JP2008511308A - 核酸フラグメントの二次元鎖数依存及び長さ依存分離 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図13
Description
本発明は新規な二次元(2D)ゲル電気泳動システムに基づいて核酸フラグメントの鎖数依存及び長さ依存の分離を達成する方法を提供する。この二次元鎖数及び長さ依存電気泳動法及びシステム(本明細書では頭字語2D−SDEを使用する)は、核酸フラグメントを一次元においては長さ及び鎖数の両方に基づいて分離するが、第2次元においては長さのみに従って分離する。このシステムは一本鎖フラグメントの集団を二本鎖フラグメントの集団から両者の複合混合物中で分離可能であり、各集団内での長さ分布決定を可能にする。さらにこのシステムは片方又は両方の分画の単離という選択肢を提供する。
本発明は、例えば以下のような、しかしこれらに限定されない異なる情況において使用できる一般的な方法を提供する:I)片方又は両方のクラスの定量及び/又は単離を可能にする一本鎖と二本鎖核酸フラグメントの物理的分離、II)生物学的サンプル中の一本鎖及び二本鎖核酸両方の量及び長さ分布の推定、III)再結合速度論の測定、IV)大量の無傷なフラグメントからの一本鎖切断を含有する二本鎖核酸フラグメントの単離、V)PCR及び他のインビトロ増幅産物を含む複合核酸調製物の品質のモニター、VI)複合混合物中のcDNA合成効率及びRNA:DNAハイブリッド存在の推定、及びVII)複合核酸サンプルの標識効率のモニター。
本発明は、一本鎖及び二本鎖核酸フラグメントを両者の複合混合物から分離し、そして所望により単離する方法を提供する。本発明は核酸調製物を、それらの生物学的機能又はゲノム位置の予備知識の有無に関わらず、それらの鎖数についてスクリーニングするために使用できる。本発明は一本鎖及び二本鎖核酸フラグメントの長さ分布の決定にも使用できる。
本発明に従った分析に適切な核酸サンプルは、50〜10,000bp(又はnt)の間のサイズ範囲、しかし好ましくは約100〜1000bp(又はnt)の範囲内の線状の一本鎖及び/又は二本鎖核酸フラグメントを包含してよい。核酸の供給源は、原核生物、真核生物、ウィルス又は合成物でもよい。供給源材料は、ゲノムDNA、cDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、PNA、LNA、プラスミドDNA、又はウイルスが自然発生しているか、異なる供給源からの核酸のベクターとして働いている場合を含むウィルスDNA若しくはRNA、又はその他でよい。核酸の供給源に依存して、それらは何らかの精製、例えば細胞供給源からの単離、蛋白質からの分離、制限酵素及びPCR阻害剤の除去等を必要とするかもしれない。本方法は複合DNAサンプル、即ち多数の異なる核酸フラグメントを含有するサンプル(例えば全ゲノム又はそのサブセットのフラグメント、及び1以上の個体からのゲノム核酸の混合物等)に適用可能であるため特に有利なことは強調されるべきである。
実施例1及び2に記載される詳細な実施態様において、2D−SDEはssDNA及びdsDNAフラグメントを鎖数及び長さ依存様式の両方で分離するのに使用される。この種類の典型的な実施態様において、分析されるサンプルはフラグメントの長さ分布が50〜10,000bpの間に調製されたゲノムサンプル又はサンプルのプールを包含する。サンプルは次に上述の方法を使用して分析される。2D−SDE分離に続いて一本鎖DNAフラグメントを表す対角線及び元々二本鎖のDNAフラグメントを表す弧を、定量及び/又は単離できる。
本発明に使用される方法及び本発明の有用性は以下の非限定的な実施例及び付随する図によって示すことができる。
λファージDNAを制限酵素NdeIIで消化し、その結果サイズ範囲12〜2225bpの116種類の異なるフラグメントが形成された。消化後サンプルを2つのアリコートに分けた。一方のアリコートを、クレノウフラグメント及びCy5−dCTPを使用してオーバーハングを伸長することにより標識した。他方のアリコートを同じ仕方でCy3−dCTPにより標識した。標識反応後、生成物をGFX PCR及びゲルバンド精製キットを使用して精製した。
2D−SDEの力量をさらに試験するために、実施例1に記載される実験に対応する実験が、今度はCy5及びCy3標識されたNdeII消化ヒトDNAを使用して実施された。ゲノムDNAは全血から単離された(Puregene DNA単離キット、Gentra Systems)。
274bpのDNAフラグメントが、ある個体由来のC−kit遺伝子中のエキソン11から増幅された;この個体は、このエキソン中の9bpの欠失変異のためにヘテロ接合体として知られる。そのような増幅の結果4つの異なるDNAハイブリッドが生じた。2つのホモハイブリッド(265bp及び274bp)、及び各々がセンス又はアンチセンス鎖のいずれかに9塩基バルジを含有する2つの265bpのヘテロハイブリッド。PCR産物をGFX PCR及びゲルバンド精製キットを使用して精製した。
λファージDNA(10μg)を30UのBanI(Amersham Biosciences)により50℃で60分間消化した。これにより中間の複雑さのサンプル(サイズ範囲6〜18362bpの26種類のDNAフラグメント)が作成された。次に、消化されたDNAを実施例1に記載されるようにCy5により標識した。
全血から単離されたDNAサンプルをBstYIで消化し精製した。制限フラグメントにアダプターをライゲートした。アダプター特異的プライマー及び内的なBbsI部位を有するAlu3’特異的プライマーを使用する複合PCRは、WO00/24935(参照することによりそのまま本明細書に組み込まれる)にさらに詳細に記載されるように実施された。結果として得られたAlu3’フラグメントをGFX(商標)カラムを使用して精製した。この複合PCR中の異なるフラグメントの推定数は1〜3×105のオーダーにある。
高純度ウイルス核酸キット(High Pure Viral Nucleic Acid Kit)(Roche)により健康な成体の血漿から遊離核酸を単離した。すべての試薬を5倍量用いた以外は製造者のプロトコルに従った。単離後、特徴付けされていないDNAサンプルをSpeedVacを使用して濃縮した。濃縮されたDNAサンプル(23ng/mL)を実施例1に記載されるように2D−SDEを使用して分離した。2D−SDE分離の後、ゲルをEtBrで染色し、そして実施例3に記載されるように走査した。2D−SDEは、この血漿からの特徴付けされていない核酸サンプルは、様々な長さの一本鎖及び二本鎖DNAフラグメント両方を含有することを明らかにした(図8)。
高レンジRNAラダー(High Range RNA ladder)(200〜6000nt)をFermentasより購入した。このラダーを、含有ランダム6量体によってcDNA合成が開始されるRevertAid H Minus第1鎖cDNA合成キット(First Strand cDNA Synthesis Kit)(Fermentas)を使用して第1鎖cDNA合成にかけた。反応混合物にCy5−dCTPを添加して合成されたcDNA鎖を標識した。第1鎖合成反応後に取り出したサンプルを100bp二本鎖DNAラダー(Fermentas)と混合し、そして2D−SDEを使用して分離した。実施例3に記載されるのと同じ条件及び設定。この混合物は予想されたように大量のRNA:DNAハイブリッドを含有することが2D−SDEで明らかになった(図9)。RNA:DNAハイブリッドを表す特異的な弧が形成された(緑色)。dsDNAを表す弧(赤色)はRNA:DNAの弧の前方に位置していた。
我々は、2D−SDEシステム中での変性後に、ホスホジエステルDNA骨格中にニック又は一本鎖切断を含有する二本鎖DNAフラグメントは、元々の二本鎖DNAフラグメントよりも短い一本鎖DNAフラグメントを生じると仮定した。そのような一本鎖DNAフラグメントは無傷な二本鎖DNAフラグメントを表す弧の前方に泳動するであろう。複合DNAサンプル中の一本鎖切断を検出し定量するツールとして2D−SDEが使用可能かどうかテストするために、以下の実験を実施した。
DNAが特異的なニッキングエンドヌクレアーゼで処理されていると、かなりの量のDNAバンドが、二本鎖DNA分画を表す弧の前方に横たわることが検出された(図10)。
Cy5標識されたλファージDNA(実施例4に記載されるように作製)をフェントン様反応中でH2O2に曝して非特異的な一本鎖切断を形成させた。λファージDNA(228ng)を20μLの0.2mM H2O2(Merck)及び0.4mM CuSO4(Merck)中で、0、1、5、10、20、又は30分間インキュベートした。その次に、反応を1μLの0.5M EDTA(Sigma)添加により停止させた。
λファージDNAを、実施例4に記載されるようにBanIで消化しCy5により標識した。Cy5標識されBanI消化されたλファージDNA(228ng)を、20μLの水中で、4℃又は60℃のいずれかで20時間インキュベートした。
λファージDNAを制限酵素NdeIIで消化し、実施例1に記載されるようにCy5により標識し、そして精製した。このサンプルを1X TE緩衝液中で、4℃で6ヵ月保持した。6ヵ月後に同一の新鮮なDNAサンプルを作製し、これら2つのサンプルを実施例1に記載されるように2D−SDEを使用して分離した。
参考文献
Claims (36)
- 混合物から、一本鎖非環状核酸分子を二本鎖非環状核酸分子から分離する方法であって、以下のステップ:
− 核酸分子のサンプルを提供すること;
− 前記サンプルを電気泳動ゲル中にロードし、そして第1次元において前記サンプルを、二本鎖核酸フラグメントは無傷で残るが一本鎖核酸フラグメントの局所的分子内二次構造を含むコンホメーション相異は最小化される条件を使用し電気泳動して、等しい長さの一本鎖と二本鎖核酸分子を分離させること;
− 前記ゲルを、変性剤と共に、且つ/又はサンプル核酸フラグメントの推定融解温度以上に上昇させた温度でインキュベートすることにより、二本鎖核酸の鎖分離が得られるように前記サンプルを前記ゲル中で変性させること;
− ゲル中の一本鎖と二本鎖核酸の分画を分離するために、二本鎖の再形成を防ぐ条件下で前記ゲルを第2次元において電気泳動すること;
を包含する、前記の方法。 - 二本鎖核酸間のコンホメーション相異は最小化されるが二本鎖核酸フラグメントは無傷で残り、且つ一本鎖核酸フラグメントの局所的分子内二次構造は最小化されるような濃度で、1又はそれを超える変性剤が、第1次元電気泳動に先立ってゲルに添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記の1又はそれを超える変性剤が、メチル、エチル、イソプロピル、n−プロピル、アリル、ブチル、イソブチル、及びアミルアルコール並びにエチレングリコールを含む脂肪族アルコール;シクロヘキシル、ベンジル、フェノール及びp−メトキシフェノールアルコール並びにイノシトールを含む環状アルコール;アニリン、ピリジン、プリン、1,4−ジオキサン、ブチロラクトン及びアミノトリアゾールを含む脂環式化合物;アミド、例えばホルムアミド、エチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、アセトアミド、N−エチルアセトアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、プロピオンアミド、グリコールアミド、チオアセトアミド、バレロラクタム;カルボヒドラジド、1,3−ジメチル尿素、エチル尿素、t−ブチル尿素、チオ尿素及びアリルチオ尿素を含む尿素又は尿素関連化合物;ウレタン、N−メチルウレタン及びN−プロピルウレタンを含むカルバメート;ツイーン40及びトリトンX−100を含む界面活性剤;シアノグアニジン、スルファミド、グリシン、ジメチルスルホキシド及びアセトニトリルより成る群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 1又はそれを超える前記一本鎖及び二本鎖分画内における長さ分布を、それらの分離後に推定することをさらに包含する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 一本鎖及び二本鎖核酸分子の相対量を、それらの分離後に分析することをさらに包含する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の分離された核酸フラグメントの少なくとも一部をゲルから単離するステップをさらに包含する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サンプルが、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、cDNA、PNA、PNA/DNAハイブリッド、又はPNA/RNAハイブリッド、あるいは上述の核酸のいずれかの混合物より選択される核酸フラグメントを包含する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 二本鎖DNA:DNAらせんが二本鎖DNA:RNAハイブリッドから分離される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 核酸サンプルが、1又はそれを超える個体からのゲノム又はトランスクリプトーム由来である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 核酸サンプルが、1又はそれを超える個体から作製されるcDNAを包含する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸サンプルが、1又はそれを超える個体から作製されるゲノム配列のサブセットを包含するゲノム呈示物である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 変性及び再結合に供された核酸サンプルの再結合効率を測定する方法であって、請求項1〜11の方法のステップを包含し、ここにおいて、分離に続いて一本鎖及び二本鎖核酸フラグメントの観察相対量が定量される、前記の方法。
- 核酸増幅後に産生物の鎖数を特徴付ける方法であって、ここにおいて、増幅に続いて一本鎖及び二本鎖核酸分子が請求項1〜11の方法を使用して分離され、ここにおいて、一本鎖及び二本鎖核酸フラグメントの観察相対量が定量され、そして各分画の長さ分布が決定される、前記の方法。
- 第1鎖若しくは第2鎖のいずれか、又は両方のcDNA合成効率を推定する方法であって、ここにおいて、cDNA合成に続いてcDNAサンプルが請求項1〜11の方法を使用して分離され、ここにおいて、一本鎖cDNA、二本鎖cDNA及びRNA:DNAハイブリッドの量;並びに3つの分画各々の長さ分布が、鎖数依存分離によって明らかになる、前記の方法。
- 核酸サンプルを均等化する方法であって、請求項1の方法によって前記サンプル中の一本鎖と二本鎖核酸分子を分離することを包含し、そしてさらに一本鎖cDNA、二本鎖核酸の量及び両分画の長さ分布を推定し、そして均等化された材料を得るためにゲルから一本鎖分画を単離する、前記の方法。
- 複合DNAサンプルからバルジ含有DNAフラグメントを検出する方法であって、サンプルをバルジ含有二本鎖核酸分子中のバルジ鎖を切断する作用因子で処理すること、続いて請求項1の方法により一本鎖と二本鎖核酸分子を分離することを包含し、ここにおいて、バルジ含有DNAフラグメントの存在が鎖数依存分離によって明らかになる、前記の方法。
- 複合核酸サンプル中の一本鎖切断を検出する方法であって、請求項1の方法を包含し、ここにおいて、切断を含有する鎖が、変性ステップの後に2又はそれを超えるフラグメントを生じ、それらは等しい長さの二本鎖分子由来の無傷な鎖よりも短く、そしてそれにより切断を持たない核酸フラグメントから分解される、前記の方法。
- 複合核酸サンプルを変異走査する方法であって、以下:
− 1又はそれを超える個体からの核酸サンプル/プールを提供すること、
− 二本鎖が分離するようにDNAサンプル/プールを変性すること、
− 相同鎖を包含する核酸ヘテロ二重鎖を形成するよう前記サンプル/DNAサンプルのプールを再結合すること、
− 再結合された核酸二重鎖の前記混合物を、ミスマッチにおいて一本鎖切断を特異的に誘導するような作用因子で処理すること、
− 一本鎖切断を含有する二重鎖を無傷な二重鎖から、請求項17の方法により分離すること、
を包含する、前記の方法。 - 複合核酸サンプル中の損傷を検出する方法であって、以下:
− 1又はそれを超える個体からの核酸を包含する核酸サンプルを提供すること、
− 核酸二重鎖の前記サンプルを、損傷の存在下で一本鎖切断を特異的に誘導するような酵素又は作用因子で処理すること、
− 一本鎖切断を含有する二重鎖を、無傷な二重鎖から請求項17の方法により分離すること、
を包含する、前記の方法。 - 請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法を使用するためのキットであって、既知の異なる長さの一本鎖核酸分子及び既知の異なる長さの二本鎖核酸分子を包含し、そして所望によりサンプルが終点まで電気泳動されたことを指示するため電気泳動の間核酸分子の前方を泳動する検出可能なマーカーを包含する内的標準を包含する、前記のキット。
- 電気泳動に適切なサンプル緩衝溶液、又は乾燥型若しくは半乾燥型で提供され水で再コンディションすることにより適切なサンプル緩衝溶液を生成する緩衝液成分を包含する、請求項20に記載のキット。
- 前記の一本鎖及び二本鎖分子が検出可能なマーカーで標識されている、請求項20に記載のキット。
- 前記の一本鎖及び二本鎖分子の各分画が異なる検出可能なマーカーで標識されている、請求項22に記載のキット。
- 電気泳動後、前記核酸をゲルマトリックス中で検出可能にするために、ゲルマトリックス中の1又はそれを超える分離された分画中の核酸分子に結合する検出剤を包含する、請求項20〜23のいずれか1項に記載のキット。
- 前記方法において第1次元電気泳動に適切なゲルの作製のために、ゲルキャスティングのための変性剤及び化学薬品を包含する、請求項20〜24のいずれか1項に記載のキット。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法に従う二次元電気泳動のために適切に作製されたプレキャスト電気泳動ゲルを包含する、請求項20〜24のいずれか1項に記載のキット。
- 第1次元電気泳動後第2次元電気泳動に先立ってゲルを処理するために適切な作用因子をさらに包含する、請求項19〜26のいずれか1項に記載のキット。
- 請求項1に記載の方法を実施するための電気泳動システムであって、以下:
− 支持プレートの間に挟まれたゲルを支持する電気泳動カセット、
− 前記電気泳動カセットを適合させる区画及びサンプルを前記カセットに導入するためのサンプルポートを備える電気泳動装置、
− 電力が電極に加えられると、挿入されたカセット中のゲルを横切る第1電場を維持する第1組の電極、
− 電力が電極に加えられると、前記第1電場に対して本質的に直交して、ゲルを横切る第2電場を維持する第2組の電極、
− 前記ゲルに熱を供給し、そして前記ゲルを実質的に予め定めた温度で維持するために、前記区画において加熱表面を有する加熱手段
を包含する、前記のシステム。 - 請求項28に記載の電気泳動システムであって、発電器及び前記システムの操作を制御するためのコンピュータソフトウェアがインストールされたコンピュータをさらに包含し、前記制御は、ある期間前記第1組電極に第1電圧を加えること(その間ゲルは第1の予め定めた温度に維持される);ある期間ゲルの温度を第2の予め定めた温度に上昇させること;そしてある期間前記第2組電極に第2電圧を加えること;を包含する、前記の電気泳動システム。
- システムが、少なくとも75℃の操作温度を維持し耐えられるように成型される、請求項28又は29に記載の電気泳動システム。
- システムが、少なくとも90℃の操作温度を維持し耐えられるように成型される、請求項30に記載の電気泳動システム。
- システムが、10cm2よりも小さいサイズのマイクロゲルと操作されるように成型されるマイクロシステムである、請求項28〜31のいずれか1項に記載の電気泳動システム。
- 請求項28〜32のいずれか1項に記載される電気泳動システムであって、請求項1の方法により電気泳動されたゲルを、適切な検出剤で染色された前記ゲルの数値化された画像に基づいて分析するためコンピュータにインストールされたコンピュータソフトウェアをさらに包含し前記コンピュータソフトウェアは、コンピュータによって実行されると、以下:
− 内的標準に対応するスポットの検出、
− 染色された領域の検出及び前記領域の境界の決定、
− 内的標準スポットの位置に基づく、検出領域の一本鎖又は二本鎖核酸への割り当て、
− 電気泳動されたゲル中の一本鎖対二本鎖核酸の比率を決定するための、検出領域の密度の推定及び積分、
を行うためのステップを実施するコードを包含する、前記のシステム。 - 前記コンピュータソフトウェアが、検出された分画領域のゲル画像内の空間的な分布に基づいて、1又はそれを超える分離された分画の長さ分布を推定するステップを実施するようなコードをさらに包含する、請求項33に記載のシステム。
- 二次元電気泳動ゲルの画像を分析して前記ゲル中で動くサンプル中の一本鎖と二本鎖核酸の比率を決定するために、コンピュータにインストール可能なコンピュータプログラム製品であって、コンピュータにインストールされ実行されると、以下:
− 前記サンプル中の、既知の異なる長さの一本鎖及び二本鎖核酸両方を包含する内的標準を定義する入力値の受け取り、
− 前記画像中の前記内的標準に対応するスポットの検出、
− 染色された領域の検出及び前記領域の境界の決定、
− 内的標準スポットの位置に基づく、検出領域の一本鎖又は二本鎖核酸への割り当て、
− 電気泳動されたゲル中の一本鎖対二本鎖核酸の比率を決定するための、検出領域の密度の推定及び積分、
を行うためにコンピュータプロセッサを指図するプログラム指図手段を包含する、前記のコンピュータプログラム製品。 - コンピュータにインストールされ実行されると、1又はそれを超える前記一本鎖及び二本鎖分画内の長さ分布を推定するためにコンピュータプロセッサを指図するプログラム指図手段をさらに包含する、請求項35に記載のコンピュータプログラム製品。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017037029A (ja) * | 2015-08-12 | 2017-02-16 | 日本電信電話株式会社 | 生体分子移動度制御方法および電気泳動槽 |
JP2022048163A (ja) * | 2016-07-19 | 2022-03-25 | 株式会社バイオダイナミクス研究所 | 長鎖一本鎖dnaを調製する方法 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120070830A1 (en) * | 2010-09-16 | 2012-03-22 | lbis Biosciences, Inc. | Stabilization of ozone-labile fluorescent dyes by thiourea |
GB201102385D0 (en) | 2011-02-10 | 2011-03-30 | Biocule Scotland Ltd | Two-dimensional gel electrophoresis apparatus and method |
WO2020086366A1 (en) * | 2018-10-22 | 2020-04-30 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Methods for separating large nucleic acids under denatured conditions |
CN111855982B (zh) * | 2019-04-25 | 2022-07-22 | 武汉华大医学检验所有限公司 | 检测核酸片段长度的方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02104299A (ja) * | 1988-05-02 | 1990-04-17 | Nederland Centr Org Toegepast Natuur Onder | 遺伝的変異を検出する方法 |
WO2003070943A1 (en) * | 2002-02-25 | 2003-08-28 | Lifeind Ehf. | Methods for two-dimensional conformation-dependent separation of non-circular nucleic acids |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6147198A (en) * | 1988-09-15 | 2000-11-14 | New York University | Methods and compositions for the manipulation and characterization of individual nucleic acid molecules |
US5074980A (en) * | 1989-11-29 | 1991-12-24 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method of characterizing polynucleotides |
US5162514A (en) * | 1990-05-15 | 1992-11-10 | Board Of Regents, University Of Texas | High molecular weight dna compositions for use in electrophoresis of large nucleic acids |
US5212299A (en) * | 1991-05-10 | 1993-05-18 | Fmc Corporation | Glyceryl agarose and borate compositions |
EP0880537B1 (en) * | 1996-02-14 | 2004-12-15 | bioMerieux B.V. | Isolation of single stranded nucleic acids |
AU1676597A (en) * | 1996-02-14 | 1997-09-02 | Amsterdam Support Diagnostics B.V. | Separation of single stranded and double stranded nucleic acid materials |
AU2803397A (en) * | 1996-04-17 | 1997-11-07 | Ramot University Authority For Applied Research And Industrial Development Ltd. | Method and kit for detecting genomic instability |
WO1998044156A1 (en) * | 1997-03-27 | 1998-10-08 | Life Technologies, Inc. | Nucleic acid ladders |
DE69842088D1 (de) * | 1997-07-15 | 2011-02-17 | Life Technologies Inc | Nukleinsäureleitern |
US6210931B1 (en) * | 1998-11-30 | 2001-04-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Ribozyme-mediated synthesis of circular RNA |
WO2002010182A2 (en) * | 2000-08-02 | 2002-02-07 | Applera Corporation | Methods for isolating one strand of a double-stranded nucleic acid |
EP1379864A1 (en) * | 2001-04-17 | 2004-01-14 | Nextgen Sciences Ltd | Electrophoretic separation system |
AU2003202183A1 (en) * | 2002-01-11 | 2003-07-24 | Lusesi AB | Method and computer program for digital image processing for two-dimensional electrophoresis |
AU2003279697A1 (en) * | 2002-05-17 | 2004-02-16 | Nugen Technologies, Inc. | Methods for fragmentation, labeling and immobilizaton of nucleic acids |
-
2005
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02104299A (ja) * | 1988-05-02 | 1990-04-17 | Nederland Centr Org Toegepast Natuur Onder | 遺伝的変異を検出する方法 |
WO2003070943A1 (en) * | 2002-02-25 | 2003-08-28 | Lifeind Ehf. | Methods for two-dimensional conformation-dependent separation of non-circular nucleic acids |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017037029A (ja) * | 2015-08-12 | 2017-02-16 | 日本電信電話株式会社 | 生体分子移動度制御方法および電気泳動槽 |
JP2022048163A (ja) * | 2016-07-19 | 2022-03-25 | 株式会社バイオダイナミクス研究所 | 長鎖一本鎖dnaを調製する方法 |
JP7305812B2 (ja) | 2016-07-19 | 2023-07-10 | 株式会社バイオダイナミクス研究所 | 長鎖一本鎖dnaを調製する方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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