JP2008268040A

JP2008268040A - クロマトグラフィー測定方法

Info

Publication number: JP2008268040A
Application number: JP2007112551A
Authority: JP
Inventors: Hideyuki Kurokawa; 英之黒川; Masahiro Agawa; 昌弘阿河
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2007-04-23
Filing date: 2007-04-23
Publication date: 2008-11-06

Abstract

【課題】標識物質が持つ吸光以外のバックグラウンドを補正して測定精度を高めたクロマトグラフィー測定方法を提供する。
【解決手段】クロマトグラフィー試験片に試料を点着する点着工程と、第１の波長での前記標識部の第１の吸光度と前記第２の波長での前記標識部の第２の吸光度を測定する標識部吸光度測定工程と、前記第１の波長での前記導入部の第１の吸光度と前記第２の波長での前記導入部の第２の吸光度を測定する導入部吸光度測定工程と、前記呈色部に前記試料が流入した後に前記第１の波長での前記呈色部の第１の吸光度と前記第２の波長での前記呈色部の第２の吸光度を測定する呈色部吸光度測定工程と、前記標識部吸光度測定工程と導入部吸光度測定工程と呈色部吸光度測定工程を用いて前記試料の前記第１と第２の波長吸光度を補正する吸光度補正工程と、から成るクロマトグラフィー測定方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、クロマトグラフィー測定方法に関し、特にクロマトグラフィー測定を行う装置の定量測定精度を向上させることができるものに関する。

以下に、従来のクロマトグラフィー測定方法について説明する。図６は、従来のクロマトグラフィー測定装置の概略図である。光源１０１から出射された入射光１０３はレンズ１０２を通してクロマトグラフィー試験片１０４に入射し、その散乱光１０５を受光するように光検出器１０６が配置されている。次に図２を用いてクロマトグラフィー試験片１０４の構造を示す。２１はニトロセルロースから成る多孔質担体であり、その上に、導入部２２、標識部２３、および判定部２４が形成されている。導入部２２に検査する液体試料を注入すると、液体試料は、毛細管現象により液体試料が多孔質担体２１の奥の方に引き込まれていき、最初に標識部２３、次に判定部２４と順番に通過する。標識部２３には、試料中の検体を標識するための標識物質が予め塗布されており、標識物質には金コロイドやラテックスや色素などが用いられる。また、判定部２４には、検体と特異的に結合する試薬が予め塗布されており、流れてきた検体をトラップして呈色する。

クロマトグラフィー測定装置では、この呈色の度合いを吸光度として測定し、試料の濃度に変換する。非呈色領域での散乱光１０４の強度をＩ₀、呈色領域での散乱光１０４の強度をＩとすると、吸光度Ａは数（１）を用いて次のように表される。

非呈色領域は、多孔質担体２１上であれば何処でも構わないが、多孔質担体２１の表面の状態や濡れ具合が呈色領域と近い領域であることが好ましい。

吸光度Ａは、試料の濃度に比例することが知られている（Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒの法則）ので、予め試料の濃度と吸光度の相関を実験的に求めておくことにより、血液中の抗体など、微量の物質を定量することができる（例えば、特許文献１を参照）。
特開２００２−９８６３１号公報

しかしながら、前記従来の技術では、入射光１０３に対して吸光を持つ物質が液体試料に含まれていれば、標識された検体が持つ吸光以外のバックグラウンドとして測定されるため、測定誤差が生じる問題があった。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、任意の二波長の光を吸光度の測定に使用し、バックグラウンドを補正して測定精度を高めたクロマトグラフィー測定方法を提供することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、本発明のクロマトグラフィー測定方法は、測定すべき試料を点着する導入部と標識物質を配置した標識部と前記試料の吸光度を測定する呈色部から成るクロマトグラフィー試験片の前記導入部に前記試料を点着する点着工程と、前記標識部に前記試料が流入する前に第１の波長での前記標識部の第１の吸光度と前記第２の波長での前記標識部の第２の吸光度を測定する標識部吸光度測定工程と、前記第１の波長での前記導入部の第１の吸光度と前記第２の波長での前記導入部の第２の吸光度を測定する導入部吸光度測定工程と、前記呈色部に前記試料が流入した後に前記第１の波長での前記呈色部の第１の吸光度と前記第２の波長での前記呈色部の第２の吸光度を測定する呈色部吸光度測定工程と、前記標識部吸光度測定工程と導入部吸光度測定工程と呈色部吸光度測定工程を用いて前記試料の前記第１と第２の波長吸光度を補正する吸光度補正工程と、から成ることを特徴としたものである。

本発明のクロマトグラフィー測定方法によれば、標識物質と光源の組み合わせを制限されることなく、標識物質が持つ吸光以外のバックグラウンドを補正して測定精度を高めることができる。

以下に、本発明のクロマトグラフィー測定方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。

（実施の形態１）
図１は、本発明の第１の実施例におけるクロマトグラフィー測定装置の構成図を示す。
図１において、光源１は、波長λ１を持つ光源で、レンズ２を介してクロマトグラフィー試験片６に照射されている。また、光源３は、波長λ１とは異なる波長λ２を持つ光源で、レンズ４を介してクロマトグラフィー試験片６に照射されている。図１には示していない外部の切り替え手段により、光源１と光源３は切り替えることが出来、異なる２つの波長λ１と波長λ２のビームをクロマトグラフィー試験片６に選択的に照射出来るように構成されている。クロマトグラフィー試験片６は光源１および３による入射光５に対して水平方向に移動可能に構成されており、光検出器７は、クロマトグラフィー試験片６からの散乱光８を受光する位置に構成されている。

クロマトグラフィー試験片６は、背景技術で説明した図２と同じものを用いる。すなわち、ニトロセルロースから成る多孔質担体２１上に、導入部２２、標識部２３、および判定部２４が形成されている。クロマトグラフィー試験片６は、入射光５に対して移動可能であるので、クロマトグラフィー試験片６の任意の位置、すなわち標識部２３または判定部２４等の部位で、異なる２つの波長λ１およびλ２における吸光度を測定することができる。

次に図３を用いて、本発明のクロマトグラフィー測定装置によるバックグラウンドを補正した吸光度測定の手順を説明する。まず、クロマトグラフィー試験片６の導入部２２に検査する液体試料を注入する。導入部２２の液体試料は、時間の経過とともに毛細管力により多孔質担体２１を移動して、最初に標識部２３、次に判定部２４と順番に通過する。

ステップＳ１では、導入部２２に注入したクロマトグラフィー試験片６の標識部２３を光源１と光源３を切り替えて照射し、波長λ１での吸光度Ａ１´と、波長λ２での吸光度Ａ２´を測定し、その結果を保存する。

ステップＳ２では、クロマトグラフィー試験片６の導入部２２の吸光度をステップ１と同様に測定して結果を保存する。ここで、波長λ１の吸光度をＢ１´、波長λ２の吸光度をＢ２´とする。

ステップＳ３では、クロマトグラフィー試験片６の判定部２４の吸光度をステップ１と同様に測定して結果を保存する。ここで、波長λ１の吸光度をＣ１、波長λ２の吸光度をＣ２とする。

ステップＳ４では、ステップＳ１、ステップＳ２およびステップＳ３の測定結果をもとに吸光度の補正を行う。すなわち、波長λ１または波長λ２に対するバックグラウンドを含まない標識物質のみの吸光度Ａ１または吸光度Ａ２を算出する。この算出方法については後述する。

ステップＳ５では、予め求めておいた濃度と吸光度の関係から、ステップＳ４で求めた吸光度Ａ１または吸光度Ａ２を試料の濃度に変換して成分濃度を定量する。

さて、次に、前述したステップＳ４での吸光度補正方法を説明する。図４は、測定波長と吸光度の関係を表したグラフである。図４中の曲線４１および曲線４２は、同じ標識物質で濃度を変えた場合（濃度ｄ１と濃度ｄ２）の、測定波長と吸光度の関係を示す。ここで、２つの波長λ１およびλ２に着目すると、Ｌａｍｂｅｒｔ-Ｂｅｅｒの法則より、吸光度は物質の濃度に比例するという関係が成り立つので、同一波長における曲線４１と曲線４２の間の吸光度の比率は等しいため数（２）が成り立つ。

ここで、ａは定数である。
この関係は、標識物質以外のバックグラウンドの物質についても同じ関係が成り立つので、数（３）が導かれる。

ここで、ｂは定数である。

一方で、前述のステップＳ３で測定した吸光度Ｃ１およびＣ２は、実際にはバックグラウンドになる物質の吸光度も含まれているので、正しく標識物質のみの吸光度を表していない。標識物質のみの吸光度をＡ１およびＡ２、バックグラウンドのみの吸光度をＢ１およびＢ２とすると、数（４）および数（５）で表される。

数（２）と数（３）より、吸光度Ａ２と吸光度Ｂ２は、数（６）および数（７）で表される。

従って、数（６）と（７）を数（４）と（５）に各々代入し、吸光度Ａ１およびＡ２について解いた式を、各々数（８）と（９）に示す。

ここで、定数ａとｂとは、数（２）と数（３）で導かれることを利用して、ステップＳ１とステップＳ２で実測して求めることが出来る。また、Ｃ１とＣ２とは、ステップＳ３で計測した値なので、補正後の吸光度Ａ１とＡ２は、数（８）と（９）を用いることで算出することが出来る。

なお、ステップＳ１は、図３に示した一連のフローチャートの中には入れず、予め実験的に求めた吸光度をＡ１´およびＡ２´として使用しても良い。同様に、ステップＳ２も予め実験的に求めた吸光度をＢ１´およびＢ２´として使用してもよい。なお、図３のステップＳ１、ステップＳ２、およびステップＳ３は必ずしも図の通りの順序で行う必要は無く、異なる順序で行っても良い。

（実施の形態２）
図５は、本発明の第２の実施の形態を示すクロマトグラフィー測定装置の構成図である。図５において、光源５１および光源５２は、それぞれ異なる波長λ１、λ２の光を持つ光源であり、クロマトグラフィー試験片５３の全体を照明するように配置されている。５５はイメージセンサであり、クロマトグラフィー試験片５３の全体を撮像できるようにイメージセンサ５５上に結像するためのレンズ５４が配置されている。

図５の構成としたことで、クロマトグラフィー試験片５３の任意の場所の吸光度を一度に測定することができ、また、光源５１と光源５２を選択的に切り替えることで、異なる２つの波長λ１およびλ２で吸光度を測定することができる。

本実施の形態２の吸光度の定義は、実施の形態１とは異なる。すなわち、イメージセンサ５５の任意の画素における吸光度Ａは、その画素の画素値（輝度）をＩとすると、数（１０）で示される。

ここで、Ｉ₀は吸光が無いと仮定したときの画素値であり、例えば、イメージセンサ５５の分解能が８ビットである場合は、２５５である。本実施の形態で使用するクロマトグラフィー試験片５３は、実施の形態１と同様なので、説明を省略する。また、バックグラウンドを補正するための吸光度補正方法は、実施の形態１に示したフローチャート図３と同じであるので説明を省略する。ただし、数（１０）で示したように、本実施例では吸光度の定義が異なるので、図３のステップＳ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４における各吸光度は、それぞれの測定領域内の全ての画素の吸光度の平均を取るので、各々、次の数（１１）から（１６）の様に示される。

なお、吸光度Ａ１´、Ａ２´、Ｂ１´、Ｂ２´、Ｃ１およびＣ２は、それぞれの測定領域内の一部の領域の画素の吸光度の平均としてもよい。また、ステップＳ１は、図３に示した一連のフローチャートの中には入れず、予め実験的に求めた吸光度をＡ１´およびＡ２´を使用しても良い。同様に、ステップＳ２も予め実験的に求めた吸光度をＢ１´およびＢ２´を使用してもよい。なお、図３のステップＳ１、ステップＳ２、およびステップＳ３は必ずしも図の通りの順序で行う必要は無く、異なる順序で行っても良い。

また、本実施例では、各測定領域の吸光度を数（１０）で定義する任意の画素における吸光度Ａを基に、数（１１）、数（１２）、数（１３）、数（１４）、数（１５）、及び数（１６）により求めたが、その代わりに、次の数（２１）で定義する吸光度ＡＳを用いても良い。

ここで、ＩＳは測定領域内の全ての画素値（輝度）の平均である。また、Ｉ０は数（１０）における定義と同様に吸光が無いと仮定したときの画素値である。

本発明にかかるクロマトグラフィー測定方法は、バックグラウンドを補正した吸光度を求めることができるため、血液等の吸光成分が存在する検体を前処理することなく、そのまま使用して検体中の成分濃度を測定することができるので、高精度なクロマトグラフィー測定方法として有用である。

本発明の実施例１におけるクロマトグラフィー測定装置の構成図本発明の実施例１におけるクロマトグラフィー試験片の平面図本発明の実施例１におけるクロマトグラフィー測定方法のフローチャート本発明の実施例１における測定波長と吸光度の相関図本発明の実施例２におけるクロマトグラフィー測定装置の構成図従来のクロマトグラフィー測定装置の構成図

符号の説明

１、３光源
２、４レンズ
５入射光
６クロマトグラフィー試験片
７光検出器
８散乱光
２１多孔質担体
２２導入部
２３標識部
２４判定部
５１、５２光源
５３クロマトグラフィー試験片
５４レンズ
５５イメージセンサ
１０１光源
１０２レンズ
１０３入射光
１０４クロマトグラフィー試験片
１０５散乱光
１０６光検出器

Claims

測定すべき試料を点着する導入部と標識物質を配置した標識部と前記試料の吸光度を測定する呈色部から成るクロマトグラフィー試験片の前記導入部に前記試料を点着する点着工程と、
前記標識部に前記試料が流入する前に第１の波長での前記標識部の第１の吸光度と前記第２の波長での前記標識部の第２の吸光度を測定する標識部吸光度測定工程と、
前記第１の波長での前記導入部の第１の吸光度と前記第２の波長での前記導入部の第２の吸光度を測定する導入部吸光度測定工程と、
前記呈色部に前記試料が流入した後に前記第１の波長での前記呈色部の第１の吸光度と前記第２の波長での前記呈色部の第２の吸光度を測定する呈色部吸光度測定工程と、
前記標識部吸光度測定工程と導入部吸光度測定工程と呈色部吸光度測定工程を用いて前記試料の前記第１と第２の波長吸光度を補正する吸光度補正工程と、から成るクロマトグラフィー測定方法。
前記標識部吸光度測定工程に代えて、予め測定した前記第１の波長での前記試料の第１の吸光度と予め測定した前記第２の波長での前記試料の第２の吸光度とを記憶し、前記吸光度補正工程で前記第１と第２の吸光度を出力する標識部出力工程とを備えた、請求項１に記載のクロマトグラフィー測定方法。
前記導入部吸光度測定工程に代えて、予め測定した前記第１の波長での前記試料の第１の吸光度と予め測定した前記第２の波長での前記試料の第２の吸光度とを記憶し、前記吸光度補正工程で前記第１と第２の吸光度を出力するバックグラウンド出力工程とを備えた、請求項１に記載のクロマトグラフィー測定方法。
前記吸光度補正工程で補正された前記第１と第２の波長吸光度から前記試料の濃度を算出する濃度算出工程とを備えた、請求項１、請求項２、および請求項３のいずれかに記載のクロマトグラフィー測定方法。
前記吸光度補正工程は、前記標識部の第２の吸光度を前記標識部の第１の吸光度で除して得た第１の定数と、前記導入部の第２の吸光度と前記導入部の第１の吸光度で除して得た第２の定数とを演算する定数演算工程とを備えた、請求項１に記載のクロマトグラフィー測定方法。
前記吸光度補正工程は、前記定数演算工程から得た演算結果と前記記呈色部の第１の吸光度と前記呈色部の第２の吸光度を用いて前記第１と第２の波長吸光度を補正する吸光度補正演算工程とを備えた、請求項５に記載のクロマトグラフィー測定方法。
前記吸光度補正演算工程は、ａを前記第１の定数とし、ｂを前記第２の定数とした時、前記第１の波長での吸光度Ａ１と前記第２の波長での吸光度Ａ２を、各々（１）および（２）式を用いて演算する請求項６に記載のクロマトグラフィー測定方法。但し、ａは前記第１の定数であり、ｂは前記第２の定数であり、Ｃ１は前記記呈色部の第１の吸光度であり、Ｃ２は、前記呈色部の第２の吸光度とする。
前記標識物質が金コロイドである請求項１に記載のクロマトグラフィー測定方法。
前記試料のバックグラウンドとなる物質がヘモグロビンである請求項１に記載のクロマトグラフィー測定方法。