JP2008266192A - 新規蛍光化合物およびそれを用いた細胞内コレステロールの検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
以下、これまで開発されている蛍光性コレステロールおよびそれらの問題点を示す。デヒドロエルゴステロール(下記化合物A)はコレステロールに分子構造が類似しているため内因性コレステロールに近い性質を有する。しかしながら,蛍光強度が弱いため精度の高い解析が困難である。Molecular Probes社(米国)において、コレステロールの3位のヒドロキシル基をエステル化して蛍光団を組み込んだ化合物(下記化合物B)が販売されている。しかしながら、細胞内に存在するコレステロールは3位のヒドロキシル基が遊離して存在しており、細胞内コレステロールの動態解析には不向きである。また、同社はコレステロールの22位にニトロベンゾフラザンを置換した化合物(下記化合物C)を市販している。しかしながら、化合物Cはミトコンドリアの膜に特異的に集積してしまいコレステロールの性質を保持していないことが報告されている[非特許文献1]。近年、コレステロールの7位にダンシルヒドラゾンを結合させた化合物(下記化合物D)が開発されている。Dは内因性コレステロールの性質に近いことが報告されており、蛍光性コレステロールアナログとして使用されている[非特許文献2]。
本発明の化合物は、以下の一般式(I)で表される。
この中では、nが2であり、mが0である、下記の化合物が特に好ましい。
特に、本発明の化合物は、細胞内に取り込まれ、コレステロールと同様の挙動を示すため、細胞内コレステロールの検出に好適に使用することができる。
検出対象の細胞の種類は特に制限されないが、コレステロールを蓄積する培養細胞が好ましい。
細胞に化合物を添加する場合、本発明の化合物を単独で添加してもよいし、同化合物の溶解を助ける働きをする他の化合物とともに添加してもよい。
本発明の化合物を単独で添加する場合、例えば、同化合物をDMSOなどに溶解させることができる。また、本発明の化合物を水に溶解しやすくするため、methyl-β-cyclodextrinとともに水溶液にしてもよい。
本発明の化合物は培養細胞の培地中に加えることができるが、その濃度は細胞の種類によっても異なるが、好ましくは、0.5μM〜50μMである。
蛍光顕微鏡などの蛍光測定装置を使用することによって本発明の化合物による蛍光を検出することができる。
なお、本発明の化合物を認識する抗体を用いて検出することも可能である。そのような抗体としては、本発明の化合物に含まれるダンシル基に対する抗体が挙げられる。
1-ダンシルスルホンアミド-2-アミノエタン(1)
ダンシルクロリド(312 mg, 1.16 mol)を無水ジクロロメタン(8 ml)に溶解させ,エチレンジアミン(0.4 ml, 6 mmol)を加え,室温で1時間攪拌した。反応液にジクロロメタン(100 ml)加え,水で2回洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させエバポレーターで減圧乾固させた(収量:320 mg, 収率:94 %)。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT):δ8.56-7.18 (6H, m, Ar-H of naphthalene), 5.78
(1H, s, -C(=O)-NH-), 5.30 (1H, m, -C=H-CH2-), 3.53 (1H, m, -CH2-C(OH)H-CH2-), 3.30-3.01 (4H, m, -NH-CH2-CH2-NH-), 2.89 (6H, s, -N(CH3)2), 2.23-0.68 (34H, m, cholesterol moiety)
図1にDCho6(前出の化合物D),DCho24のエタノール中における吸収および蛍光スペクトルを示す。これらの化合物は,ダンシル基を有しているため,340nm付近に吸収極大波長を示す。蛍光極大波長は,DCho6では527nm,DCho24では526nmであり,いずれも緑色蛍光が観測される。蛍光量子収率(Φf)は,DCho6では0.52,DCho24では0.59である。DCho24は,DCho6よりも蛍光量子収率が大きいため,蛍光顕微鏡下での観測に有利である。
マウス膵β細胞由来MIN6細胞に75μM(溶媒DMSO)でdansyl-cholesterol probe (DCho6, DCho24)を添加して、5分、30分、1時間、2時間培養し、蛍光顕微鏡で各プローブの自家蛍光を観察した。その結果、図2に示されるように、DCho24は細胞内に取り込まれ、公知のコレステロールプローブであるDCho6よりも強い蛍光を示すことがわかった。
結果を図4に示す。細胞内コレステロールはエステル化され脂質滴に貯えられるため、ナイルレッドで染色されるが、DCho24も同様の局在を示した。
チャイニーズハムスター卵巣由来CHO細胞に10 μg/mlで種々の蛍光プローブ(DCho6, DCho24, dehydroergosterol (DHE), 22-NBD-cholesterol (NBD-chol), 7-ketocholesterol)を添加して培養し、24時間後に蛍光プローブ非存在下(control)との細胞毒性(アポトーシス)を比較した。具体的には、添加24時間後に、Hoechst 33342 (HO342)とPI試薬(プロピジウムアイオダイド)でアポトーシスが起こっている細胞数をカウントとした。HO342 はUV励起可能な核酸染色色素で青色蛍光を示し、アポトーシス細胞の凝縮された核では特に明るい蛍光を発する。一方、PI は原形質膜が損傷している細胞にのみ取り込まれる。このふたつの核酸染色剤を同時に使用した時の染色パターンから、健康な細胞群、アポトーシス細胞群、死細胞群を蛍光顕微鏡法で区別し、カウントした。
なお、DHE, NBD-cholは既存のコレステロール類似蛍光試薬である。7-ketocholesterolはアポトーシスのコントロールとして加えた。
結果を図6に示した。グラフのバーが大きいほど細胞毒性が高いことを示す。
その結果、DCho24は既存の蛍光プローブよりも細胞毒性が少ないことがわかった。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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CN103265651A (zh) * | 2013-06-09 | 2013-08-28 | 江南大学 | 一种环糊精胆固醇酰胺的制备方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000506491A (ja) * | 1995-08-19 | 2000-05-30 | ノージン リミテッド | 胆汁酸誘導体の使用 |
JP2004277312A (ja) * | 2003-03-14 | 2004-10-07 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 蛍光標識ステロイド化合物及びその製造方法 |
WO2007022089A2 (en) * | 2005-08-15 | 2007-02-22 | The Scripps Research Institute | Methods to identify therapeutic agents useful for treating and preventing atherosclerosis by counteracting the effect of cholesterol ozonation products |
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2007
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000506491A (ja) * | 1995-08-19 | 2000-05-30 | ノージン リミテッド | 胆汁酸誘導体の使用 |
JP2004277312A (ja) * | 2003-03-14 | 2004-10-07 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 蛍光標識ステロイド化合物及びその製造方法 |
WO2007022089A2 (en) * | 2005-08-15 | 2007-02-22 | The Scripps Research Institute | Methods to identify therapeutic agents useful for treating and preventing atherosclerosis by counteracting the effect of cholesterol ozonation products |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN6012047520; 吉原利忠ら: 分子構造総合討論会講演要旨集 , 2006, p.2P080 * |
JPN6012047521; DESFOSSES,B. et al: 'Interaction between rat alpha1-fetoprotein and fluorescent derivatives of estrone in relation to the' Journal of Steroid Biochemistry Vol.19, No.6, 1983, p.1811-16 * |
JPN6012047522; CRAWFORD,J.M. et al: 'Physical and biological properties of fluorescent dansylated bile salt derivatives: the role of ste' Biochimica et Biophysica Acta, Lipids and Lipid Metabolism Vol.1085, No.2, 1991, p.223-34 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011184374A (ja) * | 2010-03-09 | 2011-09-22 | Gunma Univ | 新規蛍光化合物およびそれを用いた細胞内コレステロールの検出方法 |
CN103265651A (zh) * | 2013-06-09 | 2013-08-28 | 江南大学 | 一种环糊精胆固醇酰胺的制备方法 |
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