JP2008504269A - 神経再生 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本発明は、細胞ベースの治療を使用する、神経変性の予防および神経再生の促進に関する。
損傷した神経の神経再生に関して多数の研究が行われている。一般に、末梢神経の外傷性損傷の臨床外科的処置では、まず損傷の局所的部位の近くの損傷した組織を取り除き、末梢神経の再生を可能にする環境を提供することを含む、複雑な一連の段階が使用される(Kline, J Neurosurg, 1989, 70: 166-174)。外科的処置の過程には、典型的に、損傷領域の上部と底部を直接連結または融合することが含まれる(Kline and Judice, J Neurosurg, 1983, 58: 631-649)。別の外科的方法、例えば末梢神経移植(Millesi, Clin Orthop, 1988, 237: 36-42)ならびにより保守的な外来患者の処置、例えば有益な筋肉の収縮を生じさせるための電気刺激の維持では、筋肉−神経接合部の変性を阻害しつつ、神経の自発的な再生を待つ(Kim et al., Korean Academy of Rehabilitation Medicine (Korean), 1999, 23: 893-8983; al-Amood et al., J Physiol (Lond), 1991, 441: 243-256)。最後に、大多数のこれらの手順には広範な理学療法がさらに含まれ、その療法には、筋肉の衰弱および収縮を予防し、神経の副軸索の出芽を促進するための長期の制御された運動療法が含まれる(Pyun et al., Korean Academy of Rehabilitation Medicine (Korean), 1999, 23: 1063-1075)。
Kline and Judice, J Neurosurg, 1983, 58: 631-649 Millesi, Clin Orthop, 1988, 237: 36-42 Kim et al., Korean Academy of Rehabilitation Medicine (Korean), 1999, 23: 893-8983 al-Amood et al., J Physiol (Lond), 1991, 441: 243-256 Pyun et al., Korean Academy of Rehabilitation Medicine (Korean), 1999, 23: 1063-1075 Gravois, Physical Medicine and Rehabilitation, Massachusetts: Blackwell Science, 2000, pp432-433 Dumitru, In: Dumitru, editor. Electrodiagnostic medicine, 1st ed, Philadelphia Hanley & Belfus, 1995, pp341-384 Ebara and Nakayama, Spine, 2002, 16S: S10-S15 Horowitz, Muscle Nerve, 1989, 12: 314-322 Matzuk et al., Nature, 1995, 374: 360-363 Mengs, Arch Int Pharmacodyn Therp, 1984, 271(2): 315-323 Sambrook et al. Molecular Cloning, Chapter 16, 1989 Behringer, et al., Nature, 345:167, 1990 Padgett, et al., Nature, 325:81-84, 1987 Weeks, et al., Cell, 51:861-867, 1987 Mason, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 135:957-964, 1986 Thomsen, et al., Cell, 63:485, 1990 Sampath, et al., J. Biol. Chem., 1990, 265: 13198-13250 Massague, Cell 49:437, 1987 Ung, et al., Nature, 321:779, 1986 Cheifetz, et al., Cell, 48:409, 1987 Massague, Ann. Rev. Biochem. 67:753-791, 1998 Michailov et al., Science, 304, 700-703, 4/30/2004 Urist, MR: Bone, formation by autoinduction, Science, 1965, 150(698): 893-899 Wang et al., Proc Nat Acad Sci USA, 1988, 85: 9484-9488 Wozney, Mol Rep Dev, 1992, 32: 160-167 Wozney and Rosen, Clin Orthop, 1998, 346: 26-37 Croteau et al., 1999; 22: 686-695 Kawabata et al., Cytokine Growth Factor Rev, 1998, 9: 49-61 Ebara et al., Biochem Biophys Res Commun, 1997, 240: 136-141 Imamura et al., Nature, 1997, 389: 549-551 Bai et al., J Biol Chem, 2000, 275: 8267-8270 Yoshida et al., Cell, 2000, 103: 1085-1097 Wang et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 14394-14399 Zuh et al., Nature, 1999, 400: 687-693 Farkas et al., J Neurosci, 1999, 92: 227-235 Mohans et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 1998, 39: 2626-2636 Zou and Niswander, Science, 1996, 272: 738 Lianjia and Yan, Clin Orthop, 1990, 257: 249-256 Lefer et al., J Mol Cell Cardiol, 1992, 24: 585-593 Ripamonti and Duneas, Plast Reconstr Surg, 1998, 101: 227-239 De Koning et al., J Neurol Sci, 1986, 74: 237-246
一側面では、本発明は神経を再生する方法であって、下記段階を含む方法に関する:a)プロモーターに作動的に連結されているトランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのタンパク質の1メンバーをコードするDNA配列を含む組換えウイルスベクターまたはプラスミドベクターを作成する段階;b)インビトロにおいて、培養細胞の集団を組換えベクターでトランスフェクトし、該培養細胞の集団を得る段階;およびc)トランスフェクトされた細胞を、損傷した神経の近くの領域に移植し、該損傷した神経の近くの領域内でのDNA配列の発現に起因して神経の再生が生じるようにする段階。トランスフォーミング成長因子はBMPであってよい。BMPはBMP−2またはBMP−9であってよい。細胞は結合組織細胞であってよい。好ましくは、細胞は線維芽細胞または神経細胞であってよい。さらに、神経は末梢神経であってよい。ベクターはウイルスベクターであってよい。ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターであってよい。さらに、細胞の集団を、移植前に、例えば10%DMSO中で液体窒素条件下で保存してよい。
本発明は、以下に挙げる詳細な説明、および添付の図面からさらに完全に理解されるようになる。図面は単に例として挙げるものであり、ゆえに本発明を限定するものではない。
本出願においては、「a」および「an」が単一および複数の対象の両者を表すために使用される。
神経組織は脊索の影響下で胚の外胚葉から派生する。外胚葉が誘導されて、肥厚した神経板を形成し、次いでそれが分化し、その末端が最終的に融合して神経管を形成し、その神経管からすべての中枢神経系が派生する。中枢神経系は、脳、脳神経および脊髄からなる。末梢神経系は、神経冠と称される、神経溝に隣接する細胞から派生する。
中枢神経系(CNS)は脳および脊髄からなる。髄膜(硬膜、くも膜および軟膜)は、頭蓋骨および椎骨によって提供される保護に加えて、CNSを保護し、栄養を与える。脳脊髄液は、くも膜下腔、脊柱中心管および脳室で見出される。軟膜は最も内側の層であり、神経組織に癒着している。軟膜と硬膜の間にくも膜層がある。丈夫な線維性の硬膜は頭蓋のすぐ下にある。
末梢神経系には、神経、神経節、脊髄神経および脳神経であって、脳および脊髄の外側に位置するものが含まれる。脳幹に位置する核から12の脳神経が発生し、特定の位置に伝わっていて、種々の自律神経機能、例えば嗅覚、視覚、唾液分泌、心拍数および皮膚感覚を制御するインパルスを輸送する。脳神経は感覚および運動成分を輸送する点で混在性であることが多いが、運動または知覚線維のみを有することもある。下記の表は脳神経およびその機能を列挙するものである。
本発明の一側面では、神経再生が生じるために2つのイベントが生じる必要がある。第一に、再生因子産生細胞、ならびに治療の恩恵を受ける神経細胞が生存可能である必要がある。第二に、ニューロンの髄鞘形成が生じる必要がある。これに関して、種々の異なる細胞型を使用して、この表現型を実現してよい。例えば、細胞の生存を誘発する細胞およびミエリン産生細胞の混合物を一緒に使用して、神経を再生してよい。
本発明の具体的で例示的な一側面は、ラットにおける神経損傷後の再生に関する、機能的タンパク質であるBMP−2およびBMP−9の効果を決定することに関する。36匹のSprague-Dawley系統(重量400±10g)のラットを使用し、それらを3群に分けた(対照、BMP−2、およびBMP−9)。ここで、BMP−2またはBMP−9群とは、前記未注射のSprague-Dawleyラットに対して神経損傷が施された後にBMP−2またはBMP−9を発現する細胞を注射される動物群を表すことに留意する。止血鉗子を使用して、坐骨神経上に圧挫傷を施した。対照群では、改変されていない線維芽細胞を含むバッファーのみを注射した。BMP−2およびBMP−9群では、遺伝子改変型線維芽細胞を含むバッファーを注射した(BMP−2:BMP−2を分泌する線維芽細胞、BMP−9:BMP−9を分泌する線維芽細胞)。注射完了後、1)胃−ヒラメ筋で記録された坐骨神経運動伝導についての研究、および2)ヘマトキシリン−エオシン、およびトリクローム変法染色を用いる坐骨神経についての組織学的研究によって再生に対する効果を評価した。
BMPは2つの異なる型(I型およびII型)のセリンスレオニンキナーゼ受容体に結合する。2つのI型受容体および1つのII型受容体が哺乳類で確認されている(Kawabata et al., Cytokine Growth Factor Rev, 1998, 9: 49-61)。哺乳類では、I型受容体はアイソフォームAおよびBを有し、それらは構造的に類似しているが、それらによるSmadタンパク質の活性化においては異なる挙動を示す(Imamura et al., Nature, 1997, 389: 549-551)。シグナル伝達では、I型およびII型受容体は複合体を形成する必要がある。I型受容体はII型受容体によって活性化され、そのI型受容体によって細胞中でシグナルが伝達される。細胞中のシグナルはSmadタンパク質によって伝達される。Smad1、Smad5およびSmad8は同一構造に属し、BMPからのシグナルを伝達する。Smad2およびSmad3はTGF−βおよびアクチビンからのシグナルを伝達する。これらのSmadはヘテロマーの複合体を形成し、核に移行して種々の遺伝子を活性化する。Smad6、Tob、SkiおよびSmurf1はこれらの遺伝子の負の調節に関与する。これらのうち、Smad6はBMPの転写を抑制し、また、BMPシグナル伝達経路の負のフィードバックに役割を有する(Bai et al., J Biol Chem, 2000, 275: 8267-8270)。Tobは増殖抑制タンパク質ファミリーのメンバーであり、BMP/Smadシグナルの負の調節に関与する(Yoshida et al., Cell, 2000, 103: 1085-1097)。Ski腫瘍性タンパク質はBMP−シグナル伝達およびBMP−応答遺伝子の発現を抑制し、BMPの特性であるSmad複合体との直接反応によってBMPの活性化を抑制する(Wang et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 14394-14399)。Smurf1はユビキチンリガーゼのHectファミリーに属し、受容体調節型Smadと選択的に結合することによってBMPのシグナル伝達を阻害する(Zuh et al., Nature, 1999, 400: 687-693)。
本発明は、目的の部位に遺伝子を送達するエクスビボの方法に限定されない。インビボの方法も意図される。同様に留意すべきは、注射の部位内で所望のタンパク質を発現することができる限り、任意のベクターを使用してよいことである。目的の遺伝子を発現するために有効に使用できる限り、ベクターはプラスミドまたは任意の数のウイルスベクターであってよい。
実施例I−材料および方法
材料
この研究では、体重400±10gの成熟Sprague-Dawley 系統ラット(16〜18週齢)を使用した。成熟ラットを使用する理由は、成長段階のラットと比較して、神経再生に起因する変化および生理的変化を観察するのが容易であるからである。
機能的タンパク質であるBMPを末梢神経に注射することは技術的に困難である。ゆえに、この研究では、BMP2およびBMP9を産生するラット線維芽細胞を末梢神経に直接トランスフェクトして、BMP2およびBMP9が局所的に分泌されるようにした。トータルで36匹のラットを3群に分けた。各群は損傷した神経を有する12匹のラットから構成されていた。第一の群は対照群であり、導入遺伝子を含まない改変されていない線維芽細胞で処置された損傷した神経を有するラットが含まれる群であった。第二の群(BMP2群)は、BMP−2導入遺伝子を含む遺伝子改変型線維芽細胞で処置された損傷した神経を有するラットから構成され、第三の群(BMP9群)は、BMP−9導入遺伝子を含む遺伝子改変型線維芽細胞で処置された損傷した神経を有するラットから構成される群であった。処置の2、4、および8週後に、各群から2匹のラットを犠牲にし、両肢から坐骨神経を回収することによって組織の組織学的検査を実施した。また、肢由来の坐骨神経を用いて神経の運動性伝導の研究を実施した。この研究は、実験前に元のベースライン値を設定し、外科手術の8週後まで1週おきに神経伝導を測定することによって行った。
白色ラットの腹腔に300mg/Kgの濃度で4%抱水クロラールを注射することによって麻酔した。右肢の後側および大腿部から毛を除去した後、腹臥位で固定した。potadineおよび70%アルコールで大腿部を殺菌した後、大腿部の中心部分の周りの約1〜1.5cmの表皮を垂直に切開し、大腿二頭筋を外側に引っ張って坐骨神経を露出させた。DeKoningら(De Koning et al., J Neurol Sci, 1986, 74: 237-246)にしたがって神経損傷を施した。それは、大腿と全膝関節の間の皮膚を長さ2〜2.5cmに切開し、後側および全膝関節筋肉を剥脱して坐骨神経を露出させ、次いで坐骨ヘルニアの位置で露出させた神経を止血鉗子(Crile,15cm)で30秒間押しつぶして損傷させることによって行った。鉗子は3つの異なるレベルの握り強度にセットすることができ、固定部での神経損傷に関して同一レベルの握りを適用するために、鉗子上の末端から5cmの位置に黒い線をひき、最強の握りレベルによる固定部での圧挫傷を可能にした。止血鉗子を除去した後、第一の、すなわち対照群では、超微細な針(30ゲージ)を使用して、神経損傷領域の2mm以内に、改変されていない線維芽細胞(単位:5x105細胞/50μl)0.05mlを含むバッファーを注射した。第二および第三の実験群では、同法によって、それぞれBMP2およびBMP9を分泌する遺伝子改変型線維芽細胞を注射し、その後、創傷領域を縫合し、殺菌した。
ラットを4%抱水クロラールで麻酔した後、神経伝導試験を実施した。坐骨切痕を刺激するための活性記録用電極を腓腹筋上に配置し、基準電極を足上に配置し、接地電極を刺激用電極と記録用電極の間に配置した。パッチ様電極を記録用電極として使用し、針電極を使用することによって接地電極を皮膚の下に配置した。KeyPoint(Dantec, Denmark)を使用して神経伝導試験を行った。この研究では、頻度、記録印刷速度、および記録感度を、それぞれ2〜10,000Hz、2msec/区画(division)、5mV/区画としてセットした。神経伝導試験を2週毎に実施した。実験の開始から測定を実施し、以後2、4、6、および8週の時点で追跡した。ベースラインと負極点(negative electrode point)の間の振幅によって試験中の潜時および振幅を測定した。神経伝導研究に関して各群から5匹のラットを選択し、両方から10測定値を取得した。実験室およびラットの温度はそれぞれ25℃および30℃で維持した。
正常な神経を検査することによって損傷後の天然の治癒を観察するためにラット由来の神経組織の検査を実行し、その後、実験の開始からそれらを損傷させた。4匹のラット(8神経)を使用し、導入遺伝子手順を欠いている細胞を用いて神経の再生を観察した。各群から2匹のラット(4神経)をランダムに選択し、2、4、および8週後に組織を検査した。組織検査では、麻酔されたラットの圧挫傷の領域から約2cmの坐骨神経を剥脱した。緩衝ホルムアルデヒド溶液で固定し、次いでヘマトキシリン−エオシン(H&E)およびトリクローム変法(MT)染色で染色した後に、光学顕微鏡下で神経組織の変化を観察した。
神経損傷の2、4、6および8週後に、各群由来の複合筋の活動電位の最大振幅および潜時の期間の変化を参照群と比較することによって分析し、SPSS−PCプログラムによって統計分析を実行した。ANOVAおよびt検定によって各群間の比較を実施し、有意水準を0.05で設定した。損傷および再生の程度は、病理学者によって解釈されるように、組織学的データによって決定した。
当初、ラットの体重は400±10gの範囲であった。その後の体重変化は表2に示される通りである。2週の時点では、各群間で差が観察されなかったが、4および6週の時点では、BMP9群が他の群と比較していくらかの差を示した(p<0.05)。8週の時点では、群間で統計学的に有意な差はなかった(p>0.05)(表2)。
実験前に各群からランダムに測定されたベースラインデータは1.44±0.11msecの潜時を示した。外傷後の潜時は、2および4週の時点で、対照群、BMP2群およびBMP9群の間で差を示したが、統計学的有意性を欠いた(p>0.05)。6週の時点でBMP2およびBMP9群の潜時は対照群と比較して有意に短かった(p<0.05)。しかし、8週の時点では3群間で潜時の差はなかった(p>0.05)(表3)。
実験前に各群からランダムに測定されたベースラインデータは23.9±4.3mVの振幅を示した。外傷の2および4週後の時点でBMP9群の振幅は対照群と比較して有意に増加した(p<0.05)。6週の時点でBMP2およびBMP9群は対照群と比較して有意差を示し(p<0.05)、8週の時点では、BMP9、BMP2および対照群の順で有意差が示された(p<0.05)(表4)。
各群からランダムに選択されたラットの組織学的神経組織検査では、図1〜図10に示されるように神経生理学的検査の結果と同様の変化が示された。対照群は最も遅い回復速度を示した。その根拠は、神経組織の軸索が再生されず、炎症反応が残っていたことである。初期では、トランスフェクトされたBMP2またはBMP9を分泌する遺伝子改変型線維芽細胞の群は、対照群と比較して全く有意差を示さず、2週の時点では、すべての群が、神経の圧挫傷に起因する深刻な病理学的徴候、例えば空胞状変化および炎症性単球の浸潤、神経上膜静脈の出血を示した。対照群では、これらの症状が8週間にわたって持続した。しかし、BMP2群では、炎症および空胞状変化のサイズが有意に減少し、4および8週の時点では、それらの半分しか前記症状を示さなかった。BMP9群では、4および8週の時点でこれらの効果がさらに顕著であり、それらの3分の1しか、軸索の損失、および空胞状変化を示さず、さらに非常に軽度の炎症を示した。
Claims (19)
- 神経を再生する方法であって、下記段階を含む方法:
a)プロモーターに作動的に連結されたトランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのタンパク質のメンバーをコードするDNA配列を含む組換えウイルスベクターまたはプラスミドベクターを作成する段階;
b)インビトロにおいて、培養細胞の集団を組換えベクターでトランスフェクトし、該培養細胞の集団を得る段階;および
c)トランスフェクトされた細胞を、損傷した神経の近くの領域に移植し、該損傷した神経の近くの領域内でのDNA配列の発現に起因して神経の再生が生じるようにする段階。 - トランスフォーミング成長因子がBMPである、請求項1に記載の方法。
- BMPがBMP−2およびBMP−9である、請求項2に記載の方法。
- 細胞が結合組織細胞である、請求項1に記載の方法。
- 細胞が線維芽細胞である、請求項4に記載の方法。
- 細胞が神経細胞である、請求項1に記載の方法。
- 神経が末梢神経である、請求項1に記載の方法。
- ベクターがウイルスベクターである、請求項1に記載の方法。
- ベクターが、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである、請求項8に記載の方法。
- 移植前に該細胞の集団を保存する、請求項1に記載の方法。
- 移植前に、トランスフェクトされた該細胞の集団を液体窒素条件下で10%DMSO中で保存する、請求項4に記載の方法。
- 神経を再生する方法であって、下記段階を含む方法:
a)ミエリン鞘再生タンパク質をコードするDNA配列を含む組換えウイルスベクターまたはプラスミドベクターを作成する段階;
b)インビトロにおいて、培養細胞の集団を組換えベクターでトランスフェクトし、該培養細胞の集団を得る段階;および
c)トランスフェクトされた細胞を、損傷した神経の近くの領域に移植し、該損傷した神経の近くの領域内でのDNA配列の発現に起因して神経の再生が生じるようにする段階。 - 細胞が結合組織細胞である、請求項12に記載の方法。
- 細胞が線維芽細胞である、請求項13に記載の方法。
- 細胞が神経細胞である、請求項12に記載の方法。
- 細胞がグリア細胞である、請求項12に記載の方法。
- 細胞がシュワン細胞である、請求項12に記載の方法。
- タンパク質がニューレグリン−1である、請求項12に記載の方法。
- 神経が末梢神経である、請求項12に記載の方法。
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