JP2008507545A - NF−κBの阻害 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願では、その内容が本明細書中に参考として援用される、2004年7月20日に提出された米国仮特許出願番号60/589,637の利益を主張する。
(1.発明の分野)
本発明は、細胞増殖またはアポトーシスの調節に広く関係する。さらに具体的には、本発明は、細胞増殖またはアポトーシスの調節のための組成物、その使用方法、およびその同定方法に関係する。
ヒトにおけるガンの頻度は、先進国世界においては集団の年齢が上がるとともに増大する。いくつかのタイプのガンと診断時の病期については、広く研究されているにもかかわらず、罹患率および死亡率は、近年、有意には改善されていない。プログラムされた細胞死、すなわち、アポトーシスの誘導は、最も興味深いガンの治療方法の1つである。
NF−κB活性に関連する状態は、NF−κBのインヒビターを含む組成物をその必要がある患者に投与することによって処置することができる。NF−κB活性は構成的である場合も、誘導されたものである場合も、または基底レベルである場合もある。NF−κBの阻害によってp53が活性化される場合もある。NF−κBの阻害によって機能的にサイレントであるp53が活性化させられる場合もある。処置される状態は、ガン、炎症、自己免疫疾患、対宿主性移植片病、HIV感染に関連する状態、または構成的に活性なNF−κBに依存して獲得された前ガン細胞であり得る。処置することができるガンの形態としては、腎細胞ガン、肉腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、骨髄腫、骨髄性白血病およびリンパ芽球性白血病、神経芽細胞腫、膠芽細胞腫、HTLV感染によって引き起こされるガンが挙げられるがこれらに限定はされない。
R1は、Hまたはハロゲンであり;
R2は、Hまたは必要に応じて置換されたアルコキシであり;
R3は、Hまたは必要に応じて置換されたアルコキシであり;そして
R4は、Hまたは必要に応じて置換された脂肪族、アリール、もしくは複素環である。
本発明の化合物、生成物、および組成物、ならびに方法を開示し、そして記載する前に、本明細書中で使用される専門用語は特定の実施形態を記載する目的のためだけのものであり、限定するようには意図されないことが理解される。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「a」、「an」、および「the」には、その状況が他の場所で明確に示されない限りは複数形についての言及も含まれることに留意されなければならない。
用語「分岐している」は、本明細書中で使用される場合は、1個から24個までの骨格原子を含む基を意味し、ここでは、この基の骨格鎖には主鎖からの1つ以上の従属する分岐を含む基が含まれる。本明細書中の好ましい分岐している基には1個から12個までの骨格原子が含まれる。分岐している基の例としては、イソブチル、t−ブチル、イソプロピル、−CH2CH2CH(CH3)CH2CH3、−CH2CH(CH2CH3)CH2CH3、−CH2CH2C(CH3)2CH3、−CH2CH2C(CH3)3などが挙げられるがこれらに限定はされない。
本発明は、NF−κB活性を阻害することにより機能的にブロックされたp53を有しているガン細胞においてp53が活性化される場合があるという発見に関係する。腫瘍中のp53経路の不活化は、p53変異よりもはるかに広い範囲の現象である。腫瘍が野生型p53を維持していてもなお、その機能は通常は完全であるか、または一部が失われているかのいずれかである。これらの場合には、そのようなガンの中のp53は薬理学的再活性化のための標的と見ることができるので、治療の観点から特に興味深い。p53活性が組織特異的機構によってブロックされているいくつかのタイプの腫瘍が存在している。したがって、Hdm2の過剰発現は肉腫において特に頻度が高く、一方、ヒトパピローマウイルスのE6は大部分の子宮頸ガンにおいてp53を不活化する。RCCは、この種類の腫瘍の別の例を提供し、これは、本発明者らによって最近報告されたように、RCCの中の野生型p53が、おそらくは組織特異的である未知の優勢な機構によって抑えられているので、とりわけ興味深い分析対象である。したがって、p53の再活性化は、この、これまでのところは治療不可能な形態のガンの処置のため、ならびに、p53を不活化させるための同様の機構を有している他のガンの処置についての興味深い方針であると考えられている。
アミノアクリジンは、NF−κB活性を阻害するために使用することができる物質の代表的な例である。アミノアクリジンは以下の式であり得る:
R1は、Hまたはハロゲンであり;
R2は、Hまたは必要に応じて置換されたアルコキシであり;
R3は、Hまたは必要に応じて置換されたアルコキシであり;そして
R4は、Hまたは必要に応じて置換された脂肪族、アリール、もしくは複素環である。
本発明は、アミノアクリジンと必要に応じて化学療法剤を含む組成物に関係する。本発明はまた、アミノアクリジンと必要に応じてTNFポリペプチドを含む組成物にも関係する。
化学療法剤は、アポトーシスを誘導する任意の薬理学的物質または化合物であり得る。薬理学的物質または化合物は、例えば、有機低分子、ペプチド、ポリペプチド、核酸、または抗体である場合もある。
TNFポリペプチドは、リガンドのTNFスーパーファミリーのメンバーであり得る。TNFポリペプチドの代表的な例としては、NGF、CD40L、CD137L/4−1BBL、TNF−α、CD134L/OX40L、CD27L/CD70、FasL/CD95、CD30L、TNF−β/LT−α、LT−β、およびTRAILが挙げられるがこれらに限定はされない。TNFスーパーファミリーのメンバーは、免疫系の維持および機能に関係しており、そしてアポトーシスを誘発することができる、自然界に存在しているタンパク質である。TNFポリペプチドはTRAILである場合もあり、これは、主に腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するが、正常な細胞では誘導しない。
組成物の有効成分は、種々の薬学的に許容される塩の形態で有用であり得る。用語「薬学的に許容される塩」は、薬剤師に明らかである塩の形態、すなわち、実質的に非毒性であり、所望される薬物動態特性、おいしさ、吸収、分布、代謝、または排せつの特性を提供するものを意味する。より実際的には、選択においてもまた重要である他の要因は、原材料費、結晶化の容易さ、収量、安定性、吸湿性、および得られるバルクの薬物の流動性である。好都合なことに、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて有効成分から、またはそれらの薬学的に許容される塩から調製され得る。
組成物にはさらに、1つ以上の薬学的に許容される別の成分(単数または複数)(例えば、ミョウバン、安定剤、抗微生物剤、緩衝液、着色剤、香味剤、アジュバントなど)が含まれる場合がある。
ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、および水素化食用脂が挙げられるがこれらに限定はされない。乳化剤としては、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン、およびアカシアが挙げられるがこれらに限定はされない。非水性媒体としては、食用油脂、アーモンド油、ヤシ油、油性のエステル、プロピレングリコール、およびエチルアルコールが挙げられるがこれらに限定はされない。保存剤としては、メチルまたはプロピルp−ヒドロキシ安息香酸、およびソルビン酸が挙げられるがこれらに限定はされない。
組成物は、アミノアクリジンをそれを必要としている患者に投与することにより、インビボでNF−κB活性を伴う状態を処置するために使用され得る。NF−κB活性は、任意のレベルであり得、その低下によって状態の処置が導かれる。NF−κB活性はまた基底レベルである場合もある。NF−κB活性はまた、構成的なレベルである場合もある。NF−κB活性はまた、誘導された構成的なレベルである場合もある。
組成物は、化学療法および放射線治療のような他の抗ガン治療と同時に、またはそれと一緒に一定の間隔で(metronomically)投与することができる。用語「同時」または「同時に」は、本明細書中で使用される場合は、他の抗ガン治療および組成物が、互いに48時間、24時間、12時間、6時間、3時間またはそれ未満の間に投与されることを意味する。用語「一定の間隔で」は、本明細書中で使用される場合は、化学療法とは別のタイミングでの、そして反復投与および/または化学療法の投薬計画に関連して一定の頻度での組成物の投与を意味する。
治療での使用に必要な薬剤の治療有効量は、処置される状態の性質、活性が所望される時間、ならびに、患者の年齢および状態に応じて変化し、最終的にはかかりつけの医師によって決定される。所望される用量は、好都合には、単回投与で、または例えば、1日に1回、2回、3回、4回、またはそれ以上に分けられた用量として適切な間隔で投与される複数回投与として投与され得る。複数回投与が多くの場合に所望、または必要とされる。
組成物はまた、患者の腫瘍を組成物によって処置することができるかどうかを診断するために使用することもできる。腫瘍の試料は患者から得ることができる。腫瘍の細胞には、その後、p53レポーターシステム(例えば、p53応答性lacZレポーター)が形質導入され得る。形質導入された細胞は、その後、組成物とともにインキュベートされる。対照を上回るp53によって媒介されるシグナルの生産は、腫瘍を組成物で処置できることを示す。
本発明はまた、NF−κB活性を調節する物質を同定する方法にも関する。NF−κB活性を調節する物質は、NF−κB活性の調節因子の候補を細胞をベースとするNF−κBによって活性化される発現システムに対して加えることを含む方法によって同定することができる。ここでは、NF−κB活性の調節因子は、NF−κBによって活性化された発現のレベルを変化させる能力によって同定される。NF−κB活性を調節する物質はまた、NF−κB活性の調節因子の候補を、細胞をベースとするp53によって活性化される発現システムに対して加えることを含む方法によっても同定することができる。ここでは、NF−κB活性の調節因子は、p53によって活性化させられる発現のレベルを変化させる能力によって同定される。NF−κB活性を調節する物質はまた、NF−κBまたはp53によって活性化される発現システムに対して、アミノアクリジンとNF−κB活性の調節因子の候補を添加すること、NF−κBまたはp53によって活性化された発現のレベルを対照と比較することを含む方法によって同定することもできる。ここでは、NF−κB活性の調節因子は、NF−κBまたはp53によって活性化される発現システムのレベルを対照と比較して変化させる能力によって同定される。
(細胞)
使用した腎細胞ガン細胞株、RCC45、RCC54、およびACHNは、Gurova et al.,(2004).Cancer Res 64,1951−1958に記載されている。H1299、HT1080、MCF7、LNCaP、PC3、DU145、HCT116、SK−N−SH、W138細胞は、ATCCから入手した。正常な腎臓上皮細胞(NKE)の初代培養物は、J.Didonato(Cleveland Clinic Foundation,OH)から提供された。リー−フラウメニ癌症候群の患者に由来する041線維芽細胞株は、G.Starkから提供された。Mel7およびMel29細胞は、Kichina et al.,(2003).Oncogene 22,4911−4917に記載されている黒色腫細胞株である。全ての細胞を、10%のFBS、1mMのピルビン酸ナトリウム、10mMのHepes緩衝液、55nMのβ−メルカプトエタノールと、抗生物質を補充したRPMI 1640培地の中で維持した。
p53、Arf発現ベクター、pBabeH1−siHdm2、p21−ConALucレポータープラスミドは、Gurova,et al.,(2004).Cancer Res 64,1951−1958に記載されている。pNF−κBLucプラスミドは、N.Neznanov(Cleveland Clinic Foundation,ref.59)によって提供された。pss−IκBを発現するpCDNA3ベクターは、I.Budunova(Northwestern University)によって提供された。siRNAの発現のためのpBabeH1−sip53およびpBabeH1−siGFPベクターは、Gurova,et al.,(2004)Cancer Res 64,1951−1958に記載されているpBabeH1−siHDM2ベクターと同様に、siRNAの発現のためのH1プロモーターと64オリゴヌクレオチドループ鋳型を、pBabeH1−puroベクターの左のLTRに挿入することによって作成した。p53およびGFPに対するsiRNAの配列は、Brummelkamp,et al.,(2002).Science 296,550−553に記載されている。p53またはGFPの発現のためのレンチウイルスプラスミドは、Gurova,et al.,(2004).Cancer Res 64,1951−1958に記載されている。
34,000種類の化合物のDiverSetライブラリーは、Chembridge,Inc.から入手した。30d9および9AAの周辺の集中的ライブラリーは、Chembridge,Inc.から提供された。全ての他の化合物はSigmaより入手した。
60mmのプレートにプレートしたパッケージング細胞(ClontechによるA293)を、製造業者による推奨にしたがってLipofectamin Plus(Invitrogen)を使用して2μgのレトロウイルスベクターDNAでトランスフェクトした。培地を8時間後に交換した。8μg/mlのポリブレン(Polybrene(Sigma))を補充したウイルスを含む培地を、トランスフェクションの24時間後および48時間後に回収し、そして感染のために使用した。ウイルスが形質導入された細胞を、感染していない細胞を完全に死滅させることができる適切な選択物質(ベクターに応じて、G418、ハイグロマイシン、またはピューロマイシン)に対する耐性について選択した。
2×104個のRCC45ConALacZ細胞を、標準的な添加剤を含む200μLのフェノールレッドを含まないRPMI培地中の96ウェルプレートのウェルにプレートした。一晩のインキュベーションの後、対照を伴うDMSO溶液中で化合物のライブラリーを、プラスチック製の細菌増殖装置(bacterial replicator)(200+/−100mL)の助けを借りて添加した。化合物の最終濃度はおよそ5μg/mlであった。ネガティブ対照はDMSOとし、ポジティブ対照はドキソルビシン溶液(0.2、0.6、および2μM)とした。24時間後、ONPGを含む溶解緩衝液を、氷上の培地に直接添加した。37℃で3時間のインキュベーションの後、β−ガラクトシダーゼ活性を、λ=430mmでのWallack 1420プレートリーダー(Perkin Elmer)の吸光度の読取値から概算した。ドキソルビシンの最も有効な濃度よりも強いONPG反応を誘導した全ての化合物を、最初のヒットと考えた。
同時トランスフェクションの準備のために、2×105個の細胞を6ウェルプレートにプレートし、そして一晩のインキュベーションの後、種々の濃度のp53、Arf、Ss−IκB、またはsiHDM2を発現するプラスミドと組み合わせた0.5μgのレポータープラスミド(p21−ConALucまたはpNF−κBLuc)を、Lipofectamin Plus試薬(Gibco BRL)を用いてトランスフェクトした。対応する空のベクターを、2μgまでの量の全DNAで、全てのトランスフェクションに加えた。トランスフェクション効率の正規化を0.2μgのpCMV−LacZプラスミドを添加することによって行った。ルシフェラーゼ活性とβ−ガラクトシダーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)またはβ−ガラクトシダーゼ酵素システム(Promega)によって、細胞溶解緩衝液(Promega)でのトランスフェクションの48時間後に調製した溶解物中で測定した。発光反応と比色反応を、Wallack 1420プレートリーダー(Perkin Elmer)で読み取った。組み込まれたレポーターの準備。レポーターが組み込まれている2×104個の細胞を96ウェルプレートにプレートした。一晩のインキュベーションの後、化合物またはレンチウイルスを生産する細胞による培地を添加した。様々なタイミングで細胞溶解物を、レポーター溶解緩衝液(Promega)を使用して調製した。ルシフェラーゼ活性またはβ−ガラクトシダーゼ活性、およびタンパク質濃度を、標準的なキット(Promega,Luciferase and β−galactosidase assay systems,Biorad Protein Assay Kit)を使用して細胞溶解物のアリコートの中で測定した。
5×103個の細胞を6ウェルプレートにプレートし、様々な濃度の薬物で24時間処理した。その後、薬物を含まない新しい培地を添加した。コロニーの数を、インキュベーションの5〜6日後に概算した。細胞の生存率は、未処理の対照と比較した、処理した細胞のメチレンブルー染色の強度の割合として概算した(染色したコロニーからメチレンブルーを0.1%のSDSによって抽出し、そして分光光度計で定量した)。
106個の細胞を100mmのプレートにプレートし、そして一晩のインキュベーションの後、種々の濃度の9AAまたはドキソルビシンを添加した。インキュベーション時間の終了後、細胞を回収し、固定し、ヨウ化プロピジウムで染色した。DNA含有量をFACScalibur(Becton Dickinson)を使用して測定し、CellQuestソフトウェアを使用して分析した。
細胞を、1mMのPMSF(Sigma)、10μg/mlのアプロチニン(Sigma)、および10μg/mlのロイペプチン(Sigma)を含むRIPA緩衝液(25mMのTris HCl、pH7.2、125mMのNaCl、1%のNP40、1%のデオキシコール酸ナトリウム、1mMのEDTA)中で溶解させた。タンパク質濃度を、BioRad Dcタンパク質アッセイキットを用いて決定した。等量のタンパク質を4〜20%の勾配のプレキャストゲル(Novex)上で泳動させ、PVDF膜(Amersham)上にブロットした。以下の抗体を使用した:抗p53モノクローナルマウスDO1(Santa−Cruz)、抗p21モノクローナルマウスF−5(Santa−Cruz)、抗mdm2モノクローナルマウスSMP14(Santa−Cruz)。p53のリン酸化状態を、製造業者による推奨にしたがって、Cell signalingによるホスホ−p53サンプラーキット、抗p65(C20、Santa Cruz)、抗ホスホ−p65(ser536,Cell Signaling)、抗IκBa(C21,Santa Cruz)、抗p50(NLS,Santa Cruz)を使用して分析した。HRP結合二次抗体はSanta−Cruzから購入した。データの定量はQuantity One(BioRad)を使用して行った。
チャンバースライドの中の細胞をPBSで洗浄し、そこで室温の10%のリン酸緩衝化ホルマリン、−20℃の100%のメタノール、および−20℃のアセトンで固定した。その後、スライドをPBS中の3%のBSA、0.1%のTriton X100の溶液中で1時間ブロックした。抗p65抗体(C−20、Santa−Cruz)を、ブロッキング溶液中で1μg/mlの濃度で添加した。二次抗ウサギCy2結合抗体(Sigma)を使用した。全ての洗浄は、ブロッキング溶液を用いて行った。
HT1080細胞を、0.02から0.04mCi/mLの[14C]チミジン、比活性53mCi/mmol(Amersham)で24時間標識した。標識したHT1080細胞を、種々の濃度のエトポシド(VP−16)、アムサクリン(m−AMSA)、または9−アミノアクリジンで1時間処理した。トポIIによって媒介されるDNAの切断の誘導を、SDS−KCl技術の改良を使用してタンパク質DNA複合体の沈殿を測定することによって決定した。
プロテアソームアッセイキットは、Boston Biochem,Inc.から購入し、製造業者による推奨にしたがって使用した。
核抽出物は、Chernov,et al.,(1997).Oncogene 14,2503−2510に記載されているように調製した。NF−κB結合部位に相当するアニーリングしたオリゴヌクレオチド(Santa−Cruz)を、Klenowポリメラーゼによって[α−32P]dCTPで、その後、T4ポリヌクレオチドキナーゼによって[γ−32P]dATPで放射標識した。107cpmの標識したオリゴヌクレオチドを、Probe Quantカラム(Amersham)上でアフィニティー精製した。放射標識したオリゴヌクレオチドを、非特異的結合を防ぐための1μgのポリ−dIdC(Amersham)とともに、10μgのタンパク質核抽出物に対して添加し、そして室温で30分間インキュベートした。スーパーシフトのために、200ngの抗p65、抗p50、または抗−抗体を反応に添加した(全ての抗体はSanta Cruzによる)。30分間のインキュベーションの後、反応混合物の全てを0.5×TBE緩衝液中の4%のポリアクリルアミドゲルにロードし、200Vで2時間泳動した。乾燥させたゲルをX線フィルムに対して30分から1時間露光させた。
5〜6週齢の雄のNIH Swiss無胸腺ヌードマウスをHarlanから購入した。5×106個の腫瘍細胞を100μLのPBSの中でマウスの脇腹に接種した。腫瘍が5mmの直径に達した時点で、薬物の腹腔内注射を、PBS中の50%のDMSOの100μlの溶液の中で開始した(PBSに溶解させたキナクリンを除く)。媒体として、PBS中の50%のDMSOを使用した。腫瘍の大きさを一日おきに三次元で測定した。
(RCC細胞をベースとする、p53活性化物質の単離のための読み出し)
p53のトランス活性化機能は、まだ知られていないインヒビターによってRCC細胞の中で阻害され、このことは、このタイプの腫瘍細胞、さらにはp53と同様の阻害を有している他の腫瘍細胞を選択的に死滅させるためのアプローチとしての、薬物によって媒介されるp53機能の回復を示唆している。p53の再活性化がRCC細胞に対して毒性であるかどうかを試験するために、本発明者らは、インヒビターを枯渇させる試みにおいて5種類のRCCに由来する細胞株においてp53を異所で発現させた。細胞を、p53の再活性化をモニターするためのp53応答性レポーター(ConALacZ)を組み込んで補った。p53 cDNAを、CMVプロモーターを有しているレンチウイルスベクターを使用して形質導入した。p53欠損肺腺ガン細胞株H1299(これは野生型p53に対して反応性である)およびラットの繊維芽細胞様細胞株Rat1(これは、ヒトp53に対して耐性である)を対照として使用した。
(化合物のライブラリーのスクリーニングによるRCCの中での強力なP53活性化因子としてのアミノアクリジンの同定)
本発明者らは、RCC特異的p53の抑制の機構を解明するためのツールとしてもまた使用することができる治療可能性を有している低分子を単離するために、RCC中のp53トランス活性化を回復することができる化合物の細胞をベースとする直接のスクリーニングを行った。RCC45ConALacZ細胞を、34,000種類の化合物の様々な化学的ライブラリーをスクリーニングするために使用した(Chembridge Corporation)。β−ガラクトシダーゼ活性を、化合物とのインキュベーションの24時間後に細胞溶解物中で測定した。1μMのドキソルビシンよりも高いβ−ガラクトシダーゼ活性を誘導した28種類の化合物を、最初のヒットと考えた(図2a)。最も活性のあった化合物(化合物30d9)は、RCC45細胞中のレポーターの22倍の誘導を生じ、これは、ドキソルビシンよりも7倍強く作用した。化合物30d9の近くで構築した、40種類の化合物からなる構造アナログのライブラリーを、同じ細胞をベースとするレポーターアッセイを使用してスクリーニングした。化合物1の式の2つの物質が活性であることが明らかになった。
(アミノアクリジンは種々の細胞型におけるp53の強力な活性化因子である)
9AAは、RCC45細胞中でのp53レポーター遺伝子の誘導だけではなく、p21/Waf1およびHdm2のタンパク質レベルの分析によって判断される内因性p53応答性遺伝子の誘導においても、ドキソルビシンよりもはるかに強かった(図3aおよびb)。興味深いことに、p53経路が極めて活性であるMCF7細胞においては、9AAの効果はドキソルビシンよりも弱かった(図3aおよびb)。
(アミノアクリジンは野生型p53を有している腫瘍に対しては毒性がある)
p53の活性化がp53依存性細胞傷害性に形を変えるかどうかを試験するために、本発明者らは、p53の状態が異なる細胞の生存率に対する9AAの効果を比較した。この目的のために、本発明者らは、抗p53を発現する構築物または対照であるsiRNAを発現する構築物のいずれかを発現する同系の対である細胞株のシリーズを作成した。siRNAによるp53のダウンレギュレーションの程度を、ウェスタン免疫ブロッティングによって試験した。試験した全ての細胞変異体に対して9AAが毒性を有していることが明らかになった。しかし、これはp53の発現が低下している細胞に対しては毒性が低く、HT1080細胞においては極大差が観察された(図4aおよびb)。
(アミノアクリジンをベースとする薬物はインビボで抗腫瘍効果を有している)
アミノアクリジンのインビボでの抗腫瘍効果を、それらのp53状態が異なり、そしてヌードマウスにおいて皮下で増殖させたp53ルシフェラーゼレポーターを有しているHT1080細胞を使用して、異種移植腫瘍モデルにおいて試験した。腫瘍細胞中でのp53依存性ルシフェラーゼレポーターの活性を、インビボでの9AAの生体利用性を試験するために使用した。9AAおよびキナクリンはいずれも、腫瘍中のp53を活性化させることができ(図5a)、そしていずれの化合物も、上記の実験と同様の特性を示した(データは示さない)。
(アミノアクリジンによって媒介されるp53の活性化の機構)
本発明者らは、最初に、アミノアクリジンがp53を誘導する化合物についての周知の作用機構であるDNAの損傷を通じてp53を活性化させるかどうかを試験した。9AA誘導体の1つであるamsaはトポイソメラーゼIIの毒性を介してDNAの損傷を引き起こすので、本発明者らは、トポイソメラーゼIIの別のインヒビターであるamsaおよびエトポシドと比較して、9AAがインビトロではトポイソメラーゼII活性に対して効果がないことを試験し、明らかにした(図6a)。さらに、9AAは、DNAの切断に感受性であるキナーゼ(ATM、ATRなど)を介してp53を活性化するDNAを損傷させる薬物から予想することができるように、p53のリン酸化状態には影響は与えなかった。ポジティブ対照としてこれらの実験で使用したドキソルビシンは、p53のリン酸化を誘導し、このことによって、上流のp53によるシグナル伝達がRCCにおいて機能的であることが確認された(図6b)。この結果は、様々なタイプのDNAの損傷によってはRCC中のp53は活性化させられないことを示す以前の結果とともに、アミノアクリジンがDNAの損傷とは異なる機構によってp53を活性化させることを示している。
(アミノアクリジンはNF−κBを阻害する)
実施例6に示したように、9AAによってIκBの分解は予想外に誘導された。これらの結果に基づいて、本発明者らはNF−κβ経路に対するアミノアクリジンの可能性のある効果に焦点をあてた。本発明者らは、NF−κBの転写活性に対する9AAの効果を試験するために、NF−κB応答性レポーターが組み込まれているp53ヌルH1299細胞を使用した。本発明者らは、9AAとキナクリンはいずれも、レポーターの基底の活性およびTNF−によって誘導される活性を阻害したことを明らかにした(図7a)。これらは、TNFでの刺激前(−24〜0時間)、TNFでの刺激と同時(0時間)、またはTNFでの刺激の後(0〜6時間)に添加された場合に有効であった(データは示さない)。これらはまた、NF−κBフィードバック調節ループの不可欠な部分であるIκBのTNFによって刺激される誘導も阻害した(図7b)。驚くべきことに、9AAおよびキナクリンによるNF−κB依存性トランス活性化のブロックは、NF−κBのDNA結合活性における同時用量依存性の増加と同時に生じた(図7c)。いくらかの増大は、TNFでの刺激を伴わない場合にもなお観察され、これには、p50/p50ホモ二量体が主に関係している(図7d)。この増大は、薬物をTNFと組み合わせて投与した場合に特に強く、これには、p65/p50およびp50/p50 NF−κB複合体の両方が関係していた(図7cおよびd)。
(アミノアクリジンはNF−κBの阻害を通じてRCCの中でp53を活性化させる)
アミノアクリジンはRCC細胞中で2つの強い効果を生じる。これらは、DNAの損傷、またはプロテアソームの分解の阻害には関係していない異常な方法でp53を活性化させる。これはまた、NF−κBも、異常な方法で、転写活性のあるNF−κB複合体を転写不活性な形態に変換させることによって阻害する。これはおそらく、p65/RelAのリン酸化の阻害が原因である。p53およびNF−κBに対するアミノアクリジンの効果は極めて特異的である。なぜなら、これらは、c−Myc、またはN−Myc、アンドロゲン受容体、またはCLOCK/BMAL1のような他の試験した因子によって調節された転写に対しては効果がないからである(データは示さない)。本発明者らは、アミノアクリジンによるp53の活性化およびNF−κBの抑制が薬物の活性と関係しているのか、または薬物の活性とは無関係であるのか、そして、相関している場合には、これは初期事象であるのかどうかを知ることについて興味を抱いた。本発明者らは、p53の活性化がNF−κBの抑制の要因である可能性を容易に排除することができた。なぜなら、NF−κB経路に対するアミノアクリジンの効果の全てがp53欠損細胞(H1299)と、さらにはp53野生型細胞(HT1080)細胞において見られたからである。さらに、アミノアクリジンによるNF−κBの阻害は、化合物の投与後1時間以内に検出できるが、p53に対するそれらの効果は、通常はゆっくりであり、効果が見え始めるには12から16時間の処置が必要である(図2d)。正反対のモデル(アミノアクリジンによるNF−κBの抑制がp53の活性化を駆動する)を研究するために、本発明者らは(i)NF−κBが別の機構によって阻害された場合にp53活性と共に何が生じるかを試験し、そして(ii)NF−κB欠損細胞中でのp53活性化に対するアミノアクリジンの効果を分析した。
(耐性腫瘍細胞の感作)
本発明者らは、次に、死リガンドに耐性である腫瘍細胞を感作させるアミノアクリジンの能力を試験した。本発明者らは、前立腺、腎臓、肺、および乳房に由来する、もともと死リガンドでの処理に対して耐性であった腫瘍細胞が、非毒性または毒性が低い濃度のアミノアクリジンの存在下で処理した場合には、TNF、Fas、およびTRAILに対して劇的に感作させられたことを見出した(図9)。
(アミノアクリジンの腫瘍に対する適用)
本発明者らは、従来の化学療法に対するアミノアクリジンの効力を試験した。この目的のために、本発明者らは、RCCに由来する腫瘍細胞とRCC以外に由来する腫瘍細胞(それぞれのタイプについて6種類)、さらには、正常な腎臓細胞(NKE)のセットについて、いくつかの化学療法剤(ドキソルビシン、タキソール、および5−フルオロウラシル)、9AA、およびキナクリン(QC)のIC50%を比較した。非RCC細胞株には、MCF7(wt p53)、HT1080(wt p53)、H1299(p53ヌル)、U2OS(wt p53)、LNCaP(wt p53)、およびHCT116(wt p53)を含めた。RCCの平均のIC50%は、使用したすべての化学療法剤について非RCC細胞株よりも高く、そして正常な細胞のIC50%に近かった。これは、臨床報告と一致していた(図10)。9AAおよびキナクリンは、試験した10種類のRCC細胞株のうちの9種類においてp53によって媒介されるトランス活性化を効率よく回復させた(データは示さない)。これらの化合物は、後者のp53状態とは無関係に、RCC細胞および非RCC細胞の両方に対して同等に有効であった。さらに表3も参照のこと。
Claims (18)
- NF−κB活性に関連する状態を処置する方法であって、NF−κBのインヒビターを含む組成物を、その必要がある患者に投与する工程を包含する、方法。
- 前記NF−κB活性が構成的であるかまたは誘導されたものである、請求項1に記載の方法。
- 前記NF−κB活性が基底レベルにある、請求項1に記載の方法。
- NF−κBの阻害によってp53が活性化される、請求項1に記載の方法。
- 前記状態がガンである、請求項1に記載の方法。
- NF−κBの阻害によって、機能が損なわれた野生型p53の活性化が誘導される、請求項5に記載の方法。
- 前記ガンが、腎細胞ガン、肉腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、骨髄腫、骨髄性白血病およびリンパ芽球性白血病、神経芽細胞腫、膠芽細胞腫、およびHTLV感染によって引き起こされるガンからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記状態が、炎症、自己免疫疾患、対宿主性移植片病、またはHIV感染に関連する状態である、請求項1に記載の方法。
- 前記状態が、構成的に活性なNF−κBに依存して獲得された前ガン細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記アミノアクリジンが、9−アミノアクリジンおよびキナクリンからなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記組成物はさらに、TNFファミリーのポリペプチドの死受容体の活性化因子を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記活性化因子が、NGF、CD40L、CD137L/4−1BBL、TNF−α、CD134L/OX40L、CD27L/CD70、FasL/CD95、CD30L、TNF−β/LT−α、LT−β、およびTRAILからなる群より選択されるTNFファミリーのポリペプチドである、請求項12に記載の方法。
- 機能的にサイレントなp53を活性化させる物質をスクリーニングする方法であって:
(a)候補の物質を、p53応答性レポーターを含む細胞に対して加える工程;
(b)該p53応答性レポーターのシグナルのレベルを測定する工程
を包含し、それによって、(b)での対照を上回るシグナルによって物質が同定される、方法。 - 前記細胞が、機能的にサイレントなp53を含む、請求項14に記載の方法。
- NF−κBを阻害する物質をスクリーニングする方法であって:
(a)候補の物質を、p53応答性レポーターを含む細胞に対して加える工程;
(b)該p53応答性レポーターのシグナルのレベルを測定する工程
を包含し、それによって、(b)での対照を上回るシグナルによって物質が同定される、方法。 - 前記細胞が機能的にサイレントなp53を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記細胞がNF−κBトランス活性化複合体を含む、請求項16に記載の方法。
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