JP2008500260A - テンプレート固定β−ヘアピンループ模倣体とそのファージディスプレイにおける使用 - Google Patents
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Abstract
R1-Cys-Z-Cys-R2 I
[式中、2個のCys残基はジスルフィド結合により架橋されそれにより環状ペプチドを形成し;
R1およびR2が好ましくは、Glu-ThrおよびThr-Lys;またはLys-ThrおよびThr-Glu;または
Thr-GluおよびLys-Thr;またはThr-LysおよびGlu-Thr;またはLeu-GluおよびLys-Val;またはVal-LysおよびGlu-Leu;またはGlu-LeuおよびVal-Lys;またはLys-LeuおよびVal-Glu;またはAsn-GlyおよびLys-Val;またはVal-GlyおよびLys-Asn;またはGly-AsnおよびVal-Lys;またはGly-ValおよびAsn-Lys;またはGly-GlyおよびGly-Gly;またはGlu-Leu-LysおよびGlu-Val-Lys;またはLys-Val-GluおよびLys-Leu-Glu;またはLeu-Glu-LysおよびGlu-Lys-Val;またはVal-Lys-GluおよびLys-Glu-Leu;またはGlu-Lys-LeuおよびVal-Glu-Lys;またはLys-Glu-ValおよびLeu-Lys-Glu;またはLys-Glu-LeuおよびVal-Lys-Glu;またはGlu-Lys-ValおよびLeu-Glu-Lys;またはLys-Val-GlyおよびGly-Leu-Glu;またはGlu-Leu-GlyおよびGly-Val-Lys;またはVal-Lys-GlyおよびGly-Glu-Leu;またはLeu-Glu-GlyおよびGly-Lys-Val;またはVal-Gly-LysおよびGlu-Gly-Leu;またはLeu-Gly-GluおよびLys-Gly-Val;またはGly-Gly-GlyおよびGly-Gly-Glyであり;Zはn個のアミノ酸残基の鎖であってnは整数4〜20でありそしてこれらのn個のアミノ酸残基はそれぞれ独立していずれかの天然L-α-アミノ酸から誘導される]で表わされるテンプレート固定β-ヘアピン模倣体が提供される。複数のこれらのテンプレートを含んでなるライブラリーは、テンプレート固定β-ヘアピン模倣体から誘導されるファージディスプレイの構築に利用すると標的と非常に高い結合定数をもつファージディスプレイライブラリーを作製することができる、従って、テンプレート固定β-ヘアピンライブラリーから誘導される大きいファージディスプレイのスクリーニングの利点と組合わせて、さらに、構造活性の研究、従って、強力な活性をもちかつ色々な型の標的に対する新規の選択性をもつ新しい分子の発見を大きく促進する。
Description
R1-Cys-Z-Cys-R2 I
[式中、2個のCys残基はジスルフィド結合により架橋されてそれにより環状ペプチドを形成し;
R1およびR2は、
A-BおよびB-C;またはB-AおよびC-B;またはC-BおよびB-A;またはB-CおよびA-B;またはC-AおよびC-A;またはA-CおよびA-C;またはC-AおよびC-B;またはB-BおよびC-B;またはB-BおよびB-C;またはA-BおよびC-C;またはB-AおよびC-C;またはC-BおよびB-B;またはB-CおよびB-B;またはC-CおよびB-A;またはC-CおよびA-B;またはB-BおよびC-C;またはC-CおよびB-B;またはA-CおよびB-C;またはC-BおよびC-A;またはB-CおよびA-C;またはA-CおよびA-B;またはB-AおよびC-A;またはA-AおよびC-C;またはC-CおよびA-A;
またはA-B-CおよびA-B-C;またはB-A-BおよびB-C-B;またはB-C-BおよびB-A-B;またはA-B-BおよびB-B-C;またはC-B-BおよびB-B-A;またはA-C-BおよびB-A-C;またはC-A-BおよびB-C-A;またはB-A-BおよびB-C-C;またはB-C-BおよびB-A-C;またはC-C-BおよびB-B-A;またはC-C-BおよびB-A-B,またはC-B-BおよびC-C-A;またはA-C-CおよびB-B-C;またはB-C-CおよびB-A-B;またはB-C-CおよびB-A-C;またはA-B-BおよびB-C-C;またはB-A-BおよびC-C-B;またはC-A-BおよびC-C-B;またはB-B-BおよびB-C-C;またはC-B-BおよびB-B-B;またはB-B-BおよびC-C-B;またはB-C-CおよびB-B-B;またはA-B-CおよびB-B-C;またはC-B-BおよびC-B-A;またはA-B-CおよびA-C-C;またはC-C-AおよびC-B-A;またはB-A-CおよびA-C-B;またはB-C-AおよびC-A-B;またはC-B-AおよびC-B-A;またはA-A-BおよびB-C-C;またはC-C-BおよびB-A-A;またはB-B-CおよびA-C-C;またはB-B-CおよびA-B-C;またはB-B-CおよびB-B-C;またはB-B-CおよびB-B-B;またはB-A-CおよびB-C-C;またはC-C-BおよびC-A-B;またはC-C-BおよびC-B-A;またはA-B-CおよびB-C-C;またはC-A-BおよびB-C-B;またはB-C-BおよびB-B-C;またはC-B-BおよびB-C-B;またはB-C-BおよびB-B-B;またはB-B-BおよびB-C-B;またはC-B-BおよびB-C-A;またはA-C-BおよびB-B-C;またはC-B-BおよびC-B-B;またはB-B-BおよびB-B-B;またはB-B-BおよびB-B-C;またはA-A-CおよびA-C-C;またはC-C-AおよびC-A-A;またはA-A-CおよびA-C-B;またはB-C-AおよびC-A-A;またはA-A-CおよびB-C-C;またはC-C-BおよびC-A-A;またはA-A-BおよびC-C-B;またはB-C-CおよびB-A-A;またはA-B-AおよびC-B-C;またはC-B-CおよびA-B-A;またはA-B-BおよびC-B-C;またはC-B-CおよびB-B-A;またはB-A-AおよびC-C-B;またはB-C-CおよびA-A-B;またはB-B-AおよびC-B-B;またはB-B-CおよびA-B-B;またはB-B-AおよびC-C-B;またはB-C-CおよびA-B-B;またはB-B-CおよびA-C-B;またはB-C-AおよびC-B-B;またはB-C-BおよびC-B-B;またはB-B-CおよびB-C-B;またはB-C-BおよびC-A-B;またはB-A-CおよびB-C-B;またはB-C-BおよびC-B-B;またはB-A-CおよびA-C-B;またはB-A-CおよびA-C-C;またはC-C-AおよびC-A-B;またはB-A-CおよびB-C-C; B-C-CおよびA-A-C;またはC-A-AおよびC-C-B;またはC-A-AおよびC-C-A;またはA-C-CおよびA-A-C;またはC-B-AおよびC-C-A;またはA-C-CおよびA-B-C;またはC-B-AおよびC-B-B;またはC-B-AおよびC-C-B;またはB-C-CおよびA-B-C;またはC-B-BおよびC-C-A;またはC-B-BおよびC-B-B;またはC-B-BおよびC-C-B;またはB-C-CおよびB-B-C;またはC-C-AおよびC-A-B;またはC-C-AおよびC-B-B;またはC-C-BおよびB-B-B;またはC-C-BおよびC-A-A;またはC-C-BおよびC-B-A;またはC-C-BおよびC-B-B;またはB-B-CおよびB-C-C;またはA-C-BおよびB-B-C;またはA-C-CおよびB-B-Cであり;
AはAsn、Gln、Asp、Glu、Thr、SerおよびGlyのいずれかであり;
BはVal、Ile、Ser、Thr、Phe、Tyr、TrpおよびGlyのいずれかであり;そして
CはArg、LysおよびGlyのいずれかであり;そして
Zはn個のアミノ酸残基の鎖であり、nは4〜20の整数でありかつこれらのn個のアミノ酸残基はそれぞれ独立していずれかの天然L-α-アミノ酸から誘導される]
で表わされる化合物である。
a) 式Iのテンプレート固定β-ヘアピン模倣体のライブラリーであって、該テンプレート固定β-ヘアピン模倣体がファージまたはファージミド粒子の表面上にディスプレイされるファージコートタンパク質の少なくとも一部分と融合していてもよい上記ライブラリーを提供するステップ;
b) ステップa)のライブラリーを結合パートナーと接触させるステップ;
c) ライブラリーから結合パートナーと非共有結合複合体を形成することができるファージペプチドを選択するステップ;および
d) 場合によってはペプチドを単離するかまたはステップc)のDNA分析により配列を決定するステップ
を含んでなる上記方法も提供する。
Arg R L-アルギニン
Asn N L-アスパラギン
Asp D L-アスパラギン酸
Cys C L-システイン
Glu E L-グルタミン酸
Gln Q L-グルタミン
Gly G グリシン
His H L-ヒスチジン
Ile I L‐イソロイシン
Leu L L-ロイシン
Lys K L-リジン
Met M L-メチオニン
Phe F L-フェニルアラニン
Pro P L-プロリン
Ser S L-セリン
Thr T L-トレオニン
Trp W L-トリプトファン
Tyr Y L-チロシン
Val V L-バリン
R1およびR2は、それぞれ2個またはそれぞれ3個の先に記号A、BおよびCにより表わしたアミノ酸残基を含んでなり、それぞれ次のグループの1つを意味する:
-グループA:イオン結合または水素結合相互作用を形成することができるアミノ酸残基;
-グループB:疎水性相互作用を形成することができるアミノ酸残基;および
-グループC:カチオンπ相互作用またはイオン結合または水素結合を形成することができるアミノ酸残基。
Glu-ThrおよびThr-Lys;またはLys-ThrおよびThr-Glu;または
Thr-GluおよびLys-Thr;またはThr-LysおよびGlu-Thr;または
Leu-GluおよびLys-Val;またはVal-LysおよびGlu-Leu;または
Glu-LeuおよびVal-Lys;またはLys-LeuおよびVal-Glu;または
Asn-GlyおよびLys-Val;またはVal-GlyおよびLys-Asn;または
Gly-AsnおよびVal-Lys;またはGly-ValおよびAsn-Lys;または
Gly-GlyおよびGly-Gly;または
Glu-Leu-LysおよびGlu-Val-Lys;またはLys-Val-GluおよびLys-Leu-Glu;または
Leu-Glu-LysおよびGlu-Lys-Val;またはVal-Lys-GluおよびLys-Glu-Leu;または
Glu-Lys-LeuおよびVal-Glu-Lys;またはLys-Glu-ValおよびLeu-Lys-Glu;または
Lys-Glu-LeuおよびVal-Lys-Glu;またはGlu-Lys-ValおよびLeu-Glu-Lys;または
Lys-Val-GlyおよびGly-Leu-Glu;またはGlu-Leu-GlyおよびGly-Val-Lys;または
Val-Lys-GlyおよびGly-Glu-Leu;またはLeu-Glu-GlyおよびGly-Lys-Val;または
Val-Gly-LysおよびGlu-Gly-Leu;またはLeu-Gly-GluおよびLys-Gly-Val;または
Gly-Gly-GlyおよびGly-Gly-Glyである。
ジペプチド
-k1-k2-;
トリペプチド
-k1-k2-k3-
-k1-x1-k2-;
テトラペプチド
-k1-k2-k3-k4-
-k1-x1-k2-k3-
-k1-k2-x1-k3-
-k1-x1-x2-k2-;
ペンタペプチド
-k1-k2-k3-k4-k5-
-k1-x1-k2-k3-k4-
-k1-k2-x1-k3-k4-
-k1-k2-k3-x1-k4-
-k1-x1-x2-k2-k3-
-k1-k2-x1-x2-k3-
-k1-x1-k2-x2-k3-
-k1-x1-x2-x3-k2-;
ヘキサペプチド
-k1-k2-k3-k4-k5-k6-
-k1-x1-k2-k3-k4-k5-
-k1-k2-x1-k3-k4-k5-
-k1-k2-k3-x1-k4-k5-
-k1-k2-k3-k4-x1-k5-
-k1-x1-x2-k2-k3-k4-
-k1-k2-x1-x2-k3-k4-
-k1-k2-k3-x1-x2-k4-
-k1-x1-k2-x2-k3-k4-
-k1-k2-x1-k3-x2-k4-
-k1-x1-k2-k3-x2-k4-
-k1-x1-x2-x3-k2-k3-
-k1-k2-x1-x2-x3-k3-
-k1-x1-k2-x2-x3-k3-
-k1-x1-x2-k2-x3-k3-
-k1-x1-x2-x3-x4-k2-。
R G D フィブロネクチン(FN)、ビトロネクチン(VN)、オステオポンチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、フィブリノーゲン(Fg)、フォン・ビルブラント(von Willebrand)因子(vWF)中(Obrecht, D.; Altorfer, M.; Robinson, J. A. Adv. Med. Chem. Vol. 4, 1-68, JAI Press Inc., 1999を参照)、
E L R C X Cケモカイン中(Saunders, J.; Tarby, C. M. Drug Discovery Today, 1999, 4, 80-92を参照)、
R K K (J. Biol. Chem. 1999, 274, 3513を参照)、
K G F (Prot. Sci. 1998, 7, 1681-1690を参照)、
V R K K [配列番号1] 血小板由来増殖因子(PDGF)中(Ross, R.; Raines, E. W.; Bowden-Pope, D. F. Cell, 1986, 46, 155-159を参照)、
K K Y L [配列番号2] β-アミロイド神経毒性に対して神経保護特性を示すVIP(血管作用性腸ペプチド)中(Proc. Natl. Am. Soc. USA 1999, 96, 4143-4148を参照)、
W L D V [配列番号3] インテグリンα4β1中(Europ. J. Biol. 1996, 242, 352-362およびInt. J. Pept. Prot. Res. 1996, 47, 427-436を参照)、
Y I R L P [配列番号4] 第Xa因子インヒビター中(Al Obeidis,F.; Ostrem, J. A. Drug Discovery Today 1998 , 3, 223-231を参照)、
Y I G S R [配列番号5] ラミニン中(EMBO. J. 1984, 3, 1463を参照)、
I K V A V [配列番号6] (Cell 1987, 88, 989を参照)、
P P R X X W [配列番号7] (J. Biol. Chem. 1998, 273, 11001-11006 & 11007-11011を参照)。
アミノ基(リシンの側鎖にも存在する)に対しては、
Cbz ベンジルオキシカルボニル、
Boc tert-ブチルオキシカルボニル、
Fmoc 9-フルオレニルメトキシカルボニル、
Alloc アリルオキシカルボニル、
Teoc トリメチルシリルエトキシカルボニル、
Tcc トリクロロエトキシカルボニル、
Nps o-ニトロフェニルスルホニル、
Trt トリフェニルメチル(またはトリチル);、
カルボキシル基(アスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖にも存在する)に対しては、アルコール成分を用いるエステルへの転化により、
tBu tert-ブチル、
Bn ベンジル、
Me メチル、
Ph フェニル、
Pac フェナシル、
アリル、
Tse トリメチルシリルエチル、
Tce トリクロロエチル;
グアニジノ基(アルギニンの側鎖に存在する)に対しては、
Boc t-ブチルオキシカルボニル、
Pmc 2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル、
Ts トシル(すなわち、p-トルエンスルホニル)、
Cbz ベンジルオキシカルボニル、
Pbf ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル;
ヒドロキシ基(例えば、トレオニンおよびセリンの側鎖に存在する)に対しては、
tBu tert-ブチル、
Bn ベンジル、
Trt トリチル;
および、メルカプト基(システインの側鎖に存在する)に対しては、
Acm アセトアミドメチル、
tBu tert-ブチル、
Bn ベンジル、
Trt トリチル、
Mtr 4-メトキシトリチルである。
1)反応ウェルを溶媒(好ましくは5ml)で満たし、反応チューブを、ホルダーブロックおよびマニホールドと組み合わせて、5〜300分間、好ましくは15分間浸漬かつ攪拌し、重力により、続いて(出口は閉じたままで)マニホールド入り口を通して取り入れたガス圧力により溶媒を排出する;
2)マニホールドをホルダーブロックから取外し、溶媒(好ましくは5ml)のアリコートを反応チューブの上部から入れ、そして重力により試験管またはバイアルなどの受器へフィルタを通して排出する。
完全保護直鎖ペプチドの固体支持体からの脱離は、ホルダーブロックおよびマニホールドと組合わせた反応チューブを、切断試薬(好ましくは3〜5ml)の溶液を含有する反応ウエルに浸漬することにより達成する。ガスフロー、温度制御、攪拌、および反応モニタリングを上記の通りかつ所望のように実施して脱離反応を実施する。ホルダーブロックおよびマニフォールドと組合わせた反応チューブを受器ブロックから取り外し、溶液レベルより上方であるが反応ウエルの上端より下方に引き上げ、ガス圧力をマニフォールド入口を通して(出口を閉じたまま)供給し、効率的に最終生成物溶液を受器ウエル中に排出する。次いで反応チューブ内に残存する樹脂を3〜5mlの適当な溶媒を用いて上記の通り2〜5回洗浄し、脱離した生成物をできるだけ多く抽出する(洗い出す)。こうして得た生成物溶液を、交差混合を避けるように注意しながら集める。次いで、必要により、個々の溶液/抽出物を処理して最終化合物を単離する。典型的な処理としては、限定されるものでないが、蒸発、濃縮、液/液抽出、酸性化、塩基性化、中和または溶液中の追加の反応が挙げられる。
HBTU:1-ベンゾトリアゾール-1-イル-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(Knorrら, Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927-1930)
HOBt:1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DIEA:ジイソプロピルエチルアミン
a)合成
最初の保護アミノ酸残基のカップリング
0.5gの2-クロロトリチルクロリド樹脂(Barlosら、Tetrahedron Lett. 1989、30、3943-3946)(0.83mmol/g、0.415mmol)を乾燥フラスコ中に入れた。樹脂をCH2Cl2(2.5ml)中に懸濁し、室温で常に攪拌しながら30分間膨潤させた。樹脂を、0.415mMol(1eq)の最初の好適に保護されたアミノ酸残基(以下参照)および284μl(4eq)のジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を含むCH2Cl2(2.5ml)溶液を用いて処理し、その混合物を25℃にて4時間振盪した。樹脂色は紫色に変化して溶液は黄色のままであった。樹脂を30分間振盪し(30mlのCH2Cl2/MeOH/DIEA:17/2/1)、次いで以下の順で、CH2Cl2(1x)、DMF(1x)、CH2Cl2(1x)、MeOH(1x)、CH2Cl2(1x)、MeOH(1x)、CH2Cl2(2x)、Et2O(2x)により洗浄し、真空下で6時間乾燥した。ローディング(loading)量は典型的には0.45〜0.5mMol/gであった。次のプレロードした(preloaded)樹脂を調製した:Fmoc-Cys(Trt)-クロロトリチル樹脂、Fmoc-Glu(OtBu)-クロロトリチル樹脂、Fmoc-Lys(Boc)-クロロトリチル樹脂、Fmoc-Val-クロロトリチル樹脂およびFmoc-Gly-クロロトリチル樹脂。
合成は、Syro-ペプチド合成機(Multisyntech)を利用し、24〜96個の反応容器を用いて実施した。それぞれの容器中に、上記樹脂60mg(ローディング前の樹脂重量)を入れた。次の反応サイクルをプログラムして実施した:
ステップ 試薬 時間
1 CH2Cl2、洗浄および膨潤(手動で) 3 x 1分間
2 DMF、洗浄および膨潤 1 x 5分間
3 40%ピペリジン/DMF 1 x 5分間
4 DMF、洗浄 5 x 2分間
5 5equiv. Fmocアミノ酸/DMF
+5eq. HBTU
+5eq. HOBt
+5eq. DIEA 1 x 120分間
6 DMF、洗浄 4 x 2分間
7 CH2Cl2、洗浄(合成終了時) 3 x 2分間
ステップ3〜6を繰返して各アミノ酸を加える。
合成した配列のN末端からFmoc保護基を除去するために、手順1のステップ1〜4を実施した。ペプチドをローディングした樹脂を次いで、フリット(frit)と止栓を備えた15mlシリンジ中に移した。樹脂を30分間、5mlのCH2Cl2を用いて30分間膨潤させた。DIEA(0.4ml)および無水酢酸(0.1ml)を各反応器に加えた。樹脂を6時間〜一夜振盪した。樹脂を濾過し、逐次、CH2Cl2/MeOH/CH2Cl2/MeOH/CH2Cl2/ジエチルエーテルを用いて洗浄した。樹脂を真空下で乾燥した。
合成完了の後、樹脂を1mlの1%(v/v)TFAを含むCH2Cl2および1mlの20%DIEAを含むCH2Cl2に3分間懸濁させた。この手順を3回繰り返して切断の完了を確実なものにした。濾液を蒸発乾固し、その生成物を82.5%トリフルオロ酢酸(TFA)、5%水、5%フェノール、5%チオアニソール、および2.5%エタンジチオールを含有する切断混合物を用いて5時間、室温にて完全に脱保護し、次いで真空下で濃縮した。ペプチドを、10mlのジエチルエーテルを加えることにより沈降させ、次いで遠心分離してエーテル相を除去した。この操作を2回、5mlのジエチルエーテルを用いて繰り返した。
得られた直鎖ペプチドを1.5mlの水に10-4Mの濃度で溶解し、15μlのH2O2(0.01M、1eq.)を加えた。環化時間は700分までとした。
表1に示す。ペプチドは、樹脂にグラフト化したアミノ酸Cysを用いて出発して合成した。出発樹脂は、上記の通り調製したFmoc-Cys(Trt)-クロロトリチル樹脂であった。直鎖ペプチドを固体支持体上に手順1に従って次の配列:樹脂-Cys-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cysで合成し、それを次いで、記載した通りアシル化し、切断し、脱保護し、精製しそして環化した。HPLC保持時間(分)および質量は先に記載した勾配を用いて測定した:RT=7.26分、[M+H]+=1281.3.
実施例2(n=8)
表1に示す。ペプチドは、樹脂にグラフト化したアミノ酸Lysを用いて出発して合成した。出発樹脂は、上記の通り調製したFmoc-Lys(Boc)-クロロトリチル樹脂であった。直鎖ペプチドを固体支持体上に手順1に従って次の配列:樹脂-R2-Cys-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1で合成し、それを次いで、記載した通りアシル化し、切断し、脱保護し、精製しそして環化した。HPLC保持時間(分)および質量は先に記載した勾配を用いて測定した:RT=6.41分、[M+H]+=871.4。
表2に示す。ペプチドは、樹脂にグラフト化したアミノ酸Cysを用いて出発して合成した。出発樹脂は、上記の通り調製したFmoc-Cys(Trt)-クロロトリチル樹脂であった。直鎖ペプチドを固体支持体上に手順1に従って次の配列:樹脂-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cysで合成し、それを次いで、記載した通りアシル化し、切断し、脱保護し、精製しそして環化した。HPLC保持時間(分)および質量は先に記載した勾配を用いて測定した:RT=5.74分、[M+H]+=779.2。
表2に示す。ペプチドは、樹脂にグラフト化したアミノ酸Lysを用いて出発して合成した。出発樹脂は、上記の通り調製したFmoc-Lys(Boc)-クロロトリチル樹脂であった。直鎖ペプチドを固体支持体上に手順1に従って次の配列:樹脂-R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1で合成し、それを次いで、記載した通りアシル化し、切断し、脱保護し、精製しそして環化した。HPLC保持時間(分)および質量は先に記載した勾配を用いて測定した:RT=5.13分、[M+H]+=1009.2。
表2に示す。ペプチドは、樹脂にグラフト化したアミノ酸Cysを用いて出発して合成した。出発樹脂は、上記の通り調製したFmoc-Cys(Trt)-クロロトリチル樹脂であった。直鎖ペプチドを固体支持体上に手順1に従って次の配列:樹脂-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cysで合成し、それを次いで、記載した通りアシル化し、切断し、脱保護し、精製しそして環化した。 HPLC保持時間(分)および質量は先に記載した勾配を用いて測定した:RT=6.81分、[M+H]+=1482.6。
表2に示す。ペプチドは、樹脂にグラフト化したアミノ酸Valを用いて出発して合成した。出発樹脂は、上記の通り調製したFmoc-Val-クロロトリチル樹脂であった。
表2に示す。ペプチドは、樹脂にグラフト化したアミノ酸Glyを用いて出発して合成した。出発樹脂は、上記の通り調製したFmoc-Gly-クロロトリチル樹脂であった。直鎖ペプチドを固体支持体上に手順1に従って次の配列:樹脂-R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1で合成し、それを次いで、記載した通りアシル化し、切断し、脱保護し、精製しそして環化した。HPLC保持時間(分)および質量は先に記載した勾配を用いて測定した:RT=6.39分、[M+H]+=856.0。
表2に示す。ペプチドは、樹脂にグラフト化したアミノ酸Lysを用いて出発して合成した。出発樹脂は、上記の通り調製したFmoc-Lys(Boc)-クロロトリチル樹脂であった。直鎖ペプチドを固体支持体上に手順1に従って次の配列:樹脂-R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1で合成し、それを次いで、記載した通りアシル化し、切断し、脱保護し、精製しそして環化した。HPLC保持時間(分)および質量は先に記載した勾配を用いて測定した:RT=6.18分、[M+H]+=972.3。
表3に示す。ペプチドは、樹脂にグラフト化したアミノ酸Lysを用いて出発して合成した。出発樹脂は、上記の通り調製したFmoc-Lys(Boc)-クロロトリチル樹脂であった。直鎖ペプチドを固体支持体上に手順1に従って次の配列:樹脂-R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1で合成し、それを次いで、記載した通りアシル化し、切断し、脱保護し、精製しそして環化した。HPLC保持時間(分)および質量は先に記載した勾配を用いて測定した:RT=5.49分、[M+H]+=1142.0。
表3に示す。ペプチドは、樹脂にグラフト化したアミノ酸Gluを用いて出発して合成した。出発樹脂は、上記の通り調製したFmoc-Glu(Boc)-クロロトリチル樹脂であった。直鎖ペプチドを固体支持体上に手順1に従って次の配列:樹脂-R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1で合成し、それを次いで、記載した通りアシル化し、切断し、脱保護し、精製しそして環化した。 HPLC保持時間(分)および質量は先に記載した勾配を用いて測定した:RT=6.85分、[M+H]+=1033.8。
表3に示す。ペプチドは、樹脂にグラフト化したアミノ酸Glyを用いて出発して合成した。出発樹脂は、上記の通り調製したFmoc-Gly-クロロトリチル樹脂であった。直鎖ペプチドを固体支持体上に手順1に従って次の配列:樹脂-R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1で合成し、それを次いで、記載した通りアシル化し、切断し、脱保護し、精製しそして環化した。HPLC保持時間(分)および質量は先に記載した勾配を用いて測定した:RT=6.41分、[M+H]+=913.0。
表4に示す。ペプチドは、樹脂にグラフト化したアミノ酸Cysを用いて出発して合成した。出発樹脂は、上記の通り調製したFmoc-Cys(Trt)-クロロトリチル樹脂であった。直鎖ペプチドを固体支持体上に手順1に従って次の配列:樹脂-Cys-P12-P11-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cysで合成し、それを次いで、記載した通りアシル化し、切断し、脱保護し、精製しそして環化した。HPLC保持時間(分)および質量は先に記載した勾配を用いて測定した:RT=5.74分、[M+H]+=836.5。
表4に示す。ペプチドは、樹脂にグラフト化したアミノ酸Lysを用いて出発して合成した。出発樹脂は、上記の通り調製したFmoc-Lys(Boc)-クロロトリチル樹脂であった。直鎖ペプチドを固体支持体上に手順1に従って次の配列:樹脂-R2-Cys-P12-P11-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1で合成し、それを次いで、記載した通りアシル化し、切断し、脱保護し、精製しそして環化した。HPLC保持時間(分)および質量は先に記載した勾配を用いて測定した:RT=5.01分、[M+H]+=1065.1。
濃度10-4Mのペプチド水溶液1.5mlを含有する、それぞれの直鎖脱保護精製ペプチドのストック溶液を調製した。ジスルフィド架橋の形成を、分析用LC-MS上で先に記載の通りモニターした。最初のデータポイントは酸化試薬H2O2なしで時点t0にて実施した。第2のデータポイントは酸化試薬H2O2(15μl、0.01M、1eq.)を加えた後15分に実施した。データポイントは33分毎に、転化の進行が検出されなくなる時点まで記録した。
円二色性測定値は、ペプチドおよびタンパク質両方の二次構造に感受性があり、両方の立体配座を試験するために広く用いられている(M. Jourdan, S. R. Griffiths-Jones, M. S. Searle, Eur. J. Biochem. 2000, 267, 3539-3548;J. T. Pelto, L.R. Mc. Lean, Analytical Biochemistry, 2000, 277, 167-176)。
図1〜6は、%で表わしたジスルフィド架橋β-ヘアピン模倣体の形成の比較を、転化の進行が検出されなくなる時まで示す。
実施例配列Zの設計
テンプレートが固定β-ヘアピン模倣体の形成と安定化を促進するかどうかを研究するために、2つの異なるタイプのコアペプチド配列Zを選んだ。最初に、配列-Leu-Trp-Tyr-Ser-Asn-His-Trp-Val-[配列番号22]をある抗体(L. Jiang, K. Moehle, J. Robinson, Chimia (2000) 54, 558-563)のCDR L3ループから取り、これを修飾して、P. Y. Chou G.D Fasman, J. Mol. Biol. (1977) 115, 135-175に記載の、安定化βターンおよびβシート配列を含有する配列-Lys-Trp-Phe-Ser-Asn-His-Tyr-Gln-[配列番号23]を対照β-ヘアピンとして得た。第2の配列Z-Phe-Leu-Ala-His-Tyr-Ala-[配列番号24]は、P. Y. Chou G.D Fasman, J. Mol. Biol. (1977) 115, 135-175に記載の、上記安定化βターン配列またはβシート配列を含有しない配列-Leu-Trp-Tyr-Ser-Asn-His-Trp-Val-Lys-Trp-[配列番号25]から構築した。
手順1:
本発明のオリゴヌクレオチドライブラリーは、Ph. D. Peptide Display Cloning System, technical Bulletin # E8101(8/21/02, New England Biolabs, Inc)およびK. Noren, C. Noren, Methods, 2001, 23, 169-178の手順に従い、繊維状バクテリオファージM13KEの遺伝子IIIと融合させることができる。
Acc65I
5'CATGCCCGGGTACCTTTCTATTCTCACTCTGAAACCTGC3' [配列番号26]
オリゴヌクレオチド番号2
EagI
5'CATGTTTCGGCCGAGCCACCACCTTTGGTGCAGGTCTGATAATGGTTGCTGAACCATTTGGTGCAGGTTTCAGAGTGAGAATAG'3' [配列番号27]
インサートDNAのクローニングに対するライゲーション条件は最適化していない。
実施例15[配列番号42](表9を参照)の配列のファージディスプレイは、ランダム化したテンプレート固定β-ヘアピン模倣体ライブラリーの調製物を表わすものであり、以下に説明する。
Acc65I
5'CATGCCCGGGTACCTTTCTATTCTCACTCTGAAACCTGC3' [配列番号26]
オリゴヌクレオチド番号3
EagI
5'CATGTTTCGGCCGAGCCACCACCTTTGGTGCAMNNMNNMNNMNNGTCACCACGMNNMNNMNNGCAGGTTTCAGAGTGAGAATAG3' [配列番号43]
最適なライゲーション条件を、全容積20μlでインサート:ベクターのモル比を3:1から5:1、10:1まで変えかつそれぞれ100ngの消化したベクターを用いて決定する。リガーゼの存在および不在のもとで、適切なベクターを含有する対照反応も実施してライゲーション効率とベクター再ライゲーションによるバックグラウンドを決定する。反応は一夜、16℃にて、1xライゲーションバッファーおよび200 NEBユニット(=3 Weissユニット)のT4 DNAリガーゼ中で実施する。試験ライゲーションを65℃にて15分間、熱不活性化する。続いて1μlアリコートの100μl ElectroTen-Blue(登録商標)エレクトロポレーションコンピテント細胞(Stratagene)中へのエレクトロポレーションを製造業者が概説する推奨に従って実施する。エレクトロポレーション直後に、1ml SOC培地(2% Bactoトリプトン、0.5% Bacto酵母エキス、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mMグルコース)をそれぞれのキュベットに加え、インキュベーションを30分間、37℃にて実施する。それぞれの増殖培養のプラーク形成単位の力価を、X-galによる青色/白色選択により、標準の分子生物学手順に従って測定する(Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,Laboratory Press)。
Claims (9)
- 一般式I:
R1-Cys-Z-Cys-R2 I
[式中、2個のCys残基はジスルフィド結合により架橋されそれにより環状ペプチドを形成し;
R1およびR2は、
A-BおよびB-C;またはB-AおよびC-B;またはC-BおよびB-A;またはB-CおよびA-B;またはC-AおよびC-A;またはA-CおよびA-C;またはC-AおよびC-B;またはB-BおよびC-B;またはB-BおよびB-C;またはA-BおよびC-C;またはB-AおよびC-C;またはC-BおよびB-B;またはB-CおよびB-B;またはC-CおよびB-A;またはC-CおよびA-B;またはB-BおよびC-C;またはC-CおよびB-B;またはA-CおよびB-C;またはC-BおよびC-A;またはB-CおよびA-C;またはA-CおよびA-B;またはB-AおよびC-A; A-AおよびC-C;またはC-CおよびA-A;
またはA-B-CおよびA-B-C;またはB-A-BおよびB-C-B;またはB-C-BおよびB-A-B;またはA-B-BおよびB-B-C;またはC-B-BおよびB-B-A;またはA-C-BおよびB-A-C;またはC-A-BおよびB-C-A;またはB-A-BおよびB-C-C;またはB-C-BおよびB-A-C;またはC-C-BおよびB-B-A;またはC-C-BおよびB-A-B、or C-B-BおよびC-C-A;またはA-C-CおよびB-B-C;またはB-C-CおよびB-A-B;またはB-C-CおよびB-A-C;またはA-B-BおよびB-C-C;またはB-A-BおよびC-C-B;またはC-A-BおよびC-C-B;またはB-B-BおよびB-C-C;またはC-B-BおよびB-B-B;またはB-B-BおよびC-C-B;またはB-C-CおよびB-B-B;またはA-B-CおよびB-B-C;またはC-B-BおよびC-B-A;またはA-B-CおよびA-C-C;またはC-C-AおよびC-B-A;またはB-A-CおよびA-C-B;またはB-C-AおよびC-A-B;またはC-B-AおよびC-B-A;またはA-A-BおよびB-C-C;またはC-C-BおよびB-A-A;またはB-B-CおよびA-C-C;またはB-B-CおよびA-B-C;またはB-B-CおよびB-B-C;またはB-B-CおよびB-B-B;またはB-A-CおよびB-C-C;またはC-C-BおよびC-A-B;またはC-C-BおよびC-B-A;またはA-B-CおよびB-C-C;またはC-A-BおよびB-C-B;またはB-C-BおよびB-B-C;またはC-B-BおよびB-C-B;またはB-C-BおよびB-B-B;またはB-B-BおよびB-C-B;またはC-B-BおよびB-C-A;またはA-C-BおよびB-B-C;またはC-B-BおよびC-B-B;またはB-B-BおよびB-B-B;またはB-B-BおよびB-B-C;またはA-A-CおよびA-C-C;またはC-C-AおよびC-A-A;またはA-A-CおよびA-C-B;またはB-C-AおよびC-A-A;またはA-A-CおよびB-C-C;またはC-C-BおよびC-A-A;またはA-A-BおよびC-C-B;またはB-C-CおよびB-A-A;またはA-B-AおよびC-B-C;またはC-B-CおよびA-B-A;またはA-B-BおよびC-B-C;またはC-B-CおよびB-B-A;またはB-A-AおよびC-C-B;またはB-C-CおよびA-A-B;またはB-B-AおよびC-B-B;またはB-B-CおよびA-B-B;またはB-B-AおよびC-C-B;またはB-C-CおよびA-B-B;またはB-B-CおよびA-C-B;またはB-C-AおよびC-B-B;またはB-C-BおよびC-B-B;またはB-B-CおよびB-C-B;またはB-C-BおよびC-A-B;またはB-A-CおよびB-C-B;またはB-C-BおよびC-B-B;またはB-A-CおよびA-C-B;またはB-A-CおよびA-C-C;またはC-C-AおよびC-A-B;またはB-A-CおよびB-C-C; B-C-CおよびA-A-C;またはC-A-AおよびC-C-B;またはC-A-AおよびC-C-A;またはA-C-CおよびA-A-C;またはC-B-AおよびC-C-A;またはA-C-CおよびA-B-C;またはC-B-AおよびC-B-B;またはC-B-AおよびC-C-B;またはB-C-CおよびA-B-C;またはC-B-BおよびC-C-A;またはC-B-BおよびC-B-B;またはC-B-BおよびC-C-B;またはB-CCおよびB-B-C;またはC-C-AおよびC-A-B;またはC-C-AおよびC-B-B;またはC-C-BおよびB-B-B;またはC-C-BおよびC-A-A;またはC-C-BおよびC-B-A;またはC-C-BおよびC-B-B;またはB-B-CおよびB-C-C;またはA-C-BおよびB-B-C;またはA-C-CおよびB-B-Cであり;ここで
AはAsn、Gln、Asp、Glu、Thr、SerおよびGlyのいずれか1つであり;
BはVal、Ile、Ser、Thr、Phe、Tyr、TrpおよびGlyのいずれか1つであり;そして
CはArg、LysおよびGlyのいずれか1つであり;そして
Zはn個のアミノ酸残基の鎖であってnは整数4〜20でありそしてこれらのn個のアミノ酸残基はそれぞれ独立していずれかの天然L-α-アミノ酸から誘導される]
で表わされるテンプレート固定β-ヘアピン模倣体。 - R1およびR2が
Glu-ThrおよびThr-Lys;またはLys-ThrおよびThr-Glu;または
Thr-GluおよびLys-Thr;またはThr-LysおよびGlu-Thr;または
Leu-GluおよびLys-Val;またはVal-LysおよびGlu-Leu;または
Glu-LeuおよびVal-Lys;またはLys-LeuおよびVal-Glu;または
Asn-GlyおよびLys-Val;またはVal-GlyおよびLys-Asn;または
Gly-AsnおよびVal-Lys;またはGly-ValおよびAsn-Lys;または
Gly-GlyおよびGly-Gly;または
Glu-Leu-LysおよびGlu-Val-Lys;またはLys-Val-GluおよびLys-Leu-Glu;または
Leu-Glu-LysおよびGlu-Lys-Val;またはVal-Lys-GluおよびLys-Glu-Leu;または
Glu-Lys-LeuおよびVal-Glu-Lys;またはLys-Glu-ValおよびLeu-Lys-Glu;または
Lys-Glu-LeuおよびVal-Lys-Glu;またはGlu-Lys-ValおよびLeu-Glu-Lys;または
Lys-Val-GlyおよびGly-Leu-Glu;またはGlu-Leu-GlyおよびGly-Val-Lys;または
Val-Lys-GlyおよびGly-Glu-Leu;またはLeu-Glu-GlyおよびGly-Lys-Val;または
Val-Gly-LysおよびGlu-Gly-Leu;またはLeu-Gly-GluおよびLys-Gly-Val;または
Gly-Gly-GlyおよびGly-Gly-Gly
であることを特徴とする、請求項1に記載の化合物。 - Zが-Arg-Gly-Asp-、
-Glu-Leu-Arg-、
-Arg-Lys-Lys-または
-Lys-Gly-Phe-
を含有するか、または
-Val-Arg-Lys-Lys-[配列番号1]、
-Lys-Lys-Tyr-Leu-[配列番号2]、
-Trp-Leu-Asp-Val-[配列番号3]、
-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-[配列番号4]、
-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-[配列番号5]、
-Ile-Lys-Val-Ala-Val-[配列番号6]、
-Pro-Pro-Xaa-Xaa-Trp-[配列番号7](配列中、Xaaはいずれの天然L-α-アミノ酸の残基であってもよい)、
-Leu-Trp-Tyr-Ser-Asn-His-Trp-Val-[配列番号22]、
-Lys-Trp-Phe-Ser-Asn-His-Tyr-Gln-[配列番号23]、
-Phe-Leu-Ala-His-Tyr-Ala-[配列番号24]または
-Leu-Trp-Tyr-Ser-Asn-His-Trp-Val-Lys-Trp-[配列番号25]
から成るかもしくはを含有することを特徴とする、請求項1または2に記載の化合物。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載の複数の化合物を含んでなる、テンプレート固定β-ヘアピン模倣体のライブラリー。
- テンプレート固定β-ヘアピン模倣体がファージコートタンパク質の少なくとも一部分と融合しかつテンプレート固定β-ヘアピン模倣体がファージまたはファージミド粒子の表面上にディスプレイされることを特徴とする、請求項4に記載のライブラリー。
- 立体配座的にβ-ヘアピンを安定化するテンプレートを有しかつ特異的結合パートナーと結合することができるテンプレート固定ヘアピンβ-模倣体をスクリーニングする方法であって、
a)請求項3または請求項4に記載のテンプレート固定β-ヘアピン模倣体のライブラリーを提供するステップ;
b)ステップa)のライブラリーを結合パートナーと接触させるステップ
c)ライブラリーから結合パートナーと非共有結合複合体を形成することができるペプチドを選択するステップ;および
d)場合によっては、ペプチドを単離するかまたはステップc)のDNA分析により配列を決定するステップ
を含んでなる方法。 - 結合パートナーが抗体、酵素、受容体およびリガンドからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 請求項6または7に記載の方法により決定され、かつ場合によっては単離されたペプチド。
- 請求項8に記載のペプチドの構造と同一の構造を有する合成ペプチド。
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