JP2008283882A - Tag antibody-expressing transgenic non-human animal and method for gene transfer with tagged-type adenovirus vector - Google Patents
Tag antibody-expressing transgenic non-human animal and method for gene transfer with tagged-type adenovirus vector Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008283882A JP2008283882A JP2007130217A JP2007130217A JP2008283882A JP 2008283882 A JP2008283882 A JP 2008283882A JP 2007130217 A JP2007130217 A JP 2007130217A JP 2007130217 A JP2007130217 A JP 2007130217A JP 2008283882 A JP2008283882 A JP 2008283882A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tag
- antibody
- gene
- vector
- tag antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 118
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 80
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 63
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 29
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims abstract description 29
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 28
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title claims abstract description 24
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 claims description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000003622 anti-hsv Effects 0.000 claims description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims 1
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 91
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 25
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 21
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 0.000 description 11
- 102100025278 Coxsackievirus and adenovirus receptor Human genes 0.000 description 11
- 101710176411 Coxsackievirus and adenovirus receptor Proteins 0.000 description 11
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 7
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 6
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 4
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical group NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 4
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 description 3
- 101710082439 Hemagglutinin A Proteins 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108700012941 GNRH1 Proteins 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 2
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 2
- 101710155188 Hexon-interlacing protein Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000692455 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 description 2
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108010019674 Proto-Oncogene Proteins c-sis Proteins 0.000 description 2
- 108010051583 Ventricular Myosins Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 2-chloro-n-[[(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl]acetamide Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CNC(=O)CCl)[C@@H](O)C1 SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 1
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 description 1
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010015720 Dopamine beta-Hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100033156 Dopamine beta-hydroxylase Human genes 0.000 description 1
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000002045 Endothelin Human genes 0.000 description 1
- 108050009340 Endothelin Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000979333 Homo sapiens Neurofilament light polypeptide Proteins 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 241000701460 JC polyomavirus Species 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108010059343 MM Form Creatine Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 1
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 102000005604 Myosin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010084498 Myosin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102100030740 Myosin light chain 1/3, skeletal muscle isoform Human genes 0.000 description 1
- 102100026925 Myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform Human genes 0.000 description 1
- 102100023057 Neurofilament light polypeptide Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 description 1
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108010045517 Serum Amyloid P-Component Proteins 0.000 description 1
- 102100036202 Serum amyloid P-component Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102000000591 Tight Junction Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010002321 Tight Junction Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005876 Tissue Inhibitor of Metalloproteinases Human genes 0.000 description 1
- 108010005246 Tissue Inhibitor of Metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 210000001552 airway epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091007231 endothelial receptors Proteins 0.000 description 1
- ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N endothelin-1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]2CSSC[C@@H](C(N[C@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2)=O)NC(=O)[C@@H](CO)NC(=O)[C@H](N)CSSC1)C1=CNC=N1 ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 108010065781 myosin light chain 2 Proteins 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VIBUIHYCIPNHIL-IDIVVRGQSA-L potassium;sodium;[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-oxidophosphoryl] phosphono phosphate Chemical compound [Na+].[K+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O VIBUIHYCIPNHIL-IDIVVRGQSA-L 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
Abstract
Description
本発明は、タグ抗体発現細胞を含むタグ抗体発現トランスジェニック非ヒト動物に関する。さらには、アデノウイルスゲノムにタグペプチドをコードするDNAが付与されたタグ付与型アデノウイルスベクターおよび抗タグ抗体発現細胞を用いたアデノウイルスベクター上の遺伝子の細胞への導入方法に関する。 The present invention relates to a tag antibody-expressing transgenic non-human animal comprising a tag antibody-expressing cell. Furthermore, the present invention relates to a tag-added adenovirus vector in which a DNA encoding a tag peptide is added to the adenovirus genome and a method for introducing a gene on an adenovirus vector into cells using an anti-tag antibody-expressing cell.
現在、遺伝子治療のベクターとして用いられているアデノウイルスベクターは、サブグループC(sub-group C)に属した5型(あるいは2型)のヒトアデノウイルスを基盤としている。ヒトアデノウイルスはAからFまでのサブグループに分けられ、少なくとも51種類の血清型(serotype)が知られているが、サブグループB(sub-group B)に属するウイルスを除き、多くのアデノウイルス(5型アデノウイルスを含む)はレセプターとしてcoxsackievirus and adenovirus receptor(CAR)を認識して細胞に感染する(非特許文献1)。 Currently, adenovirus vectors used as vectors for gene therapy are based on type 5 (or type 2) human adenoviruses belonging to sub-group C. Human adenoviruses are divided into subgroups A to F, and at least 51 serotypes are known, but many adenoviruses except for viruses belonging to subgroup B (sub-group B) (Including type 5 adenovirus) recognizes coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) as a receptor and infects cells (Non-patent Document 1).
アデノウイルスはエンベロープを持たず、252個のカプソメアよりなる正20面体構造をしている。そのうち頂点にある12個のカプソメアは突起構造を持ったペントン(ペントンベースとファイバーから成る)と呼ばれ、他の240個はヘキソンと呼ばれる。ウイルスの細胞内への侵入(感染)は、ファイバーが受容体のCARに結合し(非特許文献1)、その後ペントンベースのRGDモチーフが細胞表面上のインテグリンに結合することによって起こる(非特許文献2、3)。エンドソームに達したウイルスは酸性条件下でカプシドタンパク質の構造変化を起こし、エンドソームを破壊して、細胞質内に侵入する。従って、細胞表面上の受容体であるCARにウイルスのファイバーが結合するのが、ウイルスが細胞へ導入される第一ステップであり、ファイバーを修飾することにより、ベクターの感染域を変えることができると考えられる(非特許文献4)。 Adenovirus does not have an envelope and has an icosahedral structure composed of 252 capsomeres. Of these, the 12 capsomeres at the top are called pentons (consisting of a penton base and fiber) with a protruding structure, and the other 240 are called hexons. Virus entry into the cell (infection) occurs when the fiber binds to the receptor CAR (Non-Patent Document 1), and then the penton-based RGD motif binds to an integrin on the cell surface (Non-Patent Document 1). 2, 3). The virus that reaches the endosome undergoes a structural change of the capsid protein under acidic conditions, destroys the endosome, and enters the cytoplasm. Thus, binding of the viral fiber to CAR, a receptor on the cell surface, is the first step in which the virus is introduced into the cell, and modification of the fiber can change the infection area of the vector. (Non-patent Document 4).
CARの発現が乏しいために、従来の5型アデノウイルスベクターによる効率の良い遺伝子導入が困難な細胞種は意外と多く、そのような細胞として、造血幹細胞をはじめとする血液系細胞、樹状細胞、血管平滑筋細胞、骨格筋細胞、滑膜細胞などが知られている。 Due to poor CAR expression, there are surprisingly many cell types that are difficult to efficiently transduce with conventional type 5 adenovirus vectors. Such cells include hematopoietic stem cells and other blood cells, dendritic cells, Vascular smooth muscle cells, skeletal muscle cells, synovial cells and the like are known.
また、癌細胞は、悪性度の進行と共にCARの発現低下およびアデノウイルスベクターでの遺伝子導入効率が低下することが報告されており(非特許文献5、6)、アデノウイルスベクターを用いて癌を対象とした遺伝子治療臨床研究を進める上で、考慮すべき問題と考えられる。さらに気道上皮細胞はCARを発現しているものの、タイトジャンクション構成部位(あるいは側底膜側)に局在しているため、上皮側からアデノウイルスベクターを作用させてもCARとは接触できず、効率の良い遺伝子導入が困難である場合もある。 In addition, cancer cells have been reported to decrease in CAR expression and gene transfer efficiency with adenoviral vectors as malignancy progresses (Non-Patent Documents 5 and 6). This is considered to be a problem to be considered when conducting targeted gene therapy clinical research. In addition, although airway epithelial cells express CAR, they are localized in the tight junction component (or basolateral membrane side), so even if the adenovirus vector is acted from the epithelium side, it cannot contact CAR. In some cases, efficient gene transfer is difficult.
アデノウイルスベクターによる遺伝子導入時のCAR依存性を克服するために、ファイバータンパク質を改変した改良型ベクターの開発が進んでいる。ファイバータンパク質はテール、シャフト、ノブからなり、ノブ領域がCARと結合する。ファイバーノブの外来ペプチドの挿入部位として適したHIループやC末端領域に、1ステップのin vitroライゲーションで任意のペプチドコード遺伝子を挿入できるシステムが報告されており、極めて簡便に種々のペプチドをファイバーに表現した改変型アデノウイルスベクターが作製できるようになった(非特許文献7、8;特許文献1〜3)。例えば、αvインテグリンに親和性があるRGD(Arg-Gly-Asp)ペプチドや、ヘパラン硫酸に親和性があるポリリジン(KKKKKKK;K7(配列番号1))ペプチドをファイバー表面上に遺伝子工学的に表現させることにより、CARを発現していない細胞に対しても効率良く遺伝子を導入することができる。これらのベクターは、αvインテグリンやヘパラン硫酸が、多くの細胞で発現していることから、広範な細胞種・目的への適用が期待できる。一方、これらの分子を発現していない細胞も依然として存在している。RGDペプチド、ポリリジンペプチド、またはTAT(GRKKRRQRRRPQ(配列番号2))ペプチドを付与したAdベクターでも遺伝子導入が困難な細胞は種々存在する。あらゆる細胞に遺伝子導入できる実験系の開発は、遺伝子治療のみならず、遺伝子の機能解析を目的とした基礎研究の遂行にとって重要な基盤技術となる。 In order to overcome the CAR dependence at the time of gene transfer by an adenovirus vector, development of an improved vector in which a fiber protein is modified is in progress. The fiber protein consists of a tail, a shaft, and a knob, and the knob region binds to CAR. A system that can insert any peptide-encoding gene into the HI loop or C-terminal region suitable for insertion of foreign peptides in the fiber knob by one-step in vitro ligation has been reported. The expressed modified adenovirus vector can be prepared (Non-patent Documents 7 and 8; Patent Documents 1 to 3). For example, RGD (Arg-Gly-Asp) peptide having affinity for αv integrin and polylysine (KKKKKKK; K7 (SEQ ID NO: 1)) peptide having affinity for heparan sulfate are expressed on the fiber surface by genetic engineering. Thus, the gene can be efficiently introduced into cells that do not express CAR. Since these vectors express αv integrin and heparan sulfate in many cells, they can be expected to be applied to a wide range of cell types and purposes. On the other hand, there are still cells that do not express these molecules. There are various cells in which gene transfer is difficult even with an Ad vector provided with an RGD peptide, polylysine peptide, or TAT (GRKKRRQRRRPQ (SEQ ID NO: 2)) peptide. The development of an experimental system that can introduce a gene into any cell is an important basic technology not only for gene therapy but also for conducting basic research aimed at analyzing the function of genes.
従来より、複数のタンパク質が混在する溶液中から所望のタンパク質のみを分離精製するために、タグと呼ばれるオリゴペプチドが使用されている。例えば或るタンパク質を大腸菌などの微生物に作らせる場合、そのタンパク質をコードする遺伝子にタグをコードする遺伝子を連結させ、得られた遺伝子を微生物に導入すると、タグ付きのタンパク質が微生物中で産生される。微生物中では他のタンパク質も産生されるので、そのタグを利用して複数のタンパク質から前記タンパク質を分離精製することができる。例えば、ヒスチジン(His)タグ(以下単に「Hisタグ」という。)を使用する場合は、ニッケルアガロースカラムにタンパク質が混在する溶液を接触させることで前記カラムにHisタグが結合するので、前記タンパク質がHisタグを介してカラムに付着する。そこで前記タンパク質のみを分離することができる。フラッグ(FLAG)ペプチドをタグとして使用する場合(以下単に「FLAGタグ」という)は、抗FLAGタグ抗体を結合させたカラムにタンパク質が混在する溶液を接触させることで、FLAGタグと抗FLAGタグ抗体とが結合することを利用して、Hisタグの場合と同様に前記タンパク質のみを分離することができる。このような、タグを用いたタンパク質の精製は、タグとその反応物質とのアフィニティーを利用することによる。
本発明は、特に基礎研究の分野において、あらゆる細胞に遺伝子導入できる実験系を構築するための遺伝子導入方法を提供することを課題とする。また、該遺伝子導入方法に使用しうるトランスジェニック非ヒト動物を提供することを課題とする。さらには、従来開発されたアデノウイルス(以下、「Ad」という。)ベクターに関し、より効果的に各種細胞に遺伝子導入可能な改変型Adベクターと該Adベクターとの組み合わせにおいて、遺伝子を導入しうる細胞を用いた遺伝子導入方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a gene introduction method for constructing an experimental system capable of gene introduction into any cell, particularly in the field of basic research. It is another object of the present invention to provide a transgenic non-human animal that can be used in the gene introduction method. Furthermore, regarding a conventionally developed adenovirus (hereinafter referred to as “Ad”) vector, a gene can be introduced in a combination of a modified Ad vector that can introduce a gene into various cells more effectively and the Ad vector. It is an object of the present invention to provide a gene transfer method using cells.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Adベクター側の改変のみならず、Adベクターと反応させる細胞についても改変を行うことに着目し、鋭意研究を重ねた結果、より効果的に細胞に遺伝子を導入しうることを見出だし、本発明を完成した。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the inventors of the present invention have not only made modifications on the Ad vector side, but also on cells that react with the Ad vector, and conducted intensive studies. As a result, it was found that genes can be introduced into cells more effectively, and the present invention was completed.
すなわち本発明は、以下よりなる。
1.抗タグ抗体を発現しうるトランスジェニック非ヒト動物。
2.抗タグ抗体が、抗Hisタグ抗体、抗FLAGタグ抗体、抗HAタグ抗体、抗Mycタグ抗体、抗HSVタグ抗体、抗CBDタグ抗体、抗Nusタグ抗体および抗GSTタグ抗体から選択される少なくとも1種の抗体である前項1に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
3.抗タグ抗体が、抗Hisタグ抗体である前項1に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
4.タグ付与型アデノウイルスベクターと、前記タグ付与型アデノウイルスベクターに付与したタグに対する抗タグ抗体を発現しうる細胞と反応させることを特徴とするタグ付与型アデノウイルスベクター上の遺伝子の細胞への導入方法。
5.前記タグ付与型アデノウイルスベクターに付与したタグに対する抗タグ抗体を発現しうる細胞が、該抗タグ抗体を発現しうるトランスジェニック非ヒト動物由来である、前項4に記載の遺伝子導入方法。
6.前記タグ付与型アデノウイルスベクターに付与したタグが、Hisタグ、FLAGタグ、HAタグ、Mycタグ、HSVタグ、CBDタグ、NusタグおよびGSTタグから選択される少なくとも1種である、前項4または5に記載の遺伝子導入方法。
7.前記タグ付与型アデノウイルスベクターに付与したタグが、Hisタグである、前項4または5に記載の遺伝子導入方法。
8.タグ付与型アデノウイルスベクターを、前項1〜3のいずれか1に記載のトランスジェニック非ヒト動物に投与することを特徴とする、前項5〜7のいずれかに記載の遺伝子導入方法。
That is, this invention consists of the following.
1. A transgenic non-human animal capable of expressing an anti-tag antibody.
2. The anti-tag antibody is at least one selected from anti-His tag antibody, anti-FLAG tag antibody, anti-HA tag antibody, anti-Myc tag antibody, anti-HSV tag antibody, anti-CBD tag antibody, anti-Nus tag antibody and anti-GST tag antibody. 2. The transgenic non-human animal according to item 1, which is a species antibody.
3. 2. The transgenic non-human animal according to item 1, wherein the anti-tag antibody is an anti-His tag antibody.
4). Introduction of a gene on a tag-added adenovirus vector into a cell, characterized by reacting with the tag-added adenovirus vector and a cell capable of expressing an anti-tag antibody against the tag applied to the tag-added adenovirus vector Method.
5. 5. The gene introduction method according to item 4 above, wherein the cell capable of expressing an anti-tag antibody against the tag attached to the tag-added adenovirus vector is derived from a transgenic non-human animal capable of expressing the anti-tag antibody.
6). 4 or 5 above, wherein the tag added to the tag-type adenovirus vector is at least one selected from a His tag, a FLAG tag, an HA tag, a Myc tag, an HSV tag, a CBD tag, a Nus tag, and a GST tag. The gene transfer method according to 1.
7). 6. The gene introduction method according to item 4 or 5, wherein the tag attached to the tag-added adenovirus vector is a His tag.
8). 8. The gene introduction method according to any one of items 5 to 7, wherein the tag-added adenovirus vector is administered to the transgenic non-human animal according to any one of items 1 to 3.
本発明はタグ付与型Adベクターと、前記タグ付与型Adベクターに付与したタグに対する抗タグ抗体を発現しうる細胞と反応させることを特徴とする遺伝子導入方法であり、タグと抗タグ抗体のアフィニティーを利用することにより、従来は細胞内にAdベクターを導入するのが困難な場合でも、容易に細胞に導入することができる。
抗タグ抗体を発現しうる細胞として、in vitroでの細胞や、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を用いると、タグ付与型Adベクターに担持した遺伝子をトランスジェニック動物に導入することで、より効果的に遺伝子を細胞に導入させることが可能となり、導入した遺伝子の作用解明など、基礎研究の分野において、効果が期待される。
The present invention is a gene transfer method comprising reacting a tag-added Ad vector with a cell capable of expressing an anti-tag antibody against the tag applied to the tag-added Ad vector, wherein the affinity between the tag and the anti-tag antibody Thus, even if it is difficult to introduce an Ad vector into a cell, it can be easily introduced into a cell.
When cells in vitro or the transgenic non-human animals of the present invention are used as cells that can express an anti-tag antibody, it is more effective to introduce a gene carried in a tagged Ad vector into a transgenic animal. It is possible to introduce a gene into a cell, and an effect is expected in the field of basic research such as elucidation of the action of the introduced gene.
本発明の遺伝子導入方法には、タグ付与型Adベクターおよび該付与したタグに対する抗タグ抗体を発現しうる細胞が必要である。そこで、以下、タグ付与型Adベクターおよび該付与したタグに対する抗タグ抗体を発現しうる細胞について説明し、さらに本発明の遺伝子導入方法について説明する。 The gene transfer method of the present invention requires a tag-added Ad vector and a cell capable of expressing an anti-tag antibody against the added tag. Thus, hereinafter, a tag-added Ad vector and cells capable of expressing an anti-tag antibody against the added tag will be described, and further the gene transfer method of the present invention will be described.
(タグ付与型Adベクター)
本発明において、タグ付与型Adベクターは、Adゲノムのカプシドタンパク質のいずれかをコードする遺伝子配列の部位に、タグペプチドをコードするDNAをライゲーション等により挿入させることにより構成される。タグ付与型Adベクターは、自体公知の方法により調製することができる。例えは、FLAGタグを付与したAdベクターについてはJ. VIROLOGY, Mar., 1844-1852 (1998)やGeneTherapy 14, 266-274 (2007)に記載のものを利用することができる。また、本発明においては、これに限定されるものではなく、以下の方法により調製したものを利用することができる。
(Tag-attached Ad vector)
In the present invention, the tag-added Ad vector is constructed by inserting a DNA encoding a tag peptide into the site of a gene sequence encoding any of the capsid proteins of the Ad genome by ligation or the like. The tag-added Ad vector can be prepared by a method known per se. For example, as the Ad vector to which a FLAG tag is added, those described in J. VIROLOGY, Mar., 1844-1852 (1998) and GeneTherapy 14, 266-274 (2007) can be used. Moreover, in this invention, it is not limited to this, What was prepared with the following method can be utilized.
本発明において、Adとはアデノウイルスをさし、本発明において使用可能なAdは、in vivoまたはin vitroでDNAやRNAなどの核酸配列を種々のタイプの細胞へ導入するビヒクルとしての機能を達成しうるものであれば良く、特に限定されない。代表的には、ヒトを宿主とする2型、5型、11型、35型の各Ad、ヒト以外を宿主とするサルAd、マウスAd、イヌAd、ヒツジAdおよびトリAdなどが挙げられる。 In the present invention, Ad refers to an adenovirus, and Ad that can be used in the present invention achieves a function as a vehicle for introducing nucleic acid sequences such as DNA and RNA into various types of cells in vivo or in vitro. It is not particularly limited as long as it is possible. Typically, there are 2 type, 5 type, 11 type and 35 type Ads having human as a host, monkey Ad, mouse Ad, dog Ad, sheep Ad and avian Ad having non-human host.
本発明においてAdゲノムとは特に限定されないが、特定の細胞種でのみ複製できるようにしたAdのゲノム、具体的にはE1領域欠損型Adや、制限増殖型Adのゲノムなどが好適であり、特に好適にはE1領域欠損型のAdゲノムが挙げられる。特定の細胞種でのみ複製できるとは、例えばE1領域欠損型Adについては293細胞で、制限増殖型Adについては293細胞や癌細胞でのみ増殖できることをいう。293細胞は、ヒト胎児腎細胞を5型AdのE1遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株であり、E1タンパク質を恒常的に発現している。 In the present invention, the Ad genome is not particularly limited, but an Ad genome that can be replicated only in a specific cell type, specifically, an E1 region-deficient Ad, a restricted growth Ad genome, and the like are preferable. Particularly preferred is an E1 region-deficient Ad genome. To be able to replicate only in a specific cell type means, for example, that E1 region-deficient Ad can be grown only in 293 cells, and restricted growth type Ad can be grown only in 293 cells or cancer cells. 293 cells are cell lines established by transforming human fetal kidney cells with the E1 gene of type 5 Ad, and constantly express the E1 protein.
E1領域欠損型Adゲノムとは、E1領域を欠損するAdゲノムをいい、制限酵素によりE1領域を切断し、欠損させたAdゲノムをいう。E1領域欠損とは、E1タンパク質をコードする領域を機能的に欠損させることを意味する。機能的に欠損させるとは、例えば、宿主細胞内で機能するE1タンパク質を発現させないようにすることであり、E1タンパク質をコードする遺伝子のすべてを欠損している必要はない。
一般に、AdにおいてE1領域を欠損させると、E1タンパク質を発現している細胞(例えば、293細胞)以外では増殖することができない。
The E1 region-deficient Ad genome refers to an Ad genome that lacks the E1 region, and refers to an Ad genome that has been deleted by cutting the E1 region with a restriction enzyme. E1 region deletion means that a region encoding E1 protein is functionally deleted. The functional deletion means, for example, that the E1 protein that functions in the host cell is not expressed, and it is not necessary to delete all the genes encoding the E1 protein.
In general, if the E1 region is deleted in Ad, it cannot proliferate except for cells expressing the E1 protein (for example, 293 cells).
5型Adゲノム(GenBank Accession番号:M73260, M29978)の場合において、E1領域とは、具体的には342〜3253番目に相当する。したがって、本発明のAdベクタープラスミドは、宿主細胞内で機能するE1タンパク質を発現しないのであれば、342〜3253番目の領域の一部を有するものであってもよい。 In the case of type 5 Ad genome (GenBank Accession numbers: M73260, M29978), the E1 region specifically corresponds to the 342th to 3253rd positions. Therefore, the Ad vector plasmid of the present invention may have a part of the 342 to 3253rd region as long as it does not express the E1 protein that functions in the host cell.
本発明の改変型Adベクタープラスミドは、E1領域の他に、例えばE3領域を欠損させた5型Adゲノムの一部または全部であっても良い。5型Adゲノム(GenBank Accession番号:M73260, M29978)のE3領域とは、28133〜30818番目または27865〜30995番目に相当する部位をいう。 In addition to the E1 region, the modified Ad vector plasmid of the present invention may be, for example, part or all of the type 5 Ad genome lacking the E3 region. The E3 region of the type 5 Ad genome (GenBank Accession No .: M73260, M29978) refers to a site corresponding to 28133-30308th or 27865-30995th.
制限増殖型Adは、E1タンパク質の発現が例えば癌細胞でのみ起こるAdであり、NATURE MEDICINE, 7, 781-787 (2001)に報告されているものを例示することができる。 Restricted growth type Ad is an Ad that occurs only in cancer cells, for example, and can be exemplified by those reported in NATURE MEDICINE, 7, 781-787 (2001).
本発明において、Adゲノムのカプシドタンパク質とは、ウイルスゲノムの表面タンパク質をいい、具体的にはファイバー、ヘキソン、ペントンベース、pIX(プロテインIX)などが挙げられる。ファイバータンパク質は、ノブ、シャフト、テールより構成され、ファイバーノブ、ファイバーシャフト、ファイバーテールともいう。カプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位とは、これらのタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位であればよく、特に限定されないが、好適にはファイバーノブのC末端コード遺伝子配列の部位が挙げられる。 In the present invention, the Ad genome capsid protein refers to a surface protein of the viral genome, and specifically includes fiber, hexon, penton base, pIX (protein IX) and the like. The fiber protein is composed of a knob, a shaft, and a tail, and is also called a fiber knob, a fiber shaft, and a fiber tail. The site of the gene sequence encoding any one of the capsid proteins is not particularly limited as long as it is the site of the gene sequence encoding any of these proteins, but preferably the C-terminal coding gene sequence of the fiber knob. A site.
ファイバーノブのHIループコード遺伝子配列とは、Adのファイバー分子のアミノ酸537から549までの領域をコードする塩基配列をさす。HIループのアミノ酸は大部分が親水基であり、ノブ領域の外側に配向している。この領域に、外来ペプチドをコードするDNAが挿入されてもファイバーの3量体形成には影響を及ぼさない。例えば、5型Adでは、該ウイルスのゲノムDNAの32643〜32685番目に相当する。 The HI loop coding gene sequence of the fiber knob refers to a base sequence encoding a region from amino acids 537 to 549 of the fiber fiber molecule of Ad. Most amino acids in the HI loop are hydrophilic groups and are oriented outside the knob region. Even if DNA encoding a foreign peptide is inserted into this region, the formation of the fiber trimer is not affected. For example, type 5 Ad corresponds to the 32642-32685th of the genomic DNA of the virus.
本発明におけるタグペプチドは、Adに対して外来ペプチドであり、タグとしての機能を有するペプチドであれば良く、特に限定されない。タグペプチドの例として、Hisタグ、FLAGタグ、HAタグ、Mycタグ、HSVタグ、CBDタグ、NusタグおよびGSTタグ等が挙げられる。 The tag peptide in the present invention is not particularly limited as long as it is a foreign peptide for Ad and has a function as a tag. Examples of tag peptides include His tags, FLAG tags, HA tags, Myc tags, HSV tags, CBD tags, Nus tags, and GST tags.
具体的には、以下で示されるペプチドが挙げられる。
Hisタグ:HHHHHH(配列番号3)
FLAGタグ:DYKDDDDK(配列番号4)
HAタグ:YPYDVPDYA(配列番号5)
c-mycタグ:EQKLISEEDL(配列番号6)
HSVタグ:QPELAPEDPEA(配列番号7)
CBD(セルロース結合ドメイン)タグ
Nusタグ:MNKEILAVVEAVSNEKALPREKIFEALESALATATKKKYEQEIDVRVQIDRKSGDFDTFRRWLVVDEVTQPTKEITLEAARYEDESLNLGDYVEDQIESVTFDRITTQTAKQVIVQKVREAERAMVVDQFREHEGEIITGVVKKVNRDNISLDLGNNAEAVILREDMLPRENFRPGDRVRGVLYSVRPEARGAQLFVTRSKPEMLIELFRIEVPEIGEEVIEIKAAARDPGSRAKIAVKTNDKRIDPVGACVGMRGARVQAVSTELGGERIDIVLWDDNPAQFVINAMAPADVASIVVDEDKHTMDIAVEAGNLAQAIGRNGQNVRLASQLSGWELNVMTVDDLQAKHQAEAHAAIDTFTKYLDIDEDFATVLVEEGFSTLEELAYVPMKELLEIEGLDEPTVEALRERAKNALATIAQAQEESLGDNKPADDLLNLEGVDRDLAFKLAARGVCTLEDLAEQGIDDLADIEGLTDEKAGALIMAARNICWFGDEA(配列番号8))
GST(グルタチオン- S-トランスフェラーゼ)タグ:グルタチオンに結合する
T7タグ:MASMTGGQQMG(配列番号9)
V5タグ:GKPIPNPLLGLDST(配列番号10)
VSV-Gタグ:水胞性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-G)のC-末端の5アミノ酸を含むエピトープ YTDIEMNRLGK(配列番号11)
タグとしての機能を有するのであれば、例えば、上記に具体的に例示した各ペプチドのうち、1〜2個程度のアミノ酸が置換、欠失、付加されたものであっても良い。
Specifically, the peptide shown below is mentioned.
His tag: HHHHHH (SEQ ID NO: 3)
FLAG tag: DYKDDDDK (SEQ ID NO: 4)
HA tag: YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 5)
c-myc tag: EQKLISEEDL (SEQ ID NO: 6)
HSV tag: QPELAPEDPEA (SEQ ID NO: 7)
CBD (cellulose binding domain) tag
Nus tag: MNKEILAVVEAVSNEKALPREKIFEALESALATATKKKYEQEIDVRVQIDRKSGDFDTFRRWLVVDEVTQPTKEITLEAARYEDESLNLGDYVEDQIESVTFDRITTQTAKQVIVQKVREAERAMVVDQFREHEGEIITGVVKKVNRDNISLDLGNNAEAVILREDMLPRENFRPGDRVRGVLYSVRPEARGAQLFVTRSKPEMLIELFRIEVPEIGEEVIEIKAAARDPGSRAKIAVKTNDKRIDPVGACVGMRGARVQAVSTELGGERIDIVLWDDNPAQFVINAMAPADVASIVVDEDKHTMDIAVEAGNLAQAIGRNGQNVRLASQLSGWELNVMTVDDLQAKHQAEAHAAIDTFTKYLDIDEDFATVLVEEGFSTLEELAYVPMKELLEIEGLDEPTVEALRERAKNALATIAQAQEESLGDNKPADDLLNLEGVDRDLAFKLAARGVCTLEDLAEQGIDDLADIEGLTDEKAGALIMAARNICWFGDEA (SEQ ID NO: 8))
GST (glutathione-S-transferase) tag: binds to glutathione
T7 tag: MASMTGGQQMG (SEQ ID NO: 9)
V5 tag: GKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO: 10)
VSV-G tag: Epitope YTDIEMNRLGK (SEQ ID NO: 11) containing 5 amino acids at the C-terminus of vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G)
As long as it has a function as a tag, for example, among the peptides specifically exemplified above, about 1-2 amino acids may be substituted, deleted, or added.
挿入するタグペプチドをコードするDNAの塩基配列は、具体的には上記に例示した各ペプチドをコードするものであればよく、どのような配列であっても良い。また、以下の配列からなるオリゴヌクレオチドDNAのほか、これらの配列のうち、1〜複数程度のヌクレオチドの置換、欠失、付加若しくは誘導されたもの、更にはそれらの塩基配列の相補的配列からなるオリゴヌクレオチドDNAであっても良い。
例えば、HisタグをコードするDNAの塩基配列は、以下が挙げられる。
オリゴヌクレオチド1 (5'- cat cac cat cac cat cac -3')(配列番号12)
オリゴヌクレオチド2 (5'- gtg atg gtg atg gtg atg -3')(配列番号13)
The base sequence of the DNA encoding the tag peptide to be inserted is not particularly limited as long as it encodes each peptide exemplified above. In addition to the oligonucleotide DNA consisting of the following sequences, among these sequences, substitutions, deletions, additions or inductions of about 1 to a plurality of nucleotides, and complementary sequences of those base sequences It may be an oligonucleotide DNA.
For example, the base sequence of DNA encoding the His tag includes the following.
Oligonucleotide 1 (5'-cat cac cat cac cat cac-3 ') (SEQ ID NO: 12)
Oligonucleotide 2 (5'-gtg atg gtg atg gtg atg -3 ') (SEQ ID NO: 13)
本発明の改変型Adベクターの作製方法は、Adゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、外来ペプチドをコードするDNAとして、タグペプチドをコードするDNAを、ライゲーション反応により挿入することを特徴とする。タグペプチドをコードするDNAの導入は、Adのカプシドタンパク質、例えばファイバーノブのHIループコード遺伝子配列中および/若しくはC末端コード遺伝子配列中に、該遺伝子配列にユニークな制限酵素認識配列を挿入し、該遺伝子配列中にタグペプチドをコードするDNAを導入することにより達成される。 In the method for producing the modified Ad vector of the present invention, a DNA encoding a tag peptide as a DNA encoding a foreign peptide is inserted into a site of a gene sequence encoding any of the capsid proteins of the Ad genome by a ligation reaction. It is characterized by that. The introduction of DNA encoding the tag peptide inserts a restriction enzyme recognition sequence unique to the gene sequence into the Ad capsid protein, for example, the HI loop coding gene sequence of the fiber knob and / or the C-terminal coding gene sequence, This is achieved by introducing a DNA encoding a tag peptide into the gene sequence.
ユニークな制限酵素認識配列とは、AdゲノムDNAに本来存在しない制限酵素認識配列を意味し、例えば、制限酵素Csp45I、ClaI、SwaI、PacI、XbaI、I-CeuI、PI-SceI、I-PpoI、I-SceIにより認識される配列が挙げられる。 The unique restriction enzyme recognition sequence means a restriction enzyme recognition sequence that does not originally exist in Ad genomic DNA, for example, restriction enzymes Csp45I, ClaI, SwaI, PacI, XbaI, I-CeuI, PI-SceI, I-PpoI, Examples include sequences recognized by I-SceI.
上記ユニークな制限酵素認識配列の、カプシドタンパク質、例えばファイバーノブのHIループコード遺伝子配列またはファイバーノブのC末端コード遺伝子配列への挿入は、例えば本実施例に記載したようにして実施することができる。また、タグペプチドをコードするDNAの導入は、例えば、該ペプチドコードDNAと上記のユニークな制限酵素認識配列とを有するオリゴヌクレオチドDNAを合成し、HIループコード領域またはC末端コード領域にあらかじめ挿入している制限酵素で切断することによって調製したDNA中に、直接ライゲーションすることによって達成することができる。 Insertion of the unique restriction enzyme recognition sequence into a capsid protein, such as the fiber knob HI loop coding gene sequence or the fiber knob C-terminal coding gene sequence, can be performed, for example, as described in this Example. . In addition, the DNA encoding the tag peptide can be introduced, for example, by synthesizing an oligonucleotide DNA having the peptide-encoding DNA and the above-mentioned unique restriction enzyme recognition sequence and inserting it in advance into the HI loop coding region or the C-terminal coding region. This can be achieved by ligation directly into DNA prepared by cutting with a restriction enzyme.
(抗タグ抗体)
本発明の遺伝子導入方法には、タグ付与型Adベクターおよび該付与したタグに対する抗タグ抗体を発現しうる細胞が必要である。ここで、抗タグ抗体は、通常のモノクローナル抗体を取得する方法により入手することができる。モノクローナル抗体は、本発明のタグペプチドに含まれるアミノ酸配列を含む抗原、具体的には、タグペプチドに含まれるアミノ酸のうち連続する少なくとも3つのアミノ酸配列もとにして、ケーラーとミルシュタインの方法(Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497 (1975))等の公知の方法に従って作製することができる。
(Anti-tag antibody)
The gene transfer method of the present invention requires a tag-added Ad vector and a cell capable of expressing an anti-tag antibody against the added tag. Here, the anti-tag antibody can be obtained by a method for obtaining a normal monoclonal antibody. The monoclonal antibody is obtained by the method of Kohler and Milstein (based on the antigen containing the amino acid sequence contained in the tag peptide of the present invention, specifically, based on at least three consecutive amino acid sequences among the amino acids contained in the tag peptide ( Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497 (1975)).
具体的には、骨髄腫細胞として、マウス、ラット、ヒトなど由来のものが使用され、例えばマウスミエローマP3X63-Ag8、P3X63-Ag8-U1、P3NS1-Ag4、SP2/o-Ag14、P3X63-Ag8・653などの株化骨髄腫細胞が例示される。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する方法も、公知の方法を採用することができ、例えばポリエチレングリコール(PEG)を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などが例示される。融合操作後の細胞は、公知の方法により選択培地で培養し、ハイブリドーマを選択することができる。生育しているハイブリドーマが所望の抗体を産生しているかどうかを知るために、培養上清を採取して抗体価アッセイを自体公知の方法により行うことができる。得られた抗体産生ハイブリドーマは、公知の凍結保護剤の共存下に凍結させて-193〜-70℃で保存することができる。ハイブリドーマの培養上清等からのモノクローナル抗体の精製は、自体公知の方法により行うことができる。 Specifically, as myeloma cells, those derived from mice, rats, humans, etc. are used.For example, mouse myeloma P3X63-Ag8, P3X63-Ag8-U1, P3NS1-Ag4, SP2 / o-Ag14, P3X63-Ag8 Examples are established myeloma cells such as 653. As a method for producing a hybridoma by fusing antibody-producing cells and myeloma cells, a known method can be adopted. For example, a method using polyethylene glycol (PEG), a method using Sendai virus, or an electrofusion device is used. Examples are methods. Cells after the fusion operation can be cultured in a selective medium by a known method to select hybridomas. In order to know whether or not the growing hybridoma produces the desired antibody, the culture supernatant can be collected and an antibody titer assay can be performed by a method known per se. The obtained antibody-producing hybridoma can be frozen in the presence of a known cryoprotectant and stored at -193 to -70 ° C. Purification of the monoclonal antibody from the hybridoma culture supernatant and the like can be performed by a method known per se.
本発明の抗体は、上記具体例に限定されるものではなく、タグペプチドを特異的に認識しうるモノクローナル抗体であればよい。 The antibody of the present invention is not limited to the above-described specific examples, and may be any monoclonal antibody that can specifically recognize the tag peptide.
(抗タグ抗体発現細胞:培養細胞系)
抗タグ抗体発現細胞は、自体公知の抗体発現細胞の調製方法により達成することができる。特定の抗タグモノクローナル抗体を生産する特定のハイブリドーマより、特定の抗タグ抗体をコードするcDNAを有する動物細胞用発現ベクターに挿入して、抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより抗体を発現させることができる。
(Anti-tag antibody expressing cells: cultured cell line)
Anti-tag antibody-expressing cells can be achieved by a method known per se for preparing antibody-expressing cells. An antibody by constructing an antibody expression vector from a specific hybridoma producing a specific anti-tag monoclonal antibody and inserting it into an animal cell expression vector having a cDNA encoding a specific anti-tag antibody, and introducing the antibody into the animal cell Can be expressed.
特定の抗タグ抗体発現ベクターとは、それぞれ特定の抗体をコードするcDNAが組み込まれた発現ベクターであり、発現ベクターに特定の抗タグ抗体をコードするcDNAを挿入することにより構築することができる。ここにおいて、抗タグ抗体をコードする遺伝子は、特定の抗タグ抗体を発現しうる塩基配列からなるcDNAであればよい。そのような塩基配列としては、本発明の抗タグ抗体をコードする塩基配列からなるcDNAの他、遺伝子コドンと縮重のため、抗タグ抗体と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAも含み、さらにそれらの相補鎖も含まれる。 A specific anti-tag antibody expression vector is an expression vector in which a cDNA encoding a specific antibody is incorporated, and can be constructed by inserting a cDNA encoding a specific anti-tag antibody into the expression vector. Here, the gene encoding the anti-tag antibody may be a cDNA having a base sequence capable of expressing a specific anti-tag antibody. As such a base sequence, in addition to the cDNA consisting of the base sequence encoding the anti-tag antibody of the present invention, it also includes a DNA encoding a protein having the same amino acid sequence as the anti-tag antibody because of the gene codon and degeneracy Furthermore, their complementary strands are also included.
発現ベクターとしては、抗体定常領域をコードするcDNAを組込み、発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133 (1990))、pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987))、pHSG274 (Gene, 27 ,223 (1984))、pKCR (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 1527 (1981))、pSG1βd2-4(Cytotechnology, 4, 173 (1990))等があげられる。例えば動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、自体公知のものを使用することができ、SV40の初期プロモーターとエンハンサー(J. Biochem. 101, 1307 (1987))、モロニーマウス白血病ウイルスのLTR プロモーターとエンハンサー(Biochem. Biophys. Res. Comun., 149, 960 (1987))、免疫グロブリンH鎖のプロモーター((Cell, 41, 479 (1985))とエンハンサー((Cell, 33, 717 (1983))等があげられる。 Any expression vector can be used as long as it can incorporate and express cDNA encoding an antibody constant region. For example, pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), pHSG274 (Gene, 27, 223 (1984)), pKCR (Proc. Natl. Acad. Sci) USA, 78, 1527 (1981)), pSG1βd2-4 (Cytotechnology, 4, 173 (1990)) and the like. For example, promoters and enhancers used in animal cell expression vectors may be those known per se, including SV40 early promoter and enhancer (J. Biochem. 101, 1307 (1987)), Moloney murine leukemia virus LTR. Promoter and enhancer (Biochem. Biophys. Res. Comun., 149, 960 (1987)), immunoglobulin heavy chain promoter ((Cell, 41, 479 (1985)) and enhancer ((Cell, 33, 717 (1983) ) Etc.
宿主細胞への導入法として、特定の抗タグ抗体発現ベクターをエレクトロポレーション法(特開平2-257891、Cytotechnology, 3, 133 (1990))等により同時に宿主細胞に導入する方法と、抗体発現ベクター(タンデム発現ベクター)を構築し、これを宿主細胞に導入する方法(BIO/TECHNOLOGY, 9, 64 (1991))等があげられる。これにより、抗体発現細胞を得ることができる。 As a method for introduction into a host cell, a method for simultaneously introducing a specific anti-tag antibody expression vector into a host cell by electroporation (Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891, Cytotechnology, 3, 133 (1990)), and an antibody expression vector (Tandem expression vector) is constructed and introduced into host cells (BIO / TECHNOLOGY, 9, 64 (1991)). Thereby, antibody-expressing cells can be obtained.
得られた形質転換株を培地中で培養することで培養液中に抗体を生成蓄積させることができる。得られた抗体の活性は酵素免疫抗体法(ELISA法: 抗体実験マニュアル、E. Harlowら編、Cold Spring Harbor Laboratory 刊、1988年)により測定することができる。 By culturing the obtained transformant in a medium, it is possible to produce and accumulate antibodies in the culture solution. The activity of the obtained antibody can be measured by enzyme immunoassay (ELISA method: Antibody Experiment Manual, edited by E. Harlow et al., Published by Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
(抗タグ抗体発現細胞:非ヒトトランスジェニック動物)
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、特定の抗タグ抗体を発現させてなる非ヒトトランスジェニック動物である。
(Anti-tag antibody expressing cells: non-human transgenic animals)
The non-human transgenic animal of the present invention is a non-human transgenic animal that expresses a specific anti-tag antibody.
本発明における非ヒトトランスジェニック動物としては、ヒト以外の哺乳動物が挙げられ、例えば、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウスなどが挙げられる。特に、モルモット、ラット、マウスなどのげっ歯類が取扱いが容易であるため好ましく、中でもマウスが好ましい。 Non-human transgenic animals in the present invention include mammals other than humans, and examples include cattle, monkeys, pigs, dogs, cats, guinea pigs, rabbits, rats, mice, and the like. In particular, rodents such as guinea pigs, rats, and mice are preferable because they are easy to handle, and mice are particularly preferable.
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト動物の発生における胚発生の段階(さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に8細胞期以前)において、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、DEAE-デキストラン法などにより導入遺伝子である特定の抗タグ抗体をコードするcDNAを導入することにより作製することができる。また、該遺伝子導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする特定の抗タグ抗体をコードするcDNA遺伝子を転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもできる。さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞配合法により融合させることにより抗タグ抗体発現トランスジェニック動物を作製することができる。 The non-human transgenic animal of the present invention preferably has a stage of embryonic development in the development of a non-human animal (more preferably, a single cell) with respect to an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm and a germ cell containing the progenitor cell thereof. Or at the fertilized egg cell stage and generally before the 8-cell stage) a specific anti-tag that is a transgene by the calcium phosphate method, electric pulse method, lipofection method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, etc. It can be prepared by introducing cDNA encoding an antibody. Further, by the gene introduction method, a cDNA gene encoding a specific anti-tag antibody of interest can be transferred to somatic cells, living organs, tissue cells, etc., and used for cell culture, tissue culture, and the like. Furthermore, an anti-tag antibody-expressing transgenic animal can be produced by fusing these cells with the above-described embryonic cells by a cell mixing method known per se.
特定の抗タグ抗体をコードするcDNAを対象動物に導入させる際、当該遺伝子を対象となる動物の細胞で発現させうるプロモーターの下流に連結した遺伝子構築物として導入することが好ましい。具体的には、目的とする特定の抗体をコードするcDNAを有する各種哺乳動物由来の特定の抗体をコードするcDNAに係る遺伝子を発現させうる各種プロモーターの下流に、該特定の抗体をコードするcDNAを連結したベクターを対象となる哺乳動物の受精卵(例えば、マウス受精卵)へマイクロインジェクションすることによって、目的とする特定の抗タグ抗体を高発現するトランスジェニック動物を作製することができる。 When introducing a cDNA encoding a specific anti-tag antibody into a target animal, it is preferable to introduce the gene as a gene construct linked downstream of a promoter that can be expressed in cells of the target animal. Specifically, a cDNA encoding the specific antibody downstream of various promoters capable of expressing a gene related to the cDNA encoding the specific antibody derived from various mammals having the cDNA encoding the specific antibody of interest. A transgenic animal that highly expresses a specific anti-tag antibody of interest can be produced by microinjecting a vector ligated to a fertilized egg (eg, a mouse fertilized egg) of interest.
特定の抗タグ抗体の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。遺伝子発現の調節を行うプロモーターとしては、たとえばウイルス(サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、JCウイルス、乳癌ウイルス、など)由来遺伝子のプロモーター、各種哺乳動物(ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど)および鳥類(ニワトリなど)由来遺伝子[例えば、アルブミン、インスリンII、エリスロポエチン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンK1,K10およびK14、コラーゲンI型およびII型、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ−水酸化酵素、内皮レセプターチロシンキナーゼ、ナトリウムカリウムアデノシン3リン酸化酵素、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインIおよびIIA、メタロプロティナーゼ1組織インヒビター、MHCクラスI抗原、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖延長因子1α(EF-1α)、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖1および2、ミエリン基礎タンパク、血清アミロイドPコンポーネント、ミオグロビン、レニンなどの遺伝子]のプロモーターなどが挙げられる。上記ベクターは、トランスジェニック哺乳動物において目的とするメッセンジャーRNAの転写を終結するターミネターを有していてもよい。その他、特定の抗タグ抗体をコードするcDNAをさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核生物遺伝子のイントロンの一部をプロモーター領域の5’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の3’下流に連結することも所望により可能である。 Specific anti-tag antibody expression vectors include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as λ phage, retroviruses such as Moloney leukemia virus, animals such as vaccinia virus or baculovirus Viruses are used. Examples of promoters that regulate gene expression include promoters of genes derived from viruses (cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, etc.), various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, Rats, mice, etc.) and birds (chicken, etc.) derived genes [eg, albumin, insulin II, erythropoietin, endothelin, osteocalcin, muscle creatine kinase, platelet-derived growth factor β, keratin K1, K10 and K14, collagen types I and II , Atrial natriuretic factor, dopamine β-hydroxylase, endothelial receptor tyrosine kinase, sodium potassium adenosine triphosphate, neurofilament light chain, metallothionein I and IIA, metalloproteinase Tissue inhibitor, MHC class I antigen, smooth muscle α-actin, polypeptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β-actin, α and β myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, serum amyloid P component , Genes such as myoglobin and renin]. The vector may have a terminator that terminates transcription of the target messenger RNA in the transgenic mammal. In addition, for the purpose of further expressing a cDNA encoding a specific anti-tag antibody, a splicing signal of each gene, an enhancer region, a part of an intron of a eukaryotic gene, 5 ′ upstream of the promoter region, a promoter region and a translation region It is also possible if desired to link between or 3 ′ downstream of the translation region.
受精卵細胞段階における特定の抗タグ抗体をコードするcDNAの導入は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保することが好ましい。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに抗タグ抗体を過剰に有する。導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモ接合体の動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫について該遺伝子を安定に保持し、また、該遺伝子を過剰に有することを確認して、通常の飼育環境で繁殖継代することができる。 It is preferable to ensure that the introduction of cDNA encoding a specific anti-tag antibody at the fertilized egg cell stage is excessively present in all germ cells and somatic cells of the subject animal. The offspring of this type of animal that inherited the gene has an excess of anti-tag antibody in all of its germ and somatic cells. Obtain a homozygous animal with the transgene on both homologous chromosomes, and crossbreed the male and female animals to stably maintain the gene for all offspring and confirm that it has an excess of the gene Thus, it can be subcultured in a normal breeding environment.
トランスジェニック対象動物が有する内在性の遺伝子とは異なる遺伝子である外来性特定の抗タグ抗体をコードするcDNAを、好ましくはマウスなどの対象動物、またはその先祖の受精卵に転移する際に用いられる受精卵は、同種の雄哺乳動物と雌哺乳動物を交配させることによって得られる。受精卵は自然交配によっても得られるが、雌哺乳動物の性周期を人工的に調節した後、雄哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌哺乳動物の性周期を人工的に調節する方法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン(妊馬血清性性腺刺激ホルモン(PMSG))、次いで黄体形成ホルモン(ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG))を例えば腹腔注射などにより投与する方法が好ましい。 Used to transfer a cDNA encoding an exogenous specific anti-tag antibody, which is a gene different from the endogenous gene of the transgenic target animal, preferably to the target animal such as a mouse or a fertilized egg of its ancestor A fertilized egg is obtained by crossing male and female mammals of the same species. Although fertilized eggs can be obtained by natural mating, a method of mating with a male mammal after artificially adjusting the sexual cycle of the female mammal is preferred. Examples of methods for artificially regulating the female sexual cycle include follicle stimulating hormone (pregnant horse serum gonadotropin (PMSG)) and then luteinizing hormone (human chorionic gonadotropin (hCG)). A method is preferred in which is administered by, for example, intraperitoneal injection.
得られた受精卵に前述の方法により外来性特定の抗タグ抗体をコードするcDNAを導入した後、雌動物に人工的に移植、着床させることにより、外来性遺伝子を組み込んだDNAを有する非ヒト動物が得られる。好ましくは、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)を投与後、雄動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌動物に得られた受精卵を人工的に移植・着床させることができる。遺伝子を導入する全能性細胞としては、マウスの場合、受精卵や初期胚を用いることができる。また培養細胞への遺伝子導入法としては、トランスジェニック動物個体の産出高率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、DNAのマイクロインジェクションが好ましい。 After introducing a cDNA encoding an exogenous specific anti-tag antibody into the resulting fertilized egg by the above-mentioned method, it is artificially transplanted and implanted in a female animal, so that the non-containing gene containing the exogenous gene is incorporated. Human animals are obtained. Preferably, after administration of luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH), a fertilized egg obtained in a pseudopregnant female animal in which fertility is induced can be artificially transplanted and implanted by mating with a male animal. it can. In the case of a mouse, a fertilized egg or an early embryo can be used as a totipotent cell into which a gene is introduced. In addition, as a method for introducing a gene into a cultured cell, DNA microinjection is preferable in consideration of the yield rate of the transgenic animal individual and the transgene transfer efficiency to the next generation.
遺伝子を注入した受精卵は、次に仮親の卵管に移植され、個体まで発生し出生した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部(マウスの場合には、例えば、尾部先端)からDNAを抽出し、サザン解析やPCR法により導入遺伝子の存在を確認することができる。導入遺伝子の存在が確認された個体を初代(Founder)とすれば、導入遺伝子はその子(F1)の50%に伝達される。さらに、このF1個体を野生型動物または他のF1動物と交配させることにより、2倍体染色体の片方(ヘテロ接合)または両方(ホモ接合)に導入遺伝子を有する個体(F2)を作成することができる。 The fertilized egg into which the gene has been injected is then transplanted into the oviduct of the foster parent, and after raising and born the animal to the foster parent, a part of the body (in the case of a mouse, for example, the tip of the tail) DNA can be extracted from and the presence of the transgene can be confirmed by Southern analysis or PCR. If an individual in which the presence of a transgene is confirmed is a founder, the transgene is transmitted to 50% of its offspring (F1). Furthermore, an individual (F2) having a transgene in one (heterozygous) or both (homozygous) of a diploid chromosome can be prepared by mating this F1 individual with a wild type animal or another F1 animal. it can.
あるいは、抗タグ抗体発現非ヒトトランスジェニック動物は、上記した特定の抗タグ抗体をコードするcDNAを導入遺伝子としてES細胞に導入することによって作製することもできる。例えば、正常マウス胚盤胞に由来するHPRT陰性(ヒポキサンチングアニン・フォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いている)ES細胞(embryonic stem cell)に、特定の抗タグ抗体をコードするcDNAを導入する。特定の抗タグ抗体をコードするcDNAがマウス内在性遺伝子上にインテグレートされたES細胞をHATセレクション法により選別する。次いで、選別したES細胞を、別の正常マウスから取得した受精卵(胚盤胞)にマイクロインジェクションする。該胚盤胞を仮親としての別の正常マウスの子宮に移植する。そうして該仮親マウスから、キメラトランスジェニックマウスが生まれる。該キメラトランスジェニックマウスを正常マウスと交配させることによりヘテロトランスジェニックマウスを得ることができる。該ヘテロトランスジェニックマウス同士を交配することにより、ホモトランスジェニックマウスが得られる。 Alternatively, an anti-tag antibody-expressing non-human transgenic animal can also be produced by introducing a cDNA encoding the above-mentioned specific anti-tag antibody into an ES cell as a transgene. For example, a cDNA encoding a specific anti-tag antibody is introduced into an HPRT negative (embryonic stem cell) ES cell (embryonic stem cell) derived from a normal mouse blastocyst. ES cells in which a cDNA encoding a specific anti-tag antibody is integrated on a mouse endogenous gene are selected by the HAT selection method. Next, the selected ES cells are microinjected into a fertilized egg (blastocyst) obtained from another normal mouse. The blastocyst is transplanted into the uterus of another normal mouse as a foster parent. Thus, a chimeric transgenic mouse is born from the temporary parent mouse. A heterotransgenic mouse can be obtained by mating the chimeric transgenic mouse with a normal mouse. A homotransgenic mouse is obtained by crossing the heterotransgenic mice.
(遺伝子導入方法)
上記方法でクローニングされた抗タグ抗体をコードするcDNAを、適当なプロモーターに結合してプラスミドコンストラクションを行い、トランスジーンベクターを作製することができる。作製されたトランスジーンベクターを線状化し、マイクロインジェクション法やレトロウイルスを用いた感染等によって受精卵に導入することができる。
(Gene transfer method)
A cDNA encoding the anti-tag antibody cloned by the above method is bound to an appropriate promoter and plasmid construction is performed to prepare a transgene vector. The produced transgene vector can be linearized and introduced into a fertilized egg by a microinjection method or infection using a retrovirus.
マイクロインジェクション後、一般的には、生まれた胚の10−40%に染色体への導入遺伝子の安定な組み込みが起こっている。選択されたマウス染色体に目的とする遺伝子の組み込みが起こっているかどうかをPCR法、サザンブロット法等により確認することが好ましい。このマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、本発明の本件抗タグ抗体発現マウスを作製することができる。 After microinjection, 10-40% of born embryos generally have stable integration of the transgene into the chromosome. It is preferable to confirm whether integration of the target gene has occurred in the selected mouse chromosome by PCR, Southern blotting, or the like. When this mouse is intercrossed with a wild-type mouse, a heterozygous mouse can be obtained, and the anti-tag antibody-expressing mouse of the present invention can be produced.
本件抗タグ抗体発現マウスが生起しているか否かを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからRNAを単離してノーザンブロット法等により調べ、またはタンパク質を抽出してウェスタンブロット法等により調べる方法がある。 As a method for confirming whether or not the anti-tag antibody-expressing mouse has occurred, for example, RNA is isolated from the mouse obtained by the above-described method and examined by Northern blotting or the like, or a protein is extracted and Western blotted. There is a method of examining by blotting or the like.
本発明は、Adベクターを用いた遺伝子導入方法の他、抗タグ抗体を発現しうる、トランスジェニック非ヒト動物にも及ぶ。 The present invention extends to transgenic non-human animals capable of expressing anti-tag antibodies in addition to gene transfer methods using Ad vectors.
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto.
(実施例1)Hisタグ付与Adベクターの調製
Hisタグ配列をファイバーC末端に付与したAdベクターは以下の方法により作製した。
ベクタープラスミドpAdHM41 (J. Gene Med., 5: 267-276, 2003)をClaI処理し、オリゴヌクレオチド1(配列番号14)およびオリゴヌクレオチド2(配列番号15)を挿入した(pAdHM41-CHis1)。
(Example 1) Preparation of His-tagged Ad vector
An Ad vector with a His tag sequence added to the fiber C-terminus was prepared by the following method.
The vector plasmid pAdHM41 (J. Gene Med., 5: 267-276, 2003) was treated with ClaI, and oligonucleotide 1 (SEQ ID NO: 14) and oligonucleotide 2 (SEQ ID NO: 15) were inserted (pAdHM41-CHis1).
オリゴヌクレオチド1:5'-c gga cca tca gcc tcc gca tct gct tcc gcc cct gga tcg aga gga tcg cat cac cat cac cat cac taa taa gg-3'(配列番号14)
オリゴヌクレオチド2:5'-c gcc tta tta gtg atg gtg atg gtg atg cga tcc tct cga tcc agg ggc gga agc aga tgc gga ggc tga tgg tc-3'(配列番号15)
Oligonucleotide 1: 5′-c gga cca tca gcc tcc gca tct gct tcc gcc cct gga tcg aga gga tcg cat cac cat cac cat cac taa gg-3 ′ (SEQ ID NO: 14)
Oligonucleotide 2: 5′-c gcc tta tta gtg atg gtg atg gtg atg cga tcc tct cga tcc agg ggc gga agc aga tgc gga ggc tga tgg tc-3 ′ (SEQ ID NO: 15)
得られたpAdHM41-CHis1をI-CeuI/PI-SceIで消化し、CMVプロモーター制御下でルシフェラーゼを発現するpCMVL1 (J. Gene Med., 5: 267-276, 2003)のI-CeuI/PI-SceI消化フラグメントとライゲーションし、改変型ベクタープラスミドpAdHM41-CHis1-L2を作製した。次に、pAdHM41-CHis1-L2をウイルスゲノム末端に存在する制限酵素PacIで切断して線状にし、市販のトランスフェクション試薬SuperFectTM(Qiagen社)を用いて293細胞にトランスフェクションした。約10日間培養後、ルシフェラーゼ発現AdベクターAd-CHis1-L2を得た。野生型のファイバーをもったルシフェラーゼ発現AdベクターAd-L2は、以前作製したものを用いた(J. Gene Med., 5: 267-276, 2003)。作製したAdベクターを293細胞を用いて増幅し、塩化セシウム密度勾配遠心法にて精製した。各ベクターの粒子数 (vector particle; VP) の測定はSDS-OD260法で測定した。 The obtained pAdHM41-CHis1 was digested with I-CeuI / PI-SceI, and I-CeuI / PI- of pCMVL1 (J. Gene Med., 5: 267-276, 2003) expressing luciferase under the control of the CMV promoter. Ligation with the SceI digested fragment produced a modified vector plasmid pAdHM41-CHis1-L2. Next, pAdHM41-CHis1-L2 was cleaved with the restriction enzyme PacI present at the end of the viral genome, and transfected into 293 cells using a commercially available transfection reagent SuperFect ™ (Qiagen). After culturing for about 10 days, a luciferase-expressing Ad vector Ad-CHis1-L2 was obtained. The luciferase-expressing Ad vector Ad-L2 having a wild-type fiber was prepared previously (J. Gene Med., 5: 267-276, 2003). The prepared Ad vector was amplified using 293 cells and purified by a cesium chloride density gradient centrifugation method. The number of particles of each vector (vector particle; VP) was measured by the SDS-OD 260 method.
(実施例2)抗Hisタグ抗体発現細胞の作製
1)抗Hisタグ抗体発現プラスミドの作製
市販のベクタープラスミドであるpDisplay TM(Invitrogen社)のSalI部位を、オリゴヌクレオチド3(配列番号16)、オリゴヌクレオチド4(配列番号17)を用いてSfiI認識部位に変更した。
上記pDisplay TM(Invitrogen社)は、カナマイシン耐性遺伝子を含み、シグナルペプチドとHA(hemagglutinin A)タグを含み、血小板由来増殖因子B (PDGFB)の膜貫通ドメイン(transmembrane domain)をコードした遺伝子を有する。該ベクタープラスミドを使用するのは、発現タンパク質を細胞表面に表示させるためである。
(Example 2) Preparation of anti-His tag antibody-expressing cells 1) Preparation of anti-His tag antibody expression plasmid The SalI site of pDisplay ™ (Invitrogen), which is a commercially available vector plasmid, was oligonucleotide 3 (SEQ ID NO: 16), oligo It was changed to the SfiI recognition site using nucleotide 4 (SEQ ID NO: 17).
The pDisplay ™ (Invitrogen) contains a kanamycin resistance gene, a signal peptide and a HA (hemagglutinin A) tag, and a gene encoding a transmembrane domain of platelet-derived growth factor B (PDGFB). The reason for using the vector plasmid is to display the expressed protein on the cell surface.
オリゴヌクレオチド3:5'-tcg agg cct cgg ggg cca-3'(配列番号16)
オリゴヌクレオチド4:5'-t cga tgg ccc ccg agg gc-3'(配列番号17)
Oligonucleotide 3: 5′-tcg agg cct cgg ggg cca-3 ′ (SEQ ID NO: 16)
Oligonucleotide 4: 5′-t cga tgg ccc ccg agg gc-3 ′ (SEQ ID NO: 17)
上記ベクタープラスミドをSfiIで切断し、Hisタグ配列に対する一本鎖抗体をコードした遺伝子を含むpAK100His2 (Dr. Andreas Plueckthun, Universitaet Zurich, Switzerland)のSfiI消化しフラグメントとライゲーションし、HAタグ抗体発現プラスミドであるpDis-Hisプラスミドを作製した。pDis-Hisは、シグナルペプチド・HAタグコード遺伝子とPDGFR膜貫通ドメインコード遺伝子の間に、Hisタグ配列に対する一本鎖抗体遺伝子を含んでおり、CMVプロモーター制御下で、Hisタグ配列に対する一本鎖抗体を発現する。
また、CMVプロモーターをCAプロモーター(β-actin promoter/CMV enhancer with β-actin intron)(宮崎純一先生(大阪大学)より供与)に置き換えたHAタグ抗体発現プラスミドであるpDis-CAHis2プラスミドも作製した。
The above vector plasmid was digested with SfiI, digested with SfiI of pAK100His2 (Dr. Andreas Plueckthun, Universitaet Zurich, Switzerland) containing a gene encoding a single chain antibody against the His tag sequence, and ligated with the HA tag antibody expression plasmid. A pDis-His plasmid was prepared. pDis-His contains a single chain antibody gene against the His tag sequence between the signal peptide / HA tag coding gene and the PDGFR transmembrane domain coding gene, and is a single chain against the His tag sequence under the control of the CMV promoter. Express antibody.
In addition, a pDis-CAHis2 plasmid, which is an HA tag antibody expression plasmid, in which the CMV promoter is replaced with a CA promoter (β-actin promoter / β-actin intron) (provided by Dr. Junichi Miyazaki (Osaka University)) was also prepared.
2)抗Hisタグ抗体発現細胞の作製
CHO(chinese hamster ovary)細胞5 ×103cellsを96穴マイクロプレートに播種して、3時間37℃で培養した。
その後、上記により得たベクタープラスミド(pDisplay TM(Invitrogen社))、抗Hisタグ抗体発現プラスミド(pDis-His)、Hisタグ抗体発現プラスミド(pDis-CAHis2)を市販のトランスフェクション試薬であるSuperFectTM(キアゲン社)を用いてトランスフェクションし、抗Hisタグ抗体発現細胞を作製した。
2) Preparation of cells expressing anti-His tag antibody
CHO (chinese hamster ovary) cells 5 × 10 3 cells were seeded in a 96-well microplate and cultured at 37 ° C. for 3 hours.
Thereafter, the vector plasmid (pDisplay ™ (Invitrogen)), the anti-His tag antibody expression plasmid (pDis-His), and the His tag antibody expression plasmid (pDis-CAHis2) obtained as described above were used as a commercially available transfection reagent, SuperFect ™ ( Qiagen) was used for transfection to produce anti-His tag antibody-expressing cells.
(実験例1)Hisタグ抗体発現細胞への遺伝子導入効果
実施例2で作製したpDis-HisまたはpDis-CAHis2をトランスフェクションした抗Hisタグ抗体発現細胞を各々トランスフェクションの翌日に、Hisタグを付与していないAdベクター(Ad-L2)(対照コントロール)および実施例1で得たHisタグ付与Adベクター(Ad-CHis1-L2)を1000 VP/cellで1.5時間作用させ、培養した。24時間後に、ルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイシステム(ピッカジーンTMLT2.0、東洋インキ)を用いて測定した。
(Experimental Example 1) Gene Transfer Effect to His Tag Antibody Expressing Cells The His tag antibody-expressing cells transfected with pDis-His or pDis-CAHis2 prepared in Example 2 were each given a His tag on the day after transfection. Unadverted Ad vector (Ad-L2) (control) and His-tagged Ad vector (Ad-CHis1-L2) obtained in Example 1 were allowed to act at 1000 VP / cell for 1.5 hours and cultured. After 24 hours, luciferase activity was measured using a luciferase assay system (Piccagene ™ LT2.0, Toyo Ink).
(結果)
CHO細胞にHisタグ配列に対する一本鎖抗体を発現するプラスミド(pDisplay)をトランスフェクションし、Ad-L2およびAd-CHis1-L2(1000 VP/cell)を作用させたところ、Ad-CHis1-L2作用群はAd-L2作用群に比べ51%の発現であった。
(result)
When CHO cells were transfected with a plasmid (pDisplay) that expresses a single chain antibody against the His tag sequence, and Ad-L2 and Ad-CHis1-L2 (1000 VP / cell) were allowed to act, Ad-CHis1-L2 action The group had 51% expression compared to the Ad-L2 acting group.
一方、CMVプロモーターを用いたpDis-His、またはCAプロモーターを用いたpDis-CAHis2をトランスフェクションした群では、Hisタグ配列に対する一本鎖抗体を発現しており、対照コントロール(Ad-L2)を作用させた場合はルシフェラーゼ発現の上昇は認められなかったが、Hisタグ付与Adベクター(Ad-CHis1-L2)を作用させた場合は、それぞれ13.6倍、9.8倍のルシフェラーゼ発現の上昇が認められた。従って、Adベクターに付与したHisタグ配列と、Hisタグ配列に対する抗体遺伝子を発現する細胞とのセットで、ベクター上のルシフェラーゼ遺伝子の発現が上昇することが確認された(図1)。 On the other hand, in the group transfected with pDis-His using the CMV promoter or pDis-CAHis2 using the CA promoter, a single-chain antibody against the His tag sequence was expressed, and the control control (Ad-L2) was effective. However, when the His-tagged Ad vector (Ad-CHis1-L2) was allowed to act, an increase in luciferase expression of 13.6 times and 9.8 times was observed, respectively. Therefore, it was confirmed that the expression of the luciferase gene on the vector was increased in a set of the His tag sequence added to the Ad vector and a cell expressing an antibody gene against the His tag sequence (FIG. 1).
(実施例3)Hisタグ抗体発現トランスジェニックマウスの作製
Hisタグ抗体発現プラスミド(pDis-CAHis2)をAvrII/ApaLI/SalIで切断し、0.7%アガロースゲルで電気泳動した。CAプロモーター・Hisタグ配列に対する一本鎖抗体遺伝子、PDGFR膜貫通ドメインコード遺伝子およびBovine Growth Hormon P(A)配列をコードした遺伝子を回収した。本遺伝子を用いて日本エスエルシー(株)にてトランスジェニックマウスを作製した。トランスジェニックマウスは、遺伝子を前核期受精卵の雄性前核にマイクロインジョクションし、2細胞期胚に発生した胚全てをレシピエントマウスに胚移植して産仔を得る定法に従って作製した。
(Example 3) Production of His-tagged antibody-expressing transgenic mice
A His tag antibody expression plasmid (pDis-CAHis2) was cleaved with AvrII / ApaLI / SalI and electrophoresed on a 0.7% agarose gel. A gene encoding a single chain antibody gene against the CA promoter / His tag sequence, a PDGFR transmembrane domain coding gene and a Bovine Growth Hormon P (A) sequence was recovered. Using this gene, a transgenic mouse was produced at Nippon SLC Co., Ltd. The transgenic mice were prepared according to a conventional method in which the gene was microinjected into the male pronucleus of a pronuclear-stage fertilized egg, and all embryos developed in the two-cell stage embryo were transplanted into recipient mice to obtain offspring.
(実験例2)ウエスタン・ブロッティング
実施例3で作製した抗Hisタグ抗体発現トランスジェニックマウスの脳、肝臓、脾臓、胸腺、肺、腎臓、筋肉、膵臓および心臓の各臓器を回収し、各臓器をホモジェネートしたものについて、lysis bufferで溶解した。溶解した各臓器10μgをSDS-PAGE処理後、ゲルをニトロセルロースメンブレンにブロッティングした。メンブレンをブロッキングした後、マウス抗HA抗体で反応させ、その後HRP標識抗マウスIgGで反応させた。ECL plus(Amercham Bioscience)にてchemiluminescenceを可視化した。Hisタグ配列に対する一本鎖抗体(抗Hisタグ抗体)の発現をウェスタンブロット法により確認した。
(Experimental example 2) Western blotting Collecting the brain, liver, spleen, thymus, lung, kidney, muscle, pancreas and heart organs of the anti-His tag antibody-expressing transgenic mouse prepared in Example 3, The homogenated product was dissolved in lysis buffer. After 10 μg of each dissolved organ was subjected to SDS-PAGE treatment, the gel was blotted onto a nitrocellulose membrane. After blocking the membrane, it was reacted with a mouse anti-HA antibody and then reacted with an HRP-labeled anti-mouse IgG. Chemiluminescence was visualized with ECL plus (Amercham Bioscience). The expression of a single chain antibody (anti-His tag antibody) against the His tag sequence was confirmed by Western blotting.
(結果)
作出したトランスジェニックマウスの各臓器における抗Hisタグ抗体の発現をウエスタン・ブロッティングで検討したところ、コントロールマウス(野生型マウス)はnegativeであったが、トランスジェニックマウスでは全ての臓器でバンドがみられ、Hisタグ配列に対する一本鎖抗体が確かに発現していることが確認された(図2)。
従って、本マウスは、ファイバーノブのC末端領域にHisタグ配列を付与したAdベクターを用いることで、より効率良く遺伝子発現することが期待される。
(result)
When Western blotting was used to examine the expression of anti-His tag antibodies in each organ of the generated transgenic mice, control mice (wild-type mice) were negative, but transgenic mice showed bands in all organs. It was confirmed that the single chain antibody against the His tag sequence was certainly expressed (FIG. 2).
Therefore, this mouse is expected to express genes more efficiently by using an Ad vector in which a His tag sequence is added to the C-terminal region of the fiber knob.
本発明はタグ付与型Adベクターと、前記タグ付与型Adベクターに付与したタグに対する抗タグ抗体を発現しうる細胞と反応させることを特徴とする遺伝子導入方法であり、タグと抗タグ抗体のアフィニティーを利用することにより、従来は細胞内にAdベクターを導入するのが困難な場合でも、容易に細胞に導入することができる。
また、トランスジェニックマウスでは、抗タグ抗体の発現が認められた。これにより、タグ付与型Adベクターに担持した遺伝子をトランスジェニックマウスに導入すると、より効果的に遺伝子を導入させることが可能となることが期待され、導入した遺伝子の作用解明など、基礎研究の分野において、効果が期待される。
The present invention is a gene transfer method comprising reacting a tag-added Ad vector with a cell capable of expressing an anti-tag antibody against the tag applied to the tag-added Ad vector, wherein the affinity between the tag and the anti-tag antibody Thus, even if it is difficult to introduce an Ad vector into a cell, it can be easily introduced into a cell.
In addition, the expression of anti-tag antibody was observed in the transgenic mice. As a result, it is expected that introduction of genes carried on tagged Ad vectors into transgenic mice will enable more effective gene introduction. The effect is expected.
Claims (8)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007130217A JP2008283882A (en) | 2007-05-16 | 2007-05-16 | Tag antibody-expressing transgenic non-human animal and method for gene transfer with tagged-type adenovirus vector |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007130217A JP2008283882A (en) | 2007-05-16 | 2007-05-16 | Tag antibody-expressing transgenic non-human animal and method for gene transfer with tagged-type adenovirus vector |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008283882A true JP2008283882A (en) | 2008-11-27 |
Family
ID=40144211
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007130217A Withdrawn JP2008283882A (en) | 2007-05-16 | 2007-05-16 | Tag antibody-expressing transgenic non-human animal and method for gene transfer with tagged-type adenovirus vector |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2008283882A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012074277A3 (en) * | 2010-11-30 | 2012-08-09 | Lg Life Sciences Ltd. | Novel hybrid promoter and recombinant vector comprising the same |
-
2007
- 2007-05-16 JP JP2007130217A patent/JP2008283882A/en not_active Withdrawn
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012074277A3 (en) * | 2010-11-30 | 2012-08-09 | Lg Life Sciences Ltd. | Novel hybrid promoter and recombinant vector comprising the same |
CN103403166A (en) * | 2010-11-30 | 2013-11-20 | 株式会社Lg生命科学 | Novel hybrid promoter and recombinant vector comprising the same |
CN103403166B (en) * | 2010-11-30 | 2014-12-24 | 株式会社Lg生命科学 | Novel hybrid promoter and recombinant vector comprising the same |
US9234211B2 (en) | 2010-11-30 | 2016-01-12 | Lg Life Sciences Ltd. | Hybrid promoter and recombinant vector comprising the same |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Deng et al. | Use of the 2A peptide for generation of multi-transgenic pigs through a single round of nuclear transfer | |
JPWO2017104404A1 (en) | Genetically modified non-human organism, egg cell, fertilized egg, and target gene modification method | |
KR20110020860A (en) | Method of generating single vl domain antibodies in transgenic animals | |
US20230345919A1 (en) | Non-human animals comprising a humanized asgr1 locus | |
KR20210005661A (en) | Pathogen-resistant animals with modified aminopeptidase N (ANPEP) gene | |
US20050229263A1 (en) | Transgenesis by sperm-mediated gene transfer | |
CN106978416B (en) | Gene positioning integration expression system and application thereof | |
JP2008283882A (en) | Tag antibody-expressing transgenic non-human animal and method for gene transfer with tagged-type adenovirus vector | |
US20080104723A1 (en) | Development of Mammalian Genome Modification Technique Using Retrotransposon | |
JP2002525047A (en) | Production of recombinant protein in urine | |
CN111787791A (en) | Materials and methods for preventing the spread of specific chromosomes | |
Bao et al. | Human coxsackie adenovirus receptor (CAR) expression in transgenic mouse prostate tumors enhances adenoviral delivery of genes | |
US20030204861A1 (en) | Transgenic animal model for spliceosome-mediated RNA trans-splicing | |
US20220403397A1 (en) | Nucleic acid constructs encoding kallikrein-2 fusion protein and vectors, preparations of cells, and methods of use thereof | |
JP6876434B2 (en) | Method for producing transgenic animal having T cell receptor specific to fluorescent protein | |
RU2796949C2 (en) | Non-human animals containing the humanized asgr1 locus | |
JP5644026B2 (en) | Partial peptide of TRPV2 | |
Himaki et al. | Production of genetically modified porcine blastocysts by somatic cell nuclear transfer: Preliminary results toward production of xenograft-competent miniature pigs | |
US20070032643A1 (en) | Cis-element regulating transcription, transcriptional regulatory factor binding specifically thereto and use of the same | |
JP3809189B2 (en) | Non-primate mammal transformed animal expressing higher primate antigen type by introduction of foreign gene and method for producing the same | |
JP2004242557A (en) | Muscular dystrophy pathological model, and method for producing the same | |
CN118109477A (en) | Non-human animals comprising a humanized ASGR1 locus | |
MOHAMMED et al. | Drosophila Transgenic Lines Expressing the Mammalian N-acetylglucosaminyltransferase II and β 1, 4-galactosyltransferase | |
WO2007007777A1 (en) | Transgenic non-human mammal capable of expressing non-fluorescent mutant of fluorescent protein | |
AU7933601A (en) | alpha(1,3)-galactosyltransferase negative swine |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20100803 |