JP2008513372A - インビボでのリガンドの抗体緩衝 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は35U.S.C.§119(e)の下で「Antibody buffering of a ligand in vivo」と題され、そしてCarol.E.O’HearおよびJefferson Footeにより2004年9月13日に出願された米国仮特許出願第60/609803号の利益を請求し、この仮出願はその全てを出典明示により本明細書の一部とする。
本発明は国立衛生研究所により付与された認可番号NIH T32 CA80416の下で米国政府により為されたものであった。政府は本発明において特定の権利を有する。
(関連分野の説明)
ヒトおよび動物における膨大な数の疾患が罹患した個体の特定の部位、組織または器官に局在する病態生理学的な悪影響を特徴とするという事実にも関わらず、かかる症状のための大部分の治療的処置計画が例えば経口または静脈内経路を介する治療用薬物の全身的または全体的投与を伴う(例えば、非特許文献1を参照)。結果的に、比較的限定された部位でかかる薬物を治療上有効なレベルに到達させるための努力の副産として、受容者内で臨床的に無関係な、不適切なおよび/または望ましくない解剖学的位置で(循環血漿濃度を含む)薬理学または超薬理学的薬物レベルがしばしば達成される。体内の薬物クリアランスおよび分解活性はしばしば薬物の反復投与を必要とし、これはしばしば実際に循環する薬物濃度の激しい変動の反復に至り得る。
特定の場合では、治療用薬物の身体区画への特異的および有効な分配を達成するための代替の試みは罹患部分への薬物の直接注射を伴っている(非特許文献1;非特許文献12;非特許文献8;非特許文献31;非特許文献32;非特許文献33;非特許文献34)。しかしながら、かかる研究法は安全性、有効性、経費、利便性およびその他の因子の課題により悩まされており、そして全ての身体区画が治療の時間枠内での複数回の直接的介入に反応するわけではない。例えばCNSへの直接注射はCNS組織に対する非可逆的損傷に随伴される危険性、および部位への反復する接近に随伴される微生物感染の可能性を伴い、そしてCNSおよびその他の区画は技術および労働集約的な外科的手順によってのみ直接接近可能である。加えて、CNSに直接投与される治療用薬物はそこに存続できず、代わりにCNS間質液の指向性のバルク流の結果としてCNSから全身循環に放出される(例えば、非特許文献35)。別の実例では、抗癌薬の直接的腹腔内注射を伴う癌治療は、腹膜区画から外へ、および全身循環への薬物の有意なそして毒性の可能性のあるレベルの漏出を招いている(例えば、非特許文献36;非特許文献37;非特許文献38)。
本発明の特定の実施態様によれば、被験体に(i)少なくとも1用量の薬物および(ii)薬物に特異的に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントを同時または逐次的かついずれかの順序で投与することを含む、被験体において1つ以上の薬物の望ましい濃度範囲を維持するための方法が提供され、ここで抗体に関しては、抗体解離定数KDは薬物の望ましい濃度に実質的に類似する値を有し、そしてここで抗体解離定数KDは被験体における特異的な薬物標的に対する該薬物の親和性とは独立している。
特定の実施態様では、本発明は被験体に薬物および薬物に特異的に結合する抗体を投与することによりインビボで被験体において薬物の望ましい濃度範囲を維持するための方法および組成物に関する。
ここで開示するようにこれらのおよび関連する実施態様は、抗薬物抗体の存在により統計的に有意な様式で身体区画内の薬物の有効半減期が延長され得る、すなわち薬物クリアランスを抑制または遅延させることができる驚くべき発見に由来する。したがってかかる抗体は本明細書で「抗体緩衝」効果として記載されるものを媒介し、それにより(i)抗体と複合体形成する薬物および(ii)未結合の遊離の薬物との間のインビボ平衡分布を抗体親和性特性に応じて制御して遊離の、生物学的に利用可能な薬物の望ましい濃度範囲を得ることができる。
本発明に従って使用するための薬物は治療および/または診断目的で被験体に投与することができる物質の任意の組成物でよい。好ましくは薬物を可溶性形態で提供する。理論に束縛されることは望まないが、薬物は被験体の細胞または組織においてその同族特異的な薬物標的と特異的に相互作用して、薬物−標的相互作用の結果として直接的(例えば酵素の阻止、受容体の遮断)または間接的(例えば望ましい事象に至るためにシグナリングカスケードを開始する受容体アゴニストとして)のいずれかで治療上の利益を付与することができる。典型的には本明細書に開示する特定の好ましい実施態様に従って使用するための薬物は「小型分子」として当分野において公知であり、そして105ダルトン未満、好ましくは104ダルトン未満、さらに好ましくは8×103、5×103、3×103、2×103または1.5×103ダルトン未満、およびなおさらに好ましくは103ダルトン未満の分子量を有する化合物を含む。
身体区画は、液体連絡において身体のその他の領域から絶対的である必要はないが実質的に分離された、例えば組織または器官構造の生成物であるような、薄膜(例えば髄膜、心膜、胸膜、骨膜、関節包膜、粘膜、基底膜、腹膜、網、器官被包膜等)によりその他の身体部分から分離され得る空間的に定義された区画のような任意の定義された解剖学的区画を含み得る。本明細書に記載する特定の好ましい実施態様では、身体区画は物理的および生理学的に血液脳関門により循環から分離されており(Begley、Pharmacal.Therapeut.104:29(2004))、そして髄腔内、脳室内、実質、硬膜下、くも膜下または硬膜外により接近可能なCNS区画でよい。
ペプチド、ポリペプチドおよび薬物に特異的に結合するその他の分子である抗薬物結合分子を含む抗体もまた本発明により企図される。かかる結合分子を本明細書に記載するような1つ以上の薬物の望ましい濃度範囲を維持するための方法において用いることができる。抗薬物結合分子のような抗体は、検出可能なレベルで薬物と反応する(例えば結合する)が、構造的に異なるまたは関連性のない分子とは検出可能なように反応しない場合に、特定の薬物に特異的に結合するとされている。したがって好ましい結合分子には、例えばポリクローナル、モノクローナル、一本鎖、キメラ、ヒト化、抗イディオタイプ、もしくはCDR移植免疫グロブリンでよい抗体、またはタンパク質溶解により作成されたもしくは組換えにより生成された免疫グロブリンF(ab’)2、Fab、Fab’、Fvおよび/もしくはFdフラグメントのようなその抗原結合フラグメント、単一ドメイン抗体(「dAb」;Holtら、Trends Biotech.21:484(2003))ならびにダイアボディ(Hudsonら、J.Immunol.Meth.231:177(1999))が含まれる。本発明による抗体は任意の免疫グロブリンクラス、例えばIgG、IgE、IgM、IgDまたはIgAに属してよい。それは動物、例えば家禽(例えばニワトリ)または、限定するものではないがマウス、ラット、ハムスター、ウサギもしくはその他のげっ歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒトまたはその他の霊長類を含む哺乳動物から得られるか、またはそこから誘導することができる。抗体は内部移行型抗体でよいか、または抗体は細胞膜を通って容易に輸送され得るように修飾され得る。
特定の実施態様では、薬物に特異的に結合する抗体は細胞内タンパク質として発現される抗体でよい。かかる細胞内抗体はまた細胞内発現抗体とも称され、そしてFabフラグメントを含み得るか、または好ましくはscFvフラグメントを含み得る(例えばLecerfら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:4764−49(2001)参照)。CDR領域をフランキングするフレームワーク領域を修飾して発現レベルおよび細胞内の還元環境内での細胞内発現抗体の溶解性を改善することができる(例えばWornら、J.Biol.Chem.275:2795−803(2000)参照)。例えば細胞内の特定の標的抗原をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能なように融合することができる細胞内発現抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを構築することにより、細胞内発現抗体を特定の細胞位置またはオルガネラに志向させることができる(例えばGraus−Portaら、Mol.Cell Biol.15:1182−91(1995);Lenerら、Eur.J.Biochem.267:1196−205(2000)参照)。遺伝子治療ベクター、または脂質混合物(例えばイムゲネックス社、サンディエゴ、カリフォルニア州により製造されたProvectin(商標))を介するものを含む当業者に利用可能な種々の技術により、または光化学的内部移行法に従って細胞内発現抗体を細胞に導入することができる。
(脳脊髄液中の抗体緩衝)
(方法)
抗体生成
抗OxハイブリドーマNQ11/7.12は以前に記載されている(Griffithsら、Nature 312:271−75(1984);Berekら、Eur.J.Immunol.17:1121−29(1987))。対照(非Ox結合)ネズミ抗リゾチーム抗体D1.3(Amitら、Science 233:747−53(1986))をも使用した。ハイブリドーマを振動気泡ローラーボトル中で成長させ(Pannellら、J.Immunol.Methods 146:43−48(1992))、そしてプロテインA−セファロースの親和性クロマトグラフィーにより各々のモノクローナル抗体を使用済み培養上澄から精製した。純度を検証するために抗体に関してSDS−PAGEを実施した。紫外分光法により配列から計算した減衰係数を用いてタンパク質濃度を決定した(Perkins、Eur.J.Biochem.157:169−80(1986))。抗体溶液をフィルター滅菌し、そして窒素下で4℃で保存した。
本質的にBerekら(前出)に記載されるように粗製Oxを調製した。3H−γ−アミノ酪酸(GAGA)(1mCi/ml)をパーキンエルマーライフサイエンシズ社(ウェルズリー、マサチューセッツ州)から入手し、そして未標識GABA(1M NaHCO3中0.5mM)および4−エトキシ−メチレン−2−フェニル−オキサゾリン−5−オン(アセトン中36.26mg/ml)の溶液を調製した。未標識GABA溶液5μlを氷上で3H−GABA 50μlと混合した。4−エトキシ−メチレン−2−フェニル−オキサゾリン−5−オン溶液10μlを加え、そして反応混合物をときどき手動で混合しながら1時間氷上に置いた。次いでさらに4−エトキシ−メチレン−2−フェニル−オキサゾリン−5−オン溶液11μlを加え、そして反応混合物を氷上で20分間放置した。未標識GABA溶液5μlを加え、そして反応物を高速で混合しながら20時間室温にした。次いで濃酢酸1μlを加え;得られた沈殿物をサーモサバントSPD1010スピードバックシステム中で加熱せずに乾燥させた。乾燥した沈殿物をPBSに溶解した(25mM NaH2PO4/125mM NaCl、pH7.0)。
パーキンエルマーLS50B発光分光計を用いて蛍光分光法により(FooteおよびMilstein、Nature 352:530−32(1991))抗体親和性を決定した。37℃に加熱した水浴を循環させることによりキュベットブロックの温度制御を維持した。PBS中20nM NQ11/7.12を含有するキュベットを分光計内に置き、そして37℃に平衡させた。30μg/mlユビキチンをキャリアとして加えた。帯域幅5nmの励起波長280nmおよび帯域幅10nmの発光波長340nmを積分時間8秒で用いた。40nM増でOx−GABA溶液を加え、そして平衡になる時間を見越して蛍光の読みを行った。得られた濃度/蛍光の読みを最小二乗法(FooteおよびWinter、J.Mol.Biol.224:487−99(1992))により分析して各抗体のKdを決定した。
雄スプラーグドーリーラット(300g)をジビックラボラトリーズ社(ゼリエノープル、ペンシルバニア州)から入手した。各ラットは注射用に右側脳室にカニューレおよび脳脊髄液(CSF)試料採取のために大槽に第2カニューレを設置するための手術を施された。簡単にはラットを2.5%イソフルランで麻酔し、そして定位固定装置内で固定した。加熱パッドにより通常の体温を維持した。正中線切開により前頭、頭頂および後頭骨を暴露した。ラットの定位図譜から得られた座標(ブレグマから1.8mm後側、3.8mm外側および4mm腹側)を用いて側脳室を位置決定した(Paxinosら、The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates(アカデミックプレス 1998))。頭蓋骨にドリルで孔を開け、カニューレを挿入し、そしてベトボンド(スリーエム、ミネアポリス、ミネソタ州)および歯科用セメントを用いて頭蓋骨に固定した。脳槽カニューレ用に、上矢状静脈洞の穿孔を避けるために後頭稜のちょうど後ろおよび中線の少し左にドリルで孔を開けた。頭蓋骨の底部の下2mmの深さまでカニューレを挿入し、そしてベトボンドおよび歯科用セメントを用いて固定した。ネジ口カニューレダミーワイヤーをカニューレガイドに挿入して閉鎖系を維持した。脳室内注射の前少なくとも24時間はラットを回復させた。
注射用の試料を調製した:抗Ox抗体104ピコモルおよびOx52ピコモル;D1.3対照抗体104ピコモルおよびOx52ピコモル;ならびにOx52ピコモル単独。各試料を滅菌PBSで10μlまで希釈した。試料を37℃まで加温し、そして次にスプラーグドーリーラットの脳室内または脳槽カニューレを通して1分間にわたって注入した。注入の終わりをゼロ(0)時と称した。種々の時点でCSF 10μlを採取した。ラット1組に関してCSF 10μlを、シンチバースII 5mlに入れ、そしてベックマンLS6500シンチレーションカウンター中で計数することにより直接計数した。ラットの別の組に関してCSF 10μlを氷冷PBS 100μlに希釈し、そして以下に記載する結合対遊離Ox実験で用いた。
ラット抗マウスカッパ抗体187.1(アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)、マナサス、バージニア州)(Yeltonら、Hybridoma 1:5−11(1981))を使用済み培養培地から単離し、そしてプロテインA−セファロース親和性カラムを通過させることにより精製した。CNBr活性化セファロース4ファストフロー(アメルシャムバイオサイエンシズ)10gを洗浄し、そして製造者のプロトコールに従って187.1と結合させた。膨潤した樹脂10gあたり187.1を2mg使用した。
NQ11/7.12およびOxの試料およびOxを調製し、そして抗体緩衝プロトコールに関して前記したようにチャールズリバーラボラトリーズからのスプラーグドーリーラットの脳槽カニューレに注入した。1、10、20、30、60、90および120分にCSF 10μlを大槽から採取した。CSF試料10μlを直接的または氷冷PBS100μlに希釈してのいずれかで計数し、そして187.1カラムに負荷して結合および遊離Oxを分離した。最初の投与後24時間および48時間に、全容量10μl中Ox52ピコモル(滅菌PBSで希釈)を大槽カニューレを通して1分間かけて注入した。再度時点を取り、そして前記したように分析した。
Oxに特異的に結合する動態学的に特徴的なモノクローナル抗体(NQ11/7.12)(FooteおよびMilstein、前出)を用いて抗Ox抗体のCSFへの添加の影響を試験した。この抗体の親和性を前記したような蛍光分光法を用いて37℃で決定し、そして1.3nMであることが判明した(NQ11/7.12)。アイソタイプ適合(IgG1)抗鶏卵リゾチーム抗体、D1.3(Amitら、Science 233:747−53(1986))を対照として使用した。これらの研究で各ラットを一度だけ用いてラット抗マウス抗体応答の可能性を制限した。
CSF中のOxの薬物動態的挙動を決定するために、トリチウム標識したOxをその脳室内カニューレを通してラットに注入し、そして大槽(CM)カニューレからのCSF試料採取によりOXの排泄を追跡した。大槽が最大のCSF区画であるのでそこから試料採取を行った。小脳および脳幹上部の間のその位置ならびにその大きさにより、試料採取およびシンチレーション計数のためのCSFへの接近が比較的容易になる(van den Bergら、J.Neurosci.Methods 116:99−107(2002))。
化学平衡の原理により、CSF中のOxが遊離形態と抗体結合形態の間で分割され、そして遊離プールは絶えず補給されて抗体Kdに近い濃度を保つはずであることが予測される。別のラットの組からのCSF試料中のOxを、親和性カラムを通過させることにより結合形態および遊離形態に分離した。Oxと同時投与したD1.3からの試料を並行して処理したが、有意な抗体結合標識は予測または見出されなかった。抗体−Ox複合体は固定したラット抗マウスカッパ抗体に結合したが、遊離OxはPBS洗浄でカラムから溶出された(遊離Ox分画)。
これらの実験に関して、NQ11/7.12を一度だけ投与した。OxをNQ11/7.12と初期に同時投与し、そしてOx単独のさらなるアリコートを24時間および48時間に脳槽カニューレを通して投与した。脳槽CSF試料を収集してCSFからの全Ox排泄を追跡した。図5Aに示すように、24時間および48時間に投与したOxの薬物動態半減期により、OxをNQ11/7.12と共に初期に投与した場合に観察されたプロフィールと、D1.3と共に投与した場合のOxプロフィールとの間の動態プロフィールが示された。非限定的な理論によればこの観察は、長時間にわたる循環抗体の緩徐なクリアランスに起因した可能性があった。CSF試料の別の組で遊離対結合Ox分離もまた実施し;データを図5Bに示す。初期の遊離Ox濃度は24時間および48時間で、Oxを抗体バッファーと組み合わせて投与した場合よりも高かった。しかしながら、この遊離濃度は減少し、そしてOxは、OxをD1.3と共に投与した場合よりも緩徐な排泄プロフィールを示した。この観察は明らかに、初期遊離Ox濃度が高いときにOxと初期結合した抗体の結果であり、そして次に抗体は続いて長時間にわたってOxを放出した。したがって、本明細書に記載したリガンドの抗体緩衝の平衡原理に従って、抗Ox抗体は初期抗体注入の後日のCSF中の遊離Oxの濃度を緩衝することができた。
(小型分子の抗体緩衝)
(方法)
抗体
3つの抗Oxハイブリドーマ(NQ11/7.12、NQ16/113.8、NQ22/16.4)のパネルは以前に記載されている(Griffithsら、前出;Berekら、前出)。対照(非Ox結合)ネズミ抗リゾチーム抗体、D1.3(Amitら、前出)もまた使用した。これらのハイブリドーマを振動気泡ローラーボトル中で成長させ(PannellおよびMilstein、前出)、そしてプロテインA−セファロースの親和性クロマトグラフィーにより使用済み培養上澄から各々のモノクローナル抗体を精製した(実施例1もまた参照)。抗体に関してSDS−PAGEを実施して純度を検証した。紫外線分光法により配列から計算した減衰係数を用いてタンパク質濃度を決定した(Perkins前出)。抗体溶液をフィルター滅菌し、そしてN2下4℃で保存した。
実施例1に記載するように粗製Oxを調製した(Berekら、前出)。3H−γ−アミノ酪酸(GAGA)(1mCi/ml)をパーキンエルマーライフサイエンシズ社から入手し、そして未標識GABA(1M NaHCO3中0.5mM)および4−エトキシ−メチレン−2−フェニル−オキサゾリン−5−オン(アセトン中0.17M)の溶液を調製した。未標識GABA溶液5μlを氷上で3H−GABA 50μlと混合した。4−エトキシ−メチレン−2−フェニル−オキサゾリン−5−オン溶液10μlを加え、そして反応混合物をときどき手動で混合しながら1時間氷上に置いた。次いでさらに14−エトキシ−メチレン−2−フェニル−オキサゾリン−5−オン溶液11μlを加え、そして反応混合物を氷上で20分間放置した。未標識GABA溶液5μlを加え、そして反応物を高速で混合しながら20時間室温にした。次いで濃酢酸1μlを加え;得られた沈殿物をサーモサバントSPD1010スピードバックシステム中で加熱せずに乾燥させた。乾燥した沈殿物をPBSに溶解した(25mM NaH2PO4/125mM NaCl、pH7.0)。
実施例1に記載するようにパーキンエルマーLS50B発光分光計を用いて蛍光分光法により(FooteおよびMilstein、前出)抗体親和性を決定した。37℃に加熱した水浴を循環させることによりキュベットブロックの温度制御を維持した。PBS中20nM(NQ11/7.12)または200nM(NQ16/113.8またはNQ22/16.4)のいずれかを含有するキュベットを分光計内に置き、そして37℃に平衡させた。NQ11/7.12の場合、30μg/mlユビキチンをキャリアとして加えた。帯域幅5nmの励起波長280nmおよび帯域幅10nmの発光波長340nmを積分時間8秒で用いた。40nM増でOx−GABA溶液を加え、そして平衡になる時間を見越して蛍光の読みを行った。得られた濃度/蛍光の読みを最小二乗法(FooteおよびWinter、前出)により分析して各抗体のKdを決定した。
クロラミンT法を用いてNQ11/7.12を125Iでヨウ素化した(HunterおよびGreenwood、前出;McConaheyおよびDixon、前出)。ヨウ素の抗体への取り込みは97%であり、そして抗体溶液の特異活性は1.25×106cpm/μgであった。ラット(300g雄スプラーグドーリーラット(ジビックラボラトリーズ社、ゼリエノープル、ペンシルバニア州))に頸静脈カニューレを埋め込んだ。納入後実験開始前に少なくとも72時間動物を休ませ、そして実験中自由に運動させた。125I−NQ11/7.12(0.39ナノモル)を未標識NQ11/7.12と最終量4.54ナノモルまで混合した。この量をさらに最終容量1mlまで滅菌PBSで希釈した。試料を手で頸部カニューレを通して1分間かけて注入し;カニューレをヘパリン添加した食塩水(250単位/ml)0.2mlで流して凝固の危険性を低減させた。注入の終わりをゼロ(0)時と称した。種々の時点で血液試料(0.4ml)をカニューレから採った。即座に血液を遠心して血漿を分離した。血漿100μlをパッカードコブラ・オートガンマを用いて計数して血漿中のNQ11/7.12の濃度を決定した。
注射用の試料を調製した:抗Ox抗体4.54ナノモルおよびOx2.27ナノモル;D1.3対照抗体4.54ナノモルおよびOx2.27ナノモル;または抗体なしおよびOx2.27ナノモル。各試料を滅菌PBSで1mlまで希釈した。試料を37℃まで加温し、そして次に前記したようにスプラーグドーリーラットの頸静脈カニューレを通して1分間にわたって注入した。種々の時点で血液0.45mlを採り、そして即座に遠心して血漿を分離した。シンチバースII 5mlに血漿を入れ、そしてベックマンLS6500シンチレーションカウンター中で計数することにより血漿100μlを直接計数した。血漿100μlを以下に記載する結合対遊離Ox実験で用いた。幾匹かのラットに関して血漿を除いた血液0.1mlを分析した。これらの試料を最初にシンチゲスト(フィッシャーサイエンティフィック):イソプロパノール(1:2容量/容量)0.3ml中40℃で1時間インキュベートすることにより脱色した。次いで30% H2O2 0.2mlを滴加し、そして溶液を室温で15分間インキュベートした。いくつかの塊を崩壊させるために上下にピペッティングする必要があった。溶液を40℃でインキュベートした後、シンチバースII 5ml中に入れた。計数前に試料を一晩放置して化学発光を低減させた。分析を補助するために既知量のOxを用いて対照試料を調製した。
ラット抗マウスカッパ抗体187.1(実施例1参照)を使用済み培養培地から単離し、そしてプロテインA−セファロース親和性カラムを通過させることにより精製した。CNBr活性化セファロース4ファストフロー(アメルシャムバイオサイエンシズ)10gを洗浄し、そして製造者のプロトコールに従って187.1と結合させた。膨潤した樹脂10gあたり187.1を2mg使用した。
NQ11/7.12およびOxの試料を調製し、そして前記したようにスプラーグドーリーラットに注入した。1、10、20、50、90および120分に血液試料(0.4ml)を採取した。血漿100μlを直接計数し、そして100μlを187.1カラムに入れて結合および遊離Oxを分離した。最初の投与後24時間および再度48時間に、PBS 0.5ml中Ox2.27ナノモルを頸部カニューレを通して1分間かけて注入した。再度時点を取り、そして前記したように分析した。
薬物動態的挙動を決定するために、トリチウム標識したOxを頸部カニューレを通してラットに注入し、そして血液試料採取、遠心による血漿の分離、および血漿のシンチレーションカウンティングによりOxの排泄を追跡した。Oxの濃度は急速に下降し、血漿からの半減期は1.2分であった。
動物からの血漿分画におけるOxの結合形態および遊離形態を親和性カラムで分離した。同時投与したD1.3から得られた試料を並行して処理したが、有意な抗体結合標識は予測または見出されなかった。抗体−Ox複合体を捕捉するために固定したラット抗マウスカッパ抗体を使用したが、遊離OxはPBS洗浄でカラムから溶出された(遊離Ox分画)。
抗体Kdと血漿からのOx排泄を遅延させる抗体の能力との間の相関性を決定した。この実験のために、3つの抗Ox抗体NQ11/7.12、NQ16/113.8およびNQ22/16.4を使用した。NQ16/113.8およびNQ22/16.4は各々Oxに関して類似のKdを有し、それはNQ11/7.12のものよりも有意に高かった(表1参照)。OxをNQ16/113.8またはNQ22/16.4のいずれかと共にラットに投与した。全Ox濃度を血液試料採取により測定した(図8A)。比較のためにNQ11/7.12またはD1.3と共に投与したOxの濃度をも図8Aに示す。NQ16/113.8およびNQ22/16.4の双方は血漿からの全Ox排泄を遅延させた。このOx半減期の増加は、Oxとの親和性がより高いNQ11/7.12と共に投与した場合のOx半減期の増加の程度に近似しなかった。したがって、抗体Kdは血漿中の全Oxの排泄速度と相関した。
初期抗体注入の後日の血漿中のOx濃度を緩衝するその能力をNQ11/7.12が保持するかどうかを決定した。これらの実験に関して、NQ11/7.12を一度だけ投与した。OxをNQ11/7.12と初期に同時投与した。Ox単独のさらなるアリコートを24時間および48時間に投与した。血液試料を入手して血漿からの全Ox排泄を追跡した。図9Aに示すように、24時間および48時間でのOxの薬物動態存在時間により、初期のNQ11/7.12投与の後の動態からは小さな変化しか示されず、それは長時間にわたる循環抗体の緩徐なクリアランスに起因し得る。D1.3対照抗体と同時投与したOxを比較のために示した。これらの血漿試料で遊離対結合Ox分離もまた実施し;データを図9Bに示す。初期の遊離Ox濃度は24時間および48時間で、Oxを抗体バッファーと同時に投与した場合よりも高かった。しかしながら血漿中にすでに存在するNQ11/7.12抗体とOxが結合したので、遊離濃度は急速に正常化された。これはOxおよびNQ11/7.12を一緒に投与した場合に観察されたパターンに類似する排泄パターンであった。したがって、抗Ox抗体は初期の抗体注入の後日の血漿中の遊離Oxの濃度を緩衝した。図9に示すように、後にOxを同時投与しても、再投与しても、血漿中のOxおよび抗体の平衡は遊離Oxの排泄よりもかなり急速であった。
(リゾチームの抗体緩衝)
(方法)
14Cリゾチームの調製
Habeeb(Habeeb、1983)から適用された手順である還元的メチル化を用いてリゾチームを14Cで標識した。14Cホルムアルデヒドをニューイングランドニュークリアから入手した(特異活性40−60mCi/ミリモル)。ガラスアンプルを乾燥氷上においてホルムアルデヒドガスを凝結させた。標識混合物はリゾチーム0.7μモル(リン酸塩バッファー中20mg/ml溶液から)、NaCNBH3(新たに調製した0.1M NaCNBH3溶液から)3.5μモル、および全容量1mlにするために加えた0.1Mリン酸塩バッファー(NaH2PO4、NaOHでpH8.0)からなった。標識混合物をアンプルに加え、そして反応物を8分毎に混合して30分間処理した。アンプルに0.05Mホウ酸塩バッファー0.5ml(H3BO3、pH8.0)を加え、そして量を制御する目的でシンチレーションカウンティングのために1μlアリコートを採った。次いで反応混合物を2×500mlホウ酸塩バッファー(pH7.0)に対して透析し、続いて滅菌PBS 5×500mlに対して透析した。透析バッファーのアリコートをシンチレーション液に加え、そして計数して透析を完了した時を決定した。SDS−PAGEを実施してタンパク質純度を評価し、そしてゲルをオートラジオグラフィーに供して14Cタグがリゾチームバンドにのみ局在したことを検証した。配列から計算した減衰係数を用いて(Perkins、1986)、紫外線分光法によりタンパク質濃度を決定した。シンチレーションカウンティングのために1μlのアリコートを採り、リゾチームの特異活性を決定した。抗体溶液をフィルター滅菌し、そしてN2下4℃で保存した。
ネズミ抗リゾチームハイブリドーマ、D1.3(Amitら、前出;Bhatら、Nature 347:483−85(1990))を振動気泡ローラーボトル中で成長させた(PannellおよびMilstein(1992))。得られたモノクローナル抗体をリゾチーム−セファロース親和性カラムを通過させることにより使用済み培養上澄から精製した。分画をジエチルアミン(フィッシャーサイエンティフィック)で1Mトリス(pH7.4)150μlの入ったチューブに溶出し、そしてプロテインAバッファー(3M NaCl、0.1Mグリシン、pH8.9)に対して透析した。次いで透析液をプロテインA−セファロースCL−4B(ファルマシア)カラムを通過させた。クエン酸ナトリウムからクエン酸のグラジエントで分画を溶出し、そして3Mトリス(pH8.8)100μlの入ったチューブ内に収集した。次いで分画をPBS(25mM NaH2PO4/125mm NaCl、pH7.0)に対して透析した。SDS−PAGEを実施して純度を検証した。紫外線分光法により配列から計算した減衰係数を用いてタンパク質濃度を決定した(Perkins(1986))。抗体溶液をフィルター滅菌し、そしてN2下4℃で保存した。D1.3のKdは3.7nM(20℃)であった(FooteおよびWinter、前出)。
ラット(300gスプラーグドーリー雄(ジビックラボラトリーズ社、ゼリエノープル、ペンシルバニア州))に頸静脈カニューレを埋め込んだ。ラットは実験中自由に運動させ、そして食餌および水に接近可能にした。D1.3抗体450μgを伴うかまたは伴わずに、14Cリゾチーム43μgからなる注入のための試料を調製した。滅菌生理食塩水を用いて容量を1mlにし、そして試料を使用前に37℃でインキュベートした。HP注入ポンプを用いて頸部カニューレを通して試料を5分間かけて注入した。注入後、カニューレをヘパリン添加した食塩水(250単位/ml)0.2mlで流して凝固の危険性を低減させた。注入の終わりをゼロ(0)時と称した。種々の時点で血液試料(0.5ml)をカニューレから採った。即座に血液を遠心して血漿を分離した。血漿(0.1ml)をシンチレーション液5mlと混合し、そして計数した。本明細書に記載する結合対遊離リゾチーム実験でさらに0.1mlを使用した。細胞ペレットをシンチレーション液と混合し、そしてまた計数した。
血漿を分離するために血液試料を遠心した後、血漿0.1mlをプロテインA−セファロースミニカラム1.5mlに負荷した。カラムを0.5mlずつ増量して3mlのPBSで、続いて0.5mlずつ増量して3mlの100mMクエン酸で洗浄した。PBS(遊離リゾチーム)およびクエン酸(抗体結合リゾチーム)分画を各時点で別個に収集した。分画でTCA沈殿を実施した。タンパク質沈殿物をアセトンで洗浄し、そして沈殿物をPBSに再溶解した(沈殿物の全てが溶解するわけではない)。液体および残存するペレットをシンチレーション液4mlに移して計数した。
頸静脈カニューレを埋め込んだスプラーグドーリーラットに14Cリゾチーム43μgおよびD1.3抗体450μgまたは900μgのいずれかを注入した。滅菌生理食塩水を用いて注入容量を1mlにした。試料を調製および注入し、そして時点を取り、そして前記したように分析した。結合対遊離分離分析を実施した。
頸静脈カニューレを埋め込んだスプラーグドーリーラットにD1.3抗体450μgおよび14Cリゾチーム43μgまたは430μgのいずれかを注入した。試料を調製し、注入し、そして時点を取り、そして前記したように分析した。
注入用に2つの試料を調製した。第1の試料は生理食塩水0.5mlに希釈したD1.3抗体450μgからなり、これをHP注入ポンプを用いて4分間かけて注入した。循環中で抗体が平衡になる時間を見越して、ラットを10分間ケージ中で自由に運動させた。次いで第2の試料は滅菌生理食塩水を用いて0.5mlにした14Cリゾチーム43μgからなり、これを4分間かけて注入した。第2の注入の終わりをゼロ時(0)と称した。血液試料を採取し、そして前記したように分析した。
ラットにおけるリゾチーム薬物動態の以前の研究では、血漿中のリゾチームの量を酵素アッセイにより定量した(Franssenら、Pharm.Res.8:1223−30(1991))。しかしながら、D1.3はリゾチームの酵素活性を遮断した;したがってリゾチームを14Cで放射標識して、血漿試料中のその量を測定することができた。リゾチームの14Cホルムアルデヒドでの還元的メチル化により、特異活性7.4×107cpm/mgを有する14Cリゾチーム抱合体を生じた。このように、リゾチームをラット血漿中のバックグラウンドレベルを超えて検出できるほど十分に標識した。図10で示すように、14Cリゾチームの純度をSDS−PAGEを用いて決定し(図10A)、そしてオートラジオグラフィーを用いてリゾチームバンドに局在する放射活性シグナルを示した(図10B)。D1.3の14Cリゾチーム抱合体に効率よく結合する能力をELISAにより決定した(図10C)。D1.3リゾチーム結合は14C抱合体で保持された。
リゾチーム検出の放射活性法を用いてリゾチームの薬物動態プロフィールを決定するために、頸部カニューレを通してラットの血流に14Cリゾチームを注入した。4時間にわたって種々の時間間隔で血液試料採取することによりリゾチーム排泄を追跡した。遠心後血漿を収集し、そしてシンチレーションカウンティングに供した。リゾチームが16.4分の血漿β半減期を有することが判明した(図11)。これらのおよび以下の研究での各ラットは1回だけ使用して、リゾチームまたは抗体のいずれかに対する免疫応答の可能性を制限した。
本明細書に記載したリガンドの抗体緩衝の平衡原理に従って、ネズミ抗リゾチーム抗体D1.3を14Cリゾチームに関する抗体バッファーとして使用した。リゾチームを等モル量のD1.3と共にラットの頸部カニューレを通して投与した。図11で示すように、単独で投与したリゾチームの濃度は排泄半減期16.4分で急速に下降した。リゾチームを伴うD1.3の投与により、ラット血漿中のリゾチームの滞留時間は有意に延長され、β半減期が42.8分まで伸びた。リゾチームをそのままで投与した場合、リゾチームの初期濃度は高く現れたが、D1.3により緩衝されたリゾチームと比較して、その量は急速に低下し、これはD1.3複合体形成が実際に排泄速度を低下させたことを示している。
全リゾチーム濃度を決定するためのシンチレーションカウンティングのために遠心して血漿を分離した後、血漿のアリコートをプロテインA−セファロースミニカラムに適用して、リゾチームの結合形態および遊離形態を分離した。遊離リゾチームはPBS洗浄で溶出されたが、D1.3に特異的に結合したリゾチームはクエン酸で溶出された。得られた大容量の溶離液は直接的なシンチレーションカウンティングを妨害するので、TCSA沈殿を実施してタンパク質の分離を行った。得られたタンパク質ペレットは組織溶解剤およびその他の試薬を用いる試みにもかかわらず、再溶解に抵抗し;したがって正確な遊離リゾチーム濃度を確定するのは困難であった。それにもかかわらず、リゾチーム単独のレベルおよび同一に調製されたリゾチーム−D1.3溶離液のレベルの分析により、これらの試料中の遊離リゾチームレベルの差が示された。
ラット血漿中の全リゾチームの緩衝に及ぼす種々の抗体濃度の影響を決定するために、等モル量または2倍モル量のいずれかのD1.3と共に14Cリゾチームをラット血漿に投与した。4時間にわたって種々の時点で血液を採取した。血漿を再度遠心により分離し、そして全リゾチーム濃度をシンチレーションカウンティングにより決定した。図13に示すように、2倍モル量のD1.3を伴うリゾチームの投与によりリゾチームのβ半減期が61.3分まで延長された。この半減期は、リゾチームを等モル濃度のD1.3と共に投与した場合のリゾチームのβ半減期(β半減期42.8分)と有意に異なった。したがってさらなる抗体のバッファー系への添加はリガンド半減期を大きく延長させると考えられた。
D1.3を単独でラット血漿に注入するさらなる実験を実施した。血漿内の抗体の平衡を可能にするためにこの注入の10分後に、ラット頸部カニューレを通して等モル量のリゾチームを投与した。得られた薬物動態は前記したように血液試料採取により追跡した。図15に示すように、リゾチームの初期濃度は高かったが、D1.3およびリゾチームを一緒に投与した場合に到達したレベルに非常に類似したレベルまで急速に平衡した。これにより、D1.3は循環中に十分に保持され、そしてリゾチームに効率よく結合するその能力はインビボで変化しなかったことが示された。
Claims (19)
- 被験体に(i)少なくとも1用量の薬物および(ii)該薬物に特異的に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントを同時または逐次的に、およびいずれかの順序で投与することを含む、該被験体において1つ以上の該薬物の望ましい濃度範囲を維持するための方法であって、ここで該抗体に関しては抗体解離定数KDは該薬物の望ましい濃度に実質的に類似する値を有し、かつ該抗体解離定数KDは該被験体における特異的な薬物標的に対する該薬物の親和性とは独立している、方法。
- 身体区画に(i)少なくとも1用量の薬物および(ii)該薬物に特異的に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントを同時または逐次的かついずれかの順序で投与することを含む、被験体の該身体区画において1つ以上の該薬物の望ましい濃度範囲を維持するための方法であって、ここで該抗体に関しては抗体解離定数KDは該薬物の望ましい濃度に実質的に類似する値を有し、かつ該抗体解離定数KDは該被験体における特異的な薬物標的に対する該薬物の親和性とは独立している、方法。
- 前記身体区画が中枢神経系区画、心膜、胸膜腔、眼窩後区画、眼区画、関節包、リンパ区画、腹膜区画、鼻内区画、肺区画、および泌尿生殖器区画からなる群より選択される区画を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記身体区画が中枢神経系区画を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記身体区画が中枢神経系区画を含み、そして投与の工程が薬物の髄腔内、脳室内、実質、硬膜下、くも膜下または硬膜外導入を含む、請求項2に記載の方法。
- 少なくとも2用量の前記薬物を投与することを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記抗体および前記薬物をほぼ等モル濃度で投与する、請求項2に記載の方法。
- 抗体対薬物モル比が少なくとも2:1で前記抗体および前記薬物を投与する、請求項2に記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項2に記載の方法。
- 前記抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項2に記載の方法。
- 前記抗原結合フラグメントがFabフラグメント、Fab’フラグメント、(Fab’)2フラグメント、Fdフラグメント、Fvフラグメント、scFv、dAbおよびダイアボディからなる群より選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記投与の工程が
(a)少なくとも1用量の第1薬物、および該第1薬物に特異的に結合する少なくとも1つの第1抗体またはその抗原結合フラグメントを投与すること;ならびに
(b)少なくとも1用量の第2薬物、および該第2薬物に特異的に結合する少なくとも1つの第2抗体またはその抗原結合フラグメントを投与すること;
を含む、請求項2に記載の方法。 - 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが前記薬物に特異的に結合する複数の抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ここで該抗体の各々は該薬物の望ましい濃度範囲内である望ましい濃度範囲に実質的に類似する値を有する抗体解離定数KDを有する、請求項2に記載の方法。
- 中枢神経系区画に(i)少なくとも1用量の薬物および(ii)該薬物に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを同時または逐次的かついずれかの順序で投与することを含む、被験体の該中枢神経系区画において該薬物の望ましい濃度範囲を維持するための方法であって、ここで該抗体に関しては抗体解離定数KDは薬物の望ましい濃度に実質的に類似する値を有し、そして該抗体解離定数KDは被験体における特異的な薬物標的に対する該薬物の親和性とは独立している、方法。
- 前記被験体が中枢神経系疾患または障害を有する、請求項14に記載の方法。
- 前記中枢神経系疾患または障害が新生物による症状、神経変成疾患、血管疾患および自己免疫疾患からなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記被験体が中枢神経系の新生物による症状を有する、請求項14に記載の方法。
- 前記新生物による症状がグリオーマ、星細胞腫、神経線維腫、神経芽細胞腫、リンパ腫、脳転移、ならびに脳実質、髄膜、脳神経、下垂体、松果体、乏突起膠細胞、上衣および脈絡叢のうちの少なくとも1つに存在する腫瘍からなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
- 被験体の身体区画における薬物の望ましい濃度範囲を維持することができる抗体を同定するための方法であって、該方法は、
(a)該被験体の身体区画において維持される該薬物の望ましい濃度範囲を決定すること;ならびに
(b)該薬物に特異的に結合し、かつ該身体区画において維持される該薬物の望ましい濃度に実質的に類似する値を有する抗体解離定数KDを有する抗体を調製し、そしてそれにより該薬物の望ましい濃度範囲を維持することができる抗体を同定すること;
を含む、方法。
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