JP2008500379A - 歯周病ワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、コンパニオン動物において歯周病を引き起こし、16S rRNA DNAによって同定される新規細菌単離体、該細菌に含有されるポリヌクレオチド配列、こうしたポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド、および不活化もしくは弱毒化されているこうした細菌単離体、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含むワクチンに関する。やはり提供するのは、歯周病を治療し、そして予防するための方法、および歯周病を検出し、治療し、そして予防するためのキットである。さらに、動物における歯周病に対するワクチンの有効性を評価するための方法を提供する。
歯周病に関する実験データの大部分は、ヒトまたはヒトから単離された細菌の研究に基づく。非ヒト動物、例えばコンパニオン動物、そして特にイヌおよびネコなどにおける歯周病に関しては、比較的わずかしか知られていない。
上述のように、ヒトにおける歯周病に関しては、非常に多くが知られている一方、コンパニオン動物における同じ疾患に関しては、非常にわずかしか知られていない。Fournier,D.ら,“Porphorymonas gulae sp.nov.,an Anaerobic,Gram−negative,Coccibacillus from the Gingival Sulcus of Various Animal Hosts”,International Journal of a Systematic and Evolutionary Microbiology(2001),51,1179−1189は、ATCC 57100と称するP.グラエ(P.gulae)新種の株を含む、多様な動物宿主から単離されたいくつかの株を記載する。著者らは、P.ジンジバリスの動物バイオタイプの株は、P.ジンジバリスとは異なるポルフィロモナス属種に相当すると仮定している。コンパニオン動物における歯周病を治療するのに有用なワクチンについての言及はない。HirasawaおよびTakada,“Porphyromonas gingivicanis sp. nov. and Porphyromonas crevioricanis sp. nov., Isolated from Beagles”,International Journal of Systemic Bacteriology,pp.637−640,(1994)は、ビーグル犬の歯肉溝浸出液から単離された2つの細菌種を記載する。これらの種は、米国特許第5,710,039号およびUS 5,563,063に記載される。著者らは、歯周病を治療するワクチンにおけるこれらの種の使用をどこにも示唆していない。公開番号WO 99/29870を有する国際出願PCT/AU98/01023は、多様なP.ジンジバリス・ポリペプチドおよびヌクレオチドを記載する。しかし、コンパニオン動物における歯周病を予防するのに有効なワクチンの証拠はまったく提供されない。ヒト疾患に関しては、非常に多くの情報があるが、ヒトにおいてさえ、この疾患を予防するかまたは治療する目的では、ほとんど達成されていない。
Gencoら(Trends in Microbiology 6:444−449,1998)は、ポルフィロモナス・ジンジビカニス(Porphyromonas gingivicanis)が仲介する歯周病を調べるためのラット・モデルを記載する。Greccaら(J.Endodontics 27:610,2001)は、誘導された歯根周囲歯周炎のイヌの歯を歯内治療した後、歯根周囲の修復のX線写真評価を記載する。
本発明は、細菌が、イヌ20Bと称されるポルフィロモナス・ジンジバリスの株でないという条件で、配列番号86〜94からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、16S rRNA DNA配列を有する、単離色素性嫌気性細菌を提供する。
別の側面において、本発明は、細菌がATCC 51700と称されるP.グラエ新種の株でないという条件で、ポルフィロモナス・グラエB43、P.カンスルシB46、P.シルクムデンタリアB52、P.グラエB69、P.シルクムデンタリアB97、P.カンジンジバリスB98、P.サリボサB104、O.デンティカニスB106、およびP.エンドドンタリスB114を同定する特徴を有する細菌からなる群より選択される細菌から単離されたヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
さらに別の態様において、単離ポリヌクレオチドは、リボソームRNAまたはトランスファーRNAをコードする。
別の態様において、本発明は、配列番号95〜102に示す配列のいずれかから選択されるfimA、またはその相補体に、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
好ましくは、宿主細胞は大腸菌(E.coli)BL21であり、そして前記ポリヌクレオチドは、発現ベクターpBAD/HisAまたはλ発現プラスミドをさらに含む。
やはり好ましいのは、免疫学的有効量のOprFおよび薬学的に許容しうるキャリアーを含む、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するためのワクチンである。
さらに別の態様において、本発明は、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するためのワクチン組成物であって、本発明記載の少なくとも1つの不活化単離色素性嫌気性細菌の免疫学的有効量、薬学的に許容しうるキャリアー、および場合によってアジュバントを含む、前記ワクチン組成物を提供する。
さらにさらなる側面において、本発明は、1以上の歯周病原性細菌に対するワクチンの有効性を評価する方法であって、動物において測定される臨床徴候が、歯肉溝浸出液、歯垢、感染した骨、または歯肉溝中の1以上の歯周病原性細菌レベルの増加、あるいはX線写真測定を介して定量化される歯槽骨(aveolar bone)量の変化を含む、前記方法を提供する。
細菌単離体
本発明は、16S rRNA DNA配列によって同定される、単離嫌気性細菌であって、コンパニオン動物において、歯周病、並びに多様な他の疾患および臨床徴候を引き起こす、前記細菌を提供する。より具体的には、細菌は、ポルフィロモナス属から選択される。
好ましい態様において、本発明のワクチンは、1以上のサブユニット・ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体、あるいは1以上の単離ポリヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
用語「ORF」は「オープンリーディングフレーム」、すなわち遺伝子のコード領域を示す。
用語「相同性」、「相同」等は、本明細書において、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列間で共有される同一性の度合いを意味する。
用語「宿主細胞」は、本明細書において、プラスミド、ウイルス、または他のベクターを宿する細菌または真核細胞を意味する。
用語「抗原性」は、タンパク質またはポリペプチドが、該タンパク質またはポリペプチドに対して作成された抗体に免疫特異的に結合される能力を指す。
用語「療法剤」は、細菌感染、あるいはそれによって引き起こされる疾患または状態の治療を補助する、分子、化合物または治療いずれか、好ましくは抗細菌分子または化合物を指す。
既知の試料採取、培養および単離技術を用いて、本発明が提供する細菌を得ることも可能である。例えば、歯周病を示すコンパニオン動物集団から、例えばイヌおよびネコから、微生物試料を得ることも可能である。>3mmの歯周ポケットを持つイヌおよび>2mmの歯周ポケットを持つネコなど、既知の目安を用いて、歯周病の証拠を観察することも可能である。コンパニオン動物の標本集団に関して、歯科指数(歯肉指数および歯周疾患指数)および歯周ポケットの深さなどの、歯周病を性質決定するための既知のパラメータを決定することも可能である。特定の動物の歯周ポケットから、個々の試料を得て、嫌気性条件下で維持し、そして多様な既知の培地を用いて培養することも可能である。
以下のコンパニオン動物歯周単離体が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110, USAに、2001年8月9日に寄託された:P.グラエB43(PTA−3618)、P.カンスルシB46(PTA−3619)、P.シルクムデンタリアB52(PTA−3620)、P.グラエB69(PTA−3621)、P.シルクムデンタリアB97(PTA−3622)、P.カンジンジバリスB98(PTA−3623)、P.サリボサB104(PTA−3624)、O.デンティカニスB106(PTA−3625)、およびP.エンドドンタリスB114(PTA−3626)。本発明の好ましい態様において、本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号86〜102および111〜119からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号103〜110および120〜128からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明のポルフィロモナス属ヌクレオチド配列をクローニングするのに使用可能な、いくつかの既知の方法または技術がある。例えば、制限断片として配列を単離して、そしてクローニングおよび/または発現ベクターにクローニングすることも可能であるし、配列をPCR増幅し、そしてクローニングおよび/または発現ベクターにクローニングすることも可能であるし、またはこれらの2つの方法の組み合わせによって、配列をクローニングすることも可能である。
fimAおよびoprFがコードするポリペプチドおよびタンパク質
本発明は、本発明のヌクレオチド配列によって発現される組換えポリペプチドの、一部切除(truncated)型および全長(天然タンパク質)型の両方を発現するのに使用可能な、ベクターおよび宿主細胞を含む、原核発現系および真核発現系の使用を含む。
抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、または組換えのいずれかであることも可能である。好適に、免疫原またはその一部、例えば配列に基づく合成ペプチドに対して抗体を調製することも可能であるし、あるいはクローニング技術によって組換え的に調製することも可能であるし、あるいは天然遺伝子産物および/またはその一部を単離して、そして免疫原として用いることも可能である。HarlowおよびLane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー,1988、並びにBorrebaeck,Antibody Engineering−A Practical Guide,W.H.Freeman and Co.,1992に一般的に記載されるように、当業者に周知の標準的抗体産生技術によって、免疫原を用いて、抗体を産生することも可能である。抗体断片もまた、抗体から調製可能であり、そして当業者に知られる方法による、Fab、F(ab’)2、およびFvが含まれる。
本発明はさらに、ポルフィロモナス属種を検出するためのキットを提供する。該キットには、本発明のポルフィロモナス属生物、ポリペプチド、またはポルフィロモナス属ヌクレオチド配列の存在に関して、試料を分析するための試薬が含まれ、ここでヌクレオチド配列の存在は、生物が存在する指標となる。この方法は、症状が存在する前に、疾患を診断可能であり、そしてしたがって、患者にダメージが発生する前に、疾患の開始を予防可能であるため、価値がある。抗体、PCR、ハイブリダイゼーション、および当業者に知られる他の検出法を用いて、ポルフィロモナス属種細菌、ポリペプチド、またはヌクレオチド配列の存在を決定することも可能である。
ワクチンが、コンパニオン動物において歯周病を療法的に治療するか、または歯周病に対する抵抗性を与えるか、または歯周病を予防するように、有効量で、本発明のワクチンをコンパニオン動物に投与することも可能である。本発明のワクチンは、歯周病を引き起こす細菌の管理に有用である。本発明のワクチンを、特に、獣医学の分野で用いて、コンパニオン動物を治療することも可能であり、そして歯周病を引き起こすことが知られる、本明細書記載の細菌に対する公衆衛生の維持のために用いることも可能である。
本発明のワクチンは、ワクチン配合物において、単位投薬型で存在することが好ましい。本発明の目的のため、免疫原性の量は、投与時に、約1x104〜1x1013不活化細菌細胞、0.1μg〜1mgの精製タンパク質、または0.1μg〜10mgの核酸を含む。多数の構成要素を含有するワクチン配合物では、同一のまたはより少ない免疫原性量を有用に使用可能である。
本発明のワクチンおよびワクチン組成物によって誘導される特定の防御機構は、以下に示すin vivo動物試験によって示されるように、ワクチン接種した動物における抗体および/または細胞性免疫応答の誘導である。
コンパニオン動物歯肉溝浸出液試料
獣医クリニックで歯周治療のために診察されたイヌおよびネコから、あるいは通常の検査のため、Pfizer Terre HauteまたはPfizer Sandwich施設のいずれかで診察されたイヌから、微生物試料を採取した。>3mmの歯周ポケットを持つイヌおよび>2mmの歯周ポケットを持つネコがこの研究に含まれた。歯科指数(歯肉指数および歯周疾患指数)および歯周ポケットの深さを記録した。目が粗い個々の吸収ペーパーポイント(Henry Schein;ニューヨーク州メルビル)を歯周ポケットに無菌的に挿入した。除去に際して、ペーパーポイントを、あらかじめ還元した嫌気性無菌(PRAS)嫌気性歯科輸送(ADT)培地(Anaerobe Systems;カリフォルニア州モーガンヒルズ)を含有するバイアルに、直ちに挿入した。
各臨床単離体を、いくつかの生化学分析、並びにプライマーD0056およびD0057(配列番号1および配列番号2;表1)を用いた16S rRNA DNA配列分析に供して、属および種を決定した。個々の単離体をBRUプレート上にストリークした。カナマイシン、バンコマイシン、およびコリスチン・ディスク(Anaerobe Systems)を寒天表面上に置いて、各単離体のKVC耐性パターンを決定した。また、精製コロニーをインドールおよびカタラーゼ試験(Anaerobe Systems)にも供した。リパーゼおよびレシチナーゼ産生パターンを決定するため、個々の単離体を卵黄寒天(EYA)プレート(Anaerobe Systems)に移した。このデータを表2に示す。
16S rRNA DNA配列に基づいて、単離体のタイプを決定した。3つ組で、プライマーD0056およびD0057(配列番号1および配列番号2;表1)を用いて、16S rRNA領域のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅のテンプレートとして、個々のよく単離されたコロニーを利用した。1xPCR緩衝液(Life Technologies;メリーランド州ロックビル)、1.0mM MgCl2、各1.25μMプライマー、各300μMデオキシ−NTP、および2.5U白金Pfx DNAポリメラーゼ(Life Technologies)を含有する50μl反応体積中でPCRを行った。以下のPCR周期条件を利用した:94℃2分間の変性工程;94℃40秒間の変性、60℃40秒間のアニーリング、および72℃1分間の伸長の30周期;72℃2分間の最終伸長工程;並びに4℃への最終冷却工程。すべてのPCR増幅に、GeneAmp 9700サーモサイクラー(Perkin Elmer Applied Biosystems;カリフォルニア州フォスターシティ)を利用した。
表3.示した細菌種を宿することが同定されたイヌおよびネコの数のまとめ
以下のコンパニオン動物歯周単離体が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110, USAに、2001年8月9日に寄託された:P.グラエB43(PTA−3618)、P.カンスルシB46(PTA−3619)、P.シルクムデンタリアB52(PTA−3620)、P.グラエB69(PTA−3621)、P.シルクムデンタリアB97(PTA−3622)、P.カンジンジバリスB98(PTA−3623)、P.サリボサB104(PTA−3624)、O.デンティカニスB106(PTA−3625)、およびP.エンドドンタリスB114(PTA−3626)。
この研究の経過中、細菌の16S rRNA配列が、入手可能なデータベース中に非常に類似のマッチを持たず、該細菌が新規単離体に相当しうることが示される、多くの臨床単離体を同定した。これらの単離体のうち1つの群は、新規種に相当するようであった。本明細書に提示するデータに基づいて、我々は、この新規の種が、オドリバクター新属と称する新規属に位置づけられると提唱する。オドリバクター・デンティカニスの標準株は、株B106T(=ATCC PTA−3625T;=CNCM I−3225T)である。
Vitek ANIカードを用いて、O.デンティカニスB106T、P.ジンジバリスATCC 53977、およびフゾバクテリウム・ヌクレアツム(Fusobacterium nucleatum)亜種ヌクレアツムATCC 23726の生化学反応パターンを決定した(表5)。O.デンティカニスB106Tは、陽性試験2つのみ(INDOLおよびTTZ)を生じたが、P.ジンジバリスATCC 53977は、5つの陽性試験(INDOL、PO4、NAG、BANA、およびTTZ)を生じた。RapID−ANA IIおよびVitek ANIカード間で共通する12の試験のすべてが類似の結果を生じた。Vitekに供給されるデータベースを用いると、O.デンティカニスB106T単離体は、信頼レベル63%で、誤ってF.ヌクレアツムと同定された(データ未提示)。この誤認は、Vitekデータベースに獣医学的PAB単離体が欠けているためである可能性もある。
プライマーD134(配列番号169)およびD57(配列番号2)を用いて、3つ組で、O.デンティカニスB106T由来の16S rRNA遺伝子をPCR増幅した。PCR産物をプールし、精製し、脱塩し、そして直接DNA配列分析に供した。O.デンティカニスB106T 16S rRNA遺伝子配列を用いた、米国バイオテクノロジー情報センターの非冗長ヌクレオチド・データベースのBLAST−N(Altschulら、1990)検索によって、O.デンティカニスB106T単離体が、バクテロイデス属のメンバーに関連することが示された。O.デンティカニスB106T 16S rRNA遺伝子配列は、バクテロイデス綱(Bacteroidetes)種口腔クローンFX069(寄託番号AY134906)の16S rRNA遺伝子配列と最も近く関連し、1,465bpに渡って、96.3%の同一性を示した。バクテロイデス綱種口腔クローンFX069は、HIV陽性患者における壊死性潰瘍性歯周炎(NUP)と関連する細菌種を定義する研究中、NUPのヒト患者から単離された(Paster, B.J.ら,“Phylogeny of Bacteroides, Prevotella,and Porphyromonas spp. and related bacteria”,J.Bacteriol.(1994),176:725−732)。
ポルフィロモナス属種の標準的増殖培地(脳心臓注入液(BHI)および肉細切れ炭水化物(CMC)培地)は、動物産物を含有し、これはワクチン産生には受け入れられないため、これらの成分を含有しない増殖培地を模索した。BHIまたはCMCの増殖のものと同等の増殖を支持する能力に関して、ヘミンおよびビタミンKの添加を伴うおよび伴わない多様な培地組成物を試験した。PYG完全培地およびME完全培地はどちらも、P.グラエB43(PTA−3618)の増殖を、BHIのものと同等のレベルに支持した(図5)。PYG完全培地は、発酵中、高密度の培養を生じる能力があるため、この培地をP.グラエB43(PTA−3618)増殖培地として選択した。この培地は、以下の成分を含有する:3%フィトン(Becton Dickinson;メリーランド州コッキースビル)、0.3%酵母エキス(Becton Dickinson)、0.3%グルコース(Sigma社;ミズーリ州セントルイス)、0.05%チオグリコール酸ナトリウム(Becton Dickinson)、0.5%塩化ナトリウム(Sigma社)、5μg/mlヘミン(Sigma社)(オートクレーブ後に添加)、0.5μg/mlメナジオン(Sigma社)(オートクレーブ後に添加)、および0.2%重炭酸ナトリウム(Sigma社)、pH7.0。
マウス歯周骨損失モデルにおいて、病原性に関して、9つの単離体(P.グラエB43、P.カンスルシB46、P.シルクムデンタリアB52、P.グラエB69、P.シルクムデンタリアB97、P.カンジンジバリスB98、P.サリボサB104、O.デンティカニスB106、およびP.エンドドンタリスB114)を試験した。体重が14〜15グラムと概算される、3週齢の年齢マッチさせた雄Balb/c CyJマウス(Jackson Laboratories;メイン州バーハーバー)をこの研究に利用した。動物を陽圧下のバリアケージ装置中で飼育した。実験全体を通じて、種に標準的な食物ペレット、および水を任意に提供した。利用したベッディングは、歯肉組織における固着(impaction)を最小限にするため、顆粒Bed O’Cobbsであった。受け入れ後、すべての動物を5〜7日間、慣れさせた。競合口腔フローラを減少させるため、スルファメトキサゾール(sulfamathoxazole)およびトリメトプリムの混合物(10ml飲用水;それぞれ、およそ2mgおよび0.4mg/ml)を10日間、動物に与え、その後、5日間の流出期間を置いた。各マウスの尾静脈血から、血清試料を採取した。強制経口投与によって、1%カルボキシメチルセルロース中、適切な細菌株およそ1x1010cfu/mlの0.5ml懸濁物で動物を感染させた。さらなる滴を口腔に入れた。この感染をさらに2回反復して全部で3回行った(月曜日、水曜日、および金曜日)。
図6は、純骨損失をグラフで示す。平均歯槽骨レベル(セメントエナメル接合部−歯槽骨稜)をmmで14の上顎部位から得て、そし各顎に関する平均値を決定した。各実験群に関して、各顎の平均値を合計して、そしてその群の動物総数で割ることによって、群平均を得た。
細菌種をBHIまたは完全PYG中、37℃で48時間、嫌気性培養した。1〜3mlの培養からの細胞を、遠心分離によってペレットにして、等量の嫌気性PBS中で1回洗浄し、再度遠心分離し、そして1/10体積の嫌気性PBSに再懸濁した。
以下のPCRプライマー:D0067(順方向;配列番号6)、D0078(順方向;配列番号8)、D0097(順方向;配列番号9)、D0068(逆方向;配列番号7)およびD0098(逆方向;配列番号10)の組み合わせを用いて、上位10の臨床単離体から単離したゲノムDNAから、fimA遺伝子をPCR増幅した。1xPCR緩衝液(Life Technologies)、1.0mM MgCl2、各1.25μMのプライマー、各300Mのデオキシ−NTP、および2.5U白金Pfx DNAポリメラーゼ(Life Technologies)を含有する50μl反応体積中で、PCRを行った。以下のPCR周期条件を利用した:94℃2分間の変性工程;94℃40秒間の変性、60℃40秒間のアニーリング、および72℃1.5分間の伸長の30周期;72℃5分間の最終伸長工程;並びに4℃への最終冷却工程。すべてのPCR増幅に、GeneAmp 9700サーモサイクラー(Perkin Elmer Applied Biosystems;カリフォルニア州フォスターシティ)を利用した。1.2% E−ゲル(Invitrogen;カリフォルニア州カールスバッド)上で増幅産物を視覚化した。
高レベルのタンパク質発現を得る目的のため、P.グラエB43(PTA−3618)fimA遺伝子を、pBAD/HisA発現ベクター(Invitrogen)にクローニングした。ゲノムDNA抽出キット(Promega社)を用いて、BHI中、37℃で2日間、嫌気性にインキュベーションしたP.グラエB43の5ml培養物から、ゲノムDNAを精製した。3つ組で、プライマーD0097およびD0098(配列番号9および配列番号10)を用いて、fimA遺伝子をPCR増幅した。1xPCR緩衝液(Life Technologies)、50ng P.グラエB43ゲノムDNA、1.0mM MgCl2、各1.25μMプライマー、各300μMデオキシ−NTP、および2.5U白金Pfx DNAポリメラーゼ(Life Technologies)を含有する50μl反応体積中でPCRを行った。
大腸菌BL21/pBAD:B43fimA4の凍結作業ストックを融解し、100μg/mlアンピシリンを含有するルリア・ブロス(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl)中に1:5000希釈で植え付け、そして5リットル作業体積のBioFlo3000バイオリアクター(New Brunswick Scientific;ニュージャージー州エジソン)中、37℃、100rpm攪拌速度で、A625が2.5〜3.5になるまで増殖させた。次いで、L−アラビノースを培養に添加して最終濃度0.1%にして、FimA発現を誘導した。さらに3時間、培養物をインキュベーションした。抗Express血清(Invitrogen)を用いて、組換えFimAの発現をSDS−PAGEおよびウェスタンブロット分析によって検出した(図8)。組換えFimAタンパク質は、45kDaの予測される分子量を有した。
P.ジンジバリス株W50 oprF相同体、遺伝子PG32(Genbank寄託番号AF175714)の配列に基づいて、オリゴヌクレオチド・プライマーD0086(配列番号43)、D0087(配列番号44)、およびKWK−Pg−03(配列番号45)を設計し、そして合成した(Life Technologies)。PCRのため、プライマーD0086(配列番号43)を、D0087(配列番号44)またはKWK−Pg−03(配列番号45)のいずれかと組み合わせて、1xPC2緩衝液(Ab Peptides)、各200μM dNTP、7.5U Klen Taq1(Ab Peptides)および0.15UクローニングPfu(Stratagene;カリフォルニア州ラホヤ)熱安定性ポリメラーゼ中、50μl最終試料体積で用いた。P.グラエB43、P.カンスルシB46、P.シルクムデンタリアB52、P.グラエB69、P.シルクムデンタリアB97、P.カンジンジバリスB98、P.サリボサB104、O.デンティカニスB106、およびP.エンドドンタリスB114由来の洗浄細胞懸濁物または精製ゲノムDNAのいずれかを、テンプレートとして用いて、3つ組で、反応を行った。増幅を以下のとおりに行った:変性(94℃、9分間);30〜40周期の変性(94℃、30秒間)、アニーリング(55〜60℃、30秒間)、および重合(72℃、1.5分間);その後、72℃7分間の最終伸長。
組換えタンパク質を発現する目的で、OprFをコードする遺伝子を、シグナルペプチドをコードする配列と一緒にクローニングした。オリゴヌクレオチド・プライマーKWK−Pg−06(配列番号76)およびKWK−Pg−03(配列番号45)を用いて、P.グラエB43からOprFを増幅した。ポリメラーゼ連鎖増幅のため、テンプレートとしての染色体DNA、1xPC2緩衝液、各200μM dNTP、各50pMolプライマー、7.5U Klen Taq1および0.15UクローニングPfu熱安定性ポリメラーゼを含有する、2つ組50μl反応物をセットアップした。増幅を以下のとおりに行った:変性(94℃、9分間);30周期の変性(94℃、30秒間)、アニーリング(60℃、30秒間)、および重合(72℃、1.5分間);その後、72℃7分間の最終伸長。増幅後、試料を精製し(QIAquickTM PCR精製キット)、そしてプールした。精製したPCR産物を、pBAD−TOPOおよびpBAD/Thio−TOPO(Invitrogen)の両方のTAクローニング部位に直接クローニングした。リガンド産物(ligand products)を最大効率大腸菌DH5α細胞に形質転換した。pBAD−TOPO:OprFから発現される、コードタンパク質の予測されるアミノ末端配列は、ベクターにコードされる配列MGSGSGDDDDKLALM(配列番号136)からなり、そのすぐ後に、OprFのグルタミン−13から始まる配列(配列番号120)が続く。適切なプラスミドを含有するクローンを同定し、そしてQIAprep Spin Miniprepキット(Qiagen)を用いて、小規模ブロス培養物から、精製したプラスミドを単離した。このプラスミドを大腸菌BL21細胞(Novagen)に形質転換し、そして適切なプラスミドを含有するクローンを同定した。
組換えOprF(N末端で配列番号137に融合)を発現する大腸菌BL21細胞を発現研究に利用した。凍結ストックを融解し、50μg/mlカナマイシン硫酸を含有する2xYT培地(1.6%トリプトン、1%酵母エキス、0.5NaCl)中に1:5000希釈で植え付け、そして5リットル作業体積のBioFlo3000バイオリアクター(New Brunswick Scientific;ニュージャージー州エジソン)中、29℃、100rpm攪拌速度で、A625が2.5〜3.5になるまで増殖させた。次いで、培養を42℃にシフトして、OprF発現を誘導した。さらに3時間、培養物をインキュベーションした。多様な時点でアリコットを取り除き、遠心分離し、そして還元試料緩衝液に再懸濁した。すべての試料を10%NuPAGEゲル(Invitrogen、米国)上で分析した(図9)。
P.グラエB43の5リットル・バッチを、上述のように発酵装置中で増殖させ、そして1リットル部分に分けた。各1リットル分画中の細胞(4.4x1012総P.グラエB43細胞)を以下の処理によって不活化した:0.4%ホルマリンに23℃で24時間曝露、pH8.5の10mM二元性エチレンイミン(BEI)に37℃で48時間曝露、2日連続で60℃で30分間加熱、および48時間空気に曝露。BEI処理後、50mMチオ硫酸ナトリウムで処理することによって、BEIを不活化した。細胞を遠心分離によって収集した。生じた細胞ペレットを220ml PBS中に再懸濁し、1mlあたり2x1010細胞の最終濃度を生じた。各不活化細胞7mlを7mlのMPL+TDMアジュバント(Sigma社)と混合して、1mlあたり、最終濃度1.0x1010細胞を生じた。
相同ワクチン有効性研究において、3週間間隔をあけて、MPL+TDMアジュバント中、上述の不活化P.グラエB43細胞の各0.2mlを2回注射して、マウスを免疫した。先に記載するように、追加免疫2週間後、これらのマウスを、P.グラエB43に感染させた。感染42日後、マウスを屠殺し、そして先に記載するようにプロセシングした。表7は、骨損失測定の数値結果を示す。
(b)陽性対照群としてのC群に基づいて計算したパーセント。
(c)NA=該当なし。
図10、11、および12は、これらの結果をグラフで示す。図11は、対照実験に関する骨損失パーセントを示す。ホルマリン不活化P.ジンジバリス53977、およびフロイントの完全/不完全またはMPL+TDLアジュバントのいずれかを含有するワクチンは、P.ジンジバリス53977の感染によって誘導される骨損失を、それぞれおよそ32%および43%減少させた。図12は、試験実験に関する骨損失パーセントを示す。ホルマリン、熱、または空気のいずれかで不活化したP.グラエB43およびMPL+TDMアジュバントを含有するワクチンは、P.グラエB43感染によって誘導される骨損失を、それぞれおよそ45%、35%、および75%減少させた。これらのデータに基づいて、ホルマリン、空気、および熱不活化P.グラエB43ワクチンは、この重感染モデルにおいて誘導される骨損失を減少させる能力が有効であった。このデータを臨床設定に当てはめると、これらの3つのワクチンは、歯周病の予防的防止に有効である可能性があり、そして歯周病の療法治療に有効であることをよく立証することも可能である。
異種ワクチン有効性研究において、3週間間隔をあけて、MPL+TDMアジュバント中、ホルマリン不活化P.グラエB43、またはホルマリン不活化P.サリボサB104およびO.デンティカニスB106細胞いずれかの各0.2mlを2回注射して、マウスを免疫した。先に記載するように、追加免疫2週間後、これらのマウスを、P.グラエB43、P.グラエB69、P.サリボサB104、またはO.デンティカニスB106いずれかに感染させた。感染42日後、マウスを屠殺し、そして先に記載するようにプロセシングした。表8は、骨損失測定の数値結果を示す。
bP.グラエB69感染マウスに関する骨損失パーセントを計算する。
cP.サリボサB104感染マウスに関する骨損失パーセントを計算する。
eNA、該当なし。
図13、14、15、16および17は、これらの結果をグラフで示す。図9は、これらの実験に関する純骨損失を示す。図14は、P.グラエB43感染群に関する骨損失パーセントを示す。ホルマリン不活化P.グラエB43およびMPL+TDMアジュバントは、P.グラエB43感染によって誘導される骨損失を、およそ84%減少させた。図15は、P.グラエB69感染群に関する骨損失パーセントを示す。MPL+TDMアジュバントを含有するホルマリン不活化P.グラエB43およびホルマリン不活化P.サリボサB104/O.デンティカニスB106ワクチンは、P.グラエB69感染によって誘導される骨損失を、それぞれおよそ40%および49%減少させた。図16は、P.サリボサB104感染群に関する骨損失パーセントを示す。ホルマリン不活化P.グラエB43およびMPL+TDMアジュバントは、P.サリボサB104によって誘導される骨損失を、およそ65%減少させた。図17は、O.デンティカニスB106感染群に関する骨損失パーセントを示す。MPL+TDMアジュバントを含むホルマリン不活化P.グラエB43は、O.デンティカニスB106の曝露に対して、交差防御に失敗した。これらのデータに基づいて、MPL+TDMをアジュバントとするホルマリン不活化P.グラエB43ワクチンは、相同体曝露からの防御だけでなく、P.グラエB69での異種曝露からの防御も提供可能であると結論付け可能であった。さらに、P.グラエB43ワクチンがP.サリボサB104曝露に対して防御したように、防御は、2つのポルフィロモナス属種間でも観察された。このデータを臨床設定に当てはめると、多価ワクチンは、歯周病の予防的防止に有効である可能性があり、そして歯周病の療法治療に有効であることをよく立証することも可能である。
サブユニット・ワクチン血清学研究において、3週間間隔をあけて、QuilA/コレステロール・アジュバント中、組換え発現させて精製したP.グラエB43 FimA、または組換え発現させて精製したP.グラエB43 OprFいずれかを各0.2ml、2回注射して、マウスを免疫した。第一のワクチン接種前、および追加免疫の2週間後、マウスを出血させた。表9は、数値結果を示し、一方、図18および19は、結果をグラフで示す。
イヌ曝露モデルにおける歯周病原性
この研究には、成体歯牙状態の10頭のビーグル犬を用いた。動物を麻酔し、そして高速ハンドピース(Henry Schein Inc.;ニューヨーク州メルビル)を備えたSchein Ultima 2000歯科装置中、西洋ナシ型歯科バー(burr)(Midwest Dental Products Corp;イリノイ州デスプレインズ)を用いて、下顎小臼歯および第一臼歯の根管に、アクセスを作製した。獣医用有刺根管針(21mm、サイズ#5;Roydent Dental Products;テネシー州ジョンソンシティ)を、根管の深さに近い深さまで根管内に通すことによって、根管へのアクセスがあることを確認した。有刺根管針を反復して通過させて、結合組織、血管および神経組織を取り除いた。出血は微量であり;根管中に入れた無菌ペーパーポイント(Henry Schein Inc.)を用いて止血を達成した。この時点で、根管の掘削および排出中、根管のいかなる不都合な汚染物質も取り除かれていることを確実にすることが重要である。したがって、根管を10%の漂白剤溶液で洗い流した。修復物配置に適した表面を生成するため、40%硫酸ゲル(Scotchbond Etching Gel、3M;ミネソタ州セントポール)を用いて、アクセスポート周囲のエナメルをエッチングした。残った漂白剤溶液または酸ゲルによる、曝露成分の生存度に対するいかなる影響も妨げるため、歯内針(27ga.、Dentsply Pharmaceutical;ペンシルバニア州ヨーク)および多量の無菌生理食塩水を用いて、中から外に根管を洗い流した。無菌ペーパーポイントを用いて、アクセス領域および根管を乾燥させた。
イヌ曝露モデルにおける三価ワクチン有効性評価
モデル開発後、イヌにおいて研究を行って、三価ワクチン調製物の有効性を試験した。三価バクテリンは、用量あたり、各50μgのQuilAおよびコレステロールをアジュバントとする、ホルマリン不活性化P.グラエ(B43)、P.サリボサ(B104)、およびO.デンティカニス(B106)を含有した。およそ1x1010CFU/ワクチン用量の濃度で、各バクテリン株を集めた。この研究では、成体歯牙状態の8頭の動物3群を用いた。第1群(T01)のイヌに1mlの三価ワクチンを筋内(IM)ワクチン接種した。第2群(T02)および第3群(T03)には、1mlの無菌生理食塩水を偽ワクチン接種した。すべてのイヌに、投与間を3週間間隔として3回、筋内(IM)投与した。最終投与の3週間後、動物を上述のように麻酔し、そして根成分の摘出後、下顎小臼歯および第一臼歯の根管に、曝露成分を導入した。T01群およびT02群のイヌを、実施例1に記載するように調製した、1x1010CFUの異種P.グラエ株(B69)に曝露した。処置の影響を測定する目的で、T03群のイヌを、無菌培地に曝露した。
イヌ曝露モデルにおけるワクチン有効性
このワクチン有効性研究は、実施例3に記載するものと設計が類似であった。各処置群は10頭の動物を含有した。T01群のイヌにワクチン接種して、そして曝露し;T02群には、曝露前に偽ワクチン接種し、そしてT03群には偽ワクチン接種して、そして偽曝露した。各ワクチンは、用量あたり各株1x107 CFUの濃度で、ホルマリン不活化P.グラエ株B43、P.サリボサ株B104、およびO.デンティカニス株B106を含有した。ワクチン接種スケジュールは、実施例3に示すものと同一であった。曝露接種物は、第三のワクチン接種の3週間後に投与する、P.グラエ株B69であった。X線写真を、やはり3週間間隔で撮影したが、曝露後9週までのみであり、そして実施例2に記載するのと類似の方式で分析した。図22は、骨反応性分析結果を示す。
ワクチンに対する全身反応性および局所反応性の評価
イヌに投与した、他のワクチンと併用した三価ワクチンに対する全身反応および局所組織反応の評価に取り掛かった。研究開始時におよそ6週齢の5頭のイヌ2群の、6週齢、9週齢、および12週齢時に、IMワクチン接種した。各ワクチン接種前に、血液試料を収集した。各ワクチン接種1週間後、全身反応および局所反応に関して、すべてのイヌを毎日調べた。これらの日にはまた、体温を測定し、そして記録した。T01群に、総抗原3x108CFUの濃度で、三価バクテリン(実施例3および4に記載するように調製)の組み合わせであり、そして用量あたり各50μgのQuilAおよびコレステロールをアジュバントとし、そして以下の修飾生ウイルスおよび死ウイルス構成要素を含む、ワクチンを接種した:イヌ・ジステンパーウイルス(CDV)、イヌ・アデノウイルス−2(CAV−2)、イヌ・パルボウイルス(CPV)、イヌ・パラインフルエンザウイルス(CPI)、およびイヌ・コロナウイルス(CCV)。T02群には、3x106CFUの濃度の三価バクテリンおよび同じ組み合わせのウイルス構成要素を投与した。図24の結果は、子犬に典型的に投与されるウイルス構成要素の組み合わせに添加した際、三価ワクチンが、試験群において、不都合な全身反応または局所反応を引き起こさなかったことを例証する。
Claims (15)
- コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するためのワクチンであって、P.グラエ(P.gulae)B43、P.サリボサ(P.salivosa)B104およびO.デンティカニス(O.denticanis)B106の不活化全細胞調製物、並びに薬学的に許容しうるキャリアーを含む、前記ワクチン。
- 細菌がホルマリンによって不活化された、請求項1のワクチン。
- イヌ・ジステンパーウイルス(CDV)、イヌ・アデノウイルス−2(CAV−2)、イヌ・パルボウイルス(CPV)、イヌ・パラインフルエンザウイルス(CPI)、またはイヌ・コロナウイルス(CCV)の少なくとも1つをさらに含む、請求項1のワクチン。
- コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するための方法であって、ワクチンを投与する必要があるコンパニオン動物に、請求項1〜3のいずれか1項記載のワクチンを投与することを含む、前記方法。
- 薬学的に許容しうるキャリアー、並びにP.グラエB43、P.サリボサB104およびO.デンティカニスB106の不活化全細胞調製物を含む、コンパニオン動物における歯周病を治療し、そして予防するための組成物を、少なくとも1つの容器中に含む、キットであって;該キットが、コンパニオン動物における歯周病を治療するかまたは予防するのに有用であることを示す、印刷した使用説明書セットをさらに含む、前記キット。
- 1以上の歯周病原性(periopathogenic)細菌に対するワクチンの有効性を評価するための方法であって:
a.第一の動物に、1以上の不活化または弱毒化歯周病原性細菌を含むワクチンを投与し;
b.前記動物を、1以上の歯周病原性細菌を含有する、有効量の曝露培養物に曝露し;
c.ワクチン接種していない第二の動物を、同量の前記曝露培養物に曝露し、ここで第二の動物は、第一の動物と同じ種である;
d.前記歯周病原性細菌によって引き起こされる疾患の臨床徴候を測定し;そして
e.ワクチン接種した動物に存在する疾患の臨床徴候を、ワクチン接種していない動物に存在する疾患の臨床徴候と比較して、それによって前記ワクチンの有効性を決定する
ことを含む、前記方法。 - 前記ワクチンが、ポルフィロモナス属(Porphyromonas)、バクテリオデス属(Bacteriodes)、プレボテラ属(Prevotella)、タネレラ属(Tannerella)またはトレポネーマ属(Treponema)の少なくとも1種の弱毒化細菌または生細菌を含む、請求項6の方法。
- 歯根成分が摘出され、その後、修復物が配置されている、歯の根管内に、前記曝露培養物が導入される、請求項6の方法。
- 前記の第一および第二の動物がコンパニオン動物である、請求項6の方法。
- 前記曝露培養物が、曝露用量あたり、約1x102〜約1x1012コロニー形成単位(CFU)を含む、請求項6の方法。
- 前記曝露培養物が、曝露用量あたり、約1x105〜約1x1011コロニー形成単位(CFU)を含む、請求項6の方法。
- 前記曝露培養物が、曝露用量あたり、約5x107〜約5x1010コロニー形成単位(CFU)を含む、請求項6の方法。
- 前記臨床徴候が、歯肉溝浸出液、歯垢、感染した骨、または歯肉溝中の1以上の歯周病原性細菌レベルの増加、あるいは歯槽骨(aveolar bone)量の変化を含む、請求項6の方法。
- 前記骨変化が、歯槽骨の歯根尖端周囲領域中である、請求項6の方法。
- 前記骨変化が、X線写真測定を介して定量化される、請求項6の方法。
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