KR101483883B1 - A novel method for assessing immuno-activity without cell counting - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 세포 계수가 필요 없는 신규한 면역활성 측정방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 말초혈액 중의 자연살해 세포의 활성도를 평가하는 방법에 관한 것이다. More particularly, the present invention relates to a method for evaluating the activity of natural killer cells in peripheral blood.
자연살해 세포(NK cell)는 선천 면역계를 구성하는 대표적인 효과기 세포(effector cells) 중 하나로, 인체에 침입한 병원균이나 바이러스에 감염된 세포를 찾아내고 이를 제거하는 기능을 수행하며, 이와 함께 비정상적으로 변이가 된 암세포를 탐지하고 제거하여 인체의 생리학적인 항상성을 유지 하는데 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.NK cells are one of the most effective effector cells of the innate immune system. They function to detect and remove the cells infected with pathogens or viruses that infiltrate the human body. In addition, abnormal mutations Is known to play an important role in maintaining the physiological homeostasis of the human body by detecting and eliminating cancer cells.
따라서 자연살해 세포는 인체의 항상성 유지를 위해 필요한 면역계의 일차적인 방어선(first line defense)으로 인식되고 있으며, 이러한 자연살해 세포가 정상적으로 기능을 하지 못하는 경우 직접 또는 간접적으로 다양한 면역관련 질환에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. Therefore, natural killer cells are recognized as the first line defense of the immune system necessary for maintaining the homeostasis of the human body. If such natural killer cells do not function normally, they may directly or indirectly affect various immune related diseases .
암의 발생과 진행 과정은 하나의 원인에 기인하기 보다는 일반적으로 다양하고 복합적인 요인의 총체적인 결과로 이해되고 있으며 이러한 많은 요인 가운데 인체의 면역력 또한 암 발병에 있어 상당한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 또한 많은 임상 연구 결과에 의하면 대부분의 암 환자에 있어 면역력 저하가 함께 동반되고 있으며, 암 환자의 면역력 증강은 환자를 치료 하는데 있어 실질적인 도움이 되는 것으로 보고되고 있다.The development and progression of cancer are generally understood to be the result of a variety of factors, rather than a single cause, and it is known that the immune system of the human body also has a considerable impact on cancer outbreaks. In addition, many clinical studies have shown that immunosuppression is accompanied in most cancer patients, and the immunity enhancement of cancer patients has been reported to be a practical help in the treatment of patients.
또한 최근에는 면역 세포를 이용한 암의 세포치료 방법에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 비록 걸음마 단계라 할 수 있으나 많은 괄목할 만한 연구 결과물이 나오고 있다. 따라서 면역세포 치료는 암 치료에 있어 새로운 치료 방법의 일환으로 많은 주목을 받고 있으며 미래에는 가시적인 연구 성과물을 얻을 수 있을 것으로 기대되고 있다. Recently, studies on cell therapy methods of cancer using immune cells have been actively carried out, and although it is a toddler stage, many remarkable research results are emerging. Therefore, immunotherapy has attracted much attention as a new treatment method for cancer treatment and it is expected that future research results will be obtained.
하지만 세포 면역 치료에 앞서 선결되어야 할 과제는 세포 면역력의 기능적인 상태를 평가하는 기술의 개발이다. 즉 면역력이 저하된 상태 또는 정상적인 상태의 면역력을 측정할 수 있는 기술을 구현 하는 것인데, 그러한 시도 가운데 하나는 면역 세포를 이용한 세포 활성도 측정이라 할 수 있으며, 다양한 면역 관련 질환과 연관이 있는 자연살해 세포를 이용한 세포 활성도 측정방법은 지금까지 널리 사용되어온 기술 가운데 하나이다.However, prior to cell immunotherapy, the challenge is to develop a technique for evaluating the functional status of cellular immunity. In other words, the technology to measure the immunity of the immunocompromised state or the normal state is implemented. One of such attempts is the measurement of the cell activity using the immune cell, and the natural killer cell Is one of the technologies widely used so far.
자연살해 세포를 이용한 세포 활성도 측정방법은 주로 말초혈액 면역세포, 즉, 말초혈액 단핵구 세포(Peripheral Blood Mononuclear Cells)를 이용하거나, 이들 말초혈액 면역세포로부터 자연살해 세포만을 따로 분리하여 세포 활성도를 측정하는 방법이 사용되고 있는데, 두 방법 모두 단점을 가지고 있다. 말초혈액 면역세포를 이용하는 경우에는 그 안에 포함되어 있는 자연살해 세포의 수에 따라 세포 활성도 값이 영향을 받기 때문에 자연살해 세포만의 정확한 세포 활성도 비교가 어렵다는 단점이 있다. 또한, 자연살해 세포만을 분리하여 세포 활성도를 측정하는 방법은 말초혈액 내 자연살해 세포의 수가 상대적으로 많지 않을 뿐 아니라 말초혈액 면역세포로부터 자연살해 세포를 분리하거나, 이들의 세포 수를 계수해야 하기 때문에 시간과 경비가 더 많이 소요가 된다는 문제점이 있다.Cellular activity measurement using natural killer cells is mainly performed by using peripheral blood mononuclear cells (Peripheral Blood Mononuclear Cells) or by separating natural killer cells from these peripheral blood immune cells and measuring cell activity Methods are used, both of which have disadvantages. In the case of using peripheral blood immune cells, since the cell activity value is influenced by the number of natural killer cells contained therein, it is difficult to compare the cell activity of natural killer cells alone. In addition, as a method of measuring cell activity by separating only natural killer cells, the number of natural killer cells in the peripheral blood is not relatively large, and the natural killer cells are separated from the peripheral blood immunocytes or the number of the cells is counted There is a problem that time and expense are more required.
대한민국 공개특허공보 제10-2013-0083267호는 자연살해 세포 활성도 측정방법으로서, 루시페라제 유전자가 삽입된 세포주를 표적세포로 활용하여 자연살해 세포 활성도 측정하는 방법을 개시하고 있으나, 본 측정방법 역시 세포활성도 측정을 위해서는 측정시료와 표적시료를 반응시키기 전 단계로서 자연살해 세포의 세포수를 계수해야 하며, 측정시료와 표적시료 사이의 반응시간이 장시간 소요된다는 한계가 있다. Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2013-0083267 discloses a method of measuring natural killer cell activity using a cell line into which a luciferase gene has been inserted as a target cell, In order to measure cell activity, the number of cells of natural killer cells must be counted as a step prior to the reaction between the measurement sample and the target sample, and the reaction time between the measurement sample and the target sample takes a long time.
본 발명은 면역활성 측정을 위한 전 단계로서 세포 계수기를 이용한 자연살해 세포(NK cell)의 세포수 계수 없이 간편하고 손쉽게 자연살해 세포의 세포활성도를 측정하여 개체의 면역활성을 평가할 수 있는 방법을 제공하고자 한다. The present invention provides a method for evaluating the immune activity of an individual by measuring cell activity of natural killer cells easily and easily without counting the number of NK cells using a cell counter as a previous step for measuring immunological activity I want to.
종래 자연살해 세포의 활성도 측정방법들은 그 세포 활성도를 측정하기 위한 전 단계로서 세포수 계수기를 이용하여 자연살해 세포의 세포수를 계수해야 하기 때문에 시간과 비용이 상당히 소요된다는 문제가 있었던바, 본 발명자들은 보다 효율적인 개체의 면역활성 측정방법에 대하여 예의 연구하던 중 놀랍게도 대장직장암환자들의 단위 말초혈액 내에 자연살해 세포수가 정상인들의 그것에 비하여 현저히 증가되어 있음에도 불구하고 대장직장암환자들의 단위 말초혈액이 나타내는 자연살해 세포 활성도가 정상인들의 단위 말초혈액에서 나타나는 자연살해 세포 활성도에 비하여 유의적으로 낮다는 점을 발견하여 본 발명을 완성하였다. Conventionally, methods for measuring the activity of natural killer cells have required a considerable time and cost because the number of cells of natural killer cells must be counted using a cell counting counter as a previous step for measuring the cell activity. The number of natural killer cells in the peripheral blood of patients with colorectal cancer is significantly increased compared to that of normal individuals, but the number of natural killer cells expressed by peripheral blood of patients with colorectal cancer is remarkably high And the activity is significantly lower than that of natural killer cells in the peripheral blood of normal subjects. Thus, the present invention has been completed.
본 발명은 면역활성 측정을 위한 전 단계로서 세포 계수기를 이용한 자연살해 세포의 계수 없이 단위 말초혈액 당 자연살해 세포의 세포 활성도의 개념을 이용하여 간편하고 손쉽게 자연살해 세포의 세포활성도를 측정하는 방법을 제공한다. The present invention provides a simple and easy method for measuring the cell activity of natural killer cells using the concept of cell activity of natural killer cells per unit peripheral blood without counting natural killer cells using a cell counter as a previous step for measuring immunological activity to provide.
본 발명은 또한 면역활성 측정을 위한 전 단계로서 세포 계수기를 이용한 자연살해 세포의 계수 없이 단위 말초혈액 당 자연살해 세포의 세포 활성도의 개념을 이용하여 간편하고 손쉽게 개체의 면역활성을 평가하는 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for easily and easily evaluating the immune activity of an individual using the concept of cell activity of natural killer cells per unit peripheral blood without counting natural killer cells using a cell counter as a previous step for measuring immunological activity do.
본 발명은 또한 면역활성 측정을 위한 전 단계로서 세포 계수기를 이용한 자연살해 세포의 계수 없이 단위 말초혈액 당 자연살해 세포의 세포 활성도의 개념을 이용하여 간편하고 손쉽게 환자의 면역활성을 평가하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. The present invention also provides information for evaluating the immune activity of a patient easily and easily by using the concept of cell activity of natural killer cells per unit peripheral blood without counting natural killer cells using a cell counter as a previous step for measuring immunological activity Provide a method to provide.
상기 방법들에 의하여 얻어진 개체의 단위 말초혈액당 자연살해 세포의 세포 활성도, 면역활성 및 면역활성에 관한 정보는 의학적 처치나 치료, 식이요법 등이 요구되는 개체의 면역활성 개선, 향상, 조절을 위하여 유용하게 사용될 수 있다. The information on the cell activity, immune activity and immune activity of the natural killer cells per unit peripheral blood obtained by the above methods can be used for the improvement, improvement and control of the immunological activity of the individual in need of medical treatment, Can be usefully used.
본 발명의 구현형태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 개체의 자연살해 세포의 세포 활성도 측정방법을 제공한다:In an embodiment of the present invention, the present invention provides a method for measuring cellular activity of a natural killer cell of an individual comprising the steps of:
(1) 단위 말초혈액 시료로부터 말초혈액 단핵구 세포군(peripheral blood mononulcear cell group)을 분리하는 단계;(1) separating a peripheral blood mononuclear cell group from a peripheral blood sample;
(2) 상기 (1)에서 분리된 말초혈액 단핵구 세포군을 일정량의 세포 배양액에 현탁시키는 단계;(2) suspending the peripheral blood mononuclear cell group separated in (1) in a certain amount of cell culture medium;
(3) 상기 (1), (2) 단계와 별도로 암세포 주를 준비하는 단계;(3) preparing a cancer cell line separately from steps (1) and (2) above;
(4) 5개 이상의 웰을 갖는 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 다음의 시험군을 준비하는 단계:(4) preparing the following test groups in each well of a multi-well plate having five or more wells:
(i) 세포 배양액만을 함유하는 시험군(이하, '시험군 (i)'이라 한다.),(i) a test group containing only a cell culture solution (hereinafter referred to as a " test group (i) "),
(ii) 상기 (3) 단계에서 준비한 암세포주와 세포 배양액을 함유하는 1개 이상의 제1 시험군(이하, '시험군 (ii)'라 한다.),(ii) at least one first test group (hereinafter, referred to as " test group (ii) ") containing the cancer cell line and the cell culture solution prepared in step (3)
(iii) 상기 (3) 단계에서 준비한 암세포주 및 세포 배양액을 함유하는 1개 이상의 제2 시험군(이하, '시험군 (iii)'이라 한다.), (iii) one or more second test groups (hereinafter referred to as "test group (iii)") containing the cancer cell lines and the cell culture liquid prepared in the step (3)
(iv) 상기 (2) 단계에서 준비한 말초혈액 단핵구 세포군 및 세포 배양액을 함유하는 시험군(이하, '시험군 (iv)'라 한다.), 및 (iv) a test group containing the peripheral blood mononuclear cell group and the cell culture liquid prepared in the step (2) (hereinafter referred to as "test group (iv)"), and
(v) 상기 (2) 단계에서 준비한 말초혈액 단핵구 세포군, 상기 (3) 단계에서 준비한 암세포주 및 세포 배양액을 함유하는 시험군(이하, '시험군 (v)'라 한다.);(v) a test group containing the peripheral blood mononuclear cell group prepared in the step (2), the cancer cell line prepared in the step (3) and the cell culture liquid (hereinafter referred to as a test group (v));
(5) 상기 (4) 단계에서 준비된 멀티 웰 플레이트를 인큐베이터 안에서 배양하는 단계;(5) culturing the multi-well plate prepared in the step (4) in an incubator;
(6) 일정 시간 배양 후, 상기 시험군 (ii)에만 세포 용해제(lytic agent)를 첨가하는 단계;(6) adding a lytic agent only to the test group (ii) after culturing for a predetermined time;
(7) 상기 배양된 시험군들에 젖산탈수소효소의 기질 용액을 첨가하고 반응시키는 단계; (7) adding a substrate solution of lactate dehydrogenase to the cultured test groups and reacting;
(8) 일정 반응시간 경과 후, 반응 종결제를 첨가하는 단계;(8) adding a reactive termination after a predetermined reaction time has elapsed;
(9) 흡광도 측정기를 이용하여 각 시험군들의 흡광도를 측정하는 단계; 및(9) measuring the absorbance of each test group using an absorbance meter; And
(10) 상기 시험군 (ii)의 흡광도에서 상기 시험군 (iii)의 흡광도와 상기 시험군 (i)의 흡광도를 뺀 값에 대하여, 상기 시험군 (v)의 흡광도에서 상기 시험군 (iv)의 흡광도, 상기 시험군 (iii)의 흡광도, 상기 시험군 (i)의 흡광도를 뺀 값을 평가하여 개체의 자연살해 세포의 세포 활성도를 결정하는 단계.(10) The absorbance of the test group (ii) is measured by subtracting the absorbance of the test group (i) and the absorbance of the test group (i) from the absorbance of the test group (ii) Determining the cell activity of the natural killer cells of the subject by evaluating the absorbance of the test group (iii) minus the absorbance of the test group (i).
상기 (1) 단계의 단위 말초혈액은 정상인 또는 환자를 포함한 개체로부터 채취한 일정양의 말초혈액으로서, 검사자가 적절히 선정하여 시험 과정 내내 동일하게 유지하는 일정한 양의 말초혈액 시료를 의미한다. 이러한 단위 말초혈액의 양은 이에 제한되는 것은 아니며, 10 ㎕ 내지 1000 ㎖ 의 범위에서 선택될 수 있고, 예를 들면, 10 ㎕, 50 ㎕, 100 ㎕, 200 ㎕, 300 ㎕, 400 ㎕, 500 ㎕, 600 ㎕, 700 ㎕, 800 ㎕, 900 ㎕, 1 ㎖, 5 ㎖, 10 ㎖, 50 ㎖, 100 ㎖, 150 ㎖, 200 ㎖, 250 ㎖, 300 ㎖, 350 ㎖, 400 ㎖, 450 ㎖, 500 ㎖, 550 ㎖, 600 ㎖, 650 ㎖, 700 ㎖, 750 ㎖, 800 ㎖, 850 ㎖, 900 ㎖, 950 ㎖, 또는 1000 ㎖ 중에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 50 ㎕, 100 ㎕, 200 ㎕, 300 ㎕, 500 ㎕, 1 ㎖, 5 ㎖, 또는 10 ㎖ 이다. The unit peripheral blood in the above step (1) means a predetermined amount of peripheral blood sampled from a normal person or an individual including a patient, which is appropriately selected by the examiner and kept constant throughout the test procedure. The amount of the unit peripheral blood is not limited thereto and may be selected in the range of 10 쨉 l to 1000 ㎖. For example, 10 袖 l, 50 袖 l, 100 袖 l, 200 袖 l, 300 袖 l, 400 袖 l, 500 袖 l, 600 μl, 700 μl, 800 μl, 900 μl, 1 ml, 5 ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml, 500 ml , 550 ml, 600 ml, 650 ml, 700 ml, 750 ml, 800 ml, 850 ml, 900 ml, 950 ml or 1000 ml, preferably 50 l, 100 l, 200 l, 300 Mu] l, 500 [mu] l, 1 ml, 5 ml, or 10 ml.
상기 (1) 단계에서, 단위 말초혈액 시료로부터 말초혈액 단핵구 세포군(peripheral blood mononulcear cell group)의 분리는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 바람직하게는 밀도 구배 원심 분리법을 이용하여 말초혈액 시료로부터 말초혈액 단핵구 세포군을 수집할 수 있다. In step (1), the peripheral blood mononuclear cell group may be separated from the peripheral blood mononuclear cells by a method generally used in the art, preferably by density gradient centrifugation Can be used to collect peripheral blood mononuclear cell populations from peripheral blood samples.
상기 (2) 단계에서 사용되는 세포 배양액은 당 분야에서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 부유세포 배양에 적합하게 고안된 필수 아미노산과 양분이 포함된 RPMI 1640 배지(welgene, Korea)를 사용하며, 이때 10 %의 소 혈청(Fetal bovine serum)을 함께 넣어 배양을 하여 제조된 것을 사용하거나, 또는 시판되는 것을 사용할 수 있다.The cell culture solution used in the step (2) may be those conventionally used in the art. For example, RPMI 1640 medium (welgene, Korea) containing essential amino acids and nutrients, , Which is prepared by culturing 10% bovine serum (Fetal bovine serum) together, or a commercially available product can be used.
상기 (3) 단계에서 사용되는 암세포주는 NK 세포에 의해 선택적으로 살해되는 암세포주이면 어느 것이나 사용될 수 있으며, 상업적으로 판매되는 암세포주, 재조합 방법으로 제작된 암세포주 등이 사용될 수 있다. 바람직하게는 K562 암 세포주 (ACTT® CCL-243TM)가 사용된다. The cancer cell line used in the step (3) may be any cancer cell line that is selectively killed by NK cells. A commercially available cancer cell line, a cancer cell line produced by the recombinant method, or the like may be used. Preferably, a K562 cancer cell line (ACTT ® CCL-243 ™ ) is used.
상기 (4) 단계 및 (5) 단계에서 사용되는 멀티 웰 플레이트는 당 분야에서 일반적으로 판매되는 제품을 사용할 수 있으며, 최소한 상기 시험군 (i) 내지 (v)를 준비할 수 있는 웰 수를 가진 플레이트가 사용된다. 예를 들면, 96-웰 라운드 보텀 플레이트가 사용된다. The multi-well plate used in the steps (4) and (5) may be a commercially available product in the art, and may be a product having a well number capable of preparing at least the test groups (i) to (v) Plate is used. For example, a 96-well round bottom plate is used.
상기 (6) 단계에서 사용되는 세포 용해제는 당 분야에서 통상적으로 사용되는 세포 라이시스 버퍼(cell lysis buffer)가 사용될 수 있으며, 예를 들면 트윈 20 (Tween 20)이 사용될 수 있다. The cell lysate used in the step (6) may be a cell lysis buffer commonly used in the art. For example, Tween 20 may be used.
상기 (7) 단계는 시료 내 자연살해 세포에 의하여 파괴된 암세포의 양을 측정하기 위한 반응을 유도하는 단계로서, 첨가되는 젖산탈수소효소(LDH: Lactate DeHydrogenase)의 기질 용액은 당 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 제조하여 사용할 수 있으며, 또는 당 분야에서 여러 제조사에서 시판되는 제품, 예컨대, Cytotox 96® Non-radioactive Cytotoxicity Assay 키트(Promega)를 사용할 수 있다. 본 발명에서는 단위 말초혈액 당 세포 활성도의 개념을 채택함으로써 젖산탈수소효소와 기질 반응에 의해 간단히 세포 활성도를 측정할 수 있도록 함으로써 측정 시간이 단축된다는 유리한 효과를 가진다. The step (7) is a step of inducing a reaction to measure the amount of cancer cells destroyed by the natural killer cells in the sample. The substrate solution of the added lactate dehydrogenase (LDH) Or a commercially available product from various manufacturers such as Cytotox 96 ® Non-radioactive Cytotoxicity Assay Kit (Promega) can be used. The present invention has an advantageous effect that the measurement time can be shortened by adopting the concept of cell activity per unit peripheral blood, by allowing the cell activity to be easily measured by lactate dehydrogenase and substrate reaction.
상기 (8) 단계는 젖산탈수소효소와 기질 간의 반응을 종결시키기 위한 반응 종결제를 첨가하는 단계로서, 반응 종결제는 당 분야에 널리 알려져 있으며, 예를 들면 아세트산이 사용된다. The step (8) is a step of adding a reactive termination to terminate the reaction between the lactate dehydrogenase and the substrate. The reaction termination is widely known in the art, for example, acetic acid is used.
상기 (9) 단계는 490 ㎚ 의 파장에서 흡광도 측정기(spectrophotometer)를 이용하여 수행된다. The step (9) is performed using a spectrophotometer at a wavelength of 490 nm.
상기 (10) 단계는 NK 세포의 세포 활성도, 즉 암세포주에 대한 세포 독성도를 평가하기 위한 단계로서, 이를 계산식으로 나타내면 다음과 같다:The step (10) is a step for evaluating the cell activity of the NK cell, that is, the cytotoxicity of the cancer cell line,
계산식 = [시험군 (v)의 평균 OD값 - 시험군 (iv)의 평균 OD값 - 시험군 (i)의 평균 OD값 - 시험군 (iii)의 평균 OD값] / [시험군 (ii)의 평균 OD값 - 시험군 (iii)의 평균 OD값 - 시험군 (i)의 평균 OD값] × 100The average OD value of the test group (i) - the average OD value of the test group (i) - the average OD value of the test group (i) - the average OD value of the test group (iii) - Average OD value of test group (iii) - Average OD value of test group (i)] x 100
본원에서 다른 특별한 기재가 없는 한, 단위 말초혈액 당 자연살해 세포의 세포 활성도 측정방법은 상기한 방법을 의미한다. Unless otherwise specified herein, the method of measuring the cellular activity of natural killer cells per unit peripheral blood means the above method.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 자연살해 세포의 세포 활성도 측정방법은 자연살해 세포의 세포수를 계수하는 단계를 포함하지 않는다. As described above, the method of measuring cell activity of a natural killer cell of the present invention does not include a step of counting the number of cells of a natural killer cell.
본원 명세서의 실시예 2에서도 확인되는 바와 같이, 정상인에 비하여 암 환자에서 자연살해 세포의 세포수가 현저히 증가되어 있으며, 현재까지 개체의 면역활성을 평가하기 위한 방법에 있어서, 단위 혈액당 자연살해 세포의 세포 활성도의 개념이 도입되거나 시도된 바 없었다. 본 발명자들은 단위 혈액당 자연살해 세포의 세포 활성도에 관한 개념을 최초로 발견하여, 이를 이용하여 실제로 빠르고 손쉽게 개체의 면역활성을 평가할 수 있는 방법을 처음으로 확립하였다. 특히, 자연살해 세포의 세포수 계수 없이 멀티 웰 플레이트를 이용하여 배양하고, 젖산탈수소효소와 기질 반응을 접목시킴으로써 간편하고도 빠르게 개체의 면역활성을 평가할 수 있는 방법을 확립하였다. As can be seen in Example 2 of the present invention, the number of natural killer cells in cancer patients is significantly increased compared to normal subjects. To date, a method for evaluating the immunological activity of a natural killer cell The concept of cell activity has not been introduced or attempted. The inventors first discovered the concept of cell activity of natural killer cells per unit blood, and established a method that can actually and quickly assess the immune activity of a subject using the same. In particular, we established a method for easily and rapidly evaluating the immune activity of a subject by culturing it using a multiwell plate without counting the number of natural killer cells and combining the lactate dehydrogenase and the substrate reaction.
따라서, 본 발명의 자연살해 세포의 세포 활성도 측정방법은 세포수의 계수 없이도 단위 혈액당 면역세포의 세포 활성도를 측정함으로써 암 환자나 정상인, 또는 개인의 주기적인 세포 활성도의 추이 등을 비교 평가하는 데 유용하게 사용될 수 있다. Therefore, the method of measuring the cellular activity of natural killer cells of the present invention can be performed by comparing the cell activity of the immune cells per unit blood without counting the number of cells, thereby comparing the periodic activity of the cancer patient, Can be usefully used.
본 발명은 또한 상술한 자연살해 세포의 세포 활성도 측정방법을 이용한 개체의 면역활성 평가방법을 제공한다. The present invention also provides a method of evaluating the immune activity of a subject using the above-described method for measuring cell activity of a natural killer cell.
즉, 본 발명은 That is,
(a) 평가 대상의 단위 말초혈액에 대하여 세포 활성도를 측정하는 단계, (a) measuring the cell activity of the unit peripheral blood to be evaluated,
(b) 정상인 또는 비교하고자 하는 개체의 단위 말초혈액에 대하여 세포 활성도를 측정하는 단계, 및 (b) measuring cell activity against a peripheral blood of a normal person or a subject to be compared, and
(c) 상기 (a)에서 결정된 세포 활성도와 상기 (b)에서 결정된 세포 활성도를 비교하는 단계를 포함하며, 단위 말초혈액당 자연살해 세포의 세포 활성도는 상술한 방법으로 측정되는 개체의 면역활성 평가방법을 제공한다. (c) comparing the cell activity determined in (a) with the cell activity determined in (b), wherein the cell activity of the natural killer cells per unit peripheral blood is determined by measuring the immune activity of the individual ≪ / RTI >
평가하고자 하는 대상과 정상인에 대하여 각각 상술한 자연살해 세포의 세포 활성도 측정방법을 수행하여 결정된 각각의 세포 활성도 값을 비교함으로써, 평가하고자 하는 대상의 면역활성, 즉, 면역기능의 상태를 평가하고, 그로부터 추후 의학적 처치 내지 치료를 위한 면역활성의 목표값 및 예상값을 손쉽게 설정할 수 있다. The immunological activity of the subject to be evaluated, that is, the state of the immune function, is evaluated by comparing the respective cell activity values determined by performing the method of measuring the cell activity of the natural killer cells with respect to the subject to be evaluated and the normal person, From which it is possible to easily set the target value and expected value of the immune activity for future medical treatment or treatment.
본 발명은 또한 상술한 자연살해 세포의 세포 활성도 측정방법을 이용한 개체의 면역활성에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for providing information on the immunological activity of an individual using the above-described method for measuring cell activity of a natural killer cell.
즉, 본 발명은 That is,
(a) 평가 대상의 단위 말초혈액에 대하여 세포 활성도를 측정하는 단계, (a) measuring the cell activity of the unit peripheral blood to be evaluated,
(b) 정상인 또는 비교하고자 하는 개체의 단위 말초혈액에 대하여 세포 활성도를 측정하는 단계, 및 (b) measuring cell activity against a peripheral blood of a normal person or a subject to be compared, and
(c) 상기 (a)에서 결정된 세포 활성도와 상기 (b)에서 결정된 세포 활성도를 비교하는 단계를 포함하며, 단위 말초혈액당 자연살해 세포의 세포 활성도는 상술한 방법으로 측정되는 개체의 면역활성에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. (c) comparing the cell activity determined in (a) with the cell activity determined in (b), wherein the cellular activity of the natural killer cells per unit peripheral blood is determined by the immunological activity of the individual To provide information about the user.
본 발명의 개체의 면역활성에 관한 정보를 제공하는 방법은 상기 단계들에 부가하여 단위 말초혈액 시료에 대하여 면역세포 분포도 및 세포수 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 본 부가적 단계를 통하여 단위 말초혈액당 세포 활성도 측정 결과를 검증할 수 있으며, 또한, 개체의 상태에 대한 종합적인 정보를 제공할 수 있다.The method of providing information on the immunological activity of an individual of the present invention may include measuring the number of immune cells and the number of cells per unit peripheral blood sample in addition to the above steps. Through this additional step, it is possible to verify the measurement result of cell activity per unit peripheral blood and to provide comprehensive information on the state of the individual.
평가하고자 하는 대상에 대하여 상술한 자연살해 세포의 세포 활성도 측정방법을 수행하여 결정된 세포 활성도 값을 제공함으로써 개체의 면역활성에 관한 정보를 제공할 수 있으며, 이를 정상인 또는 평가 대상에 대하여 다른 시점에 측정된 세포 활성도 값 등과 비교함으로써 평가 대상의 면역활성, 즉, 면역기능의 상태를 평가하는데 도움이 되는 정보를 제공할 수 있다. The method of measuring cell activity of a natural killer cell described above may be used to provide a determined cell activity value to a subject to be evaluated, thereby providing information on the immune activity of the individual. And thus can provide information to help evaluate the immune activity to be evaluated, i.e., the state of immune function.
이상 상술한 바와 같이, 본 발명은 환자에 있어서 일정량의 단위 말초혈액 당 자연살해 세포수가 정상인에 비하여 현저히 증가되어 있음에도 불구하고, 자연살해 세포의 세포수의 계수 없이 단위 말초혈액 시료에 대하여 측정한 자연살해 세포의 세포 활성도가 정상인에 비하여 환자에서 약 50% 수준으로 현저히 저하되어 있다는 놀라운 발견에 기초한 것으로서, 종래 암 환자 등의 면역활성 평가시 필수적으로 수행되던 세포수 계수 과정을 제거할 수 있도록 한 것이다. 따라서, 본 발명의 단위 말초혈액당 세포 활성도라는 개념에 의한 자연살해 세포의 세포 활성도 측정에 의하여 개체의 면역활성 평가가 보다 간편하고 용이할 뿐아니라 저렴하고 빠르게 이루어질 수 있게 되었다. As described above, in the present invention, although the number of natural killer cells per unit peripheral blood of a patient is remarkably increased compared with that of a normal person, the number of natural killer cells measured per unit peripheral blood sample The cell activity of killed cells is remarkably lowered to about 50% in patients compared with normal patients, and it is possible to eliminate the cell counting process which was conventionally performed in the evaluation of immunological activity of cancer patients . Therefore, by measuring the cell activity of natural killer cells according to the concept of cell activity per unit peripheral blood of the present invention, the evaluation of the immune activity of the individual can be made simple, easy, cheap, and quick.
본 발명의 측정방법은 혈액시료 내 함유된 세포들에 관한 세포수 계수가 필요 없어 혈구계수기를 사용하지 않기 때문에 시간과 비용을 절약할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 본 발명은 말초혈액 면역세포로부터 자연살해 세포를 재분리할 필요가 없어 추가적인 시료 및 재료가 필요하다는 종래 기술의 단점을 피할 수 있다는 장점이 있다. The measuring method of the present invention has an advantage that it can save time and money because it does not require the cell counting on the cells contained in the blood sample and does not use the hemocyte counter. In addition, the present invention has an advantage in that it is unnecessary to re-isolate natural killer cells from peripheral blood immune cells, thereby avoiding disadvantages of the prior art that additional samples and materials are required.
도 1은 정상인 104명 및 환자 94명에 대하여 계산된 자연살해 세포의 세포 활성도(%)의 평균값을 나타낸 그래프이다.
도 2는 정상인들에 대한 림프구 세포 아형 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 암 환자들에 대한 림프구 세포 아형 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 정상인의 단위 말초혈액당 자연살해 세포의 세포 활성도 값과 세포수 간의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 5는 환자군의 단위 말초혈액당 자연살해 세포의 세포 활성도 값과 세포수 간의 상관관계를 나타낸 그래프이다.1 is a graph showing an average value of cell activity (%) of natural killer cells calculated for 104 normal subjects and 94 patients.
FIG. 2 is a graph showing the results of lymphocyte subsets analysis for normal persons. FIG.
FIG. 3 is a diagram showing lymphocyte subtype analysis results for cancer patients. FIG.
4 is a graph showing the correlation between the cell activity value and the number of cells of natural killer cells per unit peripheral blood of a normal human.
5 is a graph showing the correlation between the cell activity value and the cell number of the natural killer cells per unit peripheral blood of the patient group.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example
실시예 1. 암세포(K562 세포)에 대한 세포 활성도 측정Example 1. Measurement of cell activity on cancer cells (K562 cells)
(1) 말초혈액 시료의 준비(1) Preparation of peripheral blood sample
직장암 환자 94명 및 정상인 104명으로부터 각각 말초혈액 5 cc (5 ㎖)를 채혈하여 혈액 응고를 방지하기 위해 헤파린-EDTA 튜브 (Heparin-EDTA tube)에 담아 실온 상태에서 분석실로 운반하였다.Peripheral blood 5 cc (5 ㎖) was collected from 94 rectal cancer patients and 104 normal persons, respectively. The blood was collected in a heparin-EDTA tube to prevent blood clotting and then transferred to the analysis room at room temperature.
운반된 혈액 샘플은 실온에서 1500 g의 밀도 구배 원심분리 (density gradient centrifugation) 방법을 통해 각각의 혈액 성분 별로 분리하여, 이때 림프구 세포와 단핵구 및 대식세포 등을 포함하는 말초혈액 단핵구 세포들 (PBMCs: peripheral blood mononuclear cells)이라 불리는 세포군 만을 파이펫팅으로 따로 다시 분리하였다.The transported blood samples were separated by the density gradient centrifugation method of 1500 g at room temperature for each of the blood components. At this time, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) including lymphocytes, mononuclear cells and macrophages, peripheral blood mononuclear cells) were separated again by pipetting.
분리된 PBMC는 인산-완충 식염수 (PBS: phosphate-buffered saline)로 두 번 세척하고 원심분리기를 통해 세포 펠렛 상태를 만든 후, 500 마이크로리터 (㎕)의 세포 배양액을 첨가하여 현탁시켰다. Separated PBMCs were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) and cell pelleted through a centrifuge. The cells were suspended in 500 microliters (μl) of cell culture medium.
(2) 암세포주의 준비(2) Preparation of Cancer Cells
상기 (1)에서 말초혈액 시료를 준비하는 동안, K562 암 세포주 (ACTT® CCL-243TM)를 준비하였다. K562 세포는 37℃ 인큐베이터 안에서 배양하여, 검사가 필요할 때 마다 준비하였다. 이렇게 별도로 준비된 K562 세포는 혈구 계수기 (Hemocytometer)를 이용하여 필요한 세포 수 만큼 준비하고, 각각의 검사반응 튜브 마다 20000개 당 100 ㎕ 의 세포배양액이 되도록 준비하였다.During preparation of peripheral blood samples in (1) above, a K562 cancer cell line (ACTT ® CCL-243 ™ ) was prepared. K562 cells were cultured in an incubator at 37 ° C and were prepared whenever necessary. Separately prepared K562 cells were prepared by using a hemocytometer for the required number of cells and prepared to be 100 占 퐇 of cell culture solution per 20,000 cells for each assay reaction tube.
(3) 멀티 웰 플레이트에서 배양 및 반응(3) Culture and reaction in multiwell plates
상기 (1)의 말초혈액 시료와 상기 (2)의 암세포주를 반응시키기 위한 도구로써 96-웰 라운드 보텀 플레이트를 준비하였다. 각 웰들은 하기 그림과 같이 구역을 할당하였다.A 96-well round bottom plate was prepared as a tool for reacting the peripheral blood sample of (1) with the cancer cell line of (2). Each well was assigned a zone as shown in the following figure.
[96-웰 라운드 보텀 플레이트 모식도][96-well round bottom plate schematic diagram]
위 2A 내지 2C의 3개의 반응 웰에는 세포배양액을 200 ㎕ 씩 각각 넣었다. 위 1A 내지 1F의 반응 웰에는 각각 100 ㎕ 의 세포배양액을 넣고, 여기에 100 ㎕ 의 K562 세포를 20000개를 첨가하였다. 위 3A 내지 3C의 반응 웰에는 각각 세포배양액 150 ㎕를 넣고 PBMC 50 ㎕ (이는 최초 혈액 500 ㎕ 에서 유래한 양임)를 첨가하였다. 위 3D 내지 3F의 반응 웰에는 각각 50 ㎕ 의 세포배양액을 넣고 50 ㎕의 PBMC와 100 ㎕의 K562 세포 20000개를 첨가하였다.200 [mu] L of cell culture medium was added to each of the three reaction wells 2A to 2C. 100 占 퐇 of the cell culture medium was added to the reaction wells of the above 1A to 1F, and 200 占 of 100 占 퐇 of K562 cells were added thereto. 150 [mu] l of the cell culture medium was added to the reaction wells of 3A to 3C, respectively, and 50 [mu] l of PBMC (which was derived from 500 [mu] l of the initial blood) was added. 50 占 퐇 of the cell culture solution was added to the reaction wells of the above 3D to 3F, and 50 占 퐇 of PBMC and 20000 of 100 占 퐇 of K562 cells were added.
그후, 37℃ 인큐베이터 안에서 반응 플레이트를 2시간 동안 배양하였다. 배양 시간 1시간 15분 경과 후, 위 1D 내지 1F의 반응 웰에 10 ㎕의 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)인 트윈 20을 첨가하여 K562 세포의 인위적인 세포 용해를 유도하고 다시 인큐베이터 안에서 추가로 45분간 배양하였다. The reaction plate was then incubated for 2 hours in a 37 ° C incubator. After 1 hour and 15 minutes of incubation, 10 μl of
2시간의 배양이 모두 끝이 나면 반응 플레이트를 꺼내 5분간 실온에서 250 g로 원심분리하여 반응 플레이트 각각의 세포, 세포 부유물 등을 모두 가라앉게 한 다음 각각의 반응 플레이트에서 세포배양액을 50 ㎕ 씩 새로운 96-웰 평판 보텀 플레이트에 모두 옮겨 담았다.After completion of the incubation for 2 hours, the reaction plate was taken out and the reaction was continued for 5 minutes at room temperature to 250 g After centrifugation, the cells and cell suspension of each reaction plate were all submerged, and then 50 μl of the cell culture solution was transferred to a new 96-well plate bottom plate on each reaction plate.
(4) 자연살해 세포의 세포 활성도 측정(4) Measurement of cellular activity of natural killer cells
자연살해 세포(NK 세포)의 세포 활성도 측정을 위하여, 상기 (3)에서 옮겨진 50 ㎕ 의 세포배양액 위에 젖산탈수소효소 (LDH: Lactate dehydrogenase)의 기질 용액을 50 ㎕ 씩 모두 첨가하고, 효소-기질 반응이 일어날 수 있도록 30분간 플레이트를 빛을 차단한 채로 실온에서 방치하였다. (LDH 기질 반응은 하기 그림과 같으며 당 분야에 널리 알려져 있다.)In order to measure the cell activity of natural killer cells (NK cells), 50 μl of a lactic dehydrogenase (LDH) substrate solution was added to 50 μl of the cell culture fluid transferred in (3), and the enzyme- The plate was allowed to stand at room temperature for 30 minutes while the light was blocked so that it could occur. (The LDH substrate response is shown in the figure below and is well known in the art.)
30분 동안 반응시킨 후, 반응 종결을 위해 50 ㎕의 아세트 산을 모든 반응 웰에 첨가하였다. 그후, 흡광도 측정기(spectrophotometer)를 이용하여 490 ㎚의 파장에서 각 반응 웰의 흡광도 (Optical density, OD)값을 측정하였다.After reacting for 30 minutes, 50 [mu] l of acetic acid was added to all reaction wells for reaction termination. Then, the optical density (OD) value of each reaction well was measured at a wavelength of 490 nm using a spectrophotometer.
측정된 OD 값은 하기 계산식에 의해 최종적으로 시험군인 3D 내지 3F 반응 웰에서 일어난 반응의 백분률로써 구하였다.The measured OD value was determined by the following equation, as the percentage of the reaction finally taking place in the test wells 3D to 3F reaction wells.
계산식 = [(3D~3F)의 평균 OD값 - (3A~3C)의 평균 OD값 -(2A~2C)의 평균 OD값 - (1A~1C)의 평균 OD값] / [(1D~1F)의 평균 OD값 - (1A~1C)의 평균 OD값 - (2A~2C)의 평균 OD값] × 100(1D to 1F) of the average OD value of (3A to 3C) - (average OD value of (3A to 3C) - (OD) of (2A to 2C) Average OD value of (1A to 1C) - (average OD value of (2A to 2C)] × 100
표본으로써, 암 환자 및 정상인 6명의 단위 말초혈액에 대한 자연살해 세포의 세포 활성도를 위 계산식에 따라 구한 백분률은 다음과 같았다. As a sample, the percentage of natural killer cell activity per unit peripheral blood of cancer patients and normal persons was calculated by the following formula.
[표 1] 정상인 및 환자의 단위 말초혈액당 자연살해 세포의 세포 활성도 [Table 1] Cell activity of natural killer cells per peripheral blood of normal persons and patients
전체 정상인 104명 및 환자 94명에 대하여 계산된 자연살해 세포의 세포 활성도(%)의 평균값을 도 1에 나타내었다. 위 표 1과 도 1에 나타난 바와 같이, 직장암 환자는 정상인에 비하여 단위 혈액당 자연살해 세포의 세포 활성도가 약 50% 수준으로 유의적으로 감소된 세포 활성도를 나타냄이 확인되었다. FIG. 1 shows the average value of cell activity (%) of natural killer cells calculated for 104 normal subjects and 94 subjects. As shown in Table 1 and FIG. 1, it was confirmed that the cellular activity of natural killer cells per unit blood of the rectal cancer patients was significantly reduced to about 50% as compared with that of normal individuals.
상기 실험결과로부터 말초혈액 내의 자연살해 세포를 일부러 계수하지 않고서도 단위 말초혈액당 자연살해 세포의 세포 활성도를 LDH 기질 반응을 이용하여 측정함으로써 임상적으로 유의미한 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다. 특히, 후술하는 실시예 2에서 확인되는 바와 같이, 정상인에 비하여 암 환자에서 단위 말초혈액 당 자연살해 세포의 수가 현저히 증가하였음을 고려한다면, 상기 실험결과는 매우 유의미한 정보를 제공함을 알 수 있다. From the above experimental results, it was confirmed that clinically meaningful results can be obtained by measuring the cell activity of natural killer cells per unit peripheral blood using the LDH substrate reaction without intentionally counting the natural killer cells in the peripheral blood. Particularly, as can be seen in Example 2 to be described later, it can be seen that the experimental results provide very meaningful information, considering that the number of natural killer cells per unit peripheral blood was remarkably increased in cancer patients as compared with normal persons.
실시예 2. 면역세포의 형태학적 표현형 분석 Example 2. Morphological phenotype analysis of immune cells
상기 실시예 1의 단위혈액당 자연살해 세포의 활성도 분석에 보조하여 단위 말초혈액 내 면역세포들의 분포도 분석과 세포수 분석을 다음과 같이 수행하였다. In order to analyze the activity of natural killer cells per unit blood of Example 1, the distribution of immune cells in the peripheral blood and the cell number analysis were performed as follows.
(1) 면역세포 분포도 분석 (1) Immunocyte distribution analysis
상기 실시예 1의 (1)에서 얻은 PBMC 세포배양액 중 50 ㎕ 을 각각 12x75 ㎜ 폴리스티렌 튜브 3개에 넣었다. 그 다음, 다음의 면역세포들을 항체를 이용한 세포 염색을 통하여 분석하였다:50 μl of the PBMC cell culture solution obtained in (1) of Example 1 was placed into three 12 × 75 mm polystyrene tubes. The following immune cells were then analyzed by means of antibody staining:
CD3+ T 세포; CD3 + T cells;
CD3+,CD4+ 헬퍼 T 세포; CD3 + , CD4 + helper T cells;
CD3+,CD8+ 세포독성 T 세포;CD3 + , CD8 + cytotoxic T cells;
CD3-,CD56+ 자연살해 세포;CD3 - , CD56 + natural killer cells;
CD3+,CD56+ 자연살해 T 세포;CD3 + , CD56 + natural killer T cells;
CD19+ B 세포.CD19 + B cells.
구체적으로, PBMC 면역세포 내 존재하는 위 6종의 면역세포를 분석하기 위해 다음과 같이 항체 조합을 만들었다. Specifically, antibody combinations were made as follows to analyze the above six immune cells present in PBMC immunocytes.
FITC-접합 마우스 항-인간 CD3 IgG(Becton Dikinson, Cat. No. 555339)와 PE-접합 마우스 항-인간 CD8 IgG(Becton Dikinson, Cat. No. 555367) 및 PECy5 마우스 항-인산 CD4 IgG(Becton Dikinson, Cat. No. 555348)의 항체 5 ㎕ 씩을 하나의 튜브에 혼합하여 PBMC 면역세포를 염색하였다 (이를 통해 하나의 튜브에서 CD3 T 세포와 CD4 헬퍼 T 세포 및 CD8 세포독성 T 세포, 3종을 분석할 수 있다). 마찬가지로 또다른 튜브에는 FITC-접합 마우스 항-인간 CD3 IgG(Becton Dikinson, Cat. No. 555339) 와 PE-접합 마우스 항-인간 CD56 IgG(Becton Dikinson, Cat. No. 555516) 및 PECy5 마우스 항-인간 CD19 IgG(Becton Dikinson, Cat. No. 555414)를 5 ㎕씩 혼합하여 PBMC 면역세포를 염색하였다 (이를 통해 CD3-CD56+ 자연살해 세포와 CD3+CD56+ 자연살해 T 세포 및 CD19+ B 세포를 분석할 수 있다). 항체의 염색은 빛을 차단하고 어두운 곳에서 상온에서 20분간 진행을 하였다. 또한 대조군으로 염색하지 않은 PBMC 면역세포도 함께 준비하였다.FITC-conjugated mouse anti-human CD3 IgG (Becton Dikinson, Cat. No. 555339) and PE-conjugated mouse anti-human CD8 IgG (Becton Dikinson, Cat. No. 555367) and PECy5 mouse anti-phosphate CD4 IgG , Cat. No. 555348) were mixed in a single tube to stain PBMC immune cells (thereby analyzing CD3 T cells, CD4 helper T cells and CD8 cytotoxic T cells, three species in one tube can do). Similarly, another tube contained FITC-conjugated mouse anti-human CD3 IgG (Becton Dikinson, Cat. No. 555339) and PE-conjugated mouse anti-human CD56 IgG (Becton Dikinson, Cat. No. 555516) and PECy5 mouse anti- a mixture of CD19 IgG (. Becton Dikinson, Cat No. 555414) by 5 ㎕ were stained PBMC immune cells (this CD3 - CD56 + natural killer cells, and analyzing the CD3 + CD56 + natural killer T-cells and CD19 + B cells can do). Antibody staining was carried out for 20 minutes at room temperature in the dark in order to block light. PBMC immune cells not dyed as a control group were also prepared.
염색이 끝난 PBMC는 PBS 완충 용액을 각각 2 ㎖ 씩 튜브에 넣어 원심분리 (250 x g 5분간 상온)하여 과잉의 염색 항체를 제거하였다. 이후 다시 튜브에 200 ㎕ 씩의 PBS 완충 용액을 넣어 세포를 현탁시키고 바로 유세포 분석기를 통해 면역세포를 분석하였다.The stained PBMCs were washed twice with PBS buffer (2 ml each) and centrifuged (250 x g for 5 min at room temperature) to remove excess staining antibodies. Then, the cells were suspended in 200 μl of PBS buffer solution in a tube, and the immune cells were immediately analyzed using a flow cytometer.
그 결과를 도 2 및 도 3에 나타냈다. 정상인들에 대한 림프구 세포 아형 분석 결과는 도 2와 같은 패턴을 나타냈으며, 암 환자들에 대한 림프구 세포 아형 분석 결과는 도 3과 같은 패턴을 나타내었다. 도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 암 환자의 단위 말초혈액에는 정상인에 비하여 자연살해 세포 (NK 세포)가 현저히 높은 비율로 존재하는 것으로 확인되었다. The results are shown in Fig. 2 and Fig. The results of the lymphocyte subtype analysis for normal persons showed the pattern as shown in FIG. 2, and the results of the lymphocyte subtype analysis for cancer patients showed the pattern as shown in FIG. As shown in FIGS. 2 and 3, it was confirmed that natural killer cells (NK cells) were present at a significantly higher rate in the peripheral blood of cancer patients than in normal persons.
즉, 암 환자의 단위 말초혈액 내에 자연살해 세포의 비율이 현저히 증가되어 있음이 확인되었다. 이러한 결과는 환자에서 단위 말초혈액당 자연살해 세포의 세포수가 현저히 많아, 환자의 면역활성을 확인하기 위하여는 자연살해 세포의 수를 계수하여 동일한 수의 자연살해 세포에 대하여 세포 활성도를 측정해야 함을 시사한다. 그러나, 상기 실시예 1에서 확인된 바와 같이, 본 발명자들은 예상치 못하게 말초혈액 내 자연살해 세포의 세포수를 계수하지 않고서도 환자와 정상인 간에 면역활성을 비교, 평가할 수 있는 단위 말초혈액당 세포 활성도의 개념을 처음으로 발견하고, 이에 최적화된 단계들로 구성된 방법으로 환자의 면역활성을 평가할 수 있는 방법을 확립하였다. That is, the proportion of natural killer cells in the peripheral blood of cancer patients was significantly increased. These results suggest that the number of natural killer cells per unit peripheral blood is significantly increased in patients, and that the number of natural killer cells should be counted in order to determine the immunological activity of the patient, and cell activity should be measured for the same number of natural killer cells It suggests. However, as confirmed in Example 1 above, the present inventors have unexpectedly found that the cell activity per unit peripheral blood, which can compare and evaluate the immunological activity between the patient and the normal person without counting the number of cells of the natural killer cells in the peripheral blood, The concept was first discovered and a method was developed to evaluate the immune activity of the patient in a way that consisted of optimized steps.
(2) 단위 혈액당 세포수 분석(2) Analysis of the number of cells per unit blood
5cc 의 혈액을 혈청 분리 튜브 (SST: serum separation tube)에 채혈하였다. 채혈한 혈액을 자동혈구 분석기(automated hematology analyzer) 로 백혈구 (WBC)의 수와 림프구 세포의 혈액 당 세포 수 (cells/㎕)을 계산하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 5 cc of blood was collected in a serum separation tube (SST). Blood samples were collected using an automated hematology analyzer to calculate the number of white blood cells (WBC) and the number of cells per blood (cells / μl) of lymphocytes. The results are shown in Table 2 below.
[표 2] 정상인과 환자의 말초혈액 면역세포 조성[Table 2] Peripheral Blood Immune Cell Composition of Normal Subjects and Patients
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 환자에서 단위 혈액당 NK 세포의 수는 432±299 개로 정상인의 357±199 개에 비하여 유의적으로 증가된 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 상기 (1)에서 확인한 결과와 일치함을 알 수 있다. As shown in Table 2, the number of NK cells per unit blood in the patient was 432 ± 299, which was significantly increased compared to 357 ± 199 in normal persons. These results are consistent with the results confirmed in (1) above.
실시예 3. 단위 말초혈액당 자연살해 세포의 세포 활성도와 세포수 간의 상관관계 확인 Example 3: Correlation between cell activity and cell number of natural killer cells per unit peripheral blood
(1) 암세포(K562 세포)에 대한 세포 활성도 측정(1) Measurement of cell activity on cancer cells (K562 cells)
암 환자 195명 및 정상인 209명에 대하여, 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 단위 말초혈액당 자연살해 세포의 세포 활성도(%)를 측정하였다. Cell activity (%) of natural killer cells per unit peripheral blood was measured for 195 cancer patients and 209 normal persons in the same manner as described in Example 1 above.
(2) 단위 혈액당 세포수 분석(2) Analysis of the number of cells per unit blood
상기 암 환자 195명 및 정상인 209명에 대하여, 상기 실시예 2. (2)에 기재된 방법과 동일한 방법으로 단위 말초혈액당 자연살해 세포의 세포수(cells/㎕)를 계수하였다. The number of cells (cells / μl) of natural killer cells per unit peripheral blood was counted in the same manner as described in Example 2. (2) above, for 195 cancer patients and 209 normal persons.
(3) 단위 말초혈액당 자연살해 세포의 세포 활성도와 상관관계 분석(3) Cellular activity and correlation analysis of natural killer cells per unit peripheral blood
상기 (1)에서 측정된 암 환자 및 정상인의 단위 말초혈액당 자연살해 세포의 세포 활성도 값을 Y축으로 하고, 상기 (2)에서 계수된 암 환자 및 정상인의 단위 말초혈액당 자연살해 세포의 세포수 값을 X축으로 하여, 암 환자와 정상인에서 각각 자연살해 세포의 단위 말초혈액당 세포 활성도와 세포수 사이의 상관관계를 분석하였다. The cell activity values of the natural killer cells per unit peripheral blood of the cancer patient and the normal person measured in the above (1) are taken as the Y axis, and the cells of the natural killer cells per unit peripheral blood of the cancer patients and normal individuals counted in the above (2) The correlation between cell activity and cell number per unit peripheral blood of natural killer cells in both cancer patients and normal subjects was analyzed with the number value as the X axis.
그 분석결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다. The results of the analysis are shown in FIG. 4 and FIG.
상기 분석결과로부터 도출된 환자군과 정상인의 단위 말초혈액당 자연살해 세포의 세포 독성도 값과 세포수 간의 상관관계식은 다음과 같았다. The correlation between the cytotoxicity value and the cell number of the natural killer cells per unit peripheral blood of the patient group and the normal person derived from the above analysis results was as follows.
환자군의 상관관계식 : Y = 0.011 X + 8.2691Correlation formula of patient group: Y = 0.011 X + 8.2691
정상인의 상관관계식 : Y = 0.0216 X + 10.068Correlation formula of normal person: Y = 0.0216 X + 10.068
상기 상관관계식은 단위 말초혈액당 자연살해 세포의 세포수로부터 예상 세포 활성도를 도출하거나, 역으로 단위 말초혈액당 자연살해 세포의 세포 활성도로부터 자연살해 세포의 세포수를 도출하는데 유리하게 이용될 수 있다. 따라서, 위 상관관계식은 환자에 대하여 정상인 수준으로 세포 활성도 값을 향상시키기 위한 목표값 및 예상값을 계산하는데 유리하게 사용될 수 있다. The correlation equation can be advantageously used to derive expected cell activity from the number of natural killer cells per unit peripheral blood or conversely to derive the number of natural killer cells from the cell activity of natural killer cells per unit peripheral blood . Thus, the above correlation can be advantageously used to calculate a target value and an expected value for improving the cell activity value to a normal level for a patient.
실시예 4. 정상인의 단위 말초혈액당 면역세포 분포 분석Example 4. Analysis of immune cell distribution per unit peripheral blood of a normal person
정상인 339명으로부터 말초혈액 시료를 채취하여 상기 실시예 2에 기재된 방법과 동일한 방법으로 말초혈액 림프구 세포의 아형(lymphocyte subsets)의 분포도(%) 및 표현형을 분석하였다. 그 분석결과는 다음과 같았다. Peripheral blood samples were collected from 339 normal subjects and the distribution (%) and phenotype of lymphocyte subsets of peripheral blood lymphocyte cells were analyzed in the same manner as described in Example 2 above. The results of the analysis were as follows.
[표 3] 정상인 339명의 단위 말초혈액 림프구 세포 아형 분포도 및 표현형 분석 결과[Table 3] Distribution and phenotypic analysis of 339 normal peripheral blood lymphocyte subsets
상기 정상인의 말초혈액 면역세포의 분포도(%) 및 세포수(cells/㎕)에 기초하여 환자의 말초혈액 면역세포의 형태학적 검사를 비교 조사하여 환자의 면역세포 분포도에 이상이 있는지 여부를 파악할 수 있다. Based on the distribution (%) and the number of cells (cells / 쨉) of the peripheral blood immune cells of the normal person, morphological examination of the peripheral blood immune cells of the patient is compared and it can be determined whether or not there is abnormality in the immune cell distribution of the patient have.
Claims (12)
(2) 상기 (1)에서 분리된 말초혈액 단핵구 세포군을 세포 배양액에 현탁시키는 단계;
(3) 상기 (1), (2) 단계와 별도로 암세포 주를 준비하는 단계;
(4) 5개 이상의 웰을 갖는 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 다음의 시험군을 준비하는 단계:
(i) 세포 배양액만을 함유하는 시험군(시험군 (i)),
(ii) 상기 (3) 단계에서 준비한 암세포주와 세포 배양액을 함유하는 1개 이상의 제1 시험군(시험군 (ii)),
(iii) 상기 (3) 단계에서 준비한 암세포주 및 세포 배양액을 함유하는 1개 이상의 제2 시험군(시험군 (iii)),
(iv) 상기 (2) 단계에서 준비한 말초혈액 단핵구 세포군 및 세포 배양액을 함유하는 시험군(시험군 (iv)), 및
(v) 상기 (2) 단계에서 준비한 말초혈액 단핵구 세포군, 상기 (3) 단계에서 준비한 암세포주 및 세포 배양액을 함유하는 시험군(시험군 (v));
(5) 상기 (4) 단계에서 준비된 멀티 웰 플레이트를 인큐베이터 안에서 배양하는 단계;
(6) 상기 시험군 (ii)에만 세포 용해제(lytic agent)를 첨가하는 단계;
(7) 상기 배양된 시험군들에 젖산탈수소효소의 기질 용액을 첨가하고 반응시키는 단계;
(8) 반응 종결제를 첨가하는 단계;
(9) 흡광도 측정기를 이용하여 각 시험군들의 흡광도를 측정하는 단계; 및
(10) 상기 시험군 (v)의 흡광도에서 상기 시험군 (iv)의 흡광도와 상기 시험군 (iii)의 흡광도 및, 상기 시험군 (i)의 흡광도를 뺀 값을, 상기 시험군 (ii)의 흡광도에서 상기 시험군 (iii)의 흡광도와 상기 시험군 (i)의 흡광도를 뺀 값으로 나눈 값을 산출하여 개체의 자연살해 세포의 세포 활성도를 결정하는 단계를 포함하는 개체의 면역활성 평가방법.(1) separating a peripheral blood mononuclear cell group from a peripheral blood sample;
(2) suspending the peripheral blood mononuclear cell group separated in (1) in a cell culture solution;
(3) preparing a cancer cell line separately from steps (1) and (2) above;
(4) preparing the following test groups in each well of a multi-well plate having five or more wells:
(i) a test group containing only a cell culture solution (test group (i)),
(ii) at least one first test group (test group (ii)) containing the cancer cell line prepared in the step (3) and the cell culture liquid,
(iii) one or more second test groups (test group (iii)) containing the cancer cell lines and the cell culture liquid prepared in the step (3),
(iv) a test group (test group (iv)) containing the peripheral blood mononuclear cell group and the cell culture liquid prepared in the step (2), and
(v) a test group (test group (v)) containing the peripheral blood mononuclear cell group prepared in the step (2), the cancer cell line prepared in the step (3) and the cell culture liquid;
(5) culturing the multi-well plate prepared in the step (4) in an incubator;
(6) adding a lytic agent only to the test group (ii);
(7) adding a substrate solution of lactate dehydrogenase to the cultured test groups and reacting;
(8) adding a reactive termination;
(9) measuring the absorbance of each test group using an absorbance meter; And
(10) The absorbance of the test group (ii) is determined by subtracting the absorbance of the test group (iv) from the absorbance of the test group (i) and the absorbance of the test group (iii) Of the test group (i) by the absorbance of the test group (iii) minus the absorbance of the test group (i) to determine the cell activity of the natural killer cells of the individual .
(2) 상기 (1)에서 분리된 말초혈액 단핵구 세포군을 세포 배양액에 현탁시키는 단계;
(3) 상기 (1), (2) 단계와 별도로 암세포 주를 준비하는 단계;
(4) 5개 이상의 웰을 갖는 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 다음의 시험군을 준비하는 단계:
(i) 세포 배양액만을 함유하는 시험군(시험군 (i)),
(ii) 상기 (3) 단계에서 준비한 암세포주와 세포 배양액을 함유하는 1개 이상의 제1 시험군(시험군 (ii)),
(iii) 상기 (3) 단계에서 준비한 암세포주 및 세포 배양액을 함유하는 1개 이상의 제2 시험군(시험군 (iii)),
(iv) 상기 (2) 단계에서 준비한 말초혈액 단핵구 세포군 및 세포 배양액을 함유하는 시험군(시험군 (iv)), 및
(v) 상기 (2) 단계에서 준비한 말초혈액 단핵구 세포군, 상기 (3) 단계에서 준비한 암세포주 및 세포 배양액을 함유하는 시험군(시험군 (v));
(5) 상기 (4) 단계에서 준비된 멀티 웰 플레이트를 인큐베이터 안에서 배양하는 단계;
(6) 상기 시험군 (ii)에만 세포 용해제(lytic agent)를 첨가하는 단계;
(7) 상기 배양된 시험군들에 젖산탈수소효소의 기질 용액을 첨가하고 반응시키는 단계;
(8) 반응 종결제를 첨가하는 단계;
(9) 흡광도 측정기를 이용하여 각 시험군들의 흡광도를 측정하는 단계; 및
(10) 상기 시험군 (v)의 흡광도에서 상기 시험군 (iv)의 흡광도와 상기 시험군 (iii)의 흡광도 및, 상기 시험군 (i)의 흡광도를 뺀 값을, 상기 시험군 (ii)의 흡광도에서 상기 시험군 (iii)의 흡광도와 상기 시험군 (i)의 흡광도를 뺀 값으로 나눈 값을 산출하여 개체의 면역활성에 관한 정보로서 개체의 자연살해 세포의 세포 활성도를 결정하는 단계를 포함하는 개체의 면역활성에 관한 정보를 제공하는 방법.(1) separating a peripheral blood mononuclear cell group from a peripheral blood sample;
(2) suspending the peripheral blood mononuclear cell group separated in (1) in a cell culture solution;
(3) preparing a cancer cell line separately from steps (1) and (2) above;
(4) preparing the following test groups in each well of a multi-well plate having five or more wells:
(i) a test group containing only a cell culture solution (test group (i)),
(ii) at least one first test group (test group (ii)) containing the cancer cell line prepared in the step (3) and the cell culture liquid,
(iii) one or more second test groups (test group (iii)) containing the cancer cell lines and the cell culture liquid prepared in the step (3),
(iv) a test group (test group (iv)) containing the peripheral blood mononuclear cell group and the cell culture liquid prepared in the step (2), and
(v) a test group (test group (v)) containing the peripheral blood mononuclear cell group prepared in the step (2), the cancer cell line prepared in the step (3) and the cell culture liquid;
(5) culturing the multi-well plate prepared in the step (4) in an incubator;
(6) adding a lytic agent only to the test group (ii);
(7) adding a substrate solution of lactate dehydrogenase to the cultured test groups and reacting;
(8) adding a reactive termination;
(9) measuring the absorbance of each test group using an absorbance meter; And
(10) The absorbance of the test group (ii) is determined by subtracting the absorbance of the test group (iv) from the absorbance of the test group (i) and the absorbance of the test group (iii) And dividing the absorbance of the test group (iii) by the absorbance of the test group (i) minus the absorbance of the test group (i) to determine the cell activity of the natural killer cells of the individual as information on the immunological activity of the individual And providing information about the immune activity of the containing subject.
(2) 상기 (1)에서 분리된 말초혈액 단핵구 세포군을 세포 배양액에 현탁시키는 단계;
(3) 상기 (1), (2) 단계와 별도로 암세포 주를 준비하는 단계;
(4) 5개 이상의 웰을 갖는 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 다음의 시험군을 준비하는 단계:
(i) 세포 배양액만을 함유하는 시험군(시험군 (i)),
(ii) 상기 (3) 단계에서 준비한 암세포주와 세포 배양액을 함유하는 1개 이상의 제1 시험군(시험군 (ii)),
(iii) 상기 (3) 단계에서 준비한 암세포주 및 세포 배양액을 함유하는 1개 이상의 제2 시험군(시험군 (iii)),
(iv) 상기 (2) 단계에서 준비한 말초혈액 단핵구 세포군 및 세포 배양액을 함유하는 시험군(시험군 (iv)), 및
(v) 상기 (2) 단계에서 준비한 말초혈액 단핵구 세포군, 상기 (3) 단계에서 준비한 암세포주 및 세포 배양액을 함유하는 시험군(시험군 (v));
(5) 상기 (4) 단계에서 준비된 멀티 웰 플레이트를 인큐베이터 안에서 배양하는 단계;
(6) 상기 시험군 (ii)에만 세포 용해제(lytic agent)를 첨가하는 단계;
(7) 상기 배양된 시험군들에 젖산탈수소효소의 기질 용액을 첨가하고 반응시키는 단계;
(8) 반응 종결제를 첨가하는 단계;
(9) 흡광도 측정기를 이용하여 각 시험군들의 흡광도를 측정하는 단계; 및
(10) 상기 시험군 (v)의 흡광도에서 상기 시험군 (iv)의 흡광도와 상기 시험군 (iii)의 흡광도 및, 상기 시험군 (i)의 흡광도를 뺀 값을, 상기 시험군 (ii)의 흡광도에서 상기 시험군 (iii)의 흡광도와 상기 시험군 (i)의 흡광도를 뺀 값으로 나눈 값을 산출하여 개체의 자연살해 세포의 세포 활성도를 결정하는 단계를 포함하여 세포수 계수가 필요 없는 것을 특징으로 하는, 개체의 자연살해 세포의 세포 활성도 측정방법.
(1) separating a peripheral blood mononuclear cell group from a peripheral blood sample;
(2) suspending the peripheral blood mononuclear cell group separated in (1) in a cell culture solution;
(3) preparing a cancer cell line separately from steps (1) and (2) above;
(4) preparing the following test groups in each well of a multi-well plate having five or more wells:
(i) a test group containing only a cell culture solution (test group (i)),
(ii) at least one first test group (test group (ii)) containing the cancer cell line prepared in the step (3) and the cell culture liquid,
(iii) one or more second test groups (test group (iii)) containing the cancer cell lines and the cell culture liquid prepared in the step (3),
(iv) a test group (test group (iv)) containing the peripheral blood mononuclear cell group and the cell culture liquid prepared in the step (2), and
(v) a test group (test group (v)) containing the peripheral blood mononuclear cell group prepared in the step (2), the cancer cell line prepared in the step (3) and the cell culture liquid;
(5) culturing the multi-well plate prepared in the step (4) in an incubator;
(6) adding a lytic agent only to the test group (ii);
(7) adding a substrate solution of lactate dehydrogenase to the cultured test groups and reacting;
(8) adding a reactive termination;
(9) measuring the absorbance of each test group using an absorbance meter; And
(10) The absorbance of the test group (ii) is determined by subtracting the absorbance of the test group (iv) from the absorbance of the test group (i) and the absorbance of the test group (iii) (Iii) by subtracting the absorbance of the test group (i) from the absorbance of the test group (i) to determine the cell activity of the natural killer cells of the individual. And measuring the cell activity of the natural killer cell of the individual.
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| KR1020130129788A KR101483883B1 (en) | 2013-10-30 | 2013-10-30 | A novel method for assessing immuno-activity without cell counting |
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