JP2008291017A - Ｗｉｐ１発現増強剤及び癌治療増感剤 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｗｉｐ１の発現を増強するＷｉｐ１発現増強剤及びこのＷｉｐ１発現増強剤を有する癌治療増感剤を提供する。
【解決手段】下記式（Ｉ）

に示す構造式の化合物を有することを特徴とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、Ｗｉｐ１の発現を増強させるＷｉｐ１発現増強剤、及びこのＷｉｐ１発現増強剤を有する癌治療増感剤に係り、詳しくは、Ｗｉｐ１の発現の増強を介してガン治療増感効果を発揮し得るＷｉｐ１発現増強剤、及びこのＷｉｐ１発現増強剤を有する癌治療増感剤に関する。

ＡＴＭ（ａｔａｘｉａ−ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ｍｕｔａｔｅｄ）プロテインキナーゼ（以下、単にＡＴＭと称する。）、及びＡＴＲ（ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ａｎｄ Ｒａｄ−３−ｒｅｌａｔｅｄ）プロテインキナーゼ（以下、単にＡＴＲと称する。）は、細胞のＤＮＡ損傷に係る修復において、重要な役割を演じることが知られている（非特許文献１）。細胞は、紫外線（ＵＶ）や電離放射線（ＩＲ）照射により、ＤＮＡ損傷を受け、チェックポイントシグナルカスケードが惹起され、ＤＮＡ損傷を修復したりアポトーシスを起こすため、細胞周期をＧ１／Ｓ、中間Ｓ期及びＧ２／Ｍ期にアレスト（ａｒｒｅｓｔ）される。ＡＴＭを欠損するＡＴ（ａｔａｘｉａ−ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ；血管拡張性失調症）患者由来の細胞は、Ｇ１／Ｓ及びＧ２／Ｍチェックポイントが欠落した発現型を示すため、ＩＲに感受的である。従って、ＡＴＭ及びＡＴＲ並びにその下流経路は、染色体の維持に重要である。これらの事項が示すのは、ＡＴＭ及び／又はＡＴＲ活性の制御は、染色体の安定性を保持するのに必要であるのみならず、化学療法や放射線治療などの抗癌治療への適用が可能であるということである。従って、これらのシグナル伝達を制御することは、抗癌治療に有用であり、盛んに検討がなされている。

これらのシグナル経路を利用した抗癌治療への適用の例として、非特許文献２は、カフェイン（３，７−ジヒドロ−１，３，７−トリメチル−１Ｈ−プリン−２，６−ジオン）で補助した化学療法により、非増殖性の骨肉腫に係る腫瘍の切除が最小限ですむことを開示する。カフェインは、化学療法で惹起されたＤＮＡ損傷に反応してＡＴＭプロテインキナーゼ活性を阻害すると考えられる。また、近年、細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたり、リコンビナントのキナーゼからキナーゼ部位を欠落させたタンパク質を過剰発現させるなどして、ＡＴＭの主要な役割の解明がなされている（非特許文献３乃至５）。また、ＵＶやＩＲの照射によりｐ５３依存的に発現増強が観られるフォスファターゼ活性を有するＷｉｐ１が、ＡＴＭのキナーゼ活性の活性中心である１９８１番目のセリン残基を脱リン酸化し、ＡＴＭの活性化を阻害することが報告されている（非特許文献６参照）。また、ＡＴＭの活性阻害剤であるカフェイン、ワートマンニンや、化学的にＡＴＭ及びＡＴＲのプロテインキナーゼ活性を阻害する研究が広く行われているが、癌細胞の増殖を阻止し、抗癌治療に十分に適用し得る化合物が得られていないのが現状である。このことは、ＡＴＭ及びＡＴＲ並びにこれらを取り巻くシグナル伝達経路が複雑であることに起因するものであって、ＡＴＭ及び／又はＡＴＲに特異的なこれらのシグナル伝達経路を有効に阻害して、上記の目的と達し得る薬物が望まれていた。

ＡＴＭ及びＡＴＲは、細胞におけるＤＮＡ損傷に対する反応の間、ｐ５３の１５番目のセリン残基を直接的かつ特異的にリン酸化する。ｐ５３は、ＤＮＡ損傷で誘導されるＧ１／Ｓチェックポイントにおいて、中心的な役割を演じる。ＡＴＭ及びＡＴＲは、近年の知見により、ＵＶ光の曝露やガンマ線照射（ＩＲ）に反応したｐ５３の１５番目のセリン残基のリン酸化に最も著明な役割を演じることが示唆されている。従って、ｐ５３の１５番目のセリン残基のリン酸化は、ＵＶ又はＩＲで誘導したＤＮＡ損傷の後のＧ１／Ｓチェックポイントが機能しているかどうかを予測する妥当な指標である。また、このリン酸化は、ＵＶやＩＲに対する損傷反応において、ＡＴＭ及びＡＴＲの活性を反映するものである。Ｇ１／Ｓと同様にＧ２／Ｍチェックポイントは、ＤＮＡ損傷細胞において、ＡＴＲとＡＴＭとで制御される。Ｇ２／Ｍチェックポイントは、非常に重要であり、ｐ５３欠損又は突然変異腫瘍などの多くのガン細胞において保存されている。特に、ｐ５３の機能を欠いた細胞もまた、Ｇ２／Ｍチェックポイントの欠損により、ＤＮＡ損傷に対して感受的である。事実、Ｇ２／Ｍチェックポイントに関連するＡＴＭ及びＡＴＲは、分化細胞の染色体維持に重要である。これらの結果により、ＡＴＭプロテインキナーゼ活性の阻害を含むＧ２／Ｍチェックポイントに係る一連のシグナルを阻害することが抗癌治療の候補になると示唆される。

一方、天然由来の種々の物質は、副作用が少なく、有用な抗癌剤の候補として研究が進められており、事実、現在用いられている抗ガン剤の７０％以上は、天然由来又はその類縁物質である。なかでも、スクアレン（Ｓｑｕａｌｅｎｅ；ＳＱ）は、サメの肝臓をはじめオリーブ油等を構成する化合物のひとつであり、近年はサプリメントとしても重用されている（例えば、サメミロン（商標登録）（日誠マリン社製））。スクアレンは、本来ヒトの組織中に微量ながら存在している未知なる機能を備える成分として期待されている。また、スクアレンは、抗ガン作用を有する旨の示唆が報告されているが、その分子レベルでの作用など、詳細な作用機序は、明らかになっていない。従って、スクアレンについて示唆されている抗ガン作用を発揮するに至る生体内での作用機序は、依然として明らかにされていないのが現状である。
Ｓｈｉｌｏｈ Ｙ著、"ＡＴＭ ａｎｄ ＡＴＲ： ｎｅｔｗｏｒｋｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ"、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、２００１年、１１巻、ｐ．７１−７７ Ｔｓｕｃｈｉｙａ Ｈら著、"Ｃａｆｆｅｉｎｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ ｔｕｍｏｒ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｆｏｒ ｎｏｎｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ．"、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１８巻、１９９８年、ｐ．６５７〜６６６ Ｓｈａｃｋｅｌｆｏｒｄ ＲＥら著、"Ｔｈｅ Ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｇ１ ａｎｄ Ｇ２ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．"、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、２７６巻、ｐ．２１９５１〜２１９５９ Ｗｒｉｇｈｔ ＪＡら著、"Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＡＴＲ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ＵＶ ａｎｄ ｉｏｎｉｚｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｂｒｏｇａｔｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｃｏｎｔｒｏｌ．"、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１９９８年、９５巻、ｐ．７４４５〜７４５０ Ｓｈｉｇｅｔａ Ｔら著、"Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｍｉｔｏｔｉｃ ｓｐｉｎｄｌｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ＡＴＭ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．"、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９９９年、５９巻、ｐ．２６０２〜２６０７ Ｓｈｒｅｅｒａｍら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、２００７年、２３巻、ｐ．７５７−７６４ Ｓａｒｋａｒｉａ ＪＮら著、"Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＡＴＭ ａｎｄ ＡＴＲ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ， ｃａｆｆｅｉｎｅ．"、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９９９年、５９巻、ｐ．４３７５〜４３８２ Ｔｉｂｂｅｔｔｓら著、Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０００年、１４巻、ｐ．２９８９〜３００２

本発明は、上記の問題に鑑みてなされたものであって、Ｗｉｐ１の発現を増強するＷｉｐ１発現増強剤を提供することを目的とする。

また、本発明は、このようなＷｉｐ１の発現を増強するＷｉｐ１発現増強剤を有する癌治療増感剤を提供することを目的とする。

本発明によるＷｉｐ１発現増強剤は、下記の式（Ｉ）に示すスクアレンを有することを特徴とする。

また、本発明による癌治療増感剤は、上記式（Ｉ）に示すスクアレンを有することを特徴とする。

本発明によれば、Ｗｉｐ１の発現を増強することが可能となる。また、上記式（Ｉ）に示すスクアレンによるＷｉｐ１の発現増強は、ＡＴＭ及びＡＴＲを直接阻害することなく実現し得るものである。

また、Ｗｉｐ１の発現増強により、ＡＴＭプロテインキナーゼ活性を阻害することが可能となる。

さらに、本発明によれば、Ｗｉｐ１の発現増強を介して、癌治療の効果をさらに高めることが可能となる。

本発明者らは、抗ガン剤又は放射線や化学療法の抗癌治療補助薬という観点で、スクアレンをＤＮＡ損傷に係る反応におけるシグナル伝達経路に適用することを想到した。

本発明によるＷｉｐ１発現増強剤としては、天然品など、種々の市販で利用可能なスクアレンを利用してもよく、さらにサメ肝臓やオリーブ油等から抽出／精製したスクアレンであってもよい。

本発明による癌治療増感剤は、上記のＷｉｐ１発現増強剤を有する。本発明による癌治療増感剤において、このＷｉｐ１発現増強剤としては、医薬的に許容可能な塩であってもよい。

本発明による癌治療増感剤は、癌の化学療法剤とともに用いられてもよい。この化学療法としては、本技術分野公知の種々の抗癌剤を用いたものであってもよく。このような抗癌剤としては、限定されないが、シクロフォスファミド、イホスファミド、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、カルボコン、ダカルバジン、塩酸ニムスチン、ラニムスチンなどのアルキル化剤；テガフール、メトトレキサート、メルカプトプリン、フルオロウラシル、カルモフール、ドキシフルリジン、カペシタビン、シタラビンオクホスファート、ヒドロキシカルバミド、シタラビン、塩酸ゲムシタビン、リン酸フルダラビン、エノシタビンなどの代謝拮抗剤；硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンデシン、ドセタキセル水和物、パクリタキセル、酒石酸ビノレルビンなどのアルカロイド系、塩酸ドキソルビシン、塩酸エピルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸アムルビシン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、塩酸ブレオマイシン、塩酸ペプロマイシンなどの抗生物質抗癌剤；エトポシド、塩酸イリノテカン、塩酸ノギテカンなどのトポイソメラーゼ阻害薬；リン酸エストラムスチンナトリウム、フルタミド、ビカルタミド、酢酸ゴセレリン、酢酸リュープロレリン、クエン酸トレミフェン、塩酸ファドロゾール水和物、アナストロゾール、エキセメスタン、メピチオスタン、酢酸メドロキシプロフェステロンなどのホルモン製剤；シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチンなどの白金製剤；トラスツズマブ、リツキシマブ、メシル酸イマチニブ、ゲフィチニブなどの分子標的治療薬；クレスチン、レンチナン、シゾフィラン、抗悪性腫瘍溶連菌製剤、ウベニメクスなどの非特異的抗悪性腫瘍剤；
塩酸ミトキサントロン、塩酸プロカルバジン、ペントスタチン、クラドリビン、ソブゾキサン、トレチノイン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセグラトン、ミトタン、ポルフィマーナトリウム、タラポルフィンナトリウム、三酸化ヒ素などのその他の抗癌剤が挙げられる。なかでも、この化学療法剤としては、テガフールなどの核酸代謝拮抗剤が好ましい。

本発明による癌治療増感剤は、癌の放射線療法とともに用いられてもよい。

これら化学療法剤及び放射線療法などの各種抗癌療法は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いられてもよい。

本発明による癌治療増感剤は、ＡＴＲ及びＡＴＭのキナーゼ活性を阻害しないものであってもよい。

本発明による癌治療増感剤は、上記の化学療法剤をさらに有してもよい。また、本発明による癌治療増感剤は、この他、医薬的に許容可能な種々の成分を有してもよく、このような成分としては、キャリア、アジュバント、ビヒクルが挙げられ、このようなキャリア、アジュバント、ビヒクルとしては、限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン)、緩衝液物質(例えば、リン酸塩)、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質(例えば、硫酸プロタミン)、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸エステル、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロック重合体、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられる。

本発明による癌治療増感剤の形態としては、固形状でも、液状でもよく、懸濁液であってもよい。この懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤および懸濁剤を用いて、当該技術分野で公知の方法に従って、調製されてもよい。また、本発明による癌治療増感剤は、無菌で調製されてもよく、注射用として調製されてもよい。このような液状の癌治療増感剤に用いるビヒクル、溶媒としては、例えば、水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウムが挙げられる。また、本発明による癌治療増感剤は、固体状の希釈剤を用いてもよく、このような希釈剤としては、合成のモノグリセリドやジグリセリド、脂肪酸(例えば、オレイン酸)やそのグリセリド誘導体、長鎖アルコール希釈剤や分散剤が挙げられる。

本発明による癌治療増感剤の投与形態としては、経口的であっても、非経口的であってもよい。経口的に投与される場合、本発明による癌治療増感剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒、細粒、トローチ、エリキシル剤、懸濁液、溶液の各形態であってもよい。また、非経口的に投与される場合、本発明による癌治療増感剤は、注射剤、輸液、点眼剤、経皮パッチ、座剤、浣腸、軟膏、ローション、クリーム、エアロゾルの各形態であってもよい。これらの製剤は、本技術分野公知の賦形剤及び／又は希釈剤を有してもよく、限定されないが、例えば、錠剤用キャリア（ラクトースおよびコーンスターチ）、錠剤用潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム）、カプセル剤用希釈剤（ラクトースおよび乾燥コーンスターチ）、懸濁液用乳化剤及び懸濁剤、座剤用賦形剤（ココアバター、蜜ろう、およびポリエチレングリコール）、外用キャリア（鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、および水）、ローション又はクリーム用キャリア（鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス（ｃｅｔｙｌ ｅｓｔｅｒｓ ｗａｘ）、セテアリールアルコール（ｃｅｔｅａｒｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水）が挙げられる。また、本発明による癌治療増感剤には、その他の成分を添加してもよく、例えば、防腐剤（ベンジルアルコニウムクロライド、ベンジルアルコール）、吸収促進剤、可溶化剤（フルオロカーボン）、分散剤、甘味料、香料、着色剤が挙げられる。

以下、本発明の好適な実施形態につき説明する。

（実施例１−１）
ヒト肺ガン細胞株Ａ５４９細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社製）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び１００ユニット／ｍＬのペニシリンを含有するＤＭＥＭ培地（以下、増殖培地と称する。）中で５００個／６０ｍｍディッシュとなるように播種して、一昼夜培養した後、２μＭ〜２００μＭの最終濃度となるように培地中にスクアレン（日誠マリン社製；５０ｍＭとなるようにスクアレン含有メタノール溶液を調製し、培地中で最終濃度となるように添加して用いた。以下、同様。）を添加した。その後、１４日間の培養を行い、２％のメチレンブルーの５０％メタノール溶液によりコロニーを染色し、生細胞数をカウントした。その結果を図１Ａに示す。縦軸は、未処理細胞に対する処理細胞における生細胞の比率を百分率で示し、横軸は、スクアレンの濃度（μＭ）を示す。

（実施例１−２）
実施例１−１と同様に播種し１日培養し増殖培地を除いて得たＡ５４９細胞について、１０μＭ及び１００μＭの最終濃度のスクアレンで１時間処理した。この処理した細胞に、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて２５、５０及び１００Ｊ／ｍ^２の紫外線（波長２５４ｎｍを用いた。ＵＶ照射とも称する。以下同様）を照射し、この細胞にそれぞれ同様の最終濃度のスクアレンを有する増殖培地（以下、スクアレン含有培地と称する。）を添加して、上述と同様に１４日間培養を行った。得た細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、上述と同様にクローン形成法に従って、生細胞数をカウントした。その結果を図１Ｂに示す。図１Ｂ中、横軸は、照射したＵＶの照射強度（Ｊ／ｍ^２）を示し、縦軸は、未処理細胞群に対する処理細胞群における生細胞の比率を百分率で示す。また、図１Ｂ中、○印は、スクアレンを処理しない群を示し、△印は、１０μＭのスクアレンで処理した群を示し、■印は、１００μＭのスクアレンで処理した群を示す。また、各印及び各印におけるバーは、平均±標準誤差（ｎ＝４）を示す。

（実施例１−３）
実施例１−２において、１０μＭ及び１００μＭの最終濃度のスクアレンに代えて、３０μＭ及び１００μＭのスクアレンを用い、２５、５０及び１００Ｊ／ｍ^２のＵＶ照射に代えて、増殖培地を除かずに２及び６グレイ（Ｇｙ）のγ線（^１３７Ｃｓに由来するもの；以下、同様。）の照射を行った以外は、実施例１−２と同様に行った。その結果を、図１Ｃに示す。図１Ｃ中、横軸は、γ線照射（以下、ＩＲ照射とも称する。）の照射線量（Ｇｙ）を示し、縦軸は、未処理細胞群に対する処理細胞群における生細胞の比率を百分率で示す。また、図１Ｃ中、○印は、スクアレンを処理しない群を示し、▲印は、３０μＭのスクアレンで処理した群を示し、■印は、１００μＭのスクアレンで処理した群を示す。

（実施例２−１）
Ａ５４９細胞を増殖培地で３万個／ｃｍ^２となるように１０ｃｍディッシュに播種し、一昼夜培養した後、１０又は１００μＭの最終濃度となるように培地中にスクアレンを添加した。培養３時間後、細胞を回収し培地を除去し、下述のＦＡＣＳ分析法に従って、細胞周期分布割合を測定した。その結果を図２Ａに示す。

（実施例２−２）
実施例２−１と同様にスクアレンを培地に添加して３時間培養して得たＡ５４９細胞に、２５又は１００Ｊ／ｍ^２の照射強度を有するＵＶを用いて照射を行った後、これに新鮮な増殖培地を添加してさらに１時間培養した。この細胞を回収し、下述のヒストンＨ３リン酸化量の測定に従って、解析を行った。結果を図２Ｂに示す。図２Ｂ中、丸で囲った部分は、Ｍ期の細胞群を示し、その上方に記載の数値は、解析した全細胞数に対するＭ期の細胞群の数の割合を示す。また、図２Ｃは、図２Ｂを数値化したグラフであり、各処理毎に３枚の独立したディッシュで処理して得た細胞群についてそれぞれ解析して統計的に処理したものである。図２Ｃに記載の４つのＵＶ照射群のそれぞれのバーのうち、左のバーは、コントロールを示し、中央のバーは、１０μＭのＳＱで処理した群を示し、右のバーは、１００μＭのＳＱで処理した群を示す。統計処理は、ＳＡＳとダンカンの多群比較検定により行い、Ｐ値が１％未満となる場合にのみ有意差を有する群として＊印を付した。

（実施例２−３）
実施例２−２において、１０又は１００μＭの最終濃度のスクアレンを有するスクアレン含有培地に代えて、１００μＭのスクアレン含有培地を用い、２５又は１００Ｊ／ｍ^２の照射強度を有するＵＶに代えて、６ＧｙのＩＲ照射を行った以外は、実施例２−２と同様に行った。その結果を図２Ｄに示す。また、図２Ｅは、図２Ｄを数値化したグラフであり、上述と同様である。

（実施例３）
Ａ５４９細胞を増殖培地で３万個／ｃｍ^２となるように１０ｃｍディッシュに播種し、一昼夜培養した後、３、１０、３０又は１００μＭの最終濃度となるように培地中にスクアレンを添加した。培養１時間後、培地を除去し、１０Ｇｙの照射強度を有するＩＲを用いて照射を行った後、さらに３時間培養した。その後、下述の蛋白調製に準じて細胞中の蛋白質を抽出した後、下述のイムノブロット分析に準じて、ＳＭＣ１蛋白の９６６番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−ＳＭＣ１（Ｓｅｒ９６６））、ｐ５３蛋白の１５番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５））及びチューブリン（Ｔｕｂｌｉｎ）について、イムノブロット分析を行った。その結果を図３に示す。

（実施例４）
基質として１μｇのリコンビナントＰＨＡＳ−Ｉタンパク（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を、下述のリン酸化反応用ＡＴＲ混液及びＡＴＭ混液の調製に従って得たリン酸化反応用ＡＴＲ混液及びＡＴＭ混液に添加するとともに、適当な濃度の^３２Ｐ−ＡＴＰを有する３００μＭのＡＴＰを添加して、３０℃で２０分間反応させた。この反応液の４倍濃度のＳＤＳサンプルローディングバッファー（２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４００ｍＭのＤＴＴ及び８％のＳＤＳ）を反応液に２５％の容量で添加して反応を停止し、この混液を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ゲルを乾燥後、上述の混液中の^３２Ｐ−ＰＨＡＳ−Ｉに対応するバンドに関し、オートラジオグラフィーで、β線量をカウントした。結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。図４Ａ及び図４Ｂは、それぞれＡＴＭ及びＡＴＲの相対活性を示し、横軸は、スクアレンの濃度を示し、縦軸は、スクアレン無添加に対するカウントの相対値を示す。

（実施例５）
Ａ５４９細胞を増殖培地で３万個／ｃｍ^２となるように１０ｃｍディッシュに播種し、一昼夜培養した後、３、１０、３０、１００又は３００μＭの最終濃度となるように培地中にスクアレンを添加した。培養３時間後、下述の蛋白調製に準じて細胞中の蛋白質を抽出した後、下述のイムノブロット分析に準じて、Ｗｉｐ１の発現について、イムノブロット分析を行った。その結果を図５に示す。

（実施例６）
７週齢のオスのＢＡＬＢ／ｃ系マウス（２４匹）の下肢足底部に、マウス結腸癌細胞株であるＣｏｌｏｎ２６細胞を移植し、移植８日目から、１日おきに、ＴＳ−１（大鵬薬品社製）を１５ｍｇ／ｋｇで経口投与するとともに、１００重量％のＳＱ（以下、単にＳＱとも称する。）（日誠マリン工業社製）（１５μＬ）を皮下投与した。細胞移植後５日目から、細胞の移植部位から癌組織を外科的に採取し、その容量を定法に従って計測した。その結果を図６に示す。なお、図６において、縦軸は、細胞を移植した部位から採取した癌組織の容積（ｍｍ^３）を示し、横軸は、動物に細胞を移植してからの日数を示す。全ての実験区でガン細胞を同じ手順で移植して実験に供した。「コントロール（ＣＴ）」は、対象群であって、ＴＳ−１及びＳＱの代わりに、ＰＢＳを投与及び注射した群を示し、「ＴＳ−１」は、上記のＴＳ−１の投与のみを行った群を示し、「ＳＱ」は、上記のＳＱの投与のみを行った群を示し、「ＳＱ＋ＴＳ−１」は、上記のＴＳ−１の投与及びＳＱの投与を行った群を示す。また、各点のバーは、平均±標準偏差を示す。

（実施例７）
実施例６において、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスに代えて、重度複合免疫不全マウスであるＳＣＩＤ（Ｓｅｖｅｆｅ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＩｍｍｕｎｏＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）マウスを用い、Ｃｏｌｏｎ２６細胞に代えて、ｐｏｏｒｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ由来のヒト胃癌細胞株であるＭＫＮ４５細胞を用い、ＴＳ−１を投与する代わりに、３ＧｙのＸ線（ＩＲ）を下肢に直接照射し、１５μＬのＳＱの代わりに、３０μＬのＳＱを用い、細胞移植後５日目から投与等を行った代わりに、１２日目から投与等を行った以外は、実施例６と同様に行い、癌組織の容積を計測した。その結果を図７に示す。なお、図７の縦軸及び横軸並びに各点のバーは、図６のものと同様である。

（実施例８）
実施例７において、Ｘ線を照射する代わりに、ＴＳ−１（大鵬薬品社製）を１５ｍｇ／ｋｇで経口投与した以外は、実施例７と同様に行い、癌組織の容積を計測した。その結果を図８に示す。なお、図８の縦軸及び横軸並びに各点のバーは、図６のものと同様である。

（実施例９）
実施例８において、細胞移植後２３日目に細胞の移植部位から組織を採取した。この採取した組織について、実施例３に準じたｐ５３蛋白の１５番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５））及びＳＭＣ１蛋白の９６６番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−ＳＭＣ１（Ｓｅｒ９６６））に係るイムノブロット分析、並びに実施例５に準じたＷｉｐ１発現に係るイムノブロット分析を行った。その結果を図９に示す。

（ＦＡＣＳ分析）
細胞をＰＢＳで洗浄した後、７０％氷冷エタノールで固定した。遠心分離により回収したペレットにＰＢＳを用いて洗浄した後、再度遠心分離を行った。ペレットを最終濃度１００μＭのＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社、以下ＰＩ）と４０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを含む溶液（ＰＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で懸濁し３０分間室温にて培養した。その後フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で細胞周期の解析を行った。

（ヒストンＨ３リン酸化量の測定）
細胞をＰＢＳで洗浄した後、７０％氷冷エタノールで固定した。これに、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有ＰＢＳを添加し、氷上で３０分間載置した後、細胞を回収し、遠心分離（５００×ｇ、５分間）して得た細胞ペレットに、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び１μｇの抗ウサギ血清（ヒストンＨ３の１０番目のセリン残基のリン酸化体に特異的なもの）含有ＰＢＳ（１００μＬ）を添加して、室温で４時間載置した。その後、これを１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１００倍に希釈したＦＩＴＣでコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を添加し、暗所で３０分間、載置した。さらに、上述のＦＡＣＳ分析に準じてＰＩ染色を行った後、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）でリン酸化ヒストンＨ３量を測定した。

（イムノブロット分析）
５０μｇの蛋白（下述の蛋白調製に準じて調製したもの）をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２．５％）を行い、泳動後の各蛋白を、定法に従いニトロセルロース膜に転写し、５％スキムミルク及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）を用い、室温で１時間、ブロッキング反応を行った。得た膜を、下記の所望の抗体で４℃１６時間インキュベートし、その後、西洋わさび由来ペルオキシダーゼでコンジュゲートした二次抗血清（下述の所望の抗体の由来動物に対するもの）で、室温１時間インキュベートした。その後、標的蛋白を、ＥＣＬ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）及びｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）で可視化して、蛋白像を得た。

＜抗体＞
ｐ５３抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）
リン酸化ｐ５３抗体（１５番目のセリン残基がリン酸化されているものに対するもの）（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
リン酸化ＳＭＣ１抗体（９６６番目のセリン残基がリン酸化されているものに対するもの）（Ｂｅｔｈｙｌ社製）
リン酸化ＡＴＭ抗体（１９８１番目のセリン残基がリン酸化されているものに対するもの）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）
ＡＴＭ抗体（ポリクローナルウサギＩｇＧ抗体；Ｈ−３００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）
ＡＴＲ抗体（ポリクローナルウサギＩｇＧ抗体；Ｂｅｔｈｙｌ社製）
チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ社製）
Ｗｉｐ１抗体（ポリクローナルウサギＩｇＧ抗体；Ｈ−３００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）

（蛋白調製）
細胞を、氷冷ＰＢＳで培養ディッシュから剥離し、冷ＰＢＳで２回洗浄した後、遠心分離して得た細胞ペレットに、下述のＵＴＢ緩衝液で可溶化して、細胞由来の蛋白混合物を調製した。蛋白量は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で測定した。

＜ＵＴＢ緩衝液＞
８ｍＭ 尿素
１５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）

（リン酸化反応用ＡＴＲ混液及びＡＴＭ混液の調製）
リン酸化反応用ＡＴＲ混液には、非特許文献８等の公知の方法を用いて製造されたＦｌａｇでタグ付けしたＡＴＲを用いた。詳しくは、非特許文献８に開示の方法は、ＡＴＲ遺伝子（配列番号１）のＢａｍＨ１−ＳｗａＩフラグメント（１ｋｂ）を、Ｆｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）をＮ末端に有するＡＴＲに対応する遺伝子に置き換えてＰＣＲで増幅させた遺伝子産物を、ｐｃＤＮＡ３．１に導入したプラスミドから合成する方法である。また、リン酸化反応用ＡＴＭ混液には、非特許文献７の公知の方法及び抗ＡＴＭ抗体を用いて得たＡＴＭを用いた。

Ｆｌａｇでタグ付けしたＡＴＲプラスミド（配列番号１）を、下述のリン酸カルシウム法に準じて、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１２６８）にトランスフェクトし、２日間培養した。一方、ＡＴＭの精製には、何も処理を行わず培養しフラスコを満たしたＡ５４９細胞を用いた。その後、上述のＵＴＢ緩衝液を下述のＩＰ緩衝液に変更して行った上述の蛋白調製に準じて得た蛋白混合物５ｍｇを、４℃４時間、２０μｇの抗Ｆｌａｇ−Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社製）又は抗ＡＴＭ抗体で、免疫沈降させた。これと、４℃１時間、プロテインＧセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）でコンジュゲートしたビーズとをインキュベートした。得た免疫複合体を、下述のＴＧＮ緩衝液で２回洗浄し、さらに、下述のキナーゼ緩衝液で１回洗浄し、リン酸化反応用ＡＴＲ混液及びＡＴＭ混液（配列番号２及び３）を得た。

＜ＩＰ緩衝液＞
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）
１ｍＭ ＥＤＴＡ
１ｍＭ ＥＧＴＡ
１５０ｍＭ ＮａＣｌ
０．５％ ＮＰ−４０
１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１ｍＭ フェニルメタンスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）
２μｇ／ｍＬ ペプスタチン
２μｇ／ｍＬ アプロチニン
１ｍＭ ｐ，ｐ’−ジクロロジフェニルトリクロロエタン（ＤＤＴ）

＜ＴＧＮ緩衝液＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）
５０ｍＭ グリセロリン酸
１５０ｍＭ ＮａＣｌ
１％ Ｔｗｅｅｎ２０
１０％ グリセロール

＜キナーゼ緩衝液＞
１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）
５０ｍＭ グリセロリン酸
５０ｍＭ ＮａＣｌ
１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２
１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２

＜リン酸カルシウム法＞
２９３Ｔ細胞を増殖培地中で２×１０^４個／ｃｍ^２となるように１０ｃｍディッシュに播種して一昼夜培養した。その後、上述のＦｌａｇ−ＡＴＭ及びＦｌａｇ−ＡＴＲを最終濃度２５ｍＭのＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）と２５ｍＭのＣａＣｌ_２とに混合して、細胞にトランスフェクトさせた。一晩培養後、新鮮な増殖培地に交換して２日間培養した。

（考察）
ＡＴＭ（ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｓｉａ ｍｕｔａｔｅｄ）及びＡＴＲ（ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ａｎｄ Ｒａｄ−３−ｒｅｌａｔｅｄ）は、細胞周期のＤＮＡ損傷に対する反応に係るシグナル伝達において、重要な役割を演じる。ＡＴＭ及びＡＴＲは、Ｃｈｋ１、ｐ５３、ＮＢＳ１、Ｂｒｃａ１、ＳＭＣ１などのいわゆるチェックポイント・タンパク質群や転写因子をリン酸化する。発癌の原因ともなる次の世代へのＤＮＡ損傷の持ち越しを防ぐために、上述のチェックポイントシグナルは、細胞周期全体を制御している。ＡＴＭ又はＡＴＲの不全は、ＵＶ若しくはＩＲ照射又は障害誘導性薬剤により誘導されたＤＮＡ損傷により、細胞の生存率を低下させる。このことは、損傷を受けたＤＮＡの修復、維持及び管理において、ＡＴＭ及びＡＴＲが必要であることを示す。本発明において、本願出願人は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＤＮＡ損傷反応におけるチェックポイントシグナル伝達経路に対してスクアレンが阻害効果を有することを示す。

ガン細胞に対するスクアレン自体の影響を調べるため、ＵＶやＩＲの照射を行わないで、Ａ５４９細胞の生存率に及ぼすスクアレンの濃度依存性を検討した。その結果、図１Ａに示すとおり、２００μＭの濃度まで若干低下する傾向が認められたが、その減少は、１０％程度と極めて弱いことが分かった。このことから、スクアレンは、μＭオーダーの濃度では、細胞毒性を示さないと言える。

また、ＵＶ及びＩＲ照射で惹起されるＡ５４９細胞の細胞死に及ぼすスクアレンの影響を調べた。その結果、図１Ｂに示すように、２５、５０及び１００Ｊ／ｍ^２の照射強度を有するＵＶで照射を行ったところ、細胞は、照射強度依存的に細胞死が起こった。一方、予め１０及び１００μＭのスクアレンで処理した細胞群では、ＵＶ照射した細胞群に比して、生存率が顕著に低下した。特に、５０及び１００Ｊ／ｍ^２で照射した群では、顕著であった。さらに、図１Ｃに示すように、同様の結果が、ＩＲ照射を行った群においても、確認された。

まとめると、照射強度の弱いＵＶ照射では、その差が顕著ではなかったが、比較的高強度のＵＶ照射又はＩＲ照射において、スクアレンによるガン細胞生存率の低下が認められた。このことは、ＤＮＡの一本鎖切断を主に認識し作用するＡＴＲより、むしろ二本鎖切断を主に認識するＡＴＭの作用をスクアレンが弱めている可能性が示唆された。

次に、これらの細胞毒性が、細胞周期の活動とどのように関連しているかを検討した。ガン細胞の細胞周期に対するスクアレンの影響を検討することで、スクアレンが細胞周期の速度調節を行っているか否かを判断することができる。もし、スクアレン自体が細胞周期の速度を調節する作用を有するとすると、ガン細胞を一時的に特定の細胞周期に留める（アレストする）ことで細胞の増殖を抑制したり、特定の細胞周期に見られる一過性のタンパク質発現を誘導することになったり、Ｇ２／ＭチェックポイントなどのＤＮＡ損傷に係るチェックポイントへの作用を詳細に調べる上で障害となる。ところが、ガン細胞をスクアレン単独で処理した場合、図２Ａに示すように、スクアレンは、細胞を特定の細胞周期に一時的に蓄積させないことが分かった。従って、スクアレンは、細胞周期の速度調節作用を有さないことが証明された。

ヒストンＨ３は、正常な分裂細胞においてその１０番目のセリン残基がリン酸化されるが、ＤＮＡ損傷により、リン酸化ヒストンＨ３陽性細胞の割合は減少する。図２Ｂ及び２Ｃによると、１０、２５及び１００Ｊ／ｍ^２のＵＶ照射によりリン酸化ヒストンＨ３の割合がＵＶの照射強度に依存して減少した。一方、２５Ｊ／ｍ^２のＵＶ照射では有意ではなかったが、１００Ｊ／ｍ^２のＵＶ照射により、スクアレンは、Ｇ２／Ｍチェックポイントを顕著に崩壊させた。事実、高線量のＵＶ照射において、ＤＮＡ損傷に対する反応中、スクアレンは、Ｇ２／Ｍチェックポイントを完全に無効にした。一方、図２Ｄ及び２Ｅによると、Ａ５４９細胞にＩＲ照射した場合、Ｇ２／Ｍチェックポイントを有意に崩壊させた。図１Ｂ及び１Ｃでも観察されたように、図２Ｂ及び２Ｃ並びに図２Ｄ及び２Ｅに示すように、比較的強い照射強度でＵＶ又はＩＲ照射を行った時にスクアレンがチェックポイント活性を阻害したことは、Ｇ２／Ｍチェックポイントにおいて、スクアレンが、ＡＴＲよりもむしろＡＴＭの活性に直接的に及び／又は間接的に阻害する効果を有することが示唆された。

そこで、ｉｎ ｖｉｖｏ（細胞内）においてＡＴＭキナーゼ活性に及ぼすスクアレンの阻害活性を検証するため、ＵＶ又はＩＲ照射により誘導されるＤＮＡ損傷の後のｐ５３リン酸化を検討した。ｐ５３は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、種々のプロテインキナーゼにより、複数の部位でリン酸化を受けることが知られている。事実、ｐ５３は、細胞がＵＶ照射、ＩＲ照射及びメチル化剤により障害された際、１５番目のセリン残基においてＡＴＲ及びＡＴＭにより特異的にリン酸化を受ける。本発明において、Ａ５４９細胞に対してＩＲ照射を行った場合、ＳＭＣ１とｐ５３のいずれも強くリン酸化された。このリン酸化レベルは、予めスクアレンで処理した場合、弱まることが分かった。しかも、このリン酸化のシグナルは、スクアレンの濃度依存的に減弱することも確認された。一方、細胞をスクアレン単独で処理しても、図２Ａに示すように、細胞周期の局所的な蓄積や偏りは、認められなかった。これらのことは、スクアレンによるＧ１期で一過性に増加するｐ５３のタンパク質量の増加に例えられるような特定の細胞周期への蓄積によるチェックポイント分子のリン酸化によるものではなく、ＡＴＭやＡＴＲなど、チェックポイントの上流に位置するキナーゼ活性が著しく損なわれた結果によるものであると考えられた。

そこで、本発明者らは、スクアレンがＡＴＭ及びＡＴＲの活性を酵素的に直接阻害している可能性について検討した。非特許文献７は、Ａ５４９アデノカルシノーマ細胞におけるＡＴＭ及びＡＴＲプロテインキナーゼに対するカフェインの阻害効果を開示する。本発明者らは、この文献と同一の方法により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＡＴＭおよびＡＴＲのプロテインキナーゼ活性に及ぼすスクアレンの影響を検討した。その結果、図４Ａ及び４Ｂに示すように、スクアレンをキナーゼ緩衝液とインキュベートしても、ＡＴＭ及びＡＴＲのいずれの活性も阻害されることが確認されなかった。これらの結果から、スクアレンは、ＡＴＭ及びＡＴＲに直接作用してそのキナーゼ活性を阻害するのではなく、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＡＴＭ又はＡＴＲに影響を及ぼす他のシグナル関連分子に作用することで、ＡＴＭ及びＡＴＲの活性を阻害し、それにより、ｐ５３などの下流のチェックポイント分子の活性制御を行っているものと示唆された。

スクアレンは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＡＴＭキナーゼ活性に対して阻害効果を有することが図１Ｂ及び１Ｃ並びに図２Ａ乃至２Ｅの結果から、明らかとなったが、一方で、スクアレンは、図４Ａ及び４Ｂの結果から、ＡＴＭ及びＡＴＲの分子に直接作用して、阻害効果を惹起しているのではないことが明らかとなった。そこで、スクアレンがどのようにＡＴＲ及び／又はＡＴＭのキナーゼ活性を制御しているかについて、検討した。上述したように、非特許文献６（Ｗｉｐ１−Ｃｈｋ１）は、Ｗｉｐ１が脱リン酸化酵素としてＡＴＭの活性を制御していることを開示した。そこで、スクアレンがＷｉｐ１の発現を促進することによりＡＴＭの活性を負に制御しているか否かをウェスタンブロッティングで確認した。

まず、Ａ５４９細胞を３〜３００μＭの濃度のスクアレンで処理したところ、図５に示すように、Ｗｉｐ１の発現は、スクアレンの濃度依存的に顕著に増加した。一方、Ａ５４９細胞をγ線照射したところ、図３に示すように、ＳＭＣ１及びｐ５３のリン酸化体（Ｐ−ＳＭＣ１（Ｓｅｒ９６６）；ＳＭＣ１の９６６番目のセリン残基がリン酸化されたもの、Ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５）；ｐ５３の１５番目のセリン残基がリン酸化されたもの）は、顕著に増加したが、スクアレンの濃度増加にともない減少した。つまり、Ｗｉｐ１の発現増強と、ＳＭＣ１及びｐ５３のリン酸化体の蓄積とが、反比例していることが明らかとなった。本発明に用いたＳＭＣ１及びｐ５３のリン酸化部位は、ＡＴＭの活性化により引き起こされることを考え併せると、これらの結果から、スクアレンは、非特許文献６にも示されている、ＡＴＭの特異的脱リン酸化酵素であるＷｉｐ１の発現を増強することにより、ＡＴＭの活性を間接的に阻害していることが証明された。

スクアレンは、上記の通り、株化した癌細胞において、ＡＴＭの特異的脱リン酸化酵素であるＷｉｐ１の発現を増強することにより、ＡＴＭの活性を間接的に阻害していることを示した。そこで、このようなスクアレンの効果が癌のモデル動物においても同様に得られるかどうか、検討した。その結果、図６に示すように、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスにマウス結腸癌細胞株であるＣｏｌｏｎ２６細胞を移植して作成した癌のモデル動物において、化学療法剤の一種であるＴＳ−１（テガフール、ギメラシル及びオテラシルカリウムを含有）を経口投与したところ、移植部位である下肢において形成された癌組織の容積は、減少し、また、スクアレンを皮下投与した場合も、移植部位である下肢において形成された癌組織の容積は、減少した。一方、このモデル動物において、ＴＳ−１とスクアレンとを併用投与した場合、移植部位である下肢において形成された癌組織の容積は、ＴＳ−１又はスクアレンの単独投与群と比較して、顕著に減少した。また、このような併用投与による顕著な減少は、投与後、経時的にさらに促進された。このことは、化学療法剤であるＴＳ−１の単独でのマウスにおける癌増殖抑制作用が、スクアレンにより増感されたことを示すものである。このようなスクアレンによる増感の傾向は、重度複合免疫不全マウスであるＳＣＩＤマウスにヒト胃癌細胞株であるＭＫＮ４５細胞を移植して作成したモデル動物においても、観察された（図８）。

一方、図７に示すように、重度複合免疫不全マウスであるＳＣＩＤマウスにヒト胃癌細胞株であるＭＫＮ４５細胞を移植して作成したモデル動物において、移植部位である下肢にＸ線を照射したところ、癌組織の容積は、それほど顕著に減少しなかったが、スクアレンの単独投与により、一定程度の容積の減少が観察された。また、このモデル動物において、Ｘ線の照射とともにスクアレンを投与したところ、癌組織の容積は、コントロールと比較して、顕著に減少した。この減少は、Ｘ線の照射のみを行った群に対しても、スクアレンを単独で投与した群に対しても、顕著なものであった。また、このような併用投与による顕著な減少は、照射又は投与後、経時的にさらに促進された。

このような併用投与による各種抗癌療法による増感作用が、実施例３及び５で示した培養細胞で見られたＷｉｐ１の発現及びその下流のシグナルの増減等を介して発現されたものであるか否かを検討した。その結果、図９の一段目に示すように、Ｗｉｐ１の発現は、コントロールと比較して、ＳＱの投与によって増加した。一方、図９の二段目及び三段目にそれぞれ示すように、ｐ５３蛋白の１５番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５））及びＳＭＣ１蛋白の９６６番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−ＳＭＣ１（Ｓｅｒ９６６））は、コントロールと比較して、増加が認められなかった。また、図９の一段目に示すように、Ｗｉｐ１の発現は、コントロールと比較して、ＴＳ−１の投与によって、増加するとともに、図９の二段目及び三段目にそれぞれ示すように、ｐ５３蛋白の１５番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５））及びＳＭＣ１蛋白の９６６番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−ＳＭＣ１（Ｓｅｒ９６６））は、増加した。さらに、ＳＱとＴＳ−１とを併用投与した群では、図９の一段目に示すように、Ｗｉｐ１の発現は、ＴＳ−１のみの投与群と同様であり、一方で、ｐ５３蛋白の１５番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５））及びＳＭＣ１蛋白の９６６番目のセリン残基のリン酸化体（Ｐ−ＳＭＣ１（Ｓｅｒ９６６））は、ＴＳ−１のみの投与群と比較して、減少した。このようなＷｉｐ１の発現及びその下流のシグナル増減の傾向は、上記の実施例３及び５で示した培養細胞で観察された傾向を生体においてもほぼ再現したものである。

つまり、スクアレンの単独投与区において、コントロールと比較して、Ｗｉｐ１タンパク質の発現が誘導されたことから、この誘導は、ＤＮＡ損傷を検知した結果によるものではなく、スクアレン自身が誘導した結果であると考えられる。一方、ＴＳ−１の単独投与区では、Ｗｉｐ１タンパク質発現の増加とともにｐ５３およびＳＭＣ１のリン酸化レベルが上昇していた。これら２つのリン酸化部位はＡＴＭまたはＡＴＲによる特異的なリン酸化であるため、このリン酸化レベルの上昇は、腫瘍組織におけるＤＮＡ損傷の誘導を介した、ＡＴＭ若しくはＡＴＲのいずれか、又は両者の活性化によるものと考えられる。さらに、スクアレンおよびＴＳ−１を処理したマウスの腫瘍組織においてもＷｉｐ１のタンパク質レベルの上昇が確認された。しかし、ｐ５３とＳＭＣ１のリン酸化レベルはＴＳ−１単独と比べて弱かった。これはスクアレンによるＷｉｐ１タンパク質の増加にともなって活性阻害を受けたＡＴＭではなく、ＡＴＲのみがＴＳ−１によるＤＮＡ損傷シグナルを下流の分子であるｐ５３とＳＭＣ１に伝達しているためと考えられる。

実際に、ＡＴＭとＡＴＲはＤＮＡ損傷チェックポイントシグナルにおいて、互いに協調して作用することが分かっている（非特許文献１）。したがって、腫瘍組織中の損傷修復メカニズムにおいて、スクアレンがＷｉｐ１の発現を増強したことは、ＴＳ−１による腫瘍の成長抑制を効率的にした結果であることが示唆された。

以上のことから、スクアレンは細胞レベルだけでなく、動物レベルの実験においてもＷｉｐ１の発現増強を介して、各種抗癌療法の増感作用を示したことが分かった。

このように、スクアレンは、癌のモデル動物においても、癌組織の容積を低下させ（図６〜図８）、このような効果は、マウスばかりでなく（図６）、ヒトのガン細胞を用いたモデルにおいても（図７及び図８）、観察された。また、スクアレンは、各種抗癌療法による効果をさらに促進する増感作用を有することも観察され（図６及び図８）、このような増感作用は、化学療法であっても（図６及び図８）、放射線療法であっても（図７）、観察され、各種療法による効果が顕著である場合（図７）も、それほど顕著でない場合（図６及び図８）も、発揮された。

本発明において、細胞に対するＵＶ照射で誘導されるＤＮＡ損傷応答反応におけるスクアレンの効果を示した。ＡＴＭの表現型として知られるＡＴ患者の細胞では、先天的なＡＴＭの欠損により、ＤＮＡ損傷に対する反応機構（細胞周期チェックポイント）に問題を抱えている。同時に、ＡＴ患者は、放射線治療に対して異常に高い感受性を示すことも知られている。これらは、腫瘍発生を含む増殖期の細胞において、ＡＴＭプロテインキナーゼが大変重要であることを示している。スクアレンは、患者におけるＤＮＡ損傷チェックポイントをＷｉｐ１の発現誘導を介して阻止し得る。従って、本発明の知見により、放射線療法や化学療法などの抗癌治療に利点をもたらし得る。放射線治療や抗ガン剤治療において問題となるのは、ガン細胞の過半数において、ｐ５３を欠損していることであるが、スクアレンによるＡＴＭの阻害作用は、ｐ５３が担当しているＧ１／Ｓ期のチェックポイントだけでなく、Ｓ期やＧ２／Ｍ期など、他のチェックポイントにおいても重要な役割を演じていることが知られている。事実、Ｇ２／Ｍ期チェックポイントは、ｐ５３に変異や欠損を持ったガン細胞において、最も重要なチェックポイント機構であることが近年の研究成果により明示されている。ところで、カフェインも、ＡＴＭの活性阻害作用を持つことで知られている。臨床における結果からも、カフェインを投与することは、放射線誘導性死滅に対して、感受的ではあるが、カフェインは、ＡＴＭだけでなくＡＴＲやＤＮＡ−ＰＫなど、多くのＰＩ３キナーゼに対して非特異的な阻害作用を示すため、ＡＴＭの活性阻害のみを介した作用とは言い難く、その他の副作用も指摘されていることから、ＡＴＭ特異的な新たな阻害剤、又は間接的にＡＴＭを阻害する副作用の少ない新たな薬剤が望まれている。

スクアレンは、ヒトの体内でも微量ながら合成されており、生命活動でも必須の生体成分である。本発明の図１Ａにおいても、ヒトの細胞に対して極めて毒性が低いことを確認している。従って、副作用が少ない点で大きな利点となり得る。また、ＤＮＡ損傷チェックポイントへの作用が、Ｗｉｐ１というＡＴＭの脱リン酸化酵素の発現を介した作用であることから、スクアレンのＡＴＭ以外の分子への非特異的作用は期待できない。従って、ガン治療に対するスクアレンの効果としては、これらが大きな利点となると考えられる。

非特許文献２は、化学療法剤又は放射線治療の補助として、臨床上で試験的にカフェインを適用することを報告する。ここでは、カフェインで補助した治療により化学療法剤又は放射線療法を個々に処理するよりも、骨肉腫の寸法を減少かつ最小限化した。この結果が示すのは、カフェインは、ＡＴＭ及びＡＴＲプロテインキナーゼ活性を阻害することであり、増殖する腫瘍の細胞周期のいずれにおいても、ＤＮＡ損傷に係るチェックポイントの阻止をもたらす。このことにより、スクアレンで補助した化学療法及び放射線療法として、スクアレンを臨床上で試験的に適用し得る可能性がある。さらなる検討に関して、カフェインの臨床試験可能性に、腫瘍を消失又は最小限化させ得るかどうかについて、患者に対してスクアレンの効果を試験する必要がある。特に、スクアレンは、患者において、副作用が全くないか、ほとんどないことが期待される体内で生合成される成分である。上述の補助物は、低投与量で化学療法／放射線療法の有効性を増加させることが期待されるので、化学療法／放射線療法に対してスクアレンが患者に対して副作用が少なく、化学療法／放射線療法に係る投与量／照射量を減少させることが、同等かそれ以上に期待される。

スクアレンの細胞毒性を示すグラフである。 ＵＶ照射により発生する細胞のＤＮＡ損傷時の生存率に対するスクアレンの影響である。 ＩＲ照射により発生する細胞のＤＮＡ損傷時の生存率に対するスクアレンの影響である。 細胞周期に対するスクアレンの影響である。 ＵＶ照射時のＧ２／Ｍチェックポイントに対するスクアレンの影響を示す図である。 図２Ｂを数値化したグラフである。 γ線照射時のＧ２／Ｍチェックポイントに対するスクアレンの影響を示す図である。 図２Ｄを数値化したグラフである。 Ｇ１／Ｓ期及びＳ期チェックポイントに対するスクアレンの影響を示す図である。 組換えＡＴＭの活性に対するスクアレンの影響である。 組換えＡＴＲの活性に対するスクアレンの影響である。 Ｗｉｐ１の発現とチェックポイント活性との関係に及ぼすスクアレンの影響を示すイムノブロット像を示す。 実施例６で得た、腫瘍の容積の経時変化である。 実施例７で得た、腫瘍の容積の経時変化である。 実施例８で得た、腫瘍の容積の経時変化である。 実施例９で得たウェスタンブロット像である。

Claims (7)

1. 下記式（Ｉ）
   
   に示す構造式の化合物を有することを特徴とするＷｉｐ１発現増強剤。
2. 当該Ｗｉｐ１発現増強剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＡＴＲ及びＡＴＭのキナーゼ活性を阻害しないことを特徴とする請求項１に記載のＷｉｐ１発現増強剤。
3. 下記式（Ｉ）
   
   に示す構造式の化合物を有することを特徴とする癌治療増感剤。
4. 癌の化学療法剤とともに用いることを特徴とする請求項３に記載の癌治療増感剤。
5. 前記化学療法剤は、核酸代謝拮抗剤であることを特徴とする請求項４に記載の癌治療増感剤。
6. 癌の放射線療法とともに用いることを特徴とする請求項３乃至５のいずれか一項に記載の癌治療増感剤。
7. 当該癌治療増感剤は、ＡＴＲ及びＡＴＭのキナーゼ活性を阻害しないことを特徴とする請求項３乃至６のいずれか一項に記載の癌治療増感剤。