である、請求項53記載の方法。
頻度が日に2〜5回の間である、請求項53記載の方法。
頻度が日に1回である、請求項53記載の方法。
期間が2ヶ月よりも長い、請求項53記載の方法。
期間が3ヶ月よりも長い、請求項53記載の方法。
組成物がレチクリン、ノルラウダノソリン、およびサルタリジンを含む、請求項53記載の方法。
モルヒネおよびセレンを含む組成物。
35μg〜700μgの間のモルヒネを含む、請求項70記載の組成物。
55μg〜300μgの間のセレンを含む、請求項70記載の組成物。
アルギニンを含む、請求項70記載の組成物。
1mg〜500mgの間のアルギニンを含む、請求項70記載の組成物。
カルシウム供与源を含む、請求項70記載の組成物。
1g〜1.3gの間のカルシウム供与源を含む、請求項75記載の組成物。
カルシウム供与源がクエン酸カルシウムである、請求項75記載の組成物。
チロシン、チラミン、フェニルアラニン、3,4ジヒドロキシフェニルピルベート、ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、ドーパミン、L-DOPA、レチクリン、ノルラウダノソリン、サルタリジン、テバイン、およびコデインからなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含む、請求項70記載の組成物。
CYP2D6およびCYP2D7阻害剤からなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含む、請求項70記載の組成物。
モルヒネおよびアルギニンを含む組成物。
35μg〜700μgの間のモルヒネを含む、請求項80記載の組成物。
1mg〜500mgの間のアルギニンを含む、請求項80記載の組成物。
カルシウム供与源を含む、請求項80記載の組成物。
1g〜1.3gの間のカルシウム供与源を含む、請求項83記載の組成物。
カルシウム供与源がクエン酸カルシウムである、請求項83記載の組成物。
チロシン、チラミン、フェニルアラニン、3,4ジヒドロキシフェニルピルベート、ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、ドーパミン、L-DOPA、レチクリン、ノルラウダノソリン、サルタリジン、テバイン、およびコデインからなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含む、請求項80記載の組成物。
CYP2D6およびCYP2D7阻害剤からなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含む、請求項41記載の組成物。
L-DOPAおよびドーパミンを含む、細胞において産生されるモルヒネのレベルを減少させるための組成物。
25mg〜500mgの間のL-DOPAを含む、請求項88記載の組成物。
25mg〜500mgの間のドーパミンを含む、請求項88記載の組成物。
哺乳動物内で細胞によって産生されるモルヒネの量を増大するのに有効な条件下で該哺乳動物に組成物を投与する工程を含む、哺乳動物におけるモルヒネの産生を増大するための方法であって、該組成物がレチクリン、ノルラウダノソリン、サルタリジン、テバイン、およびコデインからなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含む、方法。
細胞が免疫細胞である、請求項91記載の方法。
哺乳動物がヒトである、請求項91記載の方法。
組成物がモルヒネを含む、請求項91記載の方法。
組成物が錠剤の形態である、請求項91記載の方法。
組成物がセレンを含む、請求項91記載の方法。
組成物がL-アルギニンを含む、請求項91記載の方法。
組成物がカルシウム供与源を含む、請求項91記載の方法。
投与する工程の前に、哺乳動物がモルヒネの増大を必要とすると同定される、請求項91記載の方法。
投与する工程の後に、哺乳動物がモルヒネの増大を確認するためにモニターされる、請求項91記載の方法。
月に1回よりも頻繁な頻度で哺乳動物に組成物を投与する工程を含む、請求項91記載の方法。
週に1回よりも頻繁な頻度で哺乳動物に組成物を投与する工程を含む、請求項91記載の方法。
方法が日に1回〜5回の間の頻度で哺乳動物に組成物を投与する工程を含む、請求項91記載の方法。
週に1回よりも頻繁な頻度で、かつ1ヶ月より長期間の間、哺乳動物に組成物を投与する工程を含む、請求項91記載の方法。
期間が3ヶ月よりも長い、請求項91記載の方法。
精神分裂症、躁病、うつ病、精神病、慢性痛、偏執症、自閉症、ストレス、アルツハイマー病、パーキンソン病、炎症誘発性疾患、自己免疫障害、組織分解延髄細網症、狼蒼、関節炎、アテローム性動脈硬化症、ニューロン脈管障害、胃腸状態、および依存症からなる群より選択される状態を有する哺乳動物を処置するための方法であって、該状態の症候の重症度が減少される条件下で該哺乳動物に組成物を投与する工程を含み、該組成物はレチクリン、ノルラウダノソリン、サルタリジン、テバイン、およびコデインからなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含む、方法。
投与する工程の前に、哺乳動物が状態を有すると同定する工程を含む、請求項106記載の方法。
投与する工程の後に、重症度が減少されたことを確認するために哺乳動物をモニターする工程を含む、請求項106記載の方法。
哺乳動物がヒトである、請求項106記載の方法。
組成物が経口投与される、請求項106記載の方法。
組成物が、哺乳動物の体重の1kgあたり、該哺乳動物が約1〜5mgの1つまたは複数の薬剤の少なくとも1つを受けるような量で該哺乳動物に投与される、請求項106記載の方法。
組成物が月に1回よりも頻繁な頻度で哺乳動物に投与される、請求項106記載の方法。
組成物が日または週に1回〜5回の間の頻度で哺乳動物に投与される、請求項106記載の方法。
ある量で、週に1回よりも頻繁な頻度で、かつ1ヶ月よりも長期間の間、組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、精神分裂症、躁病、うつ病、精神病、慢性痛、偏執症、自閉症、ストレス、アルツハイマー病、パーキンソン病、炎症誘発性疾患、自己免疫障害、組織分解延髄細網症、狼蒼、関節炎、アテローム性動脈硬化症、ニューロン脈管障害、胃腸状態、および依存症からなる群より選択される状態を有する哺乳動物を処置するための方法であって、該組成物は、モルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドを含み、および該組成物の該量により、1日あたり該哺乳動物の体重の1kgあたり、0.05mg未満の該モルヒネまたはモルヒネ-6β-グルクロニドが該哺乳動物に投与されることとなる、方法。
投与する工程の前に、哺乳動物が状態を有すると同定する工程を含む、請求項114記載の方法。
状態の症候の重症度が、組成物の最初の投与の少なくとも1ヶ月後の時点で減少される、請求項114記載の方法。
投与する工程の後に、状態の症候の重症度の減少を確認するために哺乳動物を評価する工程を含む、請求項114記載の方法。
哺乳動物がヒトである、請求項114記載の方法。
組成物が経口投与される、請求項114記載の方法。
組成物が週に1回よりも頻繁な頻度で哺乳動物に投与される、請求項114記載の方法。
組成物が日または週に1回〜5回の間の頻度で哺乳動物に投与される、請求項114記載の方法。
組成物がモルヒネを含む、請求項114記載の方法。
組成物がモルヒネ-6β-グルクロニドを含む、請求項114記載の方法。
組成物がモルヒネおよびモルヒネ-6β-グルクロニドを含む、請求項114記載の方法。
セレン、モルヒネ、およびアルギニンを含む栄養補助食品。