KR20070039554A - 신경 재생 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 프로모터에 효과적으로 연결된 단백질의 형질전환 성장 인자 수퍼패밀리의 구성원을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 제작하는 단계; 배양된 세포의 개체군을 재조합 벡터로 in vitro 형질전환하여, 배양된 세포의 개체군을 수득하는 단계; 및 손상된 신경 근처의 영역에서 DNA 서열의 발현이 신경의 재생을 야기하도록, 손상된 신경 근처 영역에 형질전환된 세포를 이식하는 단계를 포함하는 신경 재생 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신경 퇴화의 예방 및 세포 기반 치료를 이용한 신경재생 촉진에 관한 것이다.
손상된 신경의 신경재생에 대한 수많은 연구가 수행되어왔다. 일반적으로, 말초신경의 외상성 손상에 대한 임상의 외과치료는 먼저 손상 국소 부위 근처의 손상된 조직을 제거하고, 말초신경의 재생을 가능하게 하는 환경을 제공하는 복잡한 연속적인 단계로 이루어진다(Kline, J Neurosurg, 1989, 70: 166-174). 외과적 과정의 역학은 일반적으로 손상된 영역의 정상과 기저를 직접 연결하거나, 융합하는 것을 포함한다(Kline and Judice, J Neurosurg, 1983, 58: 631-649). 신경의 자발적인 재생을 기다리는 동안 근육-신경 연합의 퇴화를 억제하는 것을 돕는 근육의 수축을 생성하기 위해 전기적 흥분을 유지하는 것 같은 좀 더 신중한 외래 환자 치료뿐만 아니라(Kim et al., Korean Academy of Rehabilitation Medicine (Korean), 1999, 23: 893-8983; al-Amood et al., J Physiol (Lond), 1991, 441: 243-256), 말초신경 이식 같은 추가의 외과적 방법(Millesi, Clin Orthop, 1988, 237: 36-42) 이 사용된다. 마지막으로, 이러한 과정의 대부분은 여전히 근육 약화와 수축을 막고, 신경의 발아를 촉진하기위해, 장기적이고 제어된 연습 요법을 포함하는 광범위한 물리 치료법을 포함한다(Pyun et al., Korean Academy of Rehabilitation Medicine (Korean), 1999, 23: 1063-1075).
종종, 기계적 정형외과의 장치는 관절을 보호하고, 영향을 받는 영역을 둘러싼 근육과 인대의 손상을 막기 위해 사용되어왔다(Gravois, Physical Medicine and Rehabilitation, Massachusetts: Blackwell Science, 2000, pp432-433). 더불어, 신경 재생을 위한 다양한 실험적인 기술은, 또한 신경을 접속하는 생합성 튜브의 사용을 포함하거나, 집합적으로 신경의 손상을 줄이고 신경 재생의 자극에 도움 되는, 의약과 결합한다(al-Amood et al., J Physiol (Lond), 1991, 441: 243-256; Dumitru, In: Dumitru, editor. Electrodiagnostic medicine, 1st ed, Philadelphia: Hanley & Belfus, 1995, pp341-384; Ebara and Nakayama, Spine, 2002, 16S: S10-S15; Horowitz, Muscle Nerve, 1989, 12: 314-322; Matzuk et al., Nature, 1995, 374: 360-363; Mengs, Arch Int Pharmacodyn Therp, 1984, 271(2): 315-323). 그러므로, 손상된 신경, 구체적으로 특정 말초신경의 퇴화를 억제하거나 재생하기 위한 분자적 치료 방법을 위한 분야에 필요성이 있다.
본 발명은 다음을 포함하는 신경 재생 방법에 관한 것이다: a) 프로모터와 효과적으로 연결된 단백질의 형질전환 성장 인자 수퍼패밀리의 구성원을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 제작하는 단계; b) 배양된 세포의 개체군을 재조합 벡터로 in vitro 형질전환 하여, 배양된 세포의 개체군을 수득하는 단계; 및 c) 손상된 신경 근처 영역에서 DNA 서열의 발현이 신경의 재생을 야기하도록, 손상된 신경 근처 영역에 형질전환된 세포를 이식하는 단계를 포함한다. 형질전환 성장 인자는 BMP일 수 있다. BMP는 BMP-2 또는 BMP-9일 수 있다. 세포는 결합 조직 세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 섬유아세포 또는 신경 세포일 수 있다. 더 바람직하게는, 신경은 말초신경일 수 있다. 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 포진 바이러스 벡터일 수 있다. 더불어, 세포의 개체군은 이식에 앞서 액체 질소에서 10% DMSO 등에 저장될 수 있다.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 신경 재생 방법에 관한 것이다: a) 수초 재생 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 제작하는 단계; b) 배양된 세포의 개체군을 재조합 벡터로 in vitro 형질전환 하여, 배양된 세포의 개체군을 수득하는 단계; 및 c) 손상된 신경 근처 영역에서 DNA 서열의 발현이 신경의 재생을 야기하도록, 손상된 신경 근처 영역에 형질전환된 세포를 이식하는 단계를 포함한다. 세포는 섬유아세포와 같은 결합조직 세포 또는 신경교세포 또는 슈반 세포 같은 신경 세포일 수 있다. 본 발명의 방법에서, 단백질은 뉴레귤린-1(neuregulin-1)일 수 있다. 재생될 신경은 말초신경일 수 있다.
본문에서 “a”, 그리고“an”단수와 복수의 물체에 대해 언급하기 위해 사용한다.
본문에서 사용되는 것처럼, “결합 조직 세포”또는“결합 조직의 세포”의 용어는, 지방 세포(adipocytes)과 민무늬근육세포 뿐만 아니라 교원질의 세포외 기질성분을 분비하는, 섬유아세포, 연골세포(chondrocytes) 및 뼈세포(osteoblasts/osteocytes)와 같은, 결합 조직에서 발견되는 세포를 포함한다. 바람직하게는, 결합 조직 세포는 섬유아세포, 연골세포 및 뼈세포이다. 더욱 바람직하게는, 결합 조직 세포는 섬유아세포이다. 또한, 결합 조직 세포는 미성숙 섬유아세포로 알려진 중간엽 세포를 포함한다. 본 발명은 단일형 세포뿐만 아니라 결합 조직 세포의 혼합된 배양에서도 실행될 수 있다는 것이 인정될 수 있다.
본문에서 사용되는 것처럼, 손상된 신경 “주변”세포의 주입은, 주입 영역에서 신경 재생의 유효한 결과에 영향을 미칠 정도로 주입 영역과 손상된 신경사이가 충분히 가까운 영역임을 의미한다. 그러므로 손상된 신경 근처 세포의 주입은 손상부위 또는 주입된 세포가 효과적인 폴리펩티드를 발현하고, 폴리펩티드는 직접적으로 혹은 간접적으로 신경 재생 결과에 영향을 미칠 정도로 가까운 어느 부위라도 포함한다.
본문에서 사용되는 것처럼, “프로모터”는 진핵세포에서 활성을 나타내고 전사를 조절하는 DNA 서열은 어느 것이든 될 수 있다. 프로모터는 진핵과 원핵세포의 어느 한쪽 또는 둘 다에서 활성을 지닐 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 포유류의 세포에서 활성을 지닌다. 프로모터는 항상 발현되거나 유도되어 발현될 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 유도성이다. 바람직하게는, 프로모터는 외부의 자극에 의해 유도될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 프로모터는 호르몬 또는 금속에 의해 유도될 수 있다. 더욱 더 바람직하게는, 프로모터는 중금속에 의해 유도될 수 있다. 가장 바람직하게는, 프로모터는 메탈로티오네인 유전자 프로모터이다. 유사하게, 전사를 조절하는 “강화 구성원” 역시 DNA 벡터 구조물로 삽입될 수 있고, 관심 유전자의 발현을 향상시키기 위해 본 발명의 구조물로 사용될 수 있다.
본문에서 사용되는 것처럼, “선택용 표지”는 삽입 DNA를 안정적으로 유지하는 세포에 의해 발현되고, 세포를 형태상의 변환 또는 효소적 활성 같은 변경된 표현형을 나타내도록 하는 유전자 산물을 포함한다. 형질전환된 유전자를 발현하는 세포의 분리는, 항생제 또는 다른 약제에 저항성을 부여하는 효소적 활성을 가지고 있는 것과 같은 선택용 표지를 암호화하는 두 번째 유전자를 동일한 세포에 도입함으로써 달성될 수 있다. 선택용 표지의 예에는 싸이미딘 키나아제, 디하이드로폴레이트 환원효소, 가나마이신, 네오마이신 및 제네티신과 같은 아미노글리코시드 항생제 저항성을 부여하는 아미노글리코시드 인산운반효소, 하이그로마이신 B 인산운반효소, 쟌틴-구아닌 포스포리보실기 전환효소(xanthine-guanine phosphoribosyl transferase), CAD[de novo uridine 생합성의 처음 세 개의 효소적 활성을 포함하는 단일 단백질 - 카바모일 인산 합성효소(carbamoyl phosphate synthetase), 아스파르트산 카르바밀전이효소(aspartate transcarbamylase) 및 다이하이드로오로테아제(dihydroorotase)], 아데노신 디아미나아제 (adenosine deaminase), 및 아스파라진 합성효소를 포함하고, 이에 한정되지는 않는다(Sambrook et al. Molecular Cloning, Chapter 16. 1989). 참고문헌으로 본문에 전체가 삽입된다.
본문에서 사용되는 것처럼, “형질전환성장인자-β수퍼패밀리[transforming growth factor-β(TGF-β) superfamily]”는 배아 발달동안 분화과정에 폭넓게 영향을 주는 구조적으로 관련되어 있는 단백질 군을 포함한다. 패밀리는 정상적인 남성 성 발달에 필요한 Mullerian 억제물질(Mullerian inhibiting substance; MIS, Behringer, et al., Nature, 345:167, 1990), 복축-배축 형성과 성충판의 발생에 필요한 초파리의 DPP(decapentaplegic) 유전자 산물(Padgett, et al., Nature, 325:81-84, 1987), 난자의 식물극쪽에 위치하는 Xenopus Vg-1 유전자 산물(Weeks, et al., Cell, 51:861-867, 1987), Xenopus 배(Thomsen, et al., Cell, 63:485, 1990)에서 중배엽과 전부 구조의 형성을 포함할 수 있는 액티빈(Mason, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 135:957-964, 1986), 및 de novo 연골과 뼈 형성을 유도할 수 있는 골형성성장인자(bone morphogenetic proteins; BMP's, BMP-2, 3, 4, 5, 6 및 7, osteogenin, OP-1과 같은 BMP, Sampath, et al., J. Biol. Chem., 265:13198, 1990)를 포함한다. TGF-β 유전자 산물은 지방형성, 근육발생, 연골형성, 조혈작용 및 상피 세포 분화를 포함하는 여러 가지 분화 과정에 영향을 줄 수 있고(리뷰; Massague, Cell 49:437, 1987), 이는 참고문헌으로 전체가 본문에 삽입되었다.
TGF-β 패밀리의 단백질은 처음에 C-말단으로부터 대략 110-140 아미노산의 염기성 잔기 집단에서 단백질분해 효소로 절단되는 큰 선구 단백질로서 합성되었다. 단백질의 C-말단 영역은 모두 구조적으로 관계가 있고, 다른 패밀리 구성원은 그의 상동성의 범위에 의거하는 별개의 하위 집단으로 분류될 수 있다. 비록 특정 하위 집단내의 상동성이 70%에서 90%의 아미노산 서열이 동일한 범위에 있지만, 하위 집단 사이의 상동성은 현저히 더 낮고, 일반적으로 단지 20%에서 50% 범주에 있다. 각 경우에서, 활성 종은 C-말단 단편이 이황화 결합된 이량체인 것처럼 보인다. 연구되었던 대부분의 패밀리 구성원에 대해, 동형이량체 종은 생물학적으로 활성인 것으로 발견되었으나, inhibin(Ung, et al., Nature, 321:779, 1986)과 TGF-β's(Cheifetz, et al., Cell, 48:409, 1987)와 같은 다른 패밀리 구성원에 대해, 이형이량체 역시 검출되었고, 상기는 각각의 동형이량체보다 상이한 생물학적 특성을 가지는 것처럼 보인다.
TGF-β 유전자의 수퍼패밀리 구성원은 TGF-β3, TGF-β2, TGF-β4(chicken), TGF-β1, TGF-β5(Xenopus), BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, OP-1/BMP-7, BMP-8, BMP-9, Drosophila 60A, Drosophila DPP, Vgr1, GDF-1, Xenopus Vgf, Inhibin-βA, Inhibin-βB, Inhibin-α, 및 MIS를 포함한다. 상기 유전자 중의 대부분은 Massague, Ann. Rev. Biochem. 67:753-791, 1998에서 논의되었고, 이는 전체가 참고문헌으로 본문에 삽입되었다.
바람직하게는, TGF-β 유전자의 수퍼패밀리 구성원은 TGF-β이다. 더욱 바람직하게는, 구성원은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 또는 BMP-9이다.
상기에서와 같이 지정되는 이름에 의한 단백질의 기술에서, 단백질은 야생형의 정확한 서열에만 제한되지 않는 것으로 해석된다. 단백질 서열의 다양성은 기능에 있어 실질적으로 동일한 활성을 나타내는 다른 폴리펩티드 서열도 허용가능하다.
신경 조직
신경 조직은 척색의 영향으로 배아 외배엽으로부터 유래한다. 외배엽은 비후화된 신경판을 형성하도록 유도되고 그 다음에 분화되고, 마지막으로 말단은 융합되어 모든 중추신경계 유도체로부터 신경관을 형성한다. 중추신경계는 뇌, 뇌신경 및 척수로 이루어져 있다. 말초신경계는 신경능으로 불리는 신경고랑 근처 세포로부터 유래한다.
신경 조직은 복잡하게 연결된 통신 네트워크로 신체에 걸쳐 분포된다. 신경 세포(뉴런)는 다른 뉴런과 매우 단순한 형태의 회로에서 매우 복잡한 고차원 회로의 소통을 한다. 신경교세포로 불리는 다른 신경 조직은 세포 뉴런의 지지, 보호, 방어와 영양에 의해 뉴런을 돕는 반면, 뉴런은 실제적인 메시지 전달과 통합을 수행한다. 뇌에는 뉴런보다 대략 10 배 이상의 신경교세포가 있다. 신경교세포는 신경기능에 필요한 미세환경을 만들고 때때로 그 신경 처리와 활동을 원조한다. 뉴런은 흥분하기 쉬운 세포이다. 이는 적당히 자극될 때, 정보를 멀리 떨어진 세포에 보내기 위해 세포막 밖으로 전파될 활동 전위가 시작될 수 있는 것을 의미한다. 뉴런은 자극의 수령, 전달과 처리에 원인이 되는 독립적인 기능 단위이다.
일반적으로, 뉴런은 3 부분으로 이루어져 있다; 핵과 세포 소기관이 위치하는 세포체； 환경 또는 다른 뉴런으로부터 자극을 받는 세포체로부터 뻗어 나온 돌기인 수지상 돌기； 및, 다른 세포로 신경 자극의 전달을 위해 세포체로부터 뻗어 나온 긴 한 개의 돌기인 축색돌기. 축색돌기는 보통 그 말단의 끝에서 분기하고, 다른 세포에서 끝나는 가지는 구근의 끝을 가진다. 연접 세포와 말단 구근의 상호 작용은 시냅스라는 구조를 이룬다. 시냅스는 신호를 받고, 그것을 전기적 전위로 바꾸기 위해 특수화된다.
인체에서 가장 많이 발견되는 뉴런은 다극성이고, 다극성은 축색돌기가 유일한 하나의 수상돌기와, 수상돌기인 나머지 돌기를 갖는 두 개 이상의 세포 돌기를 갖는 것을 의미한다. 망막 또는 후각 기관 점막의 쌍극 뉴런은 세포체로부터 떨어진 1개의 수상돌기 및 축색돌기를 갖는다. 척수 신경절에서 발견되는 가성단극성신경원은 수상돌기에 의해 잡힌 감각 자극이 세포체를 빠져나가지 않고 축색돌기로 직접 이동하는 것을 가능하게 한다. 뉴런은 또한 기능에 따라 분류될 수 있다. 감각 뉴런은 감각 자극의 수용과 전달에 관계하고 있다. 운동 뉴런은 근육과 분비선을 조절하기 위한 자극을 보낸다. 그 외의 뉴런인 중간신경원은 기능적 네트워크의 일부로서 뉴런의 사이에서 중개자의 역할을 한다.
시냅스는 세포 신호를 전달하는 특성화된 기능의 세포 연접이다. 대부분의 시냅스는 시냅스 전 말단의 소낭이 시냅스전막이 자극받았을 때, 시냅스틈으로 방출되는 화학적 메신저를 포함하는 화학적 시냅스이다. 화학적 메신저는 시냅스전막에서 수용기에 결합하기 위해 시냅스틈을 가로질러 확산된다. 상기는 세포의 운동에 영향을 주어 시냅스전막의 분극 상태의 변화를 유발한다. 특별한 종류의 시냅스는 신경근접합부이다. 35가지 이상의 신경전달물질이 알려져 있고, 대부분은 작은 분자(산화질소, 아세틸콜린), 카테콜아민(부신수질 호르몬, 세라토닌), 또는 신경활성 단백질(엔도르핀, 바소프레신)이다. 일단 사용되면, 신경전달물질은 전시냅스 세포에 의해 효소적 붕괴, 확산 또는 엔도시토시스에 의해 신속히 제거된다.
어떤 뉴런은 미엘린이라 불리는 절연체로 둘러싸여 있다. 이 지질 부유체는 신경교세포(말초신경계의 슈반 세포)와 중추신경계의 희소돌기아교세포에 의한 슈반 세포에 의해 형성된다. 절연은 탈분극되어야하는 막 표면 영역을 줄임으로써 더 빠른 신경 전도를 가능하게 한다. 유수신경원에서 신경 자극은 축색돌기의 길이를 넘어 하나의 무수분절에서 다른 것으로 건너뛴다. 조직에서 수초와 신경세포체의 결손은 큰 말초신경과 뇌의 백질로서 약간의 신경 조직을 하얀 것처럼 보이게 한다. 성상세포로 불리는 다른 신경교세포는, 구조적 보전, 신경원성 영양 및 신경조직의 미세환경 유지와 관련되어 있다. 성상세포는 갭(gap) 연접을 통해 서로 직접 통신을 하고, 국소 환경의 조절에 의해 그의 보호에서 뉴런의 생존에 영향을 끼칠 수 있다. 뇌실막세포는 척수와 뇌실을 이어주고, 뇌척수 유체를 분비한다. 그 외의 뇌대식세포로 불리는 작은 신경교세포는 성인의 중추신경계에서 염증과 회복에 관계하고 있는 식세포이다.
신경 조직은 전기적 자극을 받고 전달하는 것이 가능한 흥분하기 쉬운 조직이다. 중심의 세포형은 뉴런으로 불린다. 뉴런은 보통 세포체, 입력을 받는 수상돌기와 전기적 전위를 전달하는 축색돌기를 포함한다.
뉴런은 감각, 운동, 분비 또는 연합 뉴런으로 분류될 수 있다. 상기는 보통 전도 속력, 직경과 미엘린으로 불리는 특수화된 지질단백질 절연체의 존재 또는 결여에 의해 분류된다. A 형 섬유는 유수화되고, 12-120 m/sec 에 자극을 전달할 수 있다. B형은 또한 유수섬유이나 3-5 m/sec로 자극을 전달한다. C형 섬유는 무수화되어 있고, 직경이 작고 매우 느리다(2.5 m/sec). A 형 섬유의 예는 비복근에 신경이 분포되어 있는 운동 뉴런이다. 자율 원심성 절전신경원은 B형 섬유의 예이고, 널리 퍼지는 통증에 관한 정보를 운반하는 감각 뉴런은 느린 C형 섬유의 예이다.
감각 뉴런은 환경으로부터 특정 종류의 정보를 탐색하기 위해 구성된다. 상기는 압력이나 팽창 같은 역학적 수용기 감각체, 온도수용기, 망막의 광수용기 및 미뢰 또는 후각에 대한 것 같은 화학수용기를 포함한다. 연합 뉴런 또는 중간신경원은 보통 원심성 운동 또는 분비 뉴런에 원심성 감각 뉴런을 연결하는 척수와 뇌에서 발견된다.
뉴런은 시냅스라고 불리는 구조를 통하여 서로 의사소통한다. 축색돌기는 다수의 작은 소낭을 포함하는 하나 또는 그 이상의 종말단추에서 끝난다. 이 작은 소낭은 신경전달물질이라고 불리는 화학 물질로 가득 차 있다. 비록 부신수질 호르몬, 세라토닌과 GABA처럼 다른 화학물질이 뉴런에 의존해 사용되더라도 아세틸콜린이 시냅스에서의 신경전달물질로 가장 많이 쓰인다. 자극이 축색돌기의 아래로 이동하고, 종말단추에 도착할 때, 소낭은 신경막과 융합하고 신경전달물질이 방출된다. 화학물질은 그 때 좁은 시냅스틈을 가로질러 수용 뉴런의 시냅스후막에서 화학물질에 대한 특정 수용기로 확산된다.
수용기와의 신경전달물질의 상호 작용은, 시냅스후 뉴런에 새로운 자극을 유도하는 막전위 변화를 유발한다. 효소 아세틸콜린에스테라아제는 아세틸콜린을 멈추고, 자극을 종료하기 위해 시냅스에 존재한다. 다른 신경전달물질은 화학변화를 일으키거나 자극을 종료하기 위해 시냅스전 뉴런으로 백업으로 저장된다.
중추신경계에서 많은 뉴런은 한 개의 뉴런에 수렴할 수 있다. 시냅스전 뉴런의 각각이 시냅스후 뉴런과 그 시냅스로 신경전달물질을 방출할 때, 국소 막전위가 발생하여 통합되고 합쳐진다. 상기의 입력 신호는 억제나 촉진신호일 수 있다. 결과적으로 합해진 막전위가 상기 뉴런에 대한 최소 역치에 도달하면, 그 때 활동 전위가 개시될 수 있다.
활동 전위는 도약성 전도에 의해 세포체로부터 한 방향으로 이동한다. 가장 빠른 뉴런은 랑비에 결절이라고 불리는 노출된 신경막의 결절에 의해 분리된 명확한 단편으로 배열된 수초로 뒤덮인다. 도약성 전도에서, 전기적 전위는 결절에서 결절로 뛰어 넘고, 그에 따라 활동 전위의 전도에 관계하는 막 영역을 줄이고, 전도의 속도를 올린다.
신경계에서 발견되는 비-신경 세포는 신경교세포라고 불린다. 성상세포는 가장 다수의 것이고, 뉴런의 지지와 자양물을 제공한다. 소교세포는 신경 조직에 특이적인 작은 식세포이다. 뇌실계와 척수의 중부관을 연결하고 뇌척수액을 생성하는 세포는 뇌실막 세포로 불린다. 중추신경계에서, 희소돌기교세포는 다양한 뉴런의 수초의 단편을 형성한다. 말초신경계에서, 수초의 각 구분은 한 개의 슈반 세포에 의해 만들어진다.
중추신경계
중추신경계(CNS)는 뇌와 척수로 이루어져 있다. 뇌막(경막, 거미막과 연뇌막)은 두개골과 척추골에 의한 보호와 더불어 CNS를 보호하고, 영양을 공급한다. 뇌척수액은 거미막밑공간, 척주의 중심관 및 뇌실에서 발견된다. 연뇌막은 가장 내부의 층이고, 신경 조직에 부착한다. 거미막이 연뇌막과 경막의 사이에 있다. 거친 섬유성 경막이 두개골 바로 아래에 있다.
뇌는 전뇌, 중뇌와 뇌간의 3개의 기본적인 영역으로 나눠질 수 있다. 전뇌는 시상, 해마체, 기저핵과 대뇌를 포함한다. 대뇌는 의식적인 생각, 감정의 해석, 모든 자발적인 운동, 정신적인 능력과 감정에 관련되어 있다.
뇌의 조직은 구조 및 기능적 영역으로 나눠질 수 있다. 대뇌의 표면은 회(이랑)와 구(고랑)으로 뒤엉켜 있다. 피질 감각과 운동 영역은 각각, 중심뒤이랑과 중심고랑에 배치되어 있다. 감각 영역은 시상의 처리 후 진행되는 신체의 반대쪽으로부터 감각 정보를 받는다. 더 많은 감각 신경 말단을 갖는 신체의 일부는 더 많은 피질 감각 영역에 의해 제시된다. 운동 영역은 반대측 신체 일부의 자발적인 근육 운동을 제어하나 연합 영역이 운동의 개시에 있어서 중요하다.
대뇌는 두뇌의 가장 큰 부분이고, 좌뇌와 우뇌의 2개의 반구로 나눠지고, 여러 엽을 포함한다. 전두엽은 지성과 행동에 대한 운동 영역, 브로카의 언어 영역, 연합 영역과 기능을 포함한다. 두정엽은 감각과 청각에 대한 감각 영역과 기능을 포함한다. 주요한 시각 관련 영역은 후두엽과 측두엽에 위치하여 청각 관련, 냄새와 기억 저장을 위한 영역을 포함한다.
시상은 뇌의 외피와 뇌간의 사이에 위치한다. 후각 이외의 모든 감각 입력은 뇌의 다른 영역에서 진행되기 전에 여기에서 처리된다. 해마체는 시상의 아래에 위치하고, 내부의 자극 처리와 내부의 환경 유지를 맡고 있다. 혈압, 온도, 심박동수, 호흡, 물 대사, 삼투몰농도, 기아, 및 신경내분비 활동의 순간의 무의식적 제어가 여기에서 다루어진다. 옥시토신과 ADH를 뇌하수체 후엽으로부터 방출하는 신경내분비 세포의 핵은 해마체에 위치한다.
기저핵(미상핵, 담창구, 흑질, 시상하핵, 적핵)은 대뇌의 각 반구 내에 파묻힌 뉴런의 군이다. 상기들은 복잡한 운동 제어, 정보 처리와 무의식의 총체의 지향적 운동의 제어에 관계하고 있다.
뇌간은 연수와 교를 포함한다. 연수는 호흡, 강심제와 혈관의 크기를 조절하는 반사 작용의 제어를 위해 중요한 기능의 영역과 중개소를 포함한다. 교는 호흡의 규칙에 관계하고 있는 호흡조절중추를 포함한다.
대뇌는 뇌간보다 위에 있고, 신체, 운동, 자세와 평형의 위치에 관하여 어디에서든 처리되는 감각 정보를 사용한다. 운동은 대뇌에서 시작되지 않으나 대뇌는 조화된 운동에 필요하다.
말초신경계
말초신경계는 뇌와 척수 외에 위치한 신경, 신경절, 척추와 뇌신경을 포함한다. 12개의 뇌신경은 뇌간에 위치한 핵으로부터 나타나고, 냄새, 시각, 타액분비, 심장박동수와 피부감각과 같은 다양한 자율적 기능을 제어하기 위해 자극을 운반하면서 특정 지역으로 이동한다. 뇌신경은 감각과 운동 구성원을 운반하여 자주 섞이지만, 운동 또는 감각 섬유만을 가진다. 하기의 표는 뇌신경과 그의 기능을 열거한다.
표 1 뇌신경
| 번호 | 이름 | 기능 |
| I | 후각신경 | 후각 |
| II | 시신경 | 시력 |
| III | 안구운동신경 | 눈 근육 일부와 눈꺼풀의 운동 제어 |
| IV | 활차신경 | 눈 근육 일부와 운동 제어 |
| V | 삼차신경 | 저작근과 안면 감각 일부 |
| VI | 외전신경 | 눈 근육 일부와 운동 제어 |
| VII | 안면신경 | 안면근육의 운동 제어, 타액분비, 맛과 피부감각 |
| VIII | 청신경 | 균형, 정적인 감각과 청각 |
| IX | 설인신경 | 타액분비, 피부의 감각, 맛과 내장 |
| X | 미주신경 | 심장과 내장의 운동제어, 흉부, 인두 및 복부 내장으로부터의 감각 |
| XI | 부신경 | 인두와 어깨에 대한 운동 자극 |
| XII | 설하신경 | 혀, 골격 근육 일부, 내장 일부, 피부와 내장 감각의 운동 제어 |
말초신경계의 감각계는 여러 종류의 수용기로부터 정보를 받고, 그것을 처리하여, 중추신경계에 보낸다. 감각 정보는 자기수용감각(접합과 근육의 위치의 감각)에서와 같이 내부에서 또는 피부의 압력 또는 열감과 같이 외부에서 올 수 있다. 특정의 척수 신경에 의해 신경을 통하게 하게 되는 피부의 영역은 피부절로 불린다. 구심성 섬유는 감각 정보를 모으고, 척수 쪽으로 운반하고, 시상에 모여서, 마침내 대뇌의 감각 외피에서 멈춘다. 감각 수용기가 더 많은 부위, 즉 손가락 끝 또는 입술은 뇌의 감각 외피 위의 더 넓은 영역과 교신한다. 자기수용감각의 정보를 나르고 있는 섬유는 대뇌에도 분산된다. 대부분의 감각계는 자극을 시상의 일부에 보낸다. 뇌의 외피는 감각 자극의 의식적인 지각과 해석에 관계하고 있다.
근육과 분비선으로의 운동 정보 입력은 자율원심성계(automatic efferent system)와 체성원심성계(somatic efferent system)를 통하여 일어난다. 접합, 건(힘줄)과 근육의 CNS 신경분포는 체성원심성계를 통하여 전해진다. 일부 근육의 반응은 척골의 반사 작용을 통하여 조종된다. 상기의 예는 손가락이 뜨거운 난로에 닿았을 때 보이는 도피반사 작용이다. 고통이 뇌에 도달하기 오래전에 손가락을 떼어 내는 운동은 단순척수반사 작용을 통하여 일어난다. 분명히 상기는 더 이상의 손상을 피하는 보호 장치이다. 분비선과 민무늬근에의 운동 정보 입력은 보통 자율계를 통하여 일어난다.
대부분의 기관은 자율신경계의 두개의 가지로부터 정보를 받는다. 다른 가지가 특정 기관 또는 조직에서 억제성인 반면 한 가지는 일반적으로 흥분성일 수 있다. 자율계의 교감가지는 생리적 스트레스에 대해 신체를 준비시킨다. 신체가 반응하여 달리거나, 싸울 준비를 한다는 점에서 교감가지의 흥분은 자동차의 가속페달을 밟는 것과 유사하다. 증가된 심장박동, 기도의 팽창과 글리코겐 저장으로부터 포도당의 동원 같은 효과가 나타난다. 교감신경은 첫 번째 흉추로부터 네 번째 요추까지 발생한다. 상기는 척주를 따라 있는 연쇄 신경절 중의 하나에서 끝나는 짧은 절전뉴런을 가진다. 아세틸콜린은 긴 절후뉴런을 가진 시냅스에서의 신경전달물질로 목표 조직으로 이동하면 대다수의 교감신경 끝에서 노르에피네프린이 방출된다. 그것이 땀샘 또는 골격의 근육 맥관구조에 신경을 통하게 하는 것처럼, 소수의 교감 절후 뉴런은 아세틸콜린을 방출한다.
부교감 가지는 CNS의 두개골 부위와 천추 부위로부터 기인하는 뉴런을 통하여 교감 가지와 균형을 이루기 위해 활동한다. 예를 들면, 부교감 자극은 기도를 수축시키고, 심장박동수를 감소시킨다. 상기는 소화, 배뇨와 발기와 같은 정적 활동을 통제한다. 긴 절전뉴런은 종말기관 근처에 시냅스에 아세틸콜린을 방출한다. 짧은 절후뉴런도 작용자 조직위에 아세틸콜린을 방출한다.
미엘린 생산 세포에 의한 손상된 신경 세포의 재생
본 발명에 의하면, 신경 재생이 일어나기 위해 2개의 사건이 발생해야 한다. 첫째, 치료 혜택을 받는 신경세포 뿐 아니라 재생인자 생산 세포가 생육가능해야 한다. 둘째는 뉴런의 수포화가 일어나야 한다. 이런 관점에서는, 여러 다양한 세포타입들이 상기 표현형을 유효하게 하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 세포를 생존능 유도 세포와 미엘린 생산 세포는 신경을 재생하게 하기 위해 함께 사용될 수 있다.
신경 세포의 수초화를 손상된 신경의 재생에 의해 척수 손상을 치료하는 것에 적용할 수 있는지가 특히 심사숙고된다. 이런 관점에서는, 축색의 뉴레귤린-1(Nrg1)같은 발현하여 수초화를 유도하는 단백질(Michailov et al., Science, 304, 700-703, 4/30/2004)은 슈반세포에 제한되지 않는 신경세포에서, 홀로 또는 같은 다른 하나의 세포 또는 Nrg1을 발현하는 섬유아세포를 포함하나 이에 제한되지 않은 결합조직 세포와 같은 다른 유형의 세포와 결합하여 사용되고 발현된다.
신경의 재생과 신경 퇴화로부터의 보호에 관한 BMP의 효과
발명의 특별하고 예증된 관점은 래트에서 신경 손상 후 재생에 BMP-2와 BMP-9의 기능적 단백질의 효과를 결정하는 것에 관한 것이다. 스프래그 돌리종(체중, 400± 10 g) 래트 36마리를 3 개의 군(대조군, BMP-2와 BMP-9)으로 나누어 사용하였다. 상기의 비주입된 스프래그-돌리 래트에게 신경손상후 BMP-2 또는 BMP-9를 발현하는 세포를 주입한 동물군을 BMP-2 또는 BMP-9 군으로 언급한다. 지혈용 집게를 사용하여, 좌골신경에 압착성 손상을 가하였다. 대조군에는, 비-변이된 섬유아세포를 포함하는 완충용액만을 주사하였다. BMP-2와 BMP-9 군에는, 유전자-변이된 섬유아세포를 포함하는 완충용액이 주사하였다(BMP-2：BMP-2 분비 섬유아세포, BMP-9:BMP-9 분비 섬유아세포). 완전히 주입 후, 재생 효과는 1) 위-가자미근에서 기록된 좌골 신경 운동 전도 연구와, 2) 헤마토실린-에오신 염색과 수정된 삼색 염색을 이용한 좌골 신경의 조직학적 연구에 의해 평가하였다.
신경전도 연구는 1 주째에 대조군과 비교하여 BMP-2와 BMP-9 군에서 현저하게 짧은 지연 시간을 나타내었고, 넓이는 그 후 4 주째와 6 주째에 다른 군과 비교하여(p<0.05), BMP-9 군에서 더 큰 것으로 나타났다. 8 주후에, 모든 군에서 지연 시간의 명백한 차이가 나타나지 않았으나 넓이는 BMP-9 군에서 더 컸다.
조직학적 연구에서, 모든 군은 주 2까지 심한 퇴화(염증성 반응, 축색의 손실, 액포 변화가 출연하는 방법으로)를 나타내었다. 대조군에서 퇴화는 4 주와 8 주후에도 지속되었으나, BMP-2 군에서는 염증과 액포 변화의 크기가 현저하게 감소하였고, 절반의 군에서만 상기의 결과가 보였다. BMP-9 군에서, 상기의 변화는 축색돌기의 손실과 액포 변화를 나타내고 있는 것을 3분의 1로 훨씬 더 줄이게 되었고, 염증은 매우 약해졌다. 압착성 손상 후의 신경 재생에 관한 상기의 기능적 단백질의 효과는 상기 래트에서 유의하였다. 상기 결과는 말초신경 손상을 포함하는 신경 손상 후 신경의 재생을 나타낸다.
TGF-β, 액티빈과 BMP는 세포 분화, 성장과 기관 형성에 관계하고 있는 단백질이다. BMP는 TGF-β의 성장/분화 요인(growth/differentiation factors; GDF), 골원성 단백질(osteogenic proteins; OPs)과 Mullerian 억제물질/항-Mullerian 호르몬(Mullerian inhibiting substance/anti- Mullerian Hormone; MIS/AMH)과 함께 수퍼패밀리의 구성원이다(Ebara and Nakayama, Spine, 2002, 16S: S10-S15). 역사적으로, 1965년에, Urist는(Urist, MR: Bone, formation by autoinduction, Science, 1965, 150(698): 893-899) 설치류 동물과 토끼의 근육으로, 탈회된 골기질을 삽입하고 난 후연골내골화와 유사한 수정란 경화 및 다른 과정을 관찰하였다. 이식 후, 미분화된 중간엽 줄기세포는 주화성에 의해 삽입된 뼈 조직으로 옮겼고, 유사 분열과 응축이 계속되었다. 그 때 중간엽 줄기세포에서 유래된 연골모세포는 세포외 기질을 방출했고, 그것은 연골 형판의 형성을 가능하게 했다. 상기 세포외 기질은 조혈 세포와 혈관내피세포를 통하여 혈관을 발달시킨다. 골아세포와 용골세포가 국지적으로 나타나기 시작했고, 흡수된 연골은 뼈 조직으로 변했다. 21일 이후에, 뼈의 골수 중심을 포함하는 소골편이 형성되었다(Wang et al., Proc Nat Acad Sci USA, 1988, 85: 9484-9488). 탈회된 골기질로부터 상기의 변화 처리와 관련된 구성원은 골형성성장인자(bone morphogenic protein; BMP)로 기술되었다.
1988년, 왕 등(Wang et al., Proc Nat Acad Sci USA, 1988, 85: 9484-9488)은 우골(bovine bone)로부터 각각 16 kDa, 18 kDa 및 30 kDa 분자량의 세 개의 폴리펩티드를 분리하였다. 우즈닌 등(Woozney, Mol Rep Dev, 1992, 32: 160-167)은 후에 상기 폴리펩티드들을 탐침으로 사용하여 인간 RNA와 상응 DNA들을 분리하였다. 후속 연구는 적어도 16개의 내재성 BMP의 존재를 밝혀내었다(Wozney and Rosen, Clin Orthop, 1998, 346: 26-37).
BMP1(procollagen C-protease)를 제외하고, 상기는 형질전환성장인자(transforming growth factor, TGF)- β 수퍼패밀리의 모든 구성원이다(Wozney and Rosen, Clin Orthop, 1998, 346: 26-37).
구조적으로, BMP는 15-25개의 아미노산 신호 펩티드, 50-375 아미노산을 포함하는 프로도메인과 100-125개의 아미노산을 포함하는 성숙 말단 카르복실 말단으로 구성된 큰 선구체의 형태로 생산된다. 후자는 단백질분해 가공과정에 의해 카르복실 말단이 선구체로부터 나누어진 후, 펩티드의 결합을 가능하게 하는 잘 보존된 7개의 시스테인 잔기를 가진다(Croteau et al., 1999; 22: 686-695). 각각 활성을 지니고, 성숙한 BMP 단백질은 동일한 단량체로 구성되는 이황결합 동형체 또는 2가지 다른 종류의 단량체로 이루어지는 이황결합 이형체로 존재한다(Sampath et al., J Biol Chem, 19래트, 265: 13198-13250). 흥미롭게도, 단백질의 결합은 단백질의 활성에 연결되어 있고, BMP2와 BMP7의 이형체는 동일한 단량체로 구성된 동형체보다 강한 모르포겐(morphogen)이다(Kawabata et al., Cytokine Growth Factor Rev, 1998, 9: 49-61; Sampath et al., J Biol Chem, 1990, 265: 13198-13250).
BMP의 생물학적 활성을 이용하기 위해서, 세포에서의 BMP 유전자 발현의 조절과 BMP 이량화의 메커니즘을 이해하는 것이 필요하다. 비록 BMP의 유전자 발현에 관해 많이 알려지지 않았지만, 염기성 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix, bHLH) 단백질에 의해 조절될 것이라고 알려져 있다(Ebara et al., Biochem Biophys Res Commun, 1997, 240: 136-141). 상기의 bHLH 단백질은 양성 전사 활성자의 역할을 수행하는 2 개의 외부 도메인과 음성 조절자의 역할을 수행하는 중앙 도메인을 포함하는 3개의 도메인으로 이루어진다. 상기의 도메인 중, E-상자(246~265 bp의 DNA 서열)는 USF 전사 인자에 의해 인식되고, 쥐의 BMP 발현의 조절에 중요한 역할을 수행한다. BMP는 또한 세포 사멸 경로의 조절에 관련되어있다.
BMP의 생물학적 활성은 전사 수준을 넘어 다양한 시간(timepoint)에 세포외적으로 강력히 통제된다. 세포 외부에서, 억제 단백질의 역할을 수행하는 BMP의 수용기는 BMP와 쉽게 반응하고, BMP의 증가된 활성에 따라, 궁극적으로 그의 조절을 가져오는 음성 피드백 신호의 생산 촉진을 유도할 것이라고 생각된다(Ebara and Nakayama, Spine, 2002, 16S: S10-S15). 내부에서는, 세포는 신호 전달과 Smad 억제 단백질에 의해 조절되고 이는, BMP가 Smad 단백질의 발현을 상승 조절할 수 있는 것을 의미한다(Ebara and Nakayama, Spine, 2002, 16S: S10-S15).
세포외 수준에서, 세포는 BMP의 세포 수용기로의 결합을 억제하는 노긴(noggin)과 연골질(chondrin)과 같은 BMP 결합 단백질에 의해 조절된다. 꼬인 장배형성(Twisted gastrulation, Tsg)은 연골질의 기능을 향상시킨다(Ebara and Nakayama, Spine, 2002, 16S: S10-S15). 폴리사틴(Follisatin)은 OP-1/BMP-7과 BMP-4 단백질에 결합하고 BMP를 억제한다(Matzuk et al., Nature, 1995, 374: 360-363).
BMP 수용기
BMP는 세린-트레오닌 키나아제(serine-threonine kinase) 수용기의 2 가지 다른 형(I와 II 형)에 결합한다. 2개의 I 형 수용기와 1개의 II 형 수용기는 포유류에서 확인되었다(Kawabata et al., Cytokine Growth Factor Rev, 1998, 9: 49-61). 포유류에서 I형 수용기는 동형체(isoform) A와 B를 가지고, 그리고 비록 그것들이 구조적으로 유사하지만, 그것들은 Smad 단백질의 그의 활성화에서 다른 행동을 보인다(Imamura et al., Nature, 1997, 389: 549-551). 신호의 전달에서, I와 II 형 수용기는 복합체를 이룰 필요가 있다. I 형 수용기는 II 형 수용기에 의해 활성화 되고, 그리고 신호는 I 형 수용기에 의해 세포에서 변환된다. 세포에서 신호는 Smad 단백질에 의해 변환된다. Smad1, Smad5와 Smad8은 같은 구조에 속하고 있고, BMP로부터 신호를 변환한다. Smad2와 Smad3는 TGF-β와 액티빈으로부터 신호를 변환한다. 상기 Smad는 이형 복합체를 이루고, 여러 가지 유전자를 활성화하기 위해 핵으로 이동한다. Smad6, Tob, Ski와 Smurf1은 상기 유전자의 음성 조절에 관계하고 있다. 이들 중에, Smad6가 BMP 전사를 억제하고, 또한 BMP 신호전달 경로의 음성 피드백에서 역할을 수행한다(Bai et al., J Biol Chem, 2000, 275: 8267-8270). Tob는 항증식성 단백질 패밀리의 구성원이고, BMP/Smad 신호의 음성 조절에 관계하고 있다(Yoshida et al., Cell, 2000, 103: 1085-1097). Ski 암단백질은 BMP-신호와 BMP-반응 유전자의 발현을 억제하고, BMP를 특징짓는 Smad 복합체와 직접 반응하여 BMP의 활성을 억제한다(Wang et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 14394-14399). Smurf1은 유비퀴틴(ubiquitin) 리가아제의 Hect 패밀리에 속하고, 수용기-조절 Smad와의 선택적 결합에 의해 BMP의 신호의 전달을 억제한다(Zuh et al., Nature, 1999, 400: 687-693).
단백질의 BMP 패밀리의 기능에 관한 더 많은 연구가 진행 중이고, 그것들이 배아단계동안 신경계(Farkas et al., J Neurosci, 1999, 92: 227-235), 눈(Mohans et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 1998, 39: 2626-2636), 폐, 신장, 전립선, 생식 기관 및 모낭을 포함하는 기초적인 신체 형성의 기획에 관계하고 있는 것 같다. 예를 들면, 손가락과 손가락 사이 공간의 형성이 BMP에 기인하는 손가락 사이의 세포의 세포자살현상(apoptosis)에 의한다고 보고되었다(Zou and Niswander, Science, 1996, 272: 738).
BMP는 배아기 동안 골격계의 형성, 분화와 치료에 관계하고 있다. 출생 후의 골격계에서, BMP는 뇌 기질의 교원질, 골막세포와 혈액 형성 구성원으로 가득찬 간질의 중간엽세포에 존재한다. BMP는 또한 골육종과 연골 연골육종으로부터 분리되었다(Lianjia and Yan, Clin Orthop, 1990, 257: 249-256). 골절 후, BMP는 흡수된 골기질에 확산되고, 골전구세포를 활성화하고, 순번대로 더 많은 BMP를 생산한다. BMP의 분배는 치료 시간과 골절 위치에 의존적이고, 상호작용으로 더 복잡하게 될 수 있다. BMP 연구는 그것들의 보호 또는 재생 효과를 연구하기 위해 다양한 다른 조직들에서 수행되었고, BMP의 복강 주사 후 뇌허혈을 유발하는 실험에서 확장된 신경계에서 허혈시 심근의 기능과 심근의 재관류(Lefer et al., J Mol Cell Cardiol, 1992, 24: 585-593)에 보호적인 효과와 손상된 신장에 재생 효과(Ripamonti and Duneas, Plast Reconstr Surg, 1998, 101: 227-239)를 지니는 것을 증명했다.
본 발명의 적용은 말초신경의 분화에 관련되어 있는 BMP가 비 처리의 군의 치료 과정과 비교하였을 때 유리하게 신경을 치료하는 것을 보여준다.
In vivo
와
Ex vivo
방법
본 발명은 관심있는 부위로의 유전자의 전달이 ex vivo 방법에 제한되지 않는다. In vivo 방법 또한 고려된다. 또한, 주입 부위에서 목적 단백질의 발현이 가능한 어떠한 길이의 벡터도 사용될 수 있다. 벡터는 관심 유전자의 발현에 사용될 수 있는 한 플라스미드 또는 어떤 수의 바이러스 벡터도 될 수 있다.
본 발명은 하기의 상세한 설명과 첨부된 도면으로부터 더욱 충분히 이해될 것이고, 본 발명은 하기의 내용에 한정되지 않는다.
도 1A-1B는 BMP-9 군에서 손상 후 2 주의 래트 좌골신경의 현미경 실험을 나타내며, 매우 심한 축색돌기와 수초의 퇴화와 뚜렷한 액포화를 나타낸다. 또한 도 1A-1B는 신경주위 연조직에서 단핵염증세포의 상당한 침투를 보여준다(A; H&E 염색, B; 수정된 삼색염색 200 ×).
도 2A-2B는 BMP-9 군에서 손상 후 4 주의 래트 좌골신경의 현미경 실험을 나타내며, 이는 손상된 영역의 대략 70%가 액포화된 것을 보여준다. 약간의 수포 소화방이 관찰되었고, 가벼운 내막 섬유형성 역시 관찰되었다(A; H&E 염색, B; 수정된 삼색염색 200 ×).
도 3A-3C는 BMP-9군에서 손상 후 8 주의 래트 좌골신경의 현미경 실험을 나타내며, 축색돌기의 약 50%의 액포화를 보여준다. 심한 단핵염증세포는 신경외막의 공간에서 침투되었다. 또한, 국소출혈이 신경혈관에 존재한다(A; H&E 염색 × 200, B & C; 수정된 삼색염색 각 200 × & 100 × ).
도 4A-4B는 BMP-9 군에서 손상 후 8 주의 래트 좌골신경의 현미경 실험을 나타내며, 축색돌기의 약 33%의 액포화를 보여준다. 약간의 단핵염증세포가 신경외막의 공간에 남아있다(A & B; 수정된 삼색염색 200 × ).
도 5A-5B는 BMP-9 군에서 손상 후 2 주의 래트 좌골신경의 현미경 실험을 나타내며, 축색돌기의 대부분에서 액포화를 보여준다. 축색돌기 위축과 비탈수초화가 중앙에서 관찰되었다(A & B; 수정된 삼색염색 각 100 × & 200 × ).
도 6A-6B는 BMP-9 군에서 손상 후 4 주의 래트 좌골신경의 현미경 실험을 나타내며, 축색돌기의 절반에서 액포화를 보여준다. 비탈수초화가 가벼운 내막 섬유형성과 함께 관찰되었다(A & B; 수정된 삼색염색 각 100 × & 200 × ).
[0016] 도 7A-7B는 BMP-9 군에서 손상 후 8 주의 래트 좌골신경의 현미경 실험을 나타내며, 축색돌기의 대략 절반에서 액포화를 보여준다. 몇몇 단핵염증세포는 신경외막의 공간에 존재하고 있다(A & B; 수정된 삼색염색 각 100 × & 200 × )
도 8A-8B는 BMP-9 군에서 손상 후 2 주의 래트 좌골신경의 현미경 실험을 나타내며, 대부분의 모든 축색돌기가 퇴화되고 단핵염증세포는 축색돌기의 주위에서 침투된 것을 보여준다. 신경외막 섬유형성 역시 관찰되었다(A & B; 수정된 삼색염색 각 100 × & 200 × ).
도 9A-9B는 샴 군에서 손상 후 4 주의 래트 좌골신경의 현미경 실험을 나타내며, 축색돌기의 대략 33%가 퇴화되는 것과 액포화가 뚜렷해지는 것을 보여준다(A & B; 수정된 삼색염색 각 100 × & 200 × ).
도 10A-10B는 샴 군에서 손상 후 8 주의 래트 좌골신경의 현미경 실험을 나타내며, 축색돌기의 대략 10~20%의 퇴화와 액포화가 뚜렷해지는 것을 보여준다(A & B; 수정된 삼색염색 각 100 × & 200 × ).
본 발명은 본문에 기술하게 되는 특정화된 실시예의 범위에 제한되지 않는다. 실제로, 본문에 기술된 것에 추가하여 본 발명의 다양한 변형들은 상기의 서술과 첨부되는 도면으로부터 당 분야 숙련자에게 분명해질 수 있다. 상기의 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함된다. 이하의 실험예는 본 발명의 실례로서 제공되나 이에 제한되는 것은 아니다.
실험예
실험예 I - 재료와 방법
재료
본 연구에서는 체중 400± 10 g의 성숙한 스프래그 돌리 종 래트(16~18 주)가 사용되었다. 성숙한 래트를 사용한 이유는 성장기의 래트와 비교해서 신경 재생과 생리적 변화 때문에 변화를 관찰하기 쉽기 때문이다.
방법
말초신경에 기능적 단백질 BMP를 주사하는 것은 기술적으로 어렵다. 이와 같이, 이 연구에서, BMP2와 BMP9가 국지적으로 분비될 수 있게, BMP2와 BMP9를 생산하는 래트 섬유아세포는 말초신경으로 직접 형질전환시켰다. 모두 36마리의 래트는 3개의 군으로 나누었다. 각 군은 신경이 손상된 12마리의 래트로 이루어졌다. 첫 번째 군은 손상된 신경을 삽입유전자 없이 비-변형되었던 섬유아세포로 치료된 래트로 구성된 대조군이었다. 두 번째 군(BMP2 군)은 손상된 신경을 BMP-2 삽입유전자로 유전자-변이된 섬유아세포로 치료한 래트로 구성되었고, 그리고 세 번째 군(BMP9 군)은 손상된 신경을 BMP-9 삽입유전자로 유전자-변이된 섬유아세포로 치료한 래트로 구성되었다. 조직의 조직학적 실험은 치료 후, 2, 4, 및 8 주에 각 군으로부터 2마리의 래트를 희생하여, 양 다리부터 좌골신경을 수득함으로써 실행되었다. 신경 운동 전도 연구는 또한, 실험 전에 고유의 기준 가치를 설정하고, 외과 수술 후 8 주까지 격주로 신경 전도를 측정함으로써, 양 다리의 좌골신경에서 실행되었다.
신경 손상
흰래트는 300 mg/kg의 농도로 4%의 클로랄 수산화물의 복강주사에 의해 마취 시켰다. 털은 엎드린 자세로 고정되기 전에 오른쪽 다리의 후배부와 대퇴부로부터 제거하였다. 포타딘(potadine)과 70% 알코올로 대퇴부 부위를 멸균한 후, 좌골신경을 적출하기 위해 대퇴부의 중심 부분 주위의 대략 1~1.5 ㎝의 외피를 수직으로 절개하고, 대퇴부 이두근을 바깥쪽으로 끌어당겼다. 신경 손상은 DeKoning 등의 방법(De Koning et al., J Neurol Sci, 1986, 74: 237-246)에 따라, 좌골신경을 노출시키기 위해 대퇴와 전슬관절사이의 길이 2~2.5 ㎝의 피부절개와 배부와 슬관절 근육의 박리에 의해 수행하고, 지혈용 집게(Crile, 15 ㎝)로 30 초 동안 분쇄하여 좌골 탈장에서 노출시켜 신경을 손상시켰다. 집게는 3 가지 다른 수준의 집기 강도(holding strength)로 설정될 수 있고, 고정된 영역에서 신경 손상에 대한 집기의 같은 수준을 적용하기 위해, 가장 강한 집기 정도로 고정된 지역에서 분쇄 손상을 가능하게 하는, 집게의 끝으로부터 5 ㎝에 검은선을 표지하였다. 지혈 집게 제거 후에, 첫 번째 또는 대조군은 초극세집게(30 게이지)를 이용하는 신경 손상 지역의 2 mm 내에 0.05 ㎖ 비 수정된 섬유아세포(단위: 5 × 105 세포/50 ㎕)를 포함하는 완충용액을 주사하였다. 두 번째와 세 번째 군은 상처 난 지역을 봉합하고 살균하기 전에 동일한 방법으로, 각각 BMP2와 BMP9을 분비하는 유전자-변이된 섬유아세포로 주사하였다.
신경전도 실험
신경전도 실험은 4%의 클로랄 수산화물로 래트를 마취시키고 난 후에 실행하였다. 활성-저장 전극은 좌골절흔을 자극하기 위해 종아리 근육에 놓았고, 참조 전극은 발 위에 놓았고, 그리고 기저 전극은 자극하는 전극과 기록하는 전극의 사이에 놓았다. 패취-유사 전극이 바늘 전극에 의해 피부 아래에 놓인 기록 전극과 기저 전극으로서 사용되었다. 신경전도 실험은 키포인트(Dantec, Denmark)를 사용하여 수행하였다. 이 연구에서 빈도, 기록 속도, 및 기록 민감도는 각각 2~10,000 Hz, 2 msec/division, 5 mV/division으로 설정되었다. 신경전도 실험은 2주 마다 수행하였다. 측정은 실험 개시 후부터, 이후 2, 4, 6과 8주에 뒤이어 계속하였다. 실험동안의 지연 시간과 넓이는 기준선과 음극 전극 점의 사이에서 넓이에 의해 측정되었다. 신경전도 연구를 위해 5마리의 래트를 각 군에서 선별하고, 10번의 측정을 양쪽에서 수행하였다. 실험실의 온도와 래트의 온도는 각각 25℃와 30℃로 유지되었다.
병리학/조직학적 조직 실험
상처 후 자연치유를 관찰하기 위해서 실험 개시부터 손상 전에 정상신경을 검사함으로써 손상후 자연치료를 관찰하기 위해 래트로부터 신경조직의 검사를 수행하였다. 4(4)마리의 래트(8개의 신경)는 유전자도입 과정이 없는 세포로 신경의 재생을 관찰하기 위해 사용되었다. 2마리의 래트(4개의 신경)는 임의로 각 군에서 선택하였고 조직은 2, 4와 8 주 이후에 실험하였다. 조직 실험을 위해, 대략 2 ㎝의 좌골신경을 마취된 래트의 뭉개진 손상의 부위로부터 벗겨냈다. 신경 조직의 변화는 완충된 포름알데히드 용액으로 고정한 후 광학 현미경 하에서 관찰하였고 H&E 염색법(hematoxylin-eosin, H&E)과 수정된 삼색(modified trichrome, MT) 염색법으로 염색하였다.
데이터 분석
신경손상 후 2, 4, 6 및 8주에 활동 전위의 최대 넓이와 각 군으로부터의 합성 근육의 지연 시간동안의 변화는 참고군과 비교하였고, 통계적 분석은 SPSS-PC 프로그램으로 수행하였다. 각 군의 비교는 ANOVA와 t-실험에 의해 실행하였고 유의 수준은 0.05로 설정하였다. 손상과 재생의 정도는 병리학자에 의해 해석되었던 것처럼 조직학적 자료에 의해 결정되었다.
실험예 II - 무게 변화
처음에, 래트는 400± 10 g의 범위의 무게였다. 무게 변화는 하기의 표 2에 나타난다. 2 주째에 각 군 사이에서 차이가 관찰되지 않았으나, BMP9 군은 4 주와 6 주에 다른 군과 비교되는 약간의 차이(p<0.05)를 나타내었다. 8 주째에, 군 사이에 통계적으로 중요한 차이(p>0.05)는 없었다(표 2).
표 2. 실험군의 체중의 변화
| 2 주 | 4 주 | 6 주 | 8 주 | |
| 샴 군 | 380.7± 29.0 | 365.0 ± 57.7 | 430.0 ± 57.7 | 460.0 ± 46.2 |
| BMP2 | 370.6 ± 24.8 | 368.3 ± 74.7 | 382.5 ± 141.5 | 470.0 ± 40.9 |
| BMP9 | 366.8 ± 34.2 | 442.0 ± 79.8 | 505.0 ± 77.6 | 508.0 ± 60.6 |
실험예 III - 지연 시간의 변화
실험 전에 각 군으로부터 임의로 측정된 기준자료는 1.44± 0.11 msec의 지연 시간을 나타내었다. 2 주와 4 주에 대조군, BMP2군과 BMP9군 간에 외상 후 지연 시간에 차이가 있었지만, 통계적 유의성(p>0.05)은 부족했다. BMP2군과 BMP9군의 지연 시간은 6 주째에 대조군과 비교하여 현저히 짧아졌다(p<0.05). 그러나 8 주째에 3 군에 지연 시간의 차이는 없었다(p>0.05)(표 3).
표 3. 실험군의 지연 시간의 변화
| 2 주 | 4 주 | 6 주 | 8 주 | |
| 샴 군 | 1.30 ± 0.11 | 1.29 ± 0.04 | 1.25 ± 0.21 | 1.10 ± 0.0 |
| BMP2 | 1.24 ± 0.14 | 1.25 ± 0.07 | 1.08 ± 0.07* | 1.04 ± 0.04 |
| BMP9 | 1.19 ± 0.12 | 1.23 ± 0.10 | 1.06 ± 0.03* | 1.15 ± 0.07 |
실험예 IV - 넓이의 변화
실험 전에 각 군으로부터 임의로 측정된 기준자료는 23.9± 4.3 mV의 넓이를 나타내었다. BMP9 군의 넓이는 외상 후 2 주와 4 주째에 대조군과 비교하여 현저하게 증가하였다(p<0.05). BMP2군과 BMP9군은 6주에 대조군과 비교하여 중요한 차이를 나타내었고(p<0.05), 중요한 차이는 8 주째에 BMP9, BMP2와 대조군의 순서로 나타내게 되었다(p<0.05)(표 4).
표 4. 넓이의 변화
| 2 주 | 4 주 | 6 주 | 8 주 | |
| 샴 군 | 3.98 ± 1.52 | 6.17 ± 1.27 | 6.33 ± 1.27 | 6.3 ± 1.31 |
| BMP2 | 6.14 ± 1.51 | 7.51 ± 1.29 | 9.00 ± 1.69* | 7.17 ± 0.50* |
| BMP9 | 6.79 ± 1.34* | 9.53 ± 4.47* | 9.47 ± 1.22* | 10.26 ± 2.27* |
실험예 V - 조직학과 병리학적 관찰
각 군으로부터 임의대로 선택한 래트의 조직학적 신경 조직 실험은 도 10을 통하여 도 1에서 나타낸 바와 같이 신경생리 실험의 결과와 유사한 변화를 보였다. 신경조직의 축색돌기가 재생되지 않았고, 염증반응이 남아있기 때문에, 대조군은 가장 느린 회복률을 나타냈다. BMP2 또는 BMP9를 분비하는 유전자-변이 섬유아세포로 형질전환된 실험군은 초기에 대조군과 비교하여 현저한 차이를 보이지 않았고, 2주에 모든 군에서 신경외막 정맥의 출혈과, 액포의 변화와 염증성 백혈구의 침투와 같은 신경의 압착 손상에 의해 유발된 심각한 병리적 징후를 나타내었다. 대조군에 대해, 상기의 증상은 8주 동안 내내 지속하였다. 그러나 BMP2군에 대해, 염증과 액포 변화의 정도는 현저히 줄었고, 그의 절반은 4 주와 8 주째에 상기의 증상을 나타내었다. BMP9군에 대해, 상기의 영향은 4 주와 8 주째에 더욱 두드러졌고, 그의 3분의 1만은 축색돌기의 소실과 액포의 변화가 나타났고, 더불어 매우 가벼운 염증이 나타났다.
본문에 인용되는 참고문헌은 전체가 참조에 의해 본문에 포함된다.
당업계 숙련자는 통상의 실험만으로, 본문에 구체적으로 기술된 본 발명의 구체적인 실시예에 다수의 등가물이 존재함을 인정하거나 확신할 수 있다. 그러한 등가물은 청구항의 범위에 포함된다.
Claims (19)
- 하기를 포함하는 신경재생 방법:a) 프로모터에 효과적으로 연결된 단백질의 형질전환 성장 인자 수퍼패밀리의 구성원을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 제작하는 단계;b) 배양된 세포의 개체군을 재조합 벡터로 in vitro 형질전환하여, 배양된 세포의 개체군을 수득하는 단계; 및c) 손상된 신경 근처의 영역에서 DNA 서열의 발현이 신경의 재생을 야기하도록, 손상된 신경 근처 영역에 형질전환된 세포를 이식하는 단계.
- 제 1항에 있어서, 형질전환 성장 인자는 BMP인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항에 있어서, BMP가 BMP-2 및 BMP-9인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 세포는 결합 조직 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 세포는 신경 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 신경은 말초신경인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8항에 있어서, 벡터는 레트로바이러스, 아데노-부속 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 포진바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기의 세포의 개체군은 이식 전에 저장되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기의 형질전환된 세포의 개체군은 이식 전에 액화 질소 하에 10% DMSO에 보관되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 하기를 포함하는 신경 재생 방법:a) 수포 재생 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 제작하는 단계;b) 배양된 세포의 개체군을 재조합 벡터로 in vitro 형질전환 하여, 배양된 세포의 개체군을 수득하는 단계; 및c) 손상된 신경 근처의 영역에서 DNA 서열의 발현이 신경의 재생을 야기하도록, 손상된 신경 근처 영역에 형질전환된 세포를 이식하는 단계.
- 제 12항에 있어서, 세포는 결합 조직 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 13항에 있어서, 세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12항에 있어서, 세포는 신경 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12항에 있어서, 세포는 신경교 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12항에 있어서, 세포는 슈반 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12항에 있어서, 단백질은 뉴레귤린-1(neuregulin-1)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12항에 있어서, 신경은 말초신경인 것을 특징으로 하는 방법.
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