JP2008245601A - ヒト一本鎖抗体遺伝子断片の効率的な新規調製法 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒト抗体のＳｃＦｖ断片を大量に得ることができる、効率的な調製方法を提供する。
【解決手段】それぞれＰＣＲ法により、抗体重鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（重鎖断片）及び軽鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（軽鎖断片）を増幅し、これら重鎖断片と軽鎖断片を重鎖断片−重鎖リンカー配列−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む重鎖複合断片と、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−軽鎖リンカー配列−軽鎖断片を含む軽鎖複合断片として増幅し、重鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、前記軽鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させ、ライゲーション産物を制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＮｈｅＩで消化した後、重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片として増幅する方法。
【選択図】図３

Description

本発明は、ヒトＳｃＦｖ（single chain Fragment of variable region）断片（ヒト一本鎖抗体遺伝子断片）の効率的な新規な調製方法や、該調製方法により得られるヒト一本鎖抗体遺伝子断片や、該ヒト一本鎖抗体遺伝子断片が組み込まれたファージミドベクター又はファージベクターや、該ファージミドベクター又はファージベクターにより形質転換された大腸菌や、該大腸菌を用いて作製されたファージディスプレイヒト一本鎖抗体ライブラリーに関する。

抗体は、生物が進化の過程で獲得した最も高度な生体防御分子の一つであり、生体の防御機構（免疫系）の中心に位置する。抗体蛋白をコードする遺伝子は、ゲノム上の広範な領域に極めて多数の種類がクラスターとして存在し、免疫系B細胞においてのみ分化の過程で体細胞遺伝子組換えを起こして各細胞に固有な抗体遺伝子が形成される。生体は本質的にありとあらゆる分子に対する抗体の産生が可能であるが、この驚異的な多様性／柔軟性の成因は多種の抗体遺伝子の組合わせと、さらに、形成された固有な遺伝子に変異を生じさせる生体機構の働きである。抗体は各種哺乳動物や鶏に抗原を投与（免疫）してポリクローナル（多価）抗体として作製されてきたが、免疫マウス脾臓細胞と骨髄腫細胞の融合細胞、ハイブリドーマによるモノクローナル（単価）抗体の作製技術が確立して以来、同抗体は生命科学の発展に計り知れない恩恵をもたらしてきた。モノクローナル抗体は、極めて多様性が高く、病原因子の排除に有効な抗体だが、医薬品としての開発にはさらに多くの年月を要した。主な原因は、ヒト抗体の作製技術の欠如と倫理的な問題（抗体取得を目的としたヒトの免疫は通常行えない）である。近年の分子生物学手法の発達は、試験管内における抗体蛋白の機能の再構築を可能にした。その方法はファージ抗体法と呼ばれる。

ファージ抗体法は、Winterら（例えば、非特許文献１参照）によって１９９１年に報告されて以来、世界中で数多くの研究で用いられてきた。この方法では、Ｂ細胞で発現する重鎖及び軽鎖抗体遺伝子の可変領域のみをそれぞれＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)を用いてクローニングし、両遺伝子を人為的に結合、線維状バクテリオファージＭ１３の外殻蛋白ｇ３ｐとの融合蛋白として発現させる。抗原に対し、Ｂ細胞で産生された抗体が重鎖−軽鎖の四量体として達成していた親和性及び特異性を試験管内で再構築する方法である。多種多様なソースのＢ細胞から作製が可能であるが、ある抗原と特異的に結合するクローンを得るためにライブラリーと呼ばれる多種類の遺伝子配列／組み合わせをもつ母集団を作出し、この中から目的とするものを選抜する。一般にこのライブラリーに必要な多様性は、１０^９種類以上とされている（例えば、非特許文献２参照）。

ファージ抗体法は、様々な意味で大変有用かつ有効な方法であるが、欧米に比べて我国における本法の普及・進展の度合いはかなり劣るものと思われる。実際、欧米の企業が本法で得られた遺伝子由来の抗体医薬を開発のパイプラインに乗せているのに対し、我国の企業ではここ数年、本法に基礎を置くシステムの使用権利を莫大な金額で購入する事例が相次いで報道されている。我国における本法発展の妨げとなった原因のひとつは、方法的な困難さであろう。実際に手掛けてみると、高い多様性をもつライブラリーの作出は大変難しく、多くの時間と労力を要することが実感される。その最初の関門と言えるのがＰＣＲによる一本鎖抗体遺伝子断片（Single Chain Fv Fragment；ＳｃＦｖ断片）の調製である。

Nature 348, 552-554, 1990 Phage Display, Clackson T and Lowman HB ed. pp. 243-288, Oxford University Press, 2004

本発明の課題は、ヒトＳｃＦｖ断片を大量に得ることができる効率的なＳｃＦｖ断片の新規な調製方法を提供することにある。

本発明者らは、抗体重鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（重鎖断片）及び軽鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（軽鎖断片）をＰＣＲ法により増幅し、これら重鎖断片と軽鎖断片をＰＣＲ法によりそれぞれ重鎖断片−重鎖リンカー配列−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む重鎖複合断片と、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−軽鎖リンカー配列−軽鎖断片を含む軽鎖複合断片として増幅し、重鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、前記軽鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させ、ライゲーション産物を制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＮｈｅＩで消化した後、重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片としてＰＣＲ法により増幅すると、ヒトＳｃＦｖ断片を大量かつ効率よく調製しうることを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の（Ａ）〜（Ｅ）の工程を順次備えたことを特徴とするヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（Ａ）ヒト抗体重鎖遺伝子を、抗体重鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＨＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＨＶアンチセンス配列）からなるプライマー対を用いたＰＣＲ反応、並びに、ヒト抗体軽鎖遺伝子を、抗体軽鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＬＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＬＶアンチセンス配列）からなるプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、それぞれ抗体重鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（重鎖断片）及び軽鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（軽鎖断片）として増幅する工程；
（Ｂ）前記重鎖断片を、前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーと、制限酵素ＸｂａＩ認識配列、重鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応、並びに、前記軽鎖断片を、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、それぞれ重鎖断片−重鎖リンカー配列［Ｉ］−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む重鎖複合断片と、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−軽鎖リンカー配列［Ｉ］−軽鎖断片を含む軽鎖複合断片として増幅する工程；
（Ｃ）前記重鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、前記軽鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させる工程；
（Ｄ）ライゲーション産物を、制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＮｈｅＩで消化する工程；
（Ｅ）前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片を増幅する工程；
（２）以下の（Ａ）〜（Ｅ）の工程を順次備えたことを特徴とするヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（Ａ）ヒト抗体重鎖遺伝子を、抗体重鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＨＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＨＶアンチセンス配列）からなるプライマー対を用いたＰＣＲ反応、並びに、ヒト抗体軽鎖遺伝子を、抗体軽鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＬＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＬＶアンチセンス配列）からなるプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、それぞれ抗体重鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（重鎖断片）及び軽鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（軽鎖断片）として増幅する工程；
（Ｂ）前記軽鎖断片を、前記ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーと、制限酵素ＸｂａＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［II］及び前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応、並びに、前記重鎖断片を、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、重鎖リンカー配列［II］及び前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、それぞれ軽鎖断片−軽鎖リンカー配列［II］−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む軽鎖複合断片と、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−重鎖リンカー配列［II］−重鎖断片を含む重鎖複合断片として増幅する工程；
（Ｃ）前記軽鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、前記重鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させる工程；
（Ｄ）ライゲーション産物を、制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＮｈｅＩで消化する工程；
（Ｅ）前記ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片を増幅する工程；
（３）ヒトＳｃＦｖ断片が、両端部に、制限酵素ＸｂａＩ認識配列及び制限酵素ＮｈｅＩ認識配列以外の、制限酵素認識配列を有することを特徴とする上記（１）又は（２）記載のＳｃＦｖ断片の調製方法。

（４）抗体重鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＨＶセンス配列）が、配列番号１〜６に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（５）抗体重鎖可変部領域に特異的なアンチセンスプライマー配列（ＨＶアンチセンス配列）が、配列番号７〜１０に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（６）抗体軽鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＬＶセンス配列）が、配列番号１１〜１６及び２２〜２８に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列であることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（７）抗体軽鎖可変部領域に特異的なアンチセンスプライマー配列（ＬＶアンチセンス配列）が、配列番号１７〜２１及び２９〜３１に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（８）ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーとして、配列番号３２〜３７に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする上記（１）及び（３）〜（７）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（９）制限酵素ＸｂａＩ認識配列、重鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとして、配列番号３８〜４１に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする上記（１）及び（３）〜（８）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（１０）制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーとして、配列番号４２〜４７及び５３〜５９に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする上記（１）及び（３）〜（９）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（１１）ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとして、配列番号４８〜５２及び６０〜６２に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする上記（１）及び（３）〜（１０）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（１２）ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーとして、配列番号６３〜６８及び７４〜８０に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする上記（２）〜（１１）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（１３）制限酵素ＸｂａＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［II］及び前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとして、配列番号６９〜７３及び８１〜８３に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする上記（２）〜（１２）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（１４）制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、重鎖リンカー配列［II］及び前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーとして、配列番号８４〜８９に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする上記（２）〜（１３）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（１５）ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとして、配列番号９０〜９３に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする上記（２）〜（１４）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。

（１６）ＰＣＲに、ポリメラーゼとして、改変型Ｔａｑポリメラーゼとproof-reading活性を持つ酵素であるＰｆuポリメラーゼを混合したタイプの酵素（PicoMaxx High Fidelity PCR system、STRATAGENE社）を用いることを特徴とする上記（１）〜（１５）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（１７）上記（１）〜（１６）のいずれか記載の調製方法により得られることを特徴とするヒトＳｃＦｖ断片。
（１８）上記（１７）記載のヒトＳｃＦｖ断片が組み込まれたことを特徴とするファージミドベクター又はファージベクター。
（１９）上記（１８）記載のファージミドベクター又はファージベクターにより形質転換されたことを特徴とする大腸菌。
（２０）上記（１９）記載の大腸菌を用いて作製されたことを特徴とするファージディスプレイヒト一本鎖抗体ライブラリー。

本発明によると、ヒトＳｃＦｖ断片を大量かつ効率よく調製しうることができ、その結果、多様性に富んだファージディスプレイヒト一本鎖抗体ライブラリーを効率よく構築することが可能となる。

本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法は、重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片の調製方法と、軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片の調製方法からなり、２つの調製方法は基本的に同じ方法であるが、以下、前者を調製方法［Ｉ］、後者を調製方法［II］ということがある。

本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［Ｉ］及び［II］に共通する工程（１）、すなわち、抗体重鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（重鎖断片）及び軽鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（軽鎖断片）を増幅する工程における、抗体重鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＨＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＨＶアンチセンス配列）、並びに、抗体軽鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＬＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＬＶアンチセンス配列）を有する各プライマーは、抗体ライブラリー作製のためのヒト抗体可変領域遺伝子クローニング用プライマーとしてすでに報告（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（J. Mol. Biol.）、２２２巻、３号、５８１〜５９７頁及びプロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）９５巻、６１５７〜６１６２頁参照）されているものであれば、１種又は２種以上を特に制限されることなく用いることができ、例えば、ＨＶセンス配列として配列番号１〜６に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列、好ましくは６種の配列を、ＨＶアンチセンス配列として配列番号７〜１０に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列、好ましくは４種の配列を、ＬＶセンス配列として配列番号１１〜１６及び２２〜２８に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列、好ましくは１３種の配列を、ＬＶアンチセンス配列として配列番号１７〜２１及び２９〜３１に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列、好ましくは８種の配列を、具体的に挙げることができる。

本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［Ｉ］の工程（２）の重鎖断片−重鎖リンカー配列［Ｉ］−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む重鎖複合断片を増幅する工程における、重鎖断片増幅用のセンスプライマーとしては、前記ＨＶセンス配列を含むプライマーであれば特に制限されないが、制限酵素ＸｂａＩ認識配列及び制限酵素ＮｈｅＩ認識配列以外の制限酵素の認識配列を有するプライマーが好ましく、例えば、それぞれ制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を有する配列番号３２〜３７に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上、好ましくは６種のプライマーを挙げることができ、また、重鎖断片増幅用のアンチセンスプライマーとしては、制限酵素ＸｂａＩ認識配列、重鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＨＶアンチセンス配列を含むプライマーであれば特に制限されず、例えば、配列番号３８〜４１に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上、好ましくは４種のプライマーを挙げることができる。

また、本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［Ｉ］の工程（２）の制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−軽鎖リンカー配列［Ｉ］−軽鎖断片を含む軽鎖複合断片を増幅する工程における、軽鎖断片増幅用のセンスプライマーとしては、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＬＶセンス配列を含むプライマーであれば特に制限されず、例えば、配列番号４２〜４７及び５３〜５９に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上、好ましくは１３種のプライマーを挙げることができ、また、軽鎖断片増幅用のアンチセンスプライマーとしては、前記ＬＶアンチセンス配列を含むプライマーであれば特に制限されないが、制限酵素ＸｂａＩ認識配列及び制限酵素ＮｈｅＩ認識配列以外の制限酵素の認識配列を有するプライマーが好ましく、例えば、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩの認識配列を有する配列番号４８〜５２及び６０〜６２に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上、好ましくは６種のプライマーを挙げることができる。

本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［II］の工程（２）の軽鎖断片−軽鎖リンカー配列［II］−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む軽鎖複合断片を増幅する工程における、軽鎖断片増幅用のセンスプライマーとしては、前記ＬＶセンス配列を含むプライマーであれば特に制限されないが、制限酵素ＸｂａＩ認識配列及び制限酵素ＮｈｅＩ認識配列以外の制限酵素の認識配列を有するプライマーが好ましく、例えば、それぞれ制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を有する配列番号６３〜６８及び７４〜８０に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上、好ましくは１３種のプライマーを挙げることができ、また、軽鎖断片増幅用のアンチセンスプライマーとしては、制限酵素ＸｂａＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［II］及び前記ＬＶアンチセンス配列を含むプライマーであれば特に制限されず、例えば、配列番号６９〜７３及び８１〜８３に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上、好ましくは８種のプライマーを挙げることができる。

また、本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［II］の工程（２）の制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−重鎖リンカー配列［II］−重鎖断片を含む重鎖複合断片を増幅する工程における、重鎖断片増幅用のセンスプライマーとしては、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、重鎖リンカー配列［II］及び前記ＨＶセンス配列を含むプライマーであれば特に制限されず、例えば、配列番号８４〜８９に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上、好ましくは６種のプライマーを挙げることができ、また、重鎖断片増幅用のアンチセンスプライマーとしては、前記ＨＶアンチセンス配列を含むプライマーであれば特に制限されないが、制限酵素ＸｂａＩ認識配列及び制限酵素ＮｈｅＩ認識配列以外の制限酵素の認識配列を有するプライマーが好ましく、例えば、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩの認識配列を有する配列番号９０〜９３に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上、好ましくは４種のプライマーを挙げることができる。

上記重鎖リンカー配列［Ｉ］、軽鎖リンカー配列［Ｉ］、軽鎖リンカー配列［II］及び重鎖リンカー配列［II］としては特に制限されるものではないが、目的とする重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片や軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片とした場合におけるリンカー配列の長さが５残基程度から２０残基程度となるものが好ましく、かかるリンカー配列として、グリシン４残基とセリン１残基を１単位（ＧＳ配列）として３単位タンデムに繰り返す配列からなるＧＳリンカーを好適に例示することができるが、水溶性を上げるためＡｒｇを導入したものなども用いることができる。また、重鎖リンカー配列［Ｉ］と軽鎖リンカー配列［II］、及び／又は軽鎖リンカー配列［Ｉ］と重鎖リンカー配列［II］を同じ配列とすることもできる。

本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［Ｉ］の工程（３）において、重鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、軽鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させたり、本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［II］の工程（３）において、軽鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、重鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させると、連結部から制限酵素ＸｂａＩ及びＮｈｅＩの認識配列が消失し、制限酵素ＸｂａＩ及びＮｈｅＩで切断することができないライゲーション産物（重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片と軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片）が得られることになる。なお、上記ライゲーション産物には、重鎖断片同士の連結産物（重鎖断片−リンカー配列−制限酵素認識配列−リンカー配列−重鎖断片）や軽鎖断片同士の連結産物（軽鎖断片−リンカー配列−制限酵素認識配列−リンカー配列−軽鎖断片）も含まれる。

本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［Ｉ］及び［II］に共通する工程（４）、すなわち、ライゲーション産物を、制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＮｈｅＩで消化する工程により、ライゲーション産物中の上記重鎖断片同士の連結産物及び上記軽鎖断片同士の連結産物は切断されるが、目的とするライゲーション産物（重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片と軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片）は切断されることなく、次工程でＰＣＲ反応により目的とするライゲーション産物のみが増幅されることになる。

本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［Ｉ］の工程（５）において、前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片が増幅され、また、本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［II］の工程（５）において、前記LＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記HＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片が増幅される。

本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［Ｉ］及び［II］におけるＰＣＲの反応条件は特に限定されるものではないが、ポリメラーゼとして、改変型Ｔａｑポリメラーゼとproof-reading活性を持つ酵素であるＰｆuポリメラーゼを混合したタイプの酵素（PicoMaxx High Fidelity PCR system、STRATAGENE社）を用いることが増幅効率の点で好ましい。

本発明はまた、本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法により得られるヒトＳｃＦｖ断片自体や、このヒトＳｃＦｖ断片が組み込まれたファージミドベクター又はファージベクターや、これらファージミドベクター又はファージベクターにより形質転換された大腸菌や、この大腸菌を用いて作製されたファージディスプレイヒト一本鎖抗体ライブラリーに関する。上記ファージミドベクターやファージベクターは、ファージディスプレイに用いられるが、上記ファージミドベクターを好適に用いることができる。ファージミドベクターは、ファージへのパッケージングシグナルを含んだプラスミドベクターであり、繊維状ファージゲノムの一部を含むようにして作製されたプラスミドであるために、ファージミドベクターを用いて大腸菌を形質転換した後、更にヘルパーファージに感染させる必要があり、これによって粒子形成のためのコート蛋白質が供給されて、ヘルパーファージ粒子とファージミド粒子が混合したファージが得られる。他方、ファージゲノムを改良してベクター化したファージベクターの場合には、一つのベクター内にファージの全ゲノムを含み、単独でファージを形成することができ、ファージベクターを大腸菌に感染させることによって直接ファージを得ることが可能であり、ヘルパーファージを使用する必要はないが、余計なファージ構成タンパクが発現されることになる。

本発明のヒトＳｃＦｖ断片である重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片又は軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片を、ファージミドベクター又はファージベクターにインテグレイトすることにより、ヒト一本鎖抗体遺伝子ライブラリーを作製することができる。例えば、ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（アマシャム）を用いる場合、制限酵素ＮｃｏＩ（あるいはＳｆｉＩ）と制限酵素ＮｏｔＩとで、本発明のヒトＳｃＦｖ断片である重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片又は軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片と、ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅをそれぞれ処理した後、ライゲーションすることにより、ヒトＳｃＦｖ断片が組み込まれたファージミドベクターからなるヒト一本鎖抗体遺伝子ライブラリーを得ることができる。

このヒト一本鎖抗体断片が組み込まれたファージミドベクターの大腸菌への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。

本発明のファージディスプレイヒト一本鎖抗体ライブラリーとしては、多数の抗体を含むライブラリーであれば特に制限されるものではないが、理論的にはあらゆるタンパク質上の抗原エピトープに対応しうる、１０^９程度の多種多様なファージミド抗体又はファージ抗体からなるファージミド抗体ライブラリー又はファージ抗体ライブラリー（ファージディスプレイライブラリー）が好ましい。このファージディスプレイヒト一本鎖抗体ライブラリーは、例えば、前記増幅したヒトＳｃＦｖ断片が組み込まれたファージミドベクターからなるヒト一本鎖抗体遺伝子が、そのコートタンパクｐIII遺伝子の枠内に挿入されたＭ１３ファージ等の繊維状ファージ（ファージミドベクター）をエレクトロポレーション法等により大腸菌に導入し、この大腸菌にＶＣＳ−１３等のヘルパーファージを感染させることにより、ＳｃＦＶ抗体ライブラリーとして構築することができる（H.R.Hoogenboom et al., Immunotechnology, 4, 1-20(1998)）。かかるライブラリーとして構築された個々のファージディスプレイヒト一本鎖抗体は、通常の抗体分子に準ずる抗原との反応性を有する。この場合、ＳｃＦＶを発現しているＭ１３は、ファージ粒子内にＳｃＦＶの遺伝子を、ファージミドの形で持っている偽ウイルス粒子となっている。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

［ヒト抗体遺伝子の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の作製］
メラノーマの樹状細胞ワクチンを受けた２人のがん患者ドナーより末梢リンパ球を採取し、核酸抽出用スピンカラム（Nucleospin RNA II；Macherey-Nagel社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。Ｏｌｉｇｏ−ｄｔプライマーを用いた逆転写反応により全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、配列番号１〜６に示すセンスプライマーと配列番号７〜１０に示すアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ反応によりヒト抗体遺伝子重鎖可変領域を増幅し、配列番号１１〜１６及び２２〜２８に示すセンスプライマーと配列番号１７〜２１及び２９〜３１に示すアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ反応によりヒト抗体遺伝子軽鎖可変領域を増幅した。これらのプライマーは、抗体ライブラリー作製のためのヒト抗体可変領域遺伝子クローニング用プライマーとしてすでに報告されているものである（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（J. Mol. Biol.）、２２２巻、３号、５８１〜５９７頁及びプロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）９５巻、６１５７〜６１６２頁参照）。このようにして得られた多種類の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片（以下、重鎖断片及び軽鎖断片）を、リンカーペプチド配列を挟んでランダムに結合させることにより、一本鎖抗体遺伝子（ＳｃＦｖ）の多様性を生み出すことが可能となる。

［アセンブリーＰＣＲによるＳｃＦｖ断片の作製］
これまでに報告されているＳｃＦｖ断片調製方法を図１及び図２に示す（以下各々「従来法１」及び「従来法２」と呼ぶ）。これらの従来法は、いずれもアッセンブリーＰＣＲ法を用いてＤＮＡ断片を〈重鎖−リンカー−軽鎖〉の順に連結させるものであり、従来法１は重鎖、軽鎖及びリンカー配列をコードする３つのＤＮＡ断片を、従来法２はリンカー配列の約半分を重鎖３’端及び軽鎖５’端にそれぞれ付与した２つのＤＮＡ断片をＰＣＲ法で連結させるものである。

具体的には、従来法１では重鎖断片及び軽鎖断片とフレキシブル・リンカー配列と呼ばれるアミノ酸のグリシン４残基とセリン１残基を１単位（ＧＳ配列）とし、これが３単位タンデムに繰り返す配列を仲立ちとして計３種類のＤＮＡ断片をＰＣＲにより結合する。重鎖断片の３’端とリンカーの５’端、リンカーの３’端と軽鎖断片の５’端のそれぞれ一部が相補的な配列となるように設計されており、それぞれのＤＮＡ断片がプライマーとして働き、伸長反応の結果一本鎖のＤＮＡ断片が合成される。また、従来法２は、ＰＣＲ反応により重鎖３’端及び軽鎖５’端にリンカー配列の約半分の配列を付与し、かつそれぞれの一部が相補的配列を含むよう設計されたプライマーを用いて増幅を行い、計２種類のＤＮＡ断片をアセンブリーＰＣＲにより結合する方法である。

図４のＡ及びＢに両従来法により調製したＳｃＦｖ断片のアガロースゲル電気泳動像を示す。従来法１では非特異的反応の生成物と考えられるバンドが多数かつ多量に存在し、目的バンドの反応生成物全体に対する割合は低い（Ａ）。従来法２によっては低分子量側の非特異的反応生成物は減少したものの、高分子側にスメアとなる反応生成物が多量に存在し、目的バンドの目視は困難であった（Ｂ）。従来法２を用いて、ＰＣＲ反応の際のアニーリング温度の上昇（Ｃ）及び三回目のＰＣＲに用いるプライマー長を長くして特異性の向上を図った（Ｄ）が十分量の目的生成物を得ることは困難であった。

［ライゲーション反応によるＳｃＦｖ断片調製法の検討］
そこで、効率よく目的とするＰＣＲ反応物を得るために重鎖及び軽鎖断片の結合方法を根本的に変える方法を考案、これを試行した。図３に本法（方法３）の概略を示す。方法３では、２回目のＰＣＲの際に用いるプライマーのうち重鎖３’プライマーでは２単位のＧＳ配列と制限酵素認識配列、軽鎖５’プライマーは制限酵素認識配列と１単位のＧＳ配列を含む。この重鎖及び軽鎖断片の２回目のＰＣＲ産物をそれぞれ制限酵素で消化し、ライゲーション反応によりリンカーを含む両断片を結合し、３回目のＰＣＲでＳｃＦｖ断片として増幅した。

［制限酵素の選択］
本法の特色のひとつは用いる制限酵素にある。方法３に用いる制限酵素は以下の条件を満たす必要がある。
１）重鎖及び軽鎖断片を切断しない酵素であること。抗体産生細胞では、抗体遺伝子のＶ−Ｄ−Ｊの体細胞組換えとaffinity maturationと呼ばれる遺伝子変異を起こすことにより生体にとって有益な特異性と親和性をもつ抗体を産生するクローンが選抜される。各クローンがそれぞれに独自の配列を有すると考えられるため、存在するであろう全ての抗体遺伝子に関して制限酵素認識配列の有無を調べることはできないが、少なくともゲノムに存在する抗体遺伝子に関して解析し、これらを切断しない制限酵素を選び出すことは必要最低条件となる。
２）重鎖同士又は軽鎖同士のライゲーションを防ぐ為に、酵素の切断面が平滑断面でないこと。
３）対合断片（異なる酵素でライゲーション可能な切断片）を生じる制限酵素の組合せであること。
以上の条件を全て満たす制限酵素を検索した結果、方法３に使用する制限酵素としてＸｂａＩとＮｈｅＩの組合せを決定した。

［重鎖断片−リンカー−軽鎖断片の連結］
配列番号３２〜３７に示すセンスプライマーと配列番号３８〜４１に示すアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ反応により、実施例１で作製した重鎖断片の５’末端にＮｃｏ１認識配列を、３’末端にＸｂａｌ認識配列とリンカー配列の一部をそれぞれ付加した。また、配列番号４２〜４７及び５３〜５９に示すセンスプライマーと配列番号４８〜５２及び６０〜６２に示すアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ反応により、実施例１で作製した軽鎖断片の５’末端にＮｈｅ１認識配列とリンカー配列の一部を、３’末端にＮｏｔ１認識配列をそれぞれ付加した。重鎖断片のＰＣＲ産物をＸｂａＩで、軽鎖断片のＰＣＲ産物をＮｈｅＩで消化した後、ライゲーション反応により結合させた。

［軽鎖断片−リンカー−重鎖断片の連結］
軽鎖断片−リンカー−重鎖断片からなる一本鎖抗体遺伝子断片を作製する場合、配列番号６３〜６８及び７４〜８０に示すセンスプライマーと配列番号６９〜７３及び８１〜８３に示すアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ反応により、実施例１で作製した軽鎖断片の５’末端にＮｃｏ１認識配列を、３’末端にＸｂａｌ認識配列とリンカー配列の一部をそれぞれ付加する。また、配列番号８４〜８９に示すセンスプライマーと配列番号９０〜９３に示すアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ反応により、実施例１で作製した重鎖断片の５’末端にＮｈｅ１認識配列とリンカー配列の一部を、３’末端にＮｏｔ１認識配列をそれぞれ付加する。軽鎖断片のＰＣＲ産物をＸｂａＩで、重鎖断片のＰＣＲ産物をＮｈｅＩで消化した後、ライゲーション反応により結合させる。

［一本鎖抗体遺伝子断片の増幅］
実施例３で作製した一本鎖抗体遺伝子断片を、再度ＸｂａＩとＮｈｅＩにより消化することにより、重鎖断片のＰＣＲ産物同士又は軽鎖断片のＰＣＲ産物同士の結合断片を消化し、目的とする重鎖断片−軽鎖断片の結合断片のみを調製した（図５）。このようにして得られた重鎖断片−リンカー−軽鎖断片からなる一本鎖抗体遺伝子断片を配列番号３２〜３７、４８〜５２、６０〜６２に示すプライマーを用いたＰＣＲ反応により増幅させた（図４Ｅ）。

［最適なポリメラーゼの選択］
さらに、本法により得られた一本鎖抗体遺伝子断片の塩基配列を解析した（以下の全ての実験において大腸菌ＤＨ５αを宿主とした形質転換体１０〜１２コロニーについて検討した。）。前述の如く、発現する抗体遺伝子塩基配列はゲノム上の遺伝子からはある程度逸脱しており、単純ではあるが実験系の目的に則した以下の基準を設けた。
（１）配列が〈重鎖−リンカー−軽鎖〉の組合せになっていること。
（２）蛋白コード配列中の塩基欠失又は挿入によるフレームシフトを生じないこと。
（３）リンカー配列が健常であること（設計通りの配列になっていること）。
（４）重鎖及び軽鎖断片中の読み枠にストップコドンの出現しないこと。

ＰＣＲ反応の全てのステップを一般に広く使用されているＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて行った場合、ライブラリーに使用可能な、上記（１）〜（４）の基準を満たす一本鎖抗体遺伝子断片の生成率は２０％であった（２／１０クローン）。ライブラリー作製に使用可能な一本鎖抗体遺伝子断片の生成率を向上させるためには、ＰＣＲ増幅反応の正確性を向上させることが必要であると考えられたため、最適な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを選出するための実験を行った。この実験では重鎖及び軽鎖断片を増幅させるためのＰＣＲ反応（１回目のＰＣＲ）において数種類のポリメラーゼを用いて検討を行い、ＰＣＲ産物量をアガロース電気泳動法にて比較した。

その結果、ＰＣＲ反応に複数のプライマーを用いる本実験系においては、正確性の高いproof-reading酵素（ＰＲ酵素）は重鎖断片の増幅効率が悪く、十分な量のＰＣＲ産物を得ることができなかった。一方、ＴａｑポリメラーゼとＰＲ酵素であるＰｆｕポリメラーゼを混合したタイプの酵素（混合酵素：PicoMaxx High Fidelity PCR system、STRATAGENE社）で十分な増幅の起きることが判明した（図１０）。全てのＰＣＲ反応を混合酵素で行った場合について一本鎖抗体遺伝子断片の塩基配列を上記と同様な基準で評価したところ、６６．７％（８／１２クローン）であった。即ち、全てのステップに混合酵素を用いた場合、約３倍の精度向上が認められ、本実験系には混合型酵素の使用が適すると判断された。

［方法３によるヒト一本鎖抗体遺伝子ライブラリーの作製］
これまでに確立した系を用いてヒト一本鎖抗体遺伝子断片を作製し、制限酵素サイトＮｃｏＩ及びＮｏｔＩを利用してファージミドベクター（ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ；アマシャム社製）に組み込み、一本鎖抗体遺伝子ライブラリーを作製した。このライブラリーを大腸菌（ＴＧ１又はＪＭ１０９）にエレクトロポレーション法により導入した結果、図９に示すように、０．２μｇのベクターあたり約３ｘ１０^７のコロニーが得られた。

［ファージライブラリーの作製］
ファージライブラリーの作製は、BradburyとMarks（Phage Display, Edited by Tim Clackson and Henry B. Lawman, Oxford University Press, Chapter 13 Phage antibody libraries, Andrew R. M. Bradbury and James D. Marks, P.243-288）などの標準的な実験室マニュアルに記載される方法に準じて行うことができる。例えば、ファージミドベクターを導入した大腸菌を２％グルコース及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｘＹＴ寒天培地にプレーティングし３０℃にて一晩培養する。これを２％グルコース及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｘＹＴ液体培地とスクレーパーを用いて寒天培地よりかきとり、終濃度１５％となるようにグリセリンを加えて−８０℃にて保存する。形質転換した大腸菌のプレーティング時に同時にその希釈系列を作製、別な寒天培地にプレーティングしてコロニー数を算出し、形質転換効率を算定しておく。実験の目的に応じて、必要なコロニー数が獲得されるまで同様な手順を繰り返し、十分なサイズのライブラリーを作出する。用いる大腸菌としてはＴＧ１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどのストレインのエレクトロコンピテントセルを用いることが望ましい。Ｍ１３ＫＯ７などのヘルパーファージを用いることで、ファージの外殻蛋白ｇ３ｐの一部に一本鎖抗体タンパクを発現する線維状ファージを発現させることができる。

従来技術によるＳｃＦｖ断片調製方法（従来法１；３断片結合法）を示す図である。 従来技術によるＳｃＦｖ断片調製方法（従来法２；２断片結合法）を示す図である。 本発明のＳｃＦｖ断片調製方法（方法３；ライゲーションによる２断片結合法）を示す図である。 従来技術のＳｃＦｖ断片調製方法（３断片結合法及び２断片結合法）と本発明のＳｃＦｖ断片調製方法（ライゲーションによる２断片結合法）との比較結果を示す図である。 本発明の重鎖及び軽鎖断片のライゲーションによる結合フローを示す図である。 本発明の実行操作フローチャートを示す図である。 本発明の１回目のＰＣＲに供するプライマーの塩基配列を示す図である。 本発明の２回目及び３回目のＰＣＲに供するプライマーの塩基配列を示す図である。 がん患者抹消リンパ球からの本発明のファージ抗体ライブラリーの作製方法を示す図である。 本発明のＰＣＲに用いる耐熱性ポリメラーゼの検討結果を示す図である。

Claims (20)

1. 以下の（１）〜（５）の工程を順次備えたことを特徴とするヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
   （１）ヒト抗体重鎖遺伝子を、抗体重鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＨＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＨＶアンチセンス配列）からなるプライマー対を用いたＰＣＲ反応、並びに、ヒト抗体軽鎖遺伝子を、抗体軽鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＬＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＬＶアンチセンス配列）からなるプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、それぞれ抗体重鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（重鎖断片）及び軽鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（軽鎖断片）として増幅する工程；
   （２）前記重鎖断片を、前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーと、制限酵素ＸｂａＩ認識配列、重鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応、並びに、前記軽鎖断片を、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、それぞれ重鎖断片−重鎖リンカー配列［Ｉ］−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む重鎖複合断片と、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−軽鎖リンカー配列［Ｉ］−軽鎖断片を含む軽鎖複合断片として増幅する工程；
   （３）前記重鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、前記軽鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させる工程；
   （４）ライゲーション産物を、制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＮｈｅＩで消化する工程；
   （５）前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片を増幅する工程；
2. 以下の（１）〜（５）の工程を順次備えたことを特徴とするヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
   （１）ヒト抗体重鎖遺伝子を、抗体重鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＨＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＨＶアンチセンス配列）からなるプライマー対を用いたＰＣＲ反応、並びに、ヒト抗体軽鎖遺伝子を、抗体軽鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＬＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＬＶアンチセンス配列）からなるプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、それぞれ抗体重鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（重鎖断片）及び軽鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（軽鎖断片）として増幅する工程；
   （２）前記軽鎖断片を、前記ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーと、制限酵素ＸｂａＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［II］及び前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応、並びに、前記重鎖断片を、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、重鎖リンカー配列［II］及び前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、それぞれ軽鎖断片−軽鎖リンカー配列［II］−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む軽鎖複合断片と、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−重鎖リンカー配列［II］−重鎖断片を含む重鎖複合断片として増幅する工程；
   （３）前記軽鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、前記重鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させる工程；
   （４）ライゲーション産物を、制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＮｈｅＩで消化する工程；
   （５）前記ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片を増幅する工程；
3. ヒトＳｃＦｖ断片が、両端部に、制限酵素ＸｂａＩ認識配列及び制限酵素ＮｈｅＩ認識配列以外の、制限酵素認識配列を有することを特徴とする請求項１又は２記載のＳｃＦｖ断片の調製方法。
4. 抗体重鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＨＶセンス配列）が、配列番号１〜６に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
5. 抗体重鎖可変部領域に特異的なアンチセンスプライマー配列（ＨＶアンチセンス配列）が、配列番号７〜１０に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
6. 抗体軽鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＬＶセンス配列）が、配列番号１１〜１６及び２２〜２８に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
7. 抗体軽鎖可変部領域に特異的なアンチセンスプライマー配列（ＬＶアンチセンス配列）が、配列番号１７〜２１及び２９〜３１に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
8. ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーとして、配列番号３２〜３７に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項１及び３〜７のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
9. 制限酵素ＸｂａＩ認識配列、重鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとして、配列番号３８〜４１に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項１及び３〜８のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
10. 制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーとして、配列番号４２〜４７及び５３〜５９に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項１及び３〜９のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
11. ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとして、配列番号４８〜５２及び６０〜６２に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項１及び３〜１０のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
12. ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーとして、配列番号６３〜６８及び７４〜８０に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項２〜１１のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
13. 制限酵素ＸｂａＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［II］及び前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとして、配列番号６９〜７３及び８１〜８３に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項２〜１２のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
14. 制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、重鎖リンカー配列［II］及び前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーとして、配列番号８４〜８９に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項２〜１３のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
15. ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとして、配列番号９０〜９３に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項２〜１４のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
16. ＰＣＲに、ポリメラーゼとして、改変型Ｔａｑポリメラーゼとproof-reading活性を持つ酵素であるＰｆｕポリメラーゼを混合したタイプの酵素（PicoMaxx High Fidelity PCR system、STRATAGENE社）を用いることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
17. 請求項１〜１６のいずれか記載の調製方法により得られることを特徴とするヒトＳｃＦｖ断片。
18. 請求項１７記載のヒトＳｃＦｖ断片が組み込まれたことを特徴とするファージミドベクター又はファージベクター。
19. 請求項１８記載のファージミドベクター又はファージベクターにより形質転換されたことを特徴とする大腸菌。
20. 請求項１９記載の大腸菌を用いて作製されたことを特徴とするファージディスプレイヒト一本鎖抗体ライブラリー。