JP2008249367A - Evaluation method of immune competence, and kit for evaluating immune competence - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は免疫能の評価方法及び免疫能評価用キットに関し、さらに詳細には、精度管理が容易で生体の免疫能をより正確かつ簡便に評価することができる免疫能の評価方法、及び該方法に用いるための免疫能評価用キットに関する。 The present invention relates to a method for evaluating immunity and a kit for evaluating immunity, and more particularly, an immunity evaluation method capable of accurately and simply evaluating immunity of a living body, and accuracy control, and the method The present invention relates to a kit for evaluating immunity for use in medical treatment.
生体内にウイルスや細菌などの抗原（非自己）が侵入したり、生体内でがん細胞が発生した場合には、生体は抗原やがん細胞を排除するために多様な生体反応を引き起こす。この抗原等に対して起こる一連の生体反応が免疫応答であり、その強さ、すなわち免疫能がいわゆる抵抗力に直接関連している。すなわち、ヒトの免疫能を正確に評価することは、感染症や発ガンを予防する上での指標として極めて重要である。この免疫能については、生体の免疫応答が複雑であるために多方面から評価する必要がある。 When antigens (non-self) such as viruses or bacteria enter the living body or cancer cells are generated in the living body, the living body causes various biological reactions in order to eliminate the antigens and cancer cells. A series of biological reactions that occur against this antigen and the like is an immune response, and its strength, that is, immunity is directly related to so-called resistance. In other words, accurate evaluation of human immunity is extremely important as an index for preventing infections and carcinogenesis. The immune ability needs to be evaluated from various aspects because the immune response of the living body is complicated.
ヒトの免疫能の評価方法としては、被検者の末梢血から得た免疫担当細胞のナチュラルキラー活性（ＮＫ活性）を指標とする方法が従来から広く採用されている。具体的には「細胞障害性試験」と呼ばれる手法で行われており、被検者から採取した末梢血を遠心分離して得た末梢血単核細胞をエフェクター細胞とし、該エフェクター細胞を標的となるがん細胞（ターゲット細胞）と接触させ、ターゲット細胞に対する細胞障害性を細胞内に取り込ませた51Ｃｒ等の遊離をもって評価するものである。 As a method for evaluating human immunity, a method using as an index the natural killer activity (NK activity) of immunocompetent cells obtained from the peripheral blood of a subject has been widely employed. Specifically, it is performed by a technique called “cytotoxicity test”, and peripheral blood mononuclear cells obtained by centrifuging peripheral blood collected from a subject are used as effector cells, and the effector cells are targeted. It is evaluated by the release of 51 Cr or the like that is brought into contact with a target cancer cell and the cytotoxicity against the target cell is taken into the cell.
一方で、細胞障害性試験については、精度管理の難しさと操作の煩雑さが指摘されている。すなわち測定結果のばらつきが大きく、複数の条件を設定して試験を行う必要がある。そもそも細胞障害性試験で得られたＮＫ活性の値が被検者の免疫能を正しく反映しているのか、との指摘さえある。また、51Ｃｒ等の放射性物質を用いることが多く、専用の取扱い施設が必要となり、かつ作業者の安全性にも不安が残る。このような背景の下、ヒトの免疫能をより正確かつ簡便に評価するための技術開発が進められている。特許文献１には、殺細胞活性分子であるグラニュライシン、パーフォリン、あるいはグランザイムＢの免疫担当細胞における発現量を指標として、被検者の免疫状態を確認する方法が開示されている。
On the other hand, regarding the cytotoxicity test, it is pointed out that the accuracy control is difficult and the operation is complicated. That is, the measurement results vary greatly, and it is necessary to set a plurality of conditions for testing. In the first place, it is even pointed out that the value of NK activity obtained in the cytotoxicity test correctly reflects the immunity of the subject. In addition, radioactive materials such as 51 Cr are often used, and a dedicated handling facility is required, and the safety of workers remains uneasy. Under such a background, technical development for more accurately and simply evaluating human immunity has been underway.
なお臨床検査の現場において、検査体制が整っている施設では採血後ただちに細胞障害性試験を行うことができるが、そうでない施設では外部の検査機関に試験を依頼することになる。この際、採血から試験開始までに２４時間以上経過していることも少なくない。
前述のように、ヒトの免疫能を正確に把握するためには、多方面から評価する必要がある。そのためには、従来とは異なった方面から免疫能を評価する方法であって且つ精度管理が容易な技術が求められる。本発明の目的は、精度管理が容易で、生体の免疫能をより正確かつ簡便に評価することができる免疫能の評価方法等を提供することにある。 As described above, in order to accurately grasp human immunity, it is necessary to evaluate from various aspects. For this purpose, there is a need for a technique that is a method for evaluating immunity from a direction different from the prior art and that allows easy precision control. An object of the present invention is to provide a method for evaluating immunity and the like, which can be easily managed in accuracy and can more accurately and easily evaluate immunity of a living body.
本発明者らは、従来の細胞障害性試験における精度管理の難しさの一要因として、採血から試験開始までの経過時間が影響しているのではないかと考えた。すなわち、細胞障害性試験はターゲット細胞に対する細胞障害性を直接みるものであり、エフェクター細胞の成育状態（例えば、保存状態）が試験結果に影響することが予想された。そこで、採血からの経過時間とＮＫ活性との関係について実際に実験を行って調査した。その結果、時間の経過とともにＮＫ活性が減少しており、しかもその減少の度合いが予想を上回るほど大きいものであることを確認した。検体によっては２４時間経過時で５０％以下まで減少している例も見られた。さらに、検体ごとの減少度合いのばらつきが大きく、外挿も困難であった。これにより、従来の細胞障害性試験によるＮＫ活性をもって免疫能を正確に評価するためには、採血直後の新鮮な検体を用いて試験を行う必要があることが強く示唆された。 The present inventors thought that the elapsed time from blood collection to the start of the test had an effect as one factor in the difficulty of accuracy control in the conventional cytotoxicity test. That is, the cytotoxicity test directly looks at cytotoxicity against the target cell, and it was predicted that the growth state (for example, preservation state) of the effector cell affects the test result. Therefore, an experiment was actually conducted to investigate the relationship between the elapsed time from blood collection and NK activity. As a result, it was confirmed that the NK activity decreased with the passage of time, and that the degree of decrease exceeded the expectation. Some specimens were reduced to 50% or less after 24 hours. Furthermore, the variation in the degree of decrease for each specimen was large, and extrapolation was difficult. This strongly suggests that it is necessary to perform a test using a fresh specimen immediately after blood collection in order to accurately evaluate immune ability with NK activity by a conventional cytotoxicity test.
そこで本発明者らは、採血からある程度の時間が経過した検体を用いても正確な免疫能の評価ができる技術の開発を目指し、鋭意研究を行った。その結果、末梢血単核細胞の表面抗原の違いによる亜分類に着目することにより、採血からの時間経過の影響を受けず、且つばらつきも小さい免疫能の評価方法を確立することに成功した。さらに、該評価方法を簡便に行うためのキットを構築し、本発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。 Therefore, the present inventors have conducted intensive research with the aim of developing a technique that can accurately evaluate immune ability even when using a sample after a certain amount of time has passed since blood collection. As a result, by focusing on the sub-classification of peripheral blood mononuclear cells according to the difference in surface antigen, the inventors succeeded in establishing a method for evaluating immune ability that is not affected by the passage of time since blood collection and has little variation. Furthermore, a kit for simply carrying out the evaluation method was constructed, and the present invention was completed. That is, the gist of the present invention is as follows.
請求項１に記載の発明は、生体から単離された末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比を指標として、前記生体の免疫能を評価することを特徴とする免疫能の評価方法である。
The invention according to
また請求項２に記載の発明は、生体から単離された末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率を指標として、前記生体の免疫能を評価することを特徴とする免疫能の評価方法である。
The invention according to
免疫担当細胞は、発現している表面抗原の種類によって亜分類されている。表面抗原の種類としては、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２５等があり、ＣＤ４を発現している細胞（ＣＤ４＋細胞）はヘルパーＴ細胞、ＣＤ８を発現している細胞（ＣＤ８＋細胞）はキラーＴ細胞、ＣＤ４とＣＤ２５の両方を発現している細胞（ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞）は制御性Ｔ細胞に相当する。そして、本発明の免疫能の評価方法では、生体から単離された末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比（請求項１）、あるいはＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率（請求項２）を指標として、生体の免疫能を評価する。本発明の免疫能の評価方法では、表面抗原の種類によって分類された特定の細胞集団の数比をもって評価するので、検体となる末梢血単核細胞が生きてさえおればよく、その成育状態の影響を受けない。そのため、末梢血単核細胞が生きている限りにおいて採血から試験開始までの経過時間の影響を受けることはなく、精度管理が容易で、外部の検査機関にて試験を行う場合でも正確に免疫能の評価を行うことができる。さらに、末梢血単核細胞の分類については、例えばフローサイトメトリーによって簡単に行うことができるので、操作が簡便であり、多数の検体を一度に処理することができる。またさらに、放射性物質を使う必要がないので、専用の施設も不要である。 Immunocompetent cells are subclassified according to the type of surface antigen that is expressed. The types of surface antigens include CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD25 and the like. Cells expressing CD4 (CD4 + cells) are helper T cells, cells expressing CD8 (CD8 + cells) are Killer T cells, cells expressing both CD4 and CD25 (CD4 + .CD25 + cells) correspond to regulatory T cells. In the method for evaluating immunity according to the present invention, the ratio of the number of CD4 + cells to the number of CD8 + cells in a population of peripheral blood mononuclear cells isolated from a living body (Claim 1) or CD4 + · CD25 + cells The immunity of the living body is evaluated using the ratio of the numbers (claim 2) as an index. In the method for evaluating immunity according to the present invention, the evaluation is performed based on the ratio of the number of specific cell populations classified according to the type of surface antigen. Not affected. Therefore, as long as the peripheral blood mononuclear cells are alive, they are not affected by the elapsed time from blood collection to the start of the test, are easy to control the accuracy, and are accurate even when testing in an external laboratory. Can be evaluated. Furthermore, since the classification of peripheral blood mononuclear cells can be easily performed by, for example, flow cytometry, the operation is simple and a large number of specimens can be processed at a time. Furthermore, since there is no need to use radioactive materials, no dedicated facilities are required.
なお、「ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比」は、例えば「ＣＤ４＋細胞の数／ＣＤ８＋細胞の数」やその逆数「ＣＤ８＋細胞の数／ＣＤ４＋細胞の数」をもって表現することができる。あるいは、単に「ＣＤ４＋細胞の数：ＣＤ８＋細胞の数」で表現してもよい。同様に、「末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率」は、例えば、「ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数／末梢血単核細胞の全数」で表現することができる。これらは、いずれもフローサイトメトリーによって簡単に測定および算出することができる。 The “ratio between the number of CD4 + cells and the number of CD8 + cells” can be expressed by, for example, “the number of CD4 + cells / the number of CD8 + cells” or its inverse “the number of CD8 + cells / the number of CD4 + cells”. . Alternatively, it may be expressed simply as “number of CD4 + cells: number of CD8 + cells”. Similarly, the “ratio of the number of CD4 + · CD25 + cells in the population of peripheral blood mononuclear cells” can be expressed, for example, as “number of CD4 + · CD25 + cells / total number of peripheral blood mononuclear cells”. All of these can be easily measured and calculated by flow cytometry.
請求項３に記載の発明は、ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比あるいはＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率を、予め設定された基準値と比較することにより、前記生体の免疫能を評価することを特徴とする請求項１又は２に記載の免疫能の評価方法である。
In the invention according to
本発明の免疫能の評価方法では、予め基準値を設定しておき、ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比あるいはＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率を当該基準値と比較して免疫能を評価する。かかる構成により、より正確に免疫能の評価を行うことができる。 In the method for evaluating immunity according to the present invention, a reference value is set in advance, and the ratio of the number of CD4 + cells to the number of CD8 + cells or the ratio of the number of CD4 + · CD25 + cells is compared with the reference value. To evaluate. With this configuration, it is possible to more accurately evaluate immunity.
請求項４に記載の発明は、前記基準値は、生体から単離された直後の末梢血単核細胞におけるナチュラルキラー活性との相関性を有する値であることを特徴とする請求項３に記載の免疫能の評価方法である。
The invention according to
細胞障害性試験によるナチュラルキラー活性（ＮＫ活性）測定については、試験を採血直後に行えば、その測定結果は生体の免疫状態を正確に反映していると考えられる。そして本発明の免疫能の評価方法では、基準値として生体から単離された直後の末梢血単核細胞におけるＮＫ活性との相関性を有する値を採用する。かかる構成により、さらに正確に免疫能の評価を行うことができる。 Regarding the measurement of natural killer activity (NK activity) by the cytotoxicity test, if the test is performed immediately after blood collection, the measurement result is considered to accurately reflect the immune state of the living body. In the method for evaluating immunity of the present invention, a value having a correlation with NK activity in peripheral blood mononuclear cells immediately after being isolated from a living body is adopted as a reference value. With this configuration, it is possible to more accurately evaluate immunity.
請求項５に記載の発明は、請求項１に記載の免疫能の評価方法に用いるための免疫能評価用キットであって、ＣＤ４＋細胞に特異的な抗体と、ＣＤ８＋細胞に特異的な抗体とを含むことを特徴とする免疫能評価用キットである。
The invention according to
本発明は上述の免疫能の評価方法に用いるための免疫能評価用キットにかかるものであり、ＣＤ４＋細胞に特異的な抗体とＣＤ８＋細胞に特異的な抗体とを含む。本発明の免疫能評価用キットによれば、生体から単離した末梢血単核細胞の集団をフローサイトメトリーに供する際にＣＤ４＋細胞ならびにＣＤ８＋細胞の分類を簡便に行うことができる。その結果、「ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比」をきわめて簡便に測定および算出することができる。 The present invention relates to an immune capacity evaluation kit for use in the above-described evaluation method of immune capacity, and includes an antibody specific for CD4 + cells and an antibody specific for CD8 + cells. According to the kit for evaluating immunity of the present invention, CD4 + cells and CD8 + cells can be easily classified when a population of peripheral blood mononuclear cells isolated from a living body is subjected to flow cytometry. As a result, the “ratio between the number of CD4 + cells and the number of CD8 + cells” can be measured and calculated very simply.
請求項６に記載の発明は、さらにＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞に特異的な抗体を含むことを特徴とする請求項５に記載の免疫能評価用キットである。
The invention described in claim 6 is the kit for evaluating immune capacity according to
かかる構成により、「末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率」をもきわめて簡便に測定および算出することができる免疫能評価用キットが提供される。 With this configuration, an immunological ability evaluation kit is provided that can measure and calculate the “ratio of the number of CD4 + · CD25 + cells in a population of peripheral blood mononuclear cells” very simply.
請求項７に記載の発明は、請求項２に記載の免疫能の評価方法に用いるための免疫能評価用キットであって、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞に特異的な抗体を含むことを特徴とする免疫能評価用キットである。
The invention according to claim 7 is an immune capacity evaluation kit for use in the method for evaluating immune capacity according to
本発明は上述の免疫能の評価方法に用いるための免疫能評価用キットにかかるものであり、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞に特異的な抗体とを含む。本発明の免疫能評価用キットによれば、生体から単離した末梢血単核細胞の集団をフローサイトメトリーに供する際にＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の分類を簡便に行うことができる。その結果、「末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率」をきわめて簡便に測定および算出することができる。 The present invention relates to a kit for evaluating immunity for use in the above-described method for evaluating immunity, and includes an antibody specific for CD4 + / CD25 + cells. According to the kit for evaluating immunity of the present invention, CD4 + / CD25 + cells can be easily classified when a population of peripheral blood mononuclear cells isolated from a living body is subjected to flow cytometry. As a result, the “ratio of the number of CD4 + · CD25 + cells in the peripheral blood mononuclear cell population” can be measured and calculated very simply.
請求項８に記載の発明は、さらにＣＤ４＋細胞に特異的な抗体とＣＤ８＋細胞に特異的な抗体と含むことを特徴とする請求項７に記載の免疫能評価用キットである。
The invention according to
かかる構成により、「ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比」をもきわめて簡便に測定および算出することができる免疫能評価用キットが提供される。 With such a configuration, a kit for evaluating immunity is provided that can measure and calculate the “ratio between the number of CD4 + cells and the number of CD8 + cells” very simply.
本発明の免疫能の評価方法によれば、末梢血単核細胞が生きている限りにおいて採血から試験開始までの経過時間の影響を受けることはなく、精度管理が容易で、外部の検査機関にて試験を行う場合でも正確に免疫能の評価を行うことができる。さらに、末梢血単核細胞の分類については、フローサイトメトリーによって簡単に行うことができるので、操作が簡便であり、多数の検体を一度に処理することができる。またさらに、放射性物質を使う必要がないので、専用の施設も不要である。 According to the method for evaluating immunity of the present invention, as long as the peripheral blood mononuclear cells are alive, they are not affected by the elapsed time from the blood collection to the start of the test, the accuracy control is easy, and the Thus, even when the test is conducted, the immune ability can be accurately evaluated. Furthermore, since the peripheral blood mononuclear cells can be easily classified by flow cytometry, the operation is simple and a large number of specimens can be processed at one time. Furthermore, since there is no need to use radioactive materials, no dedicated facilities are required.
本発明の免疫能の評価用キットによれば、本発明の免疫能の評価方法をきわめて簡便に行うことができる。 According to the kit for evaluating immunity of the present invention, the method for evaluating immunity of the present invention can be carried out very simply.
本発明の免疫能の評価方法の１つの様相は、生体から単離された末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比を指標として、前記生体の免疫能を評価する免疫能の評価方法である。また、本発明の免疫能の評価方法の他の様相は、生体から単離された末梢血単核細胞の集団におけるＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率を指標として、前記生体の免疫能を評価する免疫能の評価方法である。 One aspect of the method for evaluating immunity of the present invention is to determine the immunity of the living body using the ratio of the number of CD4 + cells to the number of CD8 + cells in the population of peripheral blood mononuclear cells isolated from the living body as an index. It is the evaluation method of the immune ability to evaluate. Another aspect of the method for evaluating immunity of the present invention is to evaluate the immunity of the living body using as an index the ratio of the number of CD4 + / CD25 + cells in the population of peripheral blood mononuclear cells isolated from the living body. It is a method for evaluating immunity.
本発明の免疫能の評価方法では、生体から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を検体とする。ＰＢＭＣの単離方法としては、公知の方法をそのまま用いることができ、例えば、ヘパリン採血した全血を比重遠心分離に供することにより、単離することができる。採血からＰＢＭＣを単離するまでの時間については、ＰＢＭＣが生存状態で保持できる条件下で血液が保存されていれば特に制限はなく、採血直後にＰＢＭＣを単離することは必須でない。むしろ作業性を考慮すると、採血した血液を適切な条件下で一旦保存し、その後にＰＢＭＣを単離することが好ましい。血液の保存方法としては、臨床検査の分野で採用されている方法がそのまま適用でき、例えば、ヘパリン共存下で室温保存または冷蔵保存することができる。 In the method for evaluating immunity of the present invention, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from a living body are used as specimens. As a method for isolating PBMC, a known method can be used as it is, and for example, it can be isolated by subjecting whole blood collected from heparin to specific gravity centrifugation. The time from blood collection to isolation of PBMC is not particularly limited as long as the blood is stored under conditions where PBMC can be maintained in a viable state, and it is not essential to isolate PBMC immediately after blood collection. Rather, in consideration of workability, it is preferable to store the collected blood once under appropriate conditions and then isolate PBMC. As a blood storage method, a method employed in the field of clinical examination can be applied as it is, and for example, it can be stored at room temperature or refrigerated in the presence of heparin.
本発明の免疫能の評価方法では、単離されたＰＢＭＣの集団における「ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比」あるいは「ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率」といったパラメータを指標とする。これらのパラメータについては、例えば、単離したＰＢＭＣをフローサイトメトリーに供することにより、容易に得ることができる。この際、ＰＢＭＣの各表面抗原に特異的な抗体とＰＢＭＣの集団とを接触させることにより、ＰＢＭＣを表面抗原の種類に従って分類する。すなわち、ＣＤ４＋細胞に特異的な抗体とＣＤ８＋細胞に特異的な抗体とを用いることにより、ＣＤ４＋細胞の数の比率（％）とＣＤ８＋細胞の数の比率（％）を測定することができ、「単離されたＰＢＭＣの集団におけるＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比」を得ることができる。また、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞に特異的な抗体を用いることにより、「単離されたＰＢＭＣの集団におけるＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率（％）」を測定することができる。なお、これらの抗体についてはすでに取得されており、市販もされている。ケーラーとミルシュタインの方法等の公知技術で自家調製してもよい。 In the method for evaluating immunity of the present invention, a parameter such as “ratio between the number of CD4 + cells and the number of CD8 + cells” or “ratio of the number of CD4 + · CD25 + cells” in an isolated PBMC population is used as an index. These parameters can be easily obtained, for example, by subjecting isolated PBMC to flow cytometry. At this time, by contacting an antibody specific for each surface antigen of PBMC with a population of PBMC, the PBMC are classified according to the type of the surface antigen. That is, by using an antibody specific for CD4 + cells and an antibody specific for CD8 + cells, the ratio (%) of the number of CD4 + cells and the ratio (%) of the number of CD8 + cells can be measured. The ratio of the number of CD4 + cells to the number of CD8 + cells in the isolated PBMC population can be obtained. Furthermore, by using an antibody specific for CD4 + · CD25 + cells, the “ratio (%) of the number of CD4 + · CD25 + cells in the isolated PBMC population” can be measured. These antibodies have already been acquired and are commercially available. It may be self-prepared by a known technique such as the method of Kohler and Milstein.
好ましい実施形態では、上記した「ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比」あるいは「ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率」を、予め設定された基準値と比較することにより、生体の免疫能を評価する。すなわち、生体から単離された直後のＰＢＭＣ、換言すれば、採血直後のＰＢＭＣを検体とする場合には、細胞障害性試験によるＮＫ活性をもって生体の免疫能を正確に評価することができる。そこで、正確な免疫能を反映しているＮＫ活性との相関性を有する基準値を採用することにより、本発明による免疫能の評価をきわめて正確に行うことができる。当該基準値は、採血直後のＰＢＭＣを用いてＮＫ活性と各パラメータ（ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比、並びに、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率）の測定を行い、ＮＫ活性と各パラメータとの相関データから選択すればよい。例えば、２０％のＮＫ活性に相当する各パラメータの値を基準値として採用すればよい。なお、ＮＫ活性と各パラメータとは負の相関を示すので、２０％のＮＫ活性に相当する基準値を仮にＡとするとき、「ＮＫ活性２０％以上」の状態であれば各パラメータはＡ以下の値を示す。
In a preferred embodiment, the above-mentioned “ratio between the number of CD4 + cells and the number of CD8 + cells” or “ratio of the number of CD4 + · CD25 + cells” described above is compared with a preset reference value, so To evaluate. That is, when PBMC immediately after being isolated from a living body, in other words, PBMC immediately after blood collection is used as a specimen, the immunity of the living body can be accurately evaluated with NK activity by a cytotoxicity test. Therefore, by adopting a reference value having a correlation with NK activity that reflects accurate immunity, immunity evaluation according to the present invention can be performed very accurately. The reference value is determined by measuring NK activity and each parameter (ratio between the number of CD4 + cells and the number of CD8 + cells and the ratio of the number of CD4 + · CD25 + cells) using PBMC immediately after blood collection. What is necessary is just to select from the correlation data with each parameter. For example, the value of each parameter corresponding to 20% NK activity may be adopted as the reference value. In addition, since NK activity and each parameter show a negative correlation, if the reference value corresponding to 20% NK activity is A, each parameter is A or less if it is in the state of “
上記基準値については、多数の被検者から収集した値を元に設定すれば、ユニバーサルな値となり、集団検診等の際に有用である。一方、被検者ごとに固有の基準値を設定してもよく、この際には、当該被検者の免疫能をモニタリングするのに有用である。 About the said reference value, if it sets based on the value collected from many subjects, it will become a universal value and is useful in the case of a group medical examination etc. On the other hand, a specific reference value may be set for each subject, and in this case, it is useful for monitoring the immune ability of the subject.
本発明の免疫能測定用キットの１つの様相は、ＣＤ４＋細胞に特異的な抗体とＣＤ８＋細胞に特異的な抗体とを含むものである。また、本発明の免疫能測定用キットの他の様相は、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞に特異的な抗体を含むものである。当該抗体はポリクローナル抗体とモノクローナル抗体のいずれでもよいが、より特異性の高いモノクローナル抗体が好ましい。これらの抗体の形状については特に限定はなく、溶液状でもよいし凍結乾燥品でもよい。また、抗体以外の試薬類、例えば、ＰＢＭＣ単離用の試薬（Ficoll-paque液など）、各種の緩衝液、遠心用チューブ等をさらに含むものでもよい。なお、ＣＤ４＋細胞に特異的な抗体、ＣＤ８＋細胞に特異的な抗体、およびＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞に特異的な抗体、の計３種の抗体を含むキットであれば、「ＣＤ４＋細胞の数とＣＤ８＋細胞の数との比」と「ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の比率」の両パラメータの測定に対応可能であり、特に好ましい。 One aspect of the kit for measuring immunity of the present invention comprises an antibody specific for CD4 + cells and an antibody specific for CD8 + cells. Further, another aspect of the kit for measuring immunity of the present invention comprises an antibody specific for CD4 + / CD25 + cells. The antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody with higher specificity is preferred. The shape of these antibodies is not particularly limited, and may be a solution or a lyophilized product. Moreover, reagents other than antibodies, for example, reagents for isolating PBMC (Ficoll-paque solution, etc.), various buffers, centrifuge tubes and the like may be further included. If the kit contains a total of three antibodies, an antibody specific for CD4 + cells, an antibody specific for CD8 + cells, and an antibody specific for CD4 + / CD25 + cells, the number of CD4 + cells and CD8 + cells It is possible to cope with the measurement of both parameters of “ratio to the number of cells” and “ratio of the number of CD4 + · CD25 + cells”, which is particularly preferable.
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
１．細胞障害性試験によるＮＫ活性測定の基礎的検討
（１）エフェクター細胞の調製
文書により同意を得た健常人ボランティア８名から、安静時静脈血３５ｍＬをヘパリン入り採血管にて無菌的に採取し、５ｍＬずつ６本に分注した。そのまま室温にて静置し、０時間後（採血直後）、２時間後、５時間後、８時間後、１１時間後、および２４時間後に比重遠心分離に供し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を回収した。ＰＢＭＣの回収は以下の手順によった。
1. Basic examination of NK activity measurement by cytotoxicity test (1) Preparation of effector cells From 8 healthy volunteers who have obtained consent in writing, 35 mL of resting venous blood is aseptically collected with heparin-containing blood collection tubes, 5 mL each was dispensed into 6 bottles. Allowed to stand at room temperature, and subjected to specific gravity centrifugation after 0 hour (immediately after blood collection), 2 hours, 5 hours, 8 hours, 11 hours, and 24 hours, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Was recovered. The recovery of PBMC was performed according to the following procedure.
まず、各時間経過後（０〜２４時間）に１，５００Ｇで５分間遠心した後、バフィーコード部分を別の遠心管に回収し、ＲＰＭＩ１６４０で希釈した。パスツールピペットにてFicoll-paque液（ファルマシア社）を３〜４ｍＬ重層し、２０℃、４００Ｇで１５分間遠心し（アクセル・ブレーキなし）、Ficoll-paque液層の上に分離したＰＢＭＣ層をチューブに回収した。回収したＰＢＭＣをＰＢＳ（−）で希釈し、４℃、４５０Ｇで６分間遠心した。上清除去後、１０％仔ウシ血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０に浮遊させ、４℃、４００Ｇで５分間遠心した。上清除去後、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０に再浮遊させ、４×１０6個／ｍＬの細胞濃度になるようにＰＢＭＣを浮遊させた（エフェクター細胞浮遊液）。 First, after lapse of each time (0 to 24 hours), centrifugation was performed at 1,500 G for 5 minutes, and then the buffy cord portion was collected in another centrifuge tube and diluted with RPMI 1640. 3-4 mL of Ficoll-paque liquid (Pharmacia) is layered with a Pasteur pipette, centrifuged at 20 ° C. and 400 G for 15 minutes (without accelerator / brake), and the PBMC layer separated on the Ficoll-paque liquid layer is tubed Recovered. The recovered PBMC was diluted with PBS (−) and centrifuged at 4 ° C. and 450 G for 6 minutes. After removing the supernatant, it was suspended in RPMI 1640 containing 10% calf serum (FCS) and centrifuged at 400 G for 5 minutes at 4 ° C. After removing the supernatant, the suspension was resuspended in RPMI 1640 containing 10% FCS, and PBMC was suspended so that the cell concentration was 4 × 10 6 cells / mL (effector cell suspension).
（２）ターゲット細胞の調製
１１９ｇのＨＥＰＥＳ、５４．４ｇのＮａＣｌ、３．７３ｇのＫＣｌ、４．０７ｇのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏを８００ｍＬの精製水に溶解後、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整し、精製水にて全量１，０００ｍＬとした。この溶液をフィルター滅菌し、バッファーＡ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、９３ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）を調製した。また、１１９ｇのＨＥＰＥＳ、５４．４ｇのＮａＣｌ、３．７３ｇのＫＣｌ、４．０７ｇのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、２．９４ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、１８．０ｇのグルコースを８００ｍＬの精製水に溶解後、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整し、精製水にて全量１，０００ｍＬとした。この溶液をフィルター滅菌し、バッファーＢ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、９３ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）を調製した。
(2) Preparation of target cells 119 g of HEPES, 54.4 g of NaCl, 3.73 g of KCl, 4.07 g of MgCl 2 .6H 2 O were dissolved in 800 mL of purified water, and adjusted to pH 7.4 with 1N NaOH. The total volume was made up to 1,000 mL with purified water. This solution was sterilized by filter to prepare buffer A (50 mM HEPES, 93 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl 2, pH 7.4). In addition, 119 g of HEPES, 54.4 g of NaCl, 3.73 g of KCl, 4.07 g of MgCl 2 .6H 2 O, 2.94 g of CaCl 2 .2H 2 O, 18.0 g of glucose, 800 mL of purified water After being dissolved in the solution, the pH was adjusted to 7.4 with 1N NaOH, and the total volume was adjusted to 1,000 mL with purified water. This solution was filter sterilized to prepare buffer B (50 mM HEPES, 93 mM NaCl, 5 mM KCl, 2
３９３ｍｇのＤＴＰＡ（Titriplex V）を１０ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨに溶解し、１００ｍＭ ＤＴＰＡ溶液を調製した。次に、１．５２ｍＬの原子吸光用Ｅｕ溶液（１，０００μｇ／ｍＬ）、７．９８ｍＬのバッファーＡ、及び０．５ｍＬの１００ｍＭ ＤＴＰＡ溶液を混和し、ＨＣｌ又はＮａＯＨにてｐＨを７．４に調整してＥｕ−ＤＴＰＡ溶液を調製した。一方、５．０ｍｇのデキストラン硫酸（ファルマシア社）を１．０ｍＬのバッファーＡに溶解し、デキストラン硫酸溶液を調製した。そして、２５〜２７μＬのＥｕ−ＤＴＰＡ溶液と１００μＬのデキストラン硫酸溶液を混和し、バッファーＡにて全量を１ｍＬとしてラベリングバッファーを調製した。 393 mg of DTPA (Titriplex V) was dissolved in 10 mL of 1N NaOH to prepare a 100 mM DTPA solution. Next, 1.52 mL of atomic absorption Eu solution (1,000 μg / mL), 7.98 mL of buffer A, and 0.5 mL of 100 mM DTPA solution are mixed, and the pH is adjusted to 7.4 with HCl or NaOH. An Eu-DTPA solution was prepared by adjusting. On the other hand, 5.0 mg of dextran sulfate (Pharmacia) was dissolved in 1.0 mL of buffer A to prepare a dextran sulfate solution. Then, 25 to 27 μL of Eu-DTPA solution and 100 μL of dextran sulfate solution were mixed, and a labeling buffer was prepared using Buffer A with a total volume of 1 mL.
Ｔ−７５フラスコにて継代培養されたＫ−５６２細胞浮遊液を１５ｍＬ容チューブに移し、４℃、４００Ｇで５分間遠心した。上清除去後、３．０ｍＬのバッファーＡを加えて再浮遊させ、１．５ｍＬ容マイクロチューブ２本に分けて４℃、２，３００Ｇで３０秒間遠心した。上清除去後、バッファーＡを用いて１．５ｍＬ容マイクロチューブ１本にまとめ、４℃、２，３００Ｇで３０秒間遠心した。上清除去後、１．０ｍＬのラベリングバッファーで再浮遊させ、１５ｍＬ容チューブに移し、氷中で２０分間インキュベートした。この間、５分ごとに穏やかに撹拌した。 The K-562 cell suspension subcultured in a T-75 flask was transferred to a 15 mL tube and centrifuged at 4 ° C. and 400 G for 5 minutes. After removing the supernatant, 3.0 mL of buffer A was added to resuspend, and the cells were divided into two 1.5 mL microtubes and centrifuged at 4 ° C. and 2,300 G for 30 seconds. After removing the supernatant, it was put together into one 1.5 mL volume microtube using buffer A and centrifuged at 4 ° C. and 2,300 G for 30 seconds. After removing the supernatant, it was resuspended with 1.0 mL of labeling buffer, transferred to a 15 mL tube, and incubated on ice for 20 minutes. During this time, it was gently stirred every 5 minutes.
インキュベート終了後、４℃に冷却したバッファーＢを３．０ｍＬ加え、氷中で５分間インキュベートした。１．５ｍＬ容マイクロチューブ３本に分けて、４℃、２，３００Ｇで３０秒間遠心した。上清除去後、バッファーＢを用いて１本にまとめ、４℃、２，３００Ｇで３０秒間遠心した。再度、バッファーＢにて４℃、２，３００Ｇで３０秒間洗浄遠心した。さらに、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を用いて４℃、２，３００Ｇで３０秒間洗浄遠心を２回行い、再浮遊させて氷中で３０分間静置した。さらに、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を用いて同様に洗浄遠心を２回行った後、５×１０4個／ｍＬの細胞濃度となるように浮遊させた（ターゲット細胞浮遊液）。 After completion of the incubation, 3.0 mL of buffer B cooled to 4 ° C. was added and incubated in ice for 5 minutes. The solution was divided into three 1.5 mL microtubes and centrifuged at 4 ° C. and 2,300 G for 30 seconds. After removing the supernatant, it was combined into one using buffer B and centrifuged at 4 ° C. and 2,300 G for 30 seconds. Again, it was washed and centrifuged in buffer B at 4 ° C. and 2,300 G for 30 seconds. Further, washing and centrifugation were performed twice at 4 ° C. and 2,300 G for 30 seconds using RPMI 1640 containing 10% FCS, resuspended, and allowed to stand in ice for 30 minutes. Further, washing and centrifugation were similarly performed twice using RPMI 1640 containing 10% FCS, and then suspended so as to obtain a cell concentration of 5 × 10 4 cells / mL (target cell suspension).
（３）ＮＫ活性の測定
ターゲット細胞浮遊液を９６ウェルプレートに１００μＬずつ分注した。その上に、上記（１）で調製したエフェクター細胞浮遊液を「エフェクター細胞：ターゲット細胞」が「４０：１」または「２０：１」の比率となるように分注した。そのままプレートを５％ＣＯ2、３７℃の条件下で４時間静置した。４時間経過後、プレートのまま室温、３５０Ｇで５分間遠心した。遠心後の上清２０μＬを測定用プレートに移し、増強試薬１００μＬを分注して、放出されたＥｕ3+の量（１／１０量）をラベルカウンターにて測定した（測定値Ａ）。別途、エフェクター細胞浮遊液の代わりに１００μＬの１％トリトンＸ−１００溶液を添加したウェル（Total、測定値Ｂ）と、１００μＬの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を添加したウェル（Back、測定値Ｃ）も設定し、同時測定した。Totalはターゲット細胞を全て人工的に破壊した場合のＥｕ3+放出値、Backはターゲット細胞からの自然Ｅｕ3+放出値を測定するためのものである。
(3) Measurement of NK activity 100 μL of the target cell suspension was dispensed into a 96-well plate. Furthermore, the effector cell suspension prepared in (1) above was dispensed so that the ratio of “effector cells: target cells” was “40: 1” or “20: 1”. The plate was allowed to stand for 4 hours under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. After 4 hours, the plate was centrifuged for 5 minutes at 350 G at room temperature. 20 μL of the supernatant after centrifugation was transferred to a measurement plate, 100 μL of the enhancement reagent was dispensed, and the amount of released Eu 3+ (1/10 amount) was measured with a label counter (measurement value A). Separately, wells added with 100 μL of 1% Triton X-100 solution (Total, measured value B) instead of effector cell suspension and wells added with 100 μL of RPMI 1640 containing 10% FCS (Back, measured value C) Set and measured simultaneously. Total is for measuring the Eu 3+ release value when all the target cells are artificially destroyed, and Back is for measuring the natural Eu 3+ release value from the target cells.
以下の式（Ｉ）によりＮＫ活性（％）を算出した。
｛（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）｝×１００ （Ｉ）
NK activity (%) was calculated by the following formula (I).
{(AC) / (BC)} × 100 (I)
（４）結果
第１表ならびに図１に結果を示す。第１表と図１において、ａ〜ｈはぞれぞれ同一被検者由来の検体を示している。第１表において、各数値はＮＫ活性の測定値（％）、かっこ内の数値は０時間を１００とした場合の相対値である。図１は、ＮＫ活性と経過時間との関係を表すグラフである。すなわち、いずれの検体の場合も、採血後からＰＢＭＣの分離までに要した時間が長いほどＮＫ活性の値が減少していた。また、その減少度合いは検体によってばらつきが大きかった。例えば、２４時間経過後に５０％以下まで減少した検体（検体ｆ，ｇ）がある一方で、７５％程度に留まった検体（検体ｅ）もあり、外挿によって採血直後（０時間経過後）のＮＫ活性を推定することは困難であった。
以上より、細胞障害性試験によるＮＫ活性は、採血後からＰＢＭＣの分離までに要した時間が長いほど減少し、採血直後に測定しないと生体の正しい免疫能を反映しないことが示された。
(4) Results The results are shown in Table 1 and FIG. In Table 1 and FIG. 1, a to h indicate specimens derived from the same subject. In Table 1, each numerical value is a measured value (%) of NK activity, and a numerical value in parentheses is a relative value when 0 hour is 100. FIG. 1 is a graph showing the relationship between NK activity and elapsed time. That is, in any sample, the value of NK activity decreased as the time required from the collection of blood to the separation of PBMC was longer. In addition, the degree of decrease varied greatly from sample to sample. For example, there are specimens (specimens f, g) that have decreased to 50% or less after 24 hours, while there are specimens (specimen e) that have remained at about 75%. It was difficult to estimate NK activity.
From the above, it was shown that the NK activity by the cytotoxicity test decreases as the time required from the blood collection to the separation of PBMC decreases, and does not reflect the correct immunity of the living body unless measured immediately after blood collection.
２．フローサイトメトリーによる免疫担当細胞の亜分類
文書により同意を得た健常人ボランティア３０名を被検者とし、上記１と同様の手順で採血直後（０時間経過後）のＮＫ活性を測定した。このＮＫ活性測定値は採血直後のＰＢＭＣを用いて測定したものであるから、被検者の免疫能を正確に反映していると考えられた。
2. Subclassification of immunocompetent cells by
一方、採血直後（０時間経過後）におけるＰＢＭＣを、８種の表面抗原にそれぞれ特異的なモノクローナル抗体で染め分け、フローサイトメトリーに供して全ＰＢＭＣ数に対する各細胞の数の比率（％）を測定した。表面抗原８種の内訳は、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）、キラーＴ細胞（ＣＤ８＋）、単球（ＣＤ１４＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ１６＋・ＣＤ５６＋）、ＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋・ＣＤ１６＋・ＣＤ５６＋）、および制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋）とし、ＣＤ４＋細胞の数のＣＤ８＋細胞の数に対する比（ＣＤ４＋／ＣＤ８＋）を加えた９項目について検討した。結果を第２表に示す。 On the other hand, PBMC immediately after blood collection (after 0 hours) are stained with monoclonal antibodies specific for each of the eight surface antigens, and subjected to flow cytometry to measure the ratio (%) of the number of cells to the total number of PBMCs. did. The breakdown of 8 types of surface antigens is T cell (CD3 +), helper T cell (CD4 +), killer T cell (CD8 +), monocyte (CD14 +), B cell (CD19 +), NK cell (CD16 + / CD56 +), NKT cell Nine items including CD3 + · CD16 + · CD56 + and regulatory T cells (CD4 + · CD25 +) and a ratio of the number of CD4 + cells to the number of CD8 + cells (CD4 + / CD8 +) were examined. The results are shown in Table 2.
第２表に示す結果を元に、縦軸にＮＫ活性（４０：１）、横軸に各項目の値をプロットしたグラフ（全９種）を作成した。その結果、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋と、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋細胞の数の全ＰＢＭＣ数に対する比率（％）（以下、単に「ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋」と略記する。）の２項目が、ＮＫ活性に対して高い負の相関を示した。図２は、ＮＫ活性とＣＤ４＋／ＣＤ８＋との関係を示すグラフである。ＣＤ４＋／ＣＤ８＋については、回帰式「Ｙ＝４０．５０６−９．４１５Ｘ」、相関係数「０．８００」が得られた。図３は、ＮＫ活性とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋との関係を示すグラフである。ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋については、回帰式「Ｙ＝４９．７９５−１．３６Ｘ」、相関係数「０．７１８」が得られた。
以上より、採血直後において、ＮＫ活性とＣＤ４＋／ＣＤ８＋とは高い相関性を示し、ＮＫ活性に代わってＣＤ４＋／ＣＤ８＋を測定することで、免疫能の評価を行えることが示された。同様に、採血直後において、ＮＫ活性とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋とは高い相関性を示し、ＮＫ活性に代わってＣＤ４＋・ＣＤ２５＋を測定することで、免疫能の評価を行えることが示された。
Based on the results shown in Table 2, a graph (9 types in total) was prepared by plotting the NK activity (40: 1) on the vertical axis and the values of each item on the horizontal axis. As a result, two items of the ratio (%) of the number of CD4 + / CD8 + and the number of CD4 + · CD25 + cells to the total number of PBMCs (hereinafter simply abbreviated as “CD4 + · CD25 +”) are highly negative for NK activity. Correlation was shown. FIG. 2 is a graph showing the relationship between NK activity and CD4 + / CD8 +. For CD4 + / CD8 +, the regression equation “Y = 40.506-9.415X” and the correlation coefficient “0.800” were obtained. FIG. 3 is a graph showing the relationship between NK activity and CD4 + · CD25 +. For CD4 + · CD25 +, the regression equation “Y = 49.795-1.36X” and the correlation coefficient “0.718” were obtained.
As described above, NK activity and CD4 + / CD8 + showed a high correlation immediately after blood collection, and it was shown that immunity can be evaluated by measuring CD4 + / CD8 + instead of NK activity. Similarly, NK activity and CD4 + · CD25 + showed a high correlation immediately after blood collection, and it was shown that immunity can be evaluated by measuring CD4 + · CD25 + instead of NK activity.
なお得られた回帰式によれば、ＮＫ活性２０％（Ｙ＝２０）に対応するＣＤ４＋／ＣＤ８の値（Ｘ）は２．１７８、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋の値（Ｘ）は２１．９１％となる。したがって、通常、ＮＫ活性の値が２０％以上であるときに免疫能が正常と評価している場合には、ＣＤ４＋／ＣＤ８の値が２．１７８以下、あるいはＣＤ４＋・ＣＤ２５＋の値が２１．９１％以下という基準で同様の評価を行うことができる。
According to the obtained regression equation, the CD4 + / CD8 value (X) corresponding to
ＣＤ４＋／ＣＤ８＋とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋との関係についても検討した。図４は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋との関係を示すグラフである。ＣＤ４＋／ＣＤ８＋とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋とは高い正の相関を示した（相関係数０．８１５）。 The relationship between CD4 + / CD8 + and CD4 + · CD25 + was also examined. FIG. 4 is a graph showing the relationship between CD4 + / CD8 + and CD4 + · CD25 +. CD4 + / CD8 + and CD4 + · CD25 + showed a high positive correlation (correlation coefficient 0.815).
３．同一個体における各パラメータの検討
文書により同意を得た健常人ボランティア２名を被検者とし、温熱ストレスをかける直前、並びに、かけた直後、３時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後に採血し、直ちに上記１と同様の手順でＰＢＭＣを採取した。温熱ストレスとして、遠赤外線全身加温装置を用い、６０分間全身加温を負荷した。この負荷により、被検者２名の直腸温度は３９℃まで上昇した。
3. Examination of each parameter in the same individual Two healthy volunteers who have obtained consent in writing are subjects, immediately before applying thermal stress, immediately after applying, 3 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours Later, blood was collected and PBMCs were collected immediately by the same procedure as described above. As a thermal stress, whole body warming was applied for 60 minutes using a far infrared whole body warming device. This load increased the rectal temperature of the two subjects to 39 ° C.
採取したＰＢＭＣを直ちに上記１と同様手順の細胞障害性試験と上記２と同様手順のフローサイトメトリーに供し、ＮＫ活性（４０：１）、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋、及びＣＤ４＋・ＣＤ２５＋を測定した。得られた測定値を元に、ＮＫ活性とＣＤ４＋／ＣＤ８＋との相関性、並びに、ＮＫ活性とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋との相関性を検討した。結果を図５と図６に示す。図５（ａ）は一方の被検者におけるＮＫ活性とＣＤ４＋／ＣＤ８＋との関係を示すグラフ、図５（ｂ）は一方の被検者におけるＮＫ活性とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋との関係を示すグラフである。図６（ａ）は他方の被検者におけるＮＫ活性とＣＤ４＋／ＣＤ８＋との関係を示すグラフ、図６（ｂ）は他方の被検者におけるＮＫ活性とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋との関係を示すグラフである。図５，６に示すように、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋とＣＤ４＋・ＣＤ２５＋はいずれもＮＫ活性と強い負の相関を示した。特に、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋についてはいずれの個体でも相関係数が０．９７以上であり、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋とＮＫ活性とはほぼ同一視できることが示された。
以上より、同一個体においてＣＤ４＋／ＣＤ８＋あるいはＣＤ４＋・ＣＤ２５＋の変動を調べることにより、免疫能の変動を正確に把握できることが示された。
The collected PBMC was immediately subjected to the cytotoxicity test in the same procedure as in the above 1 and the flow cytometry in the same procedure as in the above 2, and NK activity (40: 1), CD4 + / CD8 +, and CD4 + · CD25 + were measured. Based on the measured values obtained, the correlation between NK activity and CD4 + / CD8 + and the correlation between NK activity and CD4 + · CD25 + were examined. The results are shown in FIGS. FIG. 5 (a) is a graph showing the relationship between NK activity and CD4 + / CD8 + in one subject, and FIG. 5 (b) is a graph showing the relationship between NK activity and CD4 + · CD25 + in one subject. is there. FIG. 6 (a) is a graph showing the relationship between NK activity and CD4 + / CD8 + in the other subject, and FIG. 6 (b) is a graph showing the relationship between NK activity and CD4 + · CD25 + in the other subject. is there. As shown in FIGS. 5 and 6, both CD4 + / CD8 + and CD4 + · CD25 + showed a strong negative correlation with NK activity. In particular, for CD4 + / CD8 +, the correlation coefficient was 0.97 or more in any individual, indicating that CD4 + / CD8 + and NK activity can be almost identical.
From the above, it was shown that by examining the change of CD4 + / CD8 + or CD4 + · CD25 + in the same individual, the fluctuation of immunity can be accurately grasped.
なお、図５（ａ）のグラフから回帰式「Ｙ＝２８．２８４−４．９８３Ｘ」、図５（ｂ）のグラフから「Ｙ＝３２．９２４−０．９７４Ｘ」が得られた。これらの式からＮＫ活性２０％（Ｙ＝２０）に相当する各パラメータ値（Ｘ）を計算すると、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋は１．６６２、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋は１３．２７となる。これらのパラメータ値は、図５の被検者に固有の基準値となり得る。同様に、図６（ａ）のグラフから回帰式「Ｙ＝７１．１９９−２７．２６４Ｘ」、図６（ｂ）のグラフから「Ｙ＝５５．５２１−１．７７９Ｘ」が得られた。これらの式からＮＫ活性２０％（Ｙ＝２０）に相当する各パラメータ値（Ｘ）を計算すると、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋は１．８７８、ＣＤ４＋・ＣＤ２５＋は１９．９７となる。これらのパラメータ値は、図６の被検者に固有の基準値となり得る。
The regression equation “Y = 28.284-4.983X” was obtained from the graph of FIG. 5A, and “Y = 32.924-0.974X” was obtained from the graph of FIG. 5B. When each parameter value (X) corresponding to
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