JP2008245601A - New method for efficiently preparing human single-stranded antibody gene fragment - Google Patents

New method for efficiently preparing human single-stranded antibody gene fragment Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for efficiently mass-preparing human antibody ScFv fragments. <P>SOLUTION: The method comprises the following processes: A gene fragment encoding an antibody heavy chain-variable domain (heavy chain fragment) and a gene fragment encoding an antibody light chain-variable domain (light chain fragment) are amplified respectively by PCR technique. The resulting heavy chain fragments and light chain fragments are further amplified into heavy chain conjugate fragments each comprising a heavy chain fragment-heavy chain linker sequence-restriction enzyme Xbal recognition sequence and into light chain conjugate fragments each comprising a restriction enzyme Nhel recognition sequence-light chain linker sequence-light chain fragment, respectively. The heavy chain conjugate fragments and the light chain conjugate fragments are digested by restriction enzyme Xbal and restriction enzyme Nhel, respectively, and then joined each other by ligation. The resulting ligation product is digested by the restriction enzyme Xbal and restriction enzyme Nhel and then amplified into the objective human ScFv fragments each comprising a heavy chain fragment-linker sequence-light chain fragment. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、ヒトＳｃＦｖ（single chain Fragment of variable region）断片（ヒト一本鎖抗体遺伝子断片）の効率的な新規な調製方法や、該調製方法により得られるヒト一本鎖抗体遺伝子断片や、該ヒト一本鎖抗体遺伝子断片が組み込まれたファージミドベクター又はファージベクターや、該ファージミドベクター又はファージベクターにより形質転換された大腸菌や、該大腸菌を用いて作製されたファージディスプレイヒト一本鎖抗体ライブラリーに関する。   The present invention provides an efficient and novel method for preparing a human ScFv (single chain fragment of variable region) fragment (human single chain antibody gene fragment), a human single chain antibody gene fragment obtained by the preparation method, The present invention relates to a phagemid vector or phage vector into which a human single chain antibody gene fragment is incorporated, Escherichia coli transformed with the phagemid vector or phage vector, and a phage display human single chain antibody library prepared using the Escherichia coli. .

抗体は、生物が進化の過程で獲得した最も高度な生体防御分子の一つであり、生体の防御機構（免疫系）の中心に位置する。抗体蛋白をコードする遺伝子は、ゲノム上の広範な領域に極めて多数の種類がクラスターとして存在し、免疫系B細胞においてのみ分化の過程で体細胞遺伝子組換えを起こして各細胞に固有な抗体遺伝子が形成される。生体は本質的にありとあらゆる分子に対する抗体の産生が可能であるが、この驚異的な多様性／柔軟性の成因は多種の抗体遺伝子の組合わせと、さらに、形成された固有な遺伝子に変異を生じさせる生体機構の働きである。抗体は各種哺乳動物や鶏に抗原を投与（免疫）してポリクローナル（多価）抗体として作製されてきたが、免疫マウス脾臓細胞と骨髄腫細胞の融合細胞、ハイブリドーマによるモノクローナル（単価）抗体の作製技術が確立して以来、同抗体は生命科学の発展に計り知れない恩恵をもたらしてきた。モノクローナル抗体は、極めて多様性が高く、病原因子の排除に有効な抗体だが、医薬品としての開発にはさらに多くの年月を要した。主な原因は、ヒト抗体の作製技術の欠如と倫理的な問題（抗体取得を目的としたヒトの免疫は通常行えない）である。近年の分子生物学手法の発達は、試験管内における抗体蛋白の機能の再構築を可能にした。その方法はファージ抗体法と呼ばれる。   An antibody is one of the most advanced biological defense molecules acquired by organisms in the course of evolution, and is located at the center of the defense mechanism (immune system) of the organism. Genes encoding antibody proteins are clustered in an extremely large number in a wide range of the genome. Antibody genes unique to each cell are caused by somatic gene recombination during differentiation only in immune system B cells. Is formed. Living organisms are capable of producing antibodies against essentially any molecule, but this tremendous diversity / flexibility is due to the combination of different antibody genes and further mutations to the unique genes formed. This is the function of the living body mechanism. Antibodies have been prepared as polyclonal (multivalent) antibodies by administering (immunizing) antigens to various mammals and chickens. Fused cells of immunized mouse spleen cells and myeloma cells, production of monoclonal (unit price) antibodies using hybridomas Since its establishment, the antibody has provided immense benefits to the development of life sciences. Monoclonal antibodies are extremely diverse and effective in eliminating virulence factors, but more time was required to develop them as pharmaceuticals. The main causes are the lack of human antibody production technology and ethical problems (human immunity for the purpose of obtaining antibodies is usually not possible). Recent developments in molecular biology techniques have made it possible to reconstruct the function of antibody proteins in vitro. This method is called the phage antibody method.

ファージ抗体法は、Winterら（例えば、非特許文献１参照）によって１９９１年に報告されて以来、世界中で数多くの研究で用いられてきた。この方法では、Ｂ細胞で発現する重鎖及び軽鎖抗体遺伝子の可変領域のみをそれぞれＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)を用いてクローニングし、両遺伝子を人為的に結合、線維状バクテリオファージＭ１３の外殻蛋白ｇ３ｐとの融合蛋白として発現させる。抗原に対し、Ｂ細胞で産生された抗体が重鎖−軽鎖の四量体として達成していた親和性及び特異性を試験管内で再構築する方法である。多種多様なソースのＢ細胞から作製が可能であるが、ある抗原と特異的に結合するクローンを得るためにライブラリーと呼ばれる多種類の遺伝子配列／組み合わせをもつ母集団を作出し、この中から目的とするものを選抜する。一般にこのライブラリーに必要な多様性は、１０９種類以上とされている（例えば、非特許文献２参照）。 The phage antibody method has been used in numerous studies worldwide since it was reported in 1991 by Winter et al. (See, for example, Non-Patent Document 1). In this method, only the variable regions of heavy and light chain antibody genes expressed in B cells are cloned using PCR (Polymerase Chain Reaction), both genes are artificially linked, and the outer shell of filamentous bacteriophage M13. It is expressed as a fusion protein with protein g3p. It is a method of reconstructing in vitro the affinity and specificity that an antibody produced in B cells has achieved as a heavy-light chain tetramer for an antigen. In order to obtain clones that specifically bind to a certain antigen, it is possible to create a population having many kinds of gene sequences / combinations called a library. Select the one you want. Is generally diversity required for this library, there is a 10 9 or more (e.g., see Non-Patent Document 2).

ファージ抗体法は、様々な意味で大変有用かつ有効な方法であるが、欧米に比べて我国における本法の普及・進展の度合いはかなり劣るものと思われる。実際、欧米の企業が本法で得られた遺伝子由来の抗体医薬を開発のパイプラインに乗せているのに対し、我国の企業ではここ数年、本法に基礎を置くシステムの使用権利を莫大な金額で購入する事例が相次いで報道されている。我国における本法発展の妨げとなった原因のひとつは、方法的な困難さであろう。実際に手掛けてみると、高い多様性をもつライブラリーの作出は大変難しく、多くの時間と労力を要することが実感される。その最初の関門と言えるのがＰＣＲによる一本鎖抗体遺伝子断片（Single Chain Fv Fragment；ＳｃＦｖ断片）の調製である。   The phage antibody method is a very useful and effective method in various meanings, but the spread and progress of this method in our country seems to be considerably inferior to those in Europe and the United States. In fact, Western companies have put the gene-derived antibody drugs obtained by this law in the development pipeline, while Japanese companies have had enormous rights to use systems based on this law in recent years. Cases of purchasing at a reasonable amount are reported one after another. One of the causes that hindered the development of this law in our country may be methodic difficulties. Actually, it is very difficult to create a highly diverse library and it takes a lot of time and effort. The first barrier is the preparation of a single chain antibody gene fragment (Single Chain Fv Fragment; ScFv fragment) by PCR.

Nature 348, 552-554, 1990Nature 348, 552-554, 1990 Phage Display, Clackson T and Lowman HB ed. pp. 243-288, Oxford University Press, 2004Phage Display, Clackson T and Lowman HB ed. Pp. 243-288, Oxford University Press, 2004

本発明の課題は、ヒトＳｃＦｖ断片を大量に得ることができる効率的なＳｃＦｖ断片の新規な調製方法を提供することにある。 The subject of this invention is providing the novel preparation method of the efficient ScFv fragment which can obtain a human ScFv fragment in large quantities.

本発明者らは、抗体重鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（重鎖断片）及び軽鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（軽鎖断片）をＰＣＲ法により増幅し、これら重鎖断片と軽鎖断片をＰＣＲ法によりそれぞれ重鎖断片−重鎖リンカー配列−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む重鎖複合断片と、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−軽鎖リンカー配列−軽鎖断片を含む軽鎖複合断片として増幅し、重鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、前記軽鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させ、ライゲーション産物を制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＮｈｅＩで消化した後、重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片としてＰＣＲ法により増幅すると、ヒトＳｃＦｖ断片を大量かつ効率よく調製しうることを見い出し、本発明を完成するに至った。   The present inventors amplified the gene fragment (heavy chain fragment) encoding the antibody heavy chain variable region and the gene fragment (light chain fragment) encoding the light chain variable region by the PCR method, Light chain fragments are obtained by PCR method, respectively, heavy chain fragment-heavy chain linker sequence-heavy chain composite fragment containing restriction enzyme XbaI recognition sequence, and restriction enzyme NheI recognition sequence-light chain linker sequence-light chain composite fragment containing light chain fragment. After digesting the heavy chain complex fragment with the restriction enzyme XbaI and digesting the light chain complex fragment with the restriction enzyme NheI, ligating by ligation, and digesting the ligation product with the restriction enzyme XbaI and the restriction enzyme NheI, When a human ScFv fragment consisting of a heavy chain fragment-linker sequence-light chain fragment is amplified by PCR, a large amount of human ScFv fragment is efficiently prepared. It found that that may have led to the completion of the present invention.

すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の（Ａ）〜（Ｅ）の工程を順次備えたことを特徴とするヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（Ａ）ヒト抗体重鎖遺伝子を、抗体重鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＨＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＨＶアンチセンス配列）からなるプライマー対を用いたＰＣＲ反応、並びに、ヒト抗体軽鎖遺伝子を、抗体軽鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＬＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＬＶアンチセンス配列）からなるプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、それぞれ抗体重鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（重鎖断片）及び軽鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（軽鎖断片）として増幅する工程；
（Ｂ）前記重鎖断片を、前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーと、制限酵素ＸｂａＩ認識配列、重鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応、並びに、前記軽鎖断片を、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、それぞれ重鎖断片−重鎖リンカー配列［Ｉ］−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む重鎖複合断片と、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−軽鎖リンカー配列［Ｉ］−軽鎖断片を含む軽鎖複合断片として増幅する工程；
（Ｃ）前記重鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、前記軽鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させる工程；
（Ｄ）ライゲーション産物を、制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＮｈｅＩで消化する工程；
（Ｅ）前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片を増幅する工程；
（２）以下の（Ａ）〜（Ｅ）の工程を順次備えたことを特徴とするヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（Ａ）ヒト抗体重鎖遺伝子を、抗体重鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＨＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＨＶアンチセンス配列）からなるプライマー対を用いたＰＣＲ反応、並びに、ヒト抗体軽鎖遺伝子を、抗体軽鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＬＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＬＶアンチセンス配列）からなるプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、それぞれ抗体重鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（重鎖断片）及び軽鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（軽鎖断片）として増幅する工程；
（Ｂ）前記軽鎖断片を、前記ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーと、制限酵素ＸｂａＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［II］及び前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応、並びに、前記重鎖断片を、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、重鎖リンカー配列［II］及び前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、それぞれ軽鎖断片−軽鎖リンカー配列［II］−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む軽鎖複合断片と、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−重鎖リンカー配列［II］−重鎖断片を含む重鎖複合断片として増幅する工程；
（Ｃ）前記軽鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、前記重鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させる工程；
（Ｄ）ライゲーション産物を、制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＮｈｅＩで消化する工程；
（Ｅ）前記ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片を増幅する工程；
（３）ヒトＳｃＦｖ断片が、両端部に、制限酵素ＸｂａＩ認識配列及び制限酵素ＮｈｅＩ認識配列以外の、制限酵素認識配列を有することを特徴とする上記（１）又は（２）記載のＳｃＦｖ断片の調製方法。 That is, the present invention is as follows.
(1) A method for preparing a human ScFv fragment comprising the following steps (A) to (E) in sequence.
(A) PCR reaction using a human antibody heavy chain gene using a primer pair consisting of a sense primer sequence (HV sense sequence) and an antisense primer sequence (HV antisense sequence) specific to the antibody heavy chain variable region, and The human antibody light chain gene was subjected to anti-PCR by PCR reaction using a primer pair consisting of a sense primer sequence (LV sense sequence) and an antisense primer sequence (LV antisense sequence) specific to the antibody light chain variable region. Amplifying as a gene fragment (heavy chain fragment) encoding a weight chain variable region and a gene fragment (light chain fragment) encoding a light chain variable region;
(B) PCR reaction using the heavy chain fragment, a sense primer containing the HV sense sequence, and an antisense primer containing a restriction enzyme XbaI recognition sequence, heavy chain linker sequence [I] and the HV antisense sequence, And, the light chain fragment was subjected to PCR reaction using a restriction primer containing a restriction enzyme NheI recognition sequence, a light chain linker sequence [I] and the LV sense sequence, and an antisense primer containing the LV antisense sequence, As a heavy chain fragment comprising a heavy chain fragment-heavy chain linker sequence [I] -restriction enzyme XbaI recognition sequence and a restriction enzyme NheI recognition sequence-light chain linker sequence [I] -light chain fragment Amplifying;
(C) a step of ligating by ligation after digesting the heavy chain complex fragment with restriction enzyme XbaI and digesting the light chain complex fragment with restriction enzyme NheI;
(D) digesting the ligation product with restriction enzyme XbaI and restriction enzyme NheI;
(E) A step of amplifying a human ScFv fragment comprising a heavy chain fragment-linker sequence-light chain fragment by PCR using the sense primer containing the HV sense sequence and the antisense primer containing the LV antisense sequence. ;
(2) A method for preparing a human ScFv fragment comprising the following steps (A) to (E) in sequence.
(A) PCR reaction using a human antibody heavy chain gene using a primer pair consisting of a sense primer sequence (HV sense sequence) and an antisense primer sequence (HV antisense sequence) specific to the antibody heavy chain variable region, and The human antibody light chain gene was subjected to anti-PCR by PCR reaction using a primer pair consisting of a sense primer sequence (LV sense sequence) and an antisense primer sequence (LV antisense sequence) specific to the antibody light chain variable region. Amplifying as a gene fragment (heavy chain fragment) encoding a weight chain variable region and a gene fragment (light chain fragment) encoding a light chain variable region;
(B) PCR reaction using the light chain fragment using a sense primer containing the LV sense sequence and an antisense primer containing a restriction enzyme XbaI recognition sequence, a light chain linker sequence [II] and the LV antisense sequence; In addition, the heavy chain fragment is subjected to PCR reaction using a restriction primer containing a restriction enzyme NheI recognition sequence, a heavy chain linker sequence [II] and the HV sense sequence, and an antisense primer containing the HV antisense sequence, Light chain fragment-light chain linker sequence [II] -light chain complex fragment containing restriction enzyme XbaI recognition sequence and heavy chain complex fragment containing restriction enzyme NheI recognition sequence-heavy chain linker sequence [II] -heavy chain fragment Amplifying;
(C) a step of ligating by ligation after digesting the light chain complex fragment with restriction enzyme XbaI and the heavy chain complex fragment with restriction enzyme NheI;
(D) digesting the ligation product with restriction enzyme XbaI and restriction enzyme NheI;
(E) Amplifying a human ScFv fragment comprising a light chain fragment-linker sequence-heavy chain fragment by PCR using the sense primer containing the LV sense sequence and the antisense primer containing the HV antisense sequence ;
(3) The ScFv fragment according to (1) or (2) above, wherein the human ScFv fragment has a restriction enzyme recognition sequence other than the restriction enzyme XbaI recognition sequence and the restriction enzyme NheI recognition sequence at both ends. Preparation method.

（４）抗体重鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＨＶセンス配列）が、配列番号１〜６に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（５）抗体重鎖可変部領域に特異的なアンチセンスプライマー配列（ＨＶアンチセンス配列）が、配列番号７〜１０に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（６）抗体軽鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＬＶセンス配列）が、配列番号１１〜１６及び２２〜２８に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列であることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（７）抗体軽鎖可変部領域に特異的なアンチセンスプライマー配列（ＬＶアンチセンス配列）が、配列番号１７〜２１及び２９〜３１に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（８）ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーとして、配列番号３２〜３７に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする上記（１）及び（３）〜（７）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（９）制限酵素ＸｂａＩ認識配列、重鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとして、配列番号３８〜４１に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする上記（１）及び（３）〜（８）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（１０）制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーとして、配列番号４２〜４７及び５３〜５９に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする上記（１）及び（３）〜（９）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（１１）ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとして、配列番号４８〜５２及び６０〜６２に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする上記（１）及び（３）〜（１０）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（１２）ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーとして、配列番号６３〜６８及び７４〜８０に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする上記（２）〜（１１）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（１３）制限酵素ＸｂａＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［II］及び前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとして、配列番号６９〜７３及び８１〜８３に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする上記（２）〜（１２）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（１４）制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、重鎖リンカー配列［II］及び前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーとして、配列番号８４〜８９に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする上記（２）〜（１３）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（１５）ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとして、配列番号９０〜９３に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする上記（２）〜（１４）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。 (4) The sense primer sequence (HV sense sequence) specific to the antibody heavy chain variable region is one or more of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6, (1) The preparation method of the human ScFv fragment | piece in any one of (3).
(5) The antisense primer sequence (HV antisense sequence) specific to the antibody heavy chain variable region is one or more of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 7 to 10, The method for preparing a human ScFv fragment according to any one of (1) to (4) above.
(6) The sense primer sequence (LV sense sequence) specific to the antibody light chain variable region is one or more of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 11 to 16 and 22 to 28 A method for preparing a human ScFv fragment according to any one of (1) to (5) above,
(7) The antisense primer sequence (LV antisense sequence) specific to the antibody light chain variable region is one or more of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 17-21 and 29-31 The method for preparing a human ScFv fragment according to any one of (1) to (6) above,
(8) The above-mentioned (1) and (3) to (7), wherein one or more of the primers comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 32-37 are used as the sense primer containing the HV sense sequence. The method for preparing a human ScFv fragment according to any one of the above.
(9) As an antisense primer containing the restriction enzyme XbaI recognition sequence, heavy chain linker sequence [I] and the HV antisense sequence, one or more of the primers consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 38 to 41 are used. A method for preparing a human ScFv fragment according to any one of (1) and (3) to (8), wherein the method is used.
(10) One or two kinds of primers comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 42 to 47 and 53 to 59 as sense primers including the restriction enzyme NheI recognition sequence, light chain linker sequence [I] and the LV sense sequence The method for preparing a human ScFv fragment according to any one of the above (1) and (3) to (9), wherein the above is used.
(11) The above-mentioned (1) and (1) characterized in that one or more of the primers consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 48 to 52 and 60 to 62 are used as the antisense primer containing the LV antisense sequence. (3) The preparation method of the human ScFv fragment | piece in any one of (10).
(12) The above-mentioned (2) to (11), wherein one or more of the primers comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 63 to 68 and 74 to 80 are used as the sense primer containing the LV sense sequence. The method for preparing a human ScFv fragment according to any one of the above.
(13) As an antisense primer containing a restriction enzyme XbaI recognition sequence, a light chain linker sequence [II] and the LV antisense sequence, one kind of primers consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 69 to 73 and 81 to 83, or The method for preparing a human ScFv fragment according to any one of (2) to (12) above, wherein two or more kinds are used.
(14) As a sense primer containing the restriction enzyme NheI recognition sequence, the heavy chain linker sequence [II] and the HV sense sequence, one or more of the primers comprising the base sequences shown in SEQ ID NOs: 84 to 89 are used. A method for preparing a human ScFv fragment according to any one of (2) to (13) above.
(15) As an antisense primer containing an HV antisense sequence, one or more of the primers consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 90 to 93 are used, wherein the above (2) to (14) A method for preparing a human ScFv fragment according to any one of the above.

（１６）ＰＣＲに、ポリメラーゼとして、改変型Ｔａｑポリメラーゼとproof-reading活性を持つ酵素であるＰｆuポリメラーゼを混合したタイプの酵素（PicoMaxx High Fidelity PCR system、STRATAGENE社）を用いることを特徴とする上記（１）〜（１５）のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（１７）上記（１）〜（１６）のいずれか記載の調製方法により得られることを特徴とするヒトＳｃＦｖ断片。
（１８）上記（１７）記載のヒトＳｃＦｖ断片が組み込まれたことを特徴とするファージミドベクター又はファージベクター。
（１９）上記（１８）記載のファージミドベクター又はファージベクターにより形質転換されたことを特徴とする大腸菌。
（２０）上記（１９）記載の大腸菌を用いて作製されたことを特徴とするファージディスプレイヒト一本鎖抗体ライブラリー。 (16) As described above, characterized in that an enzyme (PicoMaxx High Fidelity PCR system, STRATAGENE) of a mixed type of modified Taq polymerase and Pfu polymerase, which is an enzyme having proof-reading activity, is used for PCR. A method for preparing a human ScFv fragment according to any one of 1) to (15).
(17) A human ScFv fragment obtained by the preparation method according to any one of (1) to (16) above.
(18) A phagemid vector or a phage vector in which the human ScFv fragment described in (17) above is incorporated.
(19) An E. coli transformed with the phagemid vector or the phage vector according to (18) above.
(20) A phage display human single-chain antibody library produced using the Escherichia coli described in (19) above.

本発明によると、ヒトＳｃＦｖ断片を大量かつ効率よく調製しうることができ、その結果、多様性に富んだファージディスプレイヒト一本鎖抗体ライブラリーを効率よく構築することが可能となる。   According to the present invention, human ScFv fragments can be prepared in a large amount and efficiently, and as a result, it is possible to efficiently construct a phage display human single chain antibody library rich in diversity.

本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法は、重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片の調製方法と、軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片の調製方法からなり、２つの調製方法は基本的に同じ方法であるが、以下、前者を調製方法［Ｉ］、後者を調製方法［II］ということがある。   The method for preparing a human ScFv fragment of the present invention comprises a method for preparing a human ScFv fragment comprising a heavy chain fragment-linker sequence-light chain fragment and a method for preparing a human ScFv fragment comprising a light chain fragment-linker sequence-heavy chain fragment. The two preparation methods are basically the same, but hereinafter the former may be referred to as Preparation Method [I] and the latter as Preparation Method [II].

本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［Ｉ］及び［II］に共通する工程（１）、すなわち、抗体重鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（重鎖断片）及び軽鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（軽鎖断片）を増幅する工程における、抗体重鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＨＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＨＶアンチセンス配列）、並びに、抗体軽鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＬＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＬＶアンチセンス配列）を有する各プライマーは、抗体ライブラリー作製のためのヒト抗体可変領域遺伝子クローニング用プライマーとしてすでに報告（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（J. Mol. Biol.）、２２２巻、３号、５８１〜５９７頁及びプロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）９５巻、６１５７〜６１６２頁参照）されているものであれば、１種又は２種以上を特に制限されることなく用いることができ、例えば、ＨＶセンス配列として配列番号１〜６に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列、好ましくは６種の配列を、ＨＶアンチセンス配列として配列番号７〜１０に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列、好ましくは４種の配列を、ＬＶセンス配列として配列番号１１〜１６及び２２〜２８に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列、好ましくは１３種の配列を、ＬＶアンチセンス配列として配列番号１７〜２１及び２９〜３１に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列、好ましくは８種の配列を、具体的に挙げることができる。   Step (1) common to preparation methods [I] and [II] of the human ScFv fragment of the present invention, that is, encoding a gene fragment (heavy chain fragment) encoding an antibody heavy chain variable region and a light chain variable region Sense primer sequence (HV sense sequence) and antisense primer sequence (HV antisense sequence) specific to antibody heavy chain variable region, and antibody light chain variable in the step of amplifying gene fragment (light chain fragment) Each primer having a sense primer sequence specific to a partial region (LV sense sequence) and an antisense primer sequence (LV antisense sequence) has already been reported as a primer for cloning a human antibody variable region gene for preparing an antibody library ( Journal of Molecular Biology (J. Mol. Biol.), 222, 3, 581-597 and Use one or two or more types without limitation, as long as they are described in the Proceedings of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 6157-6162) For example, one or more of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 as HV sense sequences, preferably 6 sequences, are shown in SEQ ID NOs: 7 to 10 as HV antisense sequences. One or two or more kinds of base sequences, preferably 4 kinds of sequences, and one or more kinds of base sequences shown in SEQ ID NOs: 11 to 16 and 22 to 28 as LV sense sequences, preferably Thirteen types of sequences, one or more of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 17-21 and 29-31 as LV antisense sequences, preferably 8 sequences , There may be mentioned specifically.

本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［Ｉ］の工程（２）の重鎖断片−重鎖リンカー配列［Ｉ］−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む重鎖複合断片を増幅する工程における、重鎖断片増幅用のセンスプライマーとしては、前記ＨＶセンス配列を含むプライマーであれば特に制限されないが、制限酵素ＸｂａＩ認識配列及び制限酵素ＮｈｅＩ認識配列以外の制限酵素の認識配列を有するプライマーが好ましく、例えば、それぞれ制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を有する配列番号３２〜３７に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上、好ましくは６種のプライマーを挙げることができ、また、重鎖断片増幅用のアンチセンスプライマーとしては、制限酵素ＸｂａＩ認識配列、重鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＨＶアンチセンス配列を含むプライマーであれば特に制限されず、例えば、配列番号３８〜４１に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上、好ましくは４種のプライマーを挙げることができる。   The heavy chain fragment in the step of amplifying the heavy chain fragment containing the heavy chain fragment-heavy chain linker sequence [I] -restriction enzyme XbaI recognition sequence in step (2) of the method for preparing human ScFv fragment of the present invention [I] The sense primer for amplification is not particularly limited as long as it includes the HV sense sequence, but is preferably a primer having a recognition sequence for a restriction enzyme other than the restriction enzyme XbaI recognition sequence and the restriction enzyme NheI recognition sequence. One or more primers, preferably 6 primers, comprising the base sequence shown in SEQ ID NOs: 32-37 having the recognition sequence of the restriction enzyme NcoI can be mentioned, and anti-antibodies for heavy chain fragment amplification can also be mentioned. The sense primer includes a restriction enzyme XbaI recognition sequence, a heavy chain linker sequence [I] and the HV antisense sequence. If no primer is not particularly limited, for example, one or more primers comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 38 to 41, preferably may be mentioned 4 types of primers.

また、本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［Ｉ］の工程（２）の制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−軽鎖リンカー配列［Ｉ］−軽鎖断片を含む軽鎖複合断片を増幅する工程における、軽鎖断片増幅用のセンスプライマーとしては、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＬＶセンス配列を含むプライマーであれば特に制限されず、例えば、配列番号４２〜４７及び５３〜５９に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上、好ましくは１３種のプライマーを挙げることができ、また、軽鎖断片増幅用のアンチセンスプライマーとしては、前記ＬＶアンチセンス配列を含むプライマーであれば特に制限されないが、制限酵素ＸｂａＩ認識配列及び制限酵素ＮｈｅＩ認識配列以外の制限酵素の認識配列を有するプライマーが好ましく、例えば、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩの認識配列を有する配列番号４８〜５２及び６０〜６２に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上、好ましくは６種のプライマーを挙げることができる。   Further, in the step of amplifying a light chain complex fragment containing the restriction enzyme NheI recognition sequence-light chain linker sequence [I] -light chain fragment in step (2) of the method [I] for preparing a human ScFv fragment of the present invention, The sense primer for amplifying a chain fragment is not particularly limited as long as it includes a restriction enzyme NheI recognition sequence, a light chain linker sequence [I] and the LV sense sequence. For example, SEQ ID NOs: 42-47 and 53-59 One or two or more, preferably 13 types of primers comprising the base sequence shown in FIG. 5 can be mentioned, and the antisense primer for amplifying the light chain fragment includes a primer containing the LV antisense sequence. The restriction enzyme XbaI recognition sequence and the restriction enzyme recognition sequence other than the restriction enzyme NheI recognition sequence are not particularly limited. For example, mention may be made of one or more of the primers consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 48 to 52 and 60 to 62 each having a recognition sequence of restriction enzyme NotI, preferably 6 primers. it can.

本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［II］の工程（２）の軽鎖断片−軽鎖リンカー配列［II］−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む軽鎖複合断片を増幅する工程における、軽鎖断片増幅用のセンスプライマーとしては、前記ＬＶセンス配列を含むプライマーであれば特に制限されないが、制限酵素ＸｂａＩ認識配列及び制限酵素ＮｈｅＩ認識配列以外の制限酵素の認識配列を有するプライマーが好ましく、例えば、それぞれ制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を有する配列番号６３〜６８及び７４〜８０に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上、好ましくは１３種のプライマーを挙げることができ、また、軽鎖断片増幅用のアンチセンスプライマーとしては、制限酵素ＸｂａＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［II］及び前記ＬＶアンチセンス配列を含むプライマーであれば特に制限されず、例えば、配列番号６９〜７３及び８１〜８３に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上、好ましくは８種のプライマーを挙げることができる。   Light chain fragment in the step of amplifying a light chain fragment comprising a light chain fragment-light chain linker sequence [II] -restriction enzyme XbaI recognition sequence in step (2) of the method for preparing human ScFv fragment of the present invention [II] The sense primer for amplification is not particularly limited as long as it includes the LV sense sequence, but is preferably a primer having a restriction enzyme recognition sequence other than the restriction enzyme XbaI recognition sequence and the restriction enzyme NheI recognition sequence. One or more primers, preferably 13 primers, comprising the base sequences shown in SEQ ID NOs: 63 to 68 and 74 to 80 having the recognition sequence of the restriction enzyme NcoI can be mentioned, and the light chain fragment Antisense primers for amplification include a restriction enzyme XbaI recognition sequence, a light chain linker sequence [II] and the LV amp The primer is not particularly limited as long as it includes a sense sequence, and examples thereof include one or more primers, preferably 8 primers, consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 69 to 73 and 81 to 83. it can.

また、本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［II］の工程（２）の制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−重鎖リンカー配列［II］−重鎖断片を含む重鎖複合断片を増幅する工程における、重鎖断片増幅用のセンスプライマーとしては、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、重鎖リンカー配列［II］及び前記ＨＶセンス配列を含むプライマーであれば特に制限されず、例えば、配列番号８４〜８９に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上、好ましくは６種のプライマーを挙げることができ、また、重鎖断片増幅用のアンチセンスプライマーとしては、前記ＨＶアンチセンス配列を含むプライマーであれば特に制限されないが、制限酵素ＸｂａＩ認識配列及び制限酵素ＮｈｅＩ認識配列以外の制限酵素の認識配列を有するプライマーが好ましく、例えば、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩの認識配列を有する配列番号９０〜９３に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上、好ましくは４種のプライマーを挙げることができる。   Further, in the step of amplifying a heavy chain complex fragment comprising the restriction enzyme NheI recognition sequence-heavy chain linker sequence [II] -heavy chain fragment in step (2) of the method for preparing human ScFv fragment of the present invention [II] The sense primer for amplifying a chain fragment is not particularly limited as long as it is a primer including a restriction enzyme NheI recognition sequence, a heavy chain linker sequence [II] and the HV sense sequence. For example, bases represented by SEQ ID NOs: 84 to 89 1 type or 2 types or more, preferably 6 types of primers comprising the sequence can be mentioned, and the antisense primer for amplification of the heavy chain fragment is particularly a primer containing the HV antisense sequence. Although not limited, a primer having a recognition sequence for a restriction enzyme other than the restriction enzyme XbaI recognition sequence and the restriction enzyme NheI recognition sequence is preferred, Example, each one of the primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 90 to 93 having the recognition sequence for the restriction enzyme NotI or two or more, preferably mention may be made of four primers.

上記重鎖リンカー配列［Ｉ］、軽鎖リンカー配列［Ｉ］、軽鎖リンカー配列［II］及び重鎖リンカー配列［II］としては特に制限されるものではないが、目的とする重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片や軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片とした場合におけるリンカー配列の長さが５残基程度から２０残基程度となるものが好ましく、かかるリンカー配列として、グリシン４残基とセリン１残基を１単位（ＧＳ配列）として３単位タンデムに繰り返す配列からなるＧＳリンカーを好適に例示することができるが、水溶性を上げるためＡｒｇを導入したものなども用いることができる。また、重鎖リンカー配列［Ｉ］と軽鎖リンカー配列［II］、及び／又は軽鎖リンカー配列［Ｉ］と重鎖リンカー配列［II］を同じ配列とすることもできる。   The heavy chain linker sequence [I], light chain linker sequence [I], light chain linker sequence [II] and heavy chain linker sequence [II] are not particularly limited, When the linker sequence-light chain fragment or the light chain fragment-linker sequence-heavy chain fragment is used, the length of the linker sequence is preferably about 5 to 20 residues. A GS linker composed of a sequence repeating in 3 units tandem with a group and 1 residue of serine as 1 unit (GS sequence) can be preferably exemplified. However, in order to increase the water solubility, those introduced with Arg can also be used. . Further, the heavy chain linker sequence [I] and the light chain linker sequence [II] and / or the light chain linker sequence [I] and the heavy chain linker sequence [II] can be the same sequence.

本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［Ｉ］の工程（３）において、重鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、軽鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させたり、本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［II］の工程（３）において、軽鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、重鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させると、連結部から制限酵素ＸｂａＩ及びＮｈｅＩの認識配列が消失し、制限酵素ＸｂａＩ及びＮｈｅＩで切断することができないライゲーション産物（重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片と軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片）が得られることになる。なお、上記ライゲーション産物には、重鎖断片同士の連結産物（重鎖断片−リンカー配列−制限酵素認識配列−リンカー配列−重鎖断片）や軽鎖断片同士の連結産物（軽鎖断片−リンカー配列−制限酵素認識配列−リンカー配列−軽鎖断片）も含まれる。   In step (3) of the method for preparing a human ScFv fragment of the present invention [I], the heavy chain complex fragment is digested with the restriction enzyme XbaI and the light chain complex fragment is digested with the restriction enzyme NheI, and then linked by ligation. In step (3) of the preparation method [II] of the human ScFv fragment of the present invention, after digesting the light chain complex fragment with the restriction enzyme XbaI and the heavy chain complex fragment with the restriction enzyme NheI, and ligating them by ligation, Ligation products (heavy chain fragment-linker sequence-light chain fragment and light chain fragment-linker sequence-heavy chain fragment) in which the recognition sequences of restriction enzymes XbaI and NheI disappear from the junction and cannot be cleaved with restriction enzymes XbaI and NheI ) Will be obtained. The ligation product includes a ligation product of heavy chain fragments (heavy chain fragment-linker sequence-restriction enzyme recognition sequence-linker sequence-heavy chain fragment) and a ligation product of light chain fragments (light chain fragment-linker sequence). -Restriction enzyme recognition sequence-linker sequence-light chain fragment).

本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［Ｉ］及び［II］に共通する工程（４）、すなわち、ライゲーション産物を、制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＮｈｅＩで消化する工程により、ライゲーション産物中の上記重鎖断片同士の連結産物及び上記軽鎖断片同士の連結産物は切断されるが、目的とするライゲーション産物（重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片と軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片）は切断されることなく、次工程でＰＣＲ反応により目的とするライゲーション産物のみが増幅されることになる。   The above heavy chain in the ligation product is obtained by the step (4) common to the preparation methods [I] and [II] of the human ScFv fragment of the present invention, that is, the step of digesting the ligation product with the restriction enzyme XbaI and the restriction enzyme NheI. The ligation product between the fragments and the ligation product between the light chain fragments are cleaved, but the target ligation product (heavy chain fragment-linker sequence-light chain fragment and light chain fragment-linker sequence-heavy chain fragment) is cleaved. Instead, only the target ligation product is amplified by the PCR reaction in the next step.

本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［Ｉ］の工程（５）において、前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片が増幅され、また、本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［II］の工程（５）において、前記LＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記HＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片が増幅される。   In step (5) of the preparation method [I] of the human ScFv fragment of the present invention, a heavy chain fragment is obtained by PCR reaction using the sense primer containing the HV sense sequence and the antisense primer containing the LV antisense sequence. -A human ScFv fragment consisting of a linker sequence-light chain fragment is amplified, and in step (5) of the method for preparing a human ScFv fragment of the present invention [II], the sense primer containing the LV sense sequence and the HV anti-antibody A human ScFv fragment consisting of a light chain fragment-linker sequence-heavy chain fragment is amplified by a PCR reaction using an antisense primer containing a sense sequence.

本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法［Ｉ］及び［II］におけるＰＣＲの反応条件は特に限定されるものではないが、ポリメラーゼとして、改変型Ｔａｑポリメラーゼとproof-reading活性を持つ酵素であるＰｆuポリメラーゼを混合したタイプの酵素（PicoMaxx High Fidelity PCR system、STRATAGENE社）を用いることが増幅効率の点で好ましい。   The PCR reaction conditions in the preparation methods [I] and [II] of the human ScFv fragment of the present invention are not particularly limited, but the modified Taq polymerase and Pfu polymerase which is an enzyme having proof-reading activity are used as the polymerase. It is preferable in terms of amplification efficiency to use a type of enzyme mixed with (PicoMaxx High Fidelity PCR system, STRATAGENE).

本発明はまた、本発明のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法により得られるヒトＳｃＦｖ断片自体や、このヒトＳｃＦｖ断片が組み込まれたファージミドベクター又はファージベクターや、これらファージミドベクター又はファージベクターにより形質転換された大腸菌や、この大腸菌を用いて作製されたファージディスプレイヒト一本鎖抗体ライブラリーに関する。上記ファージミドベクターやファージベクターは、ファージディスプレイに用いられるが、上記ファージミドベクターを好適に用いることができる。ファージミドベクターは、ファージへのパッケージングシグナルを含んだプラスミドベクターであり、繊維状ファージゲノムの一部を含むようにして作製されたプラスミドであるために、ファージミドベクターを用いて大腸菌を形質転換した後、更にヘルパーファージに感染させる必要があり、これによって粒子形成のためのコート蛋白質が供給されて、ヘルパーファージ粒子とファージミド粒子が混合したファージが得られる。他方、ファージゲノムを改良してベクター化したファージベクターの場合には、一つのベクター内にファージの全ゲノムを含み、単独でファージを形成することができ、ファージベクターを大腸菌に感染させることによって直接ファージを得ることが可能であり、ヘルパーファージを使用する必要はないが、余計なファージ構成タンパクが発現されることになる。   The present invention also includes a human ScFv fragment itself obtained by the method for preparing a human ScFv fragment of the present invention, a phagemid vector or a phage vector in which the human ScFv fragment is incorporated, and Escherichia coli transformed with these phagemid vector or phage vector. And a phage display human single-chain antibody library prepared using this Escherichia coli. Although the said phagemid vector and phage vector are used for phage display, the said phagemid vector can be used conveniently. Since the phagemid vector is a plasmid vector containing a packaging signal for phage and is a plasmid prepared so as to contain a part of the filamentous phage genome, after transformation of E. coli with the phagemid vector, It is necessary to infect a helper phage, whereby a coat protein for particle formation is supplied, and a phage in which helper phage particles and phagemid particles are mixed is obtained. On the other hand, in the case of a phage vector obtained by improving the phage genome, the entire genome of the phage is contained in one vector, and a phage can be formed alone, and directly by infecting E. coli with the phage vector. It is possible to obtain phage and it is not necessary to use helper phage, but extra phage-constituting proteins will be expressed.

本発明のヒトＳｃＦｖ断片である重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片又は軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片を、ファージミドベクター又はファージベクターにインテグレイトすることにより、ヒト一本鎖抗体遺伝子ライブラリーを作製することができる。例えば、ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（アマシャム）を用いる場合、制限酵素ＮｃｏＩ（あるいはＳｆｉＩ）と制限酵素ＮｏｔＩとで、本発明のヒトＳｃＦｖ断片である重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片又は軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片と、ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅをそれぞれ処理した後、ライゲーションすることにより、ヒトＳｃＦｖ断片が組み込まれたファージミドベクターからなるヒト一本鎖抗体遺伝子ライブラリーを得ることができる。   By integrating the human ScFv fragment of the present invention, which is a heavy chain fragment-linker sequence-light chain fragment or light chain fragment-linker sequence-heavy chain fragment, into a phagemid vector or a phage vector, A rally can be made. For example, when the phagemid vector pCANTAB5E (Amersham) is used, the heavy chain fragment-linker sequence-light chain fragment or light chain fragment-linker which is the human ScFv fragment of the present invention using the restriction enzyme NcoI (or SfiI) and the restriction enzyme NotI. A human single chain antibody gene library comprising a phagemid vector incorporating a human ScFv fragment can be obtained by treating the sequence-heavy chain fragment and the phagemid vector pCANTAB5E, followed by ligation.

このヒト一本鎖抗体断片が組み込まれたファージミドベクターの大腸菌への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。   The introduction of this phagemid vector incorporating the human single chain antibody fragment into E. coli was performed by Davis et al. (BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986) and Sambrook et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) and other methods described in many standard laboratory manuals such as electroporation, calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, transvection, micro It can be performed by injection, cationic lipid mediated transfection, transduction, scrape loading, ballistic introduction, infection and the like.

本発明のファージディスプレイヒト一本鎖抗体ライブラリーとしては、多数の抗体を含むライブラリーであれば特に制限されるものではないが、理論的にはあらゆるタンパク質上の抗原エピトープに対応しうる、１０９程度の多種多様なファージミド抗体又はファージ抗体からなるファージミド抗体ライブラリー又はファージ抗体ライブラリー（ファージディスプレイライブラリー）が好ましい。このファージディスプレイヒト一本鎖抗体ライブラリーは、例えば、前記増幅したヒトＳｃＦｖ断片が組み込まれたファージミドベクターからなるヒト一本鎖抗体遺伝子が、そのコートタンパクｐIII遺伝子の枠内に挿入されたＭ１３ファージ等の繊維状ファージ（ファージミドベクター）をエレクトロポレーション法等により大腸菌に導入し、この大腸菌にＶＣＳ−１３等のヘルパーファージを感染させることにより、ＳｃＦＶ抗体ライブラリーとして構築することができる（H.R.Hoogenboom et al., Immunotechnology, 4, 1-20(1998)）。かかるライブラリーとして構築された個々のファージディスプレイヒト一本鎖抗体は、通常の抗体分子に準ずる抗原との反応性を有する。この場合、ＳｃＦＶを発現しているＭ１３は、ファージ粒子内にＳｃＦＶの遺伝子を、ファージミドの形で持っている偽ウイルス粒子となっている。 The phage display human single-chain antibody library of the present invention is not particularly limited as long as it is a library containing a large number of antibodies, but can theoretically correspond to antigenic epitopes on any protein. A phagemid antibody library or a phage antibody library (phage display library) comprising about 9 various phagemid antibodies or phage antibodies is preferred. This phage display human single chain antibody library is, for example, an M13 phage in which a human single chain antibody gene comprising a phagemid vector incorporating the amplified human ScFv fragment is inserted into the frame of its coat protein pIII gene. A filamentous phage (phagemid vector) is introduced into E. coli by electroporation or the like, and a helper phage such as VCS-13 is infected into this E. coli to construct a ScFV antibody library (HRHoogenboom et al., Immunotechnology, 4, 1-20 (1998)). Each phage display human single chain antibody constructed as such a library has reactivity with an antigen according to a normal antibody molecule. In this case, M13 expressing ScFV is a pseudoviral particle having the ScFV gene in the form of a phagemid in the phage particle.

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.

［ヒト抗体遺伝子の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の作製］
メラノーマの樹状細胞ワクチンを受けた２人のがん患者ドナーより末梢リンパ球を採取し、核酸抽出用スピンカラム（Nucleospin RNA II；Macherey-Nagel社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。Ｏｌｉｇｏ−ｄｔプライマーを用いた逆転写反応により全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、配列番号１〜６に示すセンスプライマーと配列番号７〜１０に示すアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ反応によりヒト抗体遺伝子重鎖可変領域を増幅し、配列番号１１〜１６及び２２〜２８に示すセンスプライマーと配列番号１７〜２１及び２９〜３１に示すアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ反応によりヒト抗体遺伝子軽鎖可変領域を増幅した。これらのプライマーは、抗体ライブラリー作製のためのヒト抗体可変領域遺伝子クローニング用プライマーとしてすでに報告されているものである（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（J. Mol. Biol.）、２２２巻、３号、５８１〜５９７頁及びプロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）９５巻、６１５７〜６１６２頁参照）。このようにして得られた多種類の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片（以下、重鎖断片及び軽鎖断片）を、リンカーペプチド配列を挟んでランダムに結合させることにより、一本鎖抗体遺伝子（ＳｃＦｖ）の多様性を生み出すことが可能となる。 [Preparation of heavy and light chain variable region gene fragments of human antibody genes]
Peripheral lymphocytes were collected from two cancer patient donors who received a melanoma dendritic cell vaccine, and total RNA was extracted using a spin column for nucleic acid extraction (Nucleospin RNA II; manufactured by Macherey-Nagel). CDNA is synthesized from total RNA by reverse transcription reaction using Oligo-dt primer, and human antibody gene heavy chain is obtained by PCR reaction using the sense primer shown in SEQ ID NO: 1-6 and the antisense primer shown in SEQ ID NO: 7-10. The variable region was amplified, and the human antibody gene light chain variable region was amplified by PCR reaction using the sense primers shown in SEQ ID NOs: 11-16 and 22-28 and the antisense primers shown in SEQ ID NOs: 17-21 and 29-31. . These primers have already been reported as primers for human antibody variable region gene cloning for antibody library construction (J. Mol. Biol., Vol. 222, No. 3, 581-597 and Proceedings of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 6157-6162). A single chain antibody gene can be obtained by randomly joining the various heavy chain and light chain variable region gene fragments (hereinafter referred to as heavy chain fragment and light chain fragment) obtained in this manner with a linker peptide sequence in between. It becomes possible to create diversity of (ScFv).

［アセンブリーＰＣＲによるＳｃＦｖ断片の作製］
これまでに報告されているＳｃＦｖ断片調製方法を図１及び図２に示す（以下各々「従来法１」及び「従来法２」と呼ぶ）。これらの従来法は、いずれもアッセンブリーＰＣＲ法を用いてＤＮＡ断片を〈重鎖−リンカー−軽鎖〉の順に連結させるものであり、従来法１は重鎖、軽鎖及びリンカー配列をコードする３つのＤＮＡ断片を、従来法２はリンカー配列の約半分を重鎖３’端及び軽鎖５’端にそれぞれ付与した２つのＤＮＡ断片をＰＣＲ法で連結させるものである。 [Preparation of ScFv fragment by assembly PCR]
ScFv fragment preparation methods reported so far are shown in FIGS. 1 and 2 (hereinafter referred to as “Conventional method 1” and “Conventional method 2”, respectively). In any of these conventional methods, DNA fragments are ligated in the order of <heavy chain-linker-light chain> using the assembly PCR method. Conventional method 1 encodes a heavy chain, a light chain, and a linker sequence. In the conventional method 2, two DNA fragments each having about half of the linker sequence added to the heavy chain 3 ′ end and the light chain 5 ′ end are ligated by the PCR method.

具体的には、従来法１では重鎖断片及び軽鎖断片とフレキシブル・リンカー配列と呼ばれるアミノ酸のグリシン４残基とセリン１残基を１単位（ＧＳ配列）とし、これが３単位タンデムに繰り返す配列を仲立ちとして計３種類のＤＮＡ断片をＰＣＲにより結合する。重鎖断片の３’端とリンカーの５’端、リンカーの３’端と軽鎖断片の５’端のそれぞれ一部が相補的な配列となるように設計されており、それぞれのＤＮＡ断片がプライマーとして働き、伸長反応の結果一本鎖のＤＮＡ断片が合成される。また、従来法２は、ＰＣＲ反応により重鎖３’端及び軽鎖５’端にリンカー配列の約半分の配列を付与し、かつそれぞれの一部が相補的配列を含むよう設計されたプライマーを用いて増幅を行い、計２種類のＤＮＡ断片をアセンブリーＰＣＲにより結合する方法である。   Specifically, in the conventional method 1, a heavy chain fragment and a light chain fragment, and amino acid glycine 4 residue and serine 1 residue called flexible linker sequence are defined as 1 unit (GS sequence), and this repeats in 3 units tandem. A total of three types of DNA fragments are bound by PCR. The 3 ′ end of the heavy chain fragment and the 5 ′ end of the linker, and the 3 ′ end of the linker and the 5 ′ end of the light chain fragment are designed to have complementary sequences. As a primer, a single-stranded DNA fragment is synthesized as a result of the extension reaction. Further, in the conventional method 2, a primer designed so that about half of the linker sequence is added to the heavy chain 3 ′ end and the light chain 5 ′ end by PCR reaction, and each part includes a complementary sequence. Amplification is performed, and a total of two types of DNA fragments are combined by assembly PCR.

図４のＡ及びＢに両従来法により調製したＳｃＦｖ断片のアガロースゲル電気泳動像を示す。従来法１では非特異的反応の生成物と考えられるバンドが多数かつ多量に存在し、目的バンドの反応生成物全体に対する割合は低い（Ａ）。従来法２によっては低分子量側の非特異的反応生成物は減少したものの、高分子側にスメアとなる反応生成物が多量に存在し、目的バンドの目視は困難であった（Ｂ）。従来法２を用いて、ＰＣＲ反応の際のアニーリング温度の上昇（Ｃ）及び三回目のＰＣＲに用いるプライマー長を長くして特異性の向上を図った（Ｄ）が十分量の目的生成物を得ることは困難であった。   FIGS. 4A and 4B show agarose gel electrophoresis images of ScFv fragments prepared by both conventional methods. In the conventional method 1, there are many and a large amount of bands that are considered to be products of non-specific reaction, and the ratio of the target band to the whole reaction product is low (A). Although the non-specific reaction product on the low molecular weight side decreased depending on the conventional method 2, a large amount of a reaction product that becomes a smear exists on the polymer side, and it was difficult to visually observe the target band (B). The conventional method 2 was used to increase the annealing temperature during the PCR reaction (C) and to increase the specificity by increasing the primer length used in the third PCR (D). It was difficult to get.

［ライゲーション反応によるＳｃＦｖ断片調製法の検討］
そこで、効率よく目的とするＰＣＲ反応物を得るために重鎖及び軽鎖断片の結合方法を根本的に変える方法を考案、これを試行した。図３に本法（方法３）の概略を示す。方法３では、２回目のＰＣＲの際に用いるプライマーのうち重鎖３’プライマーでは２単位のＧＳ配列と制限酵素認識配列、軽鎖５’プライマーは制限酵素認識配列と１単位のＧＳ配列を含む。この重鎖及び軽鎖断片の２回目のＰＣＲ産物をそれぞれ制限酵素で消化し、ライゲーション反応によりリンカーを含む両断片を結合し、３回目のＰＣＲでＳｃＦｖ断片として増幅した。 [Examination of ScFv fragment preparation method by ligation reaction]
Thus, in order to efficiently obtain the desired PCR reaction product, a method for fundamentally changing the method for binding heavy and light chain fragments was devised and tried. FIG. 3 shows an outline of this method (Method 3). In method 3, the heavy chain 3 ′ primer of the primers used for the second PCR contains 2 units of GS sequence and restriction enzyme recognition sequence, and the light chain 5 ′ primer contains a restriction enzyme recognition sequence and 1 unit of GS sequence. . The second PCR products of the heavy chain and light chain fragments were each digested with restriction enzymes, both fragments including the linker were ligated by ligation reaction, and amplified as ScFv fragments by the third PCR.

［制限酵素の選択］
本法の特色のひとつは用いる制限酵素にある。方法３に用いる制限酵素は以下の条件を満たす必要がある。
１）重鎖及び軽鎖断片を切断しない酵素であること。抗体産生細胞では、抗体遺伝子のＶ−Ｄ−Ｊの体細胞組換えとaffinity maturationと呼ばれる遺伝子変異を起こすことにより生体にとって有益な特異性と親和性をもつ抗体を産生するクローンが選抜される。各クローンがそれぞれに独自の配列を有すると考えられるため、存在するであろう全ての抗体遺伝子に関して制限酵素認識配列の有無を調べることはできないが、少なくともゲノムに存在する抗体遺伝子に関して解析し、これらを切断しない制限酵素を選び出すことは必要最低条件となる。
２）重鎖同士又は軽鎖同士のライゲーションを防ぐ為に、酵素の切断面が平滑断面でないこと。
３）対合断片（異なる酵素でライゲーション可能な切断片）を生じる制限酵素の組合せであること。
以上の条件を全て満たす制限酵素を検索した結果、方法３に使用する制限酵素としてＸｂａＩとＮｈｅＩの組合せを決定した。 [Selection of restriction enzymes]
One of the features of this method is the restriction enzyme used. The restriction enzyme used in Method 3 must satisfy the following conditions.
1) An enzyme that does not cleave heavy and light chain fragments. In the antibody-producing cells, clones that produce antibodies having specificity and affinity useful for the living body are selected by causing gene mutation called affinity maturation and somatic recombination of antibody genes VD-J. Since each clone is considered to have its own unique sequence, it is impossible to check for the presence of restriction enzyme recognition sequences for all antibody genes that may be present, but at least the antibody genes present in the genome are analyzed, Selecting a restriction enzyme that does not cleave is a necessary minimum condition.
2) In order to prevent ligation between heavy chains or light chains, the cut surface of the enzyme is not a smooth cross section.
3) It is a combination of restriction enzymes that generates paired fragments (cut fragments that can be ligated with different enzymes).
As a result of searching for restriction enzymes that satisfy all of the above conditions, a combination of XbaI and NheI was determined as a restriction enzyme used in Method 3.

［重鎖断片−リンカー−軽鎖断片の連結］
配列番号３２〜３７に示すセンスプライマーと配列番号３８〜４１に示すアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ反応により、実施例１で作製した重鎖断片の５’末端にＮｃｏ１認識配列を、３’末端にＸｂａｌ認識配列とリンカー配列の一部をそれぞれ付加した。また、配列番号４２〜４７及び５３〜５９に示すセンスプライマーと配列番号４８〜５２及び６０〜６２に示すアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ反応により、実施例１で作製した軽鎖断片の５’末端にＮｈｅ１認識配列とリンカー配列の一部を、３’末端にＮｏｔ１認識配列をそれぞれ付加した。重鎖断片のＰＣＲ産物をＸｂａＩで、軽鎖断片のＰＣＲ産物をＮｈｅＩで消化した後、ライゲーション反応により結合させた。 [Linkage of heavy chain fragment-linker-light chain fragment]
By PCR reaction using the sense primer shown in SEQ ID NOs: 32-37 and the antisense primer shown in SEQ ID NOs: 38-41, an Nco1 recognition sequence was added to the 5 ′ end of the heavy chain fragment prepared in Example 1 at the 3 ′ end. An Xbal recognition sequence and a part of the linker sequence were added. Further, the 5 ′ end of the light chain fragment prepared in Example 1 was obtained by PCR reaction using the sense primers shown in SEQ ID NOs: 42 to 47 and 53 to 59 and the antisense primers shown in SEQ ID NOs: 48 to 52 and 60 to 62. The Nhe1 recognition sequence and a part of the linker sequence were added to the 3 ′ end, and the Not1 recognition sequence was added to the 3 ′ end. The PCR product of the heavy chain fragment was digested with XbaI and the PCR product of the light chain fragment was digested with NheI, and then ligated by a ligation reaction.

［軽鎖断片−リンカー−重鎖断片の連結］
軽鎖断片−リンカー−重鎖断片からなる一本鎖抗体遺伝子断片を作製する場合、配列番号６３〜６８及び７４〜８０に示すセンスプライマーと配列番号６９〜７３及び８１〜８３に示すアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ反応により、実施例１で作製した軽鎖断片の５’末端にＮｃｏ１認識配列を、３’末端にＸｂａｌ認識配列とリンカー配列の一部をそれぞれ付加する。また、配列番号８４〜８９に示すセンスプライマーと配列番号９０〜９３に示すアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ反応により、実施例１で作製した重鎖断片の５’末端にＮｈｅ１認識配列とリンカー配列の一部を、３’末端にＮｏｔ１認識配列をそれぞれ付加する。軽鎖断片のＰＣＲ産物をＸｂａＩで、重鎖断片のＰＣＲ産物をＮｈｅＩで消化した後、ライゲーション反応により結合させる。 [Linkage of light chain fragment-linker-heavy chain fragment]
When producing a single-chain antibody gene fragment comprising a light chain fragment-linker-heavy chain fragment, sense primers shown in SEQ ID NOs: 63 to 68 and 74 to 80 and antisense primers shown in SEQ ID NOs: 69 to 73 and 81 to 83 The Nco1 recognition sequence is added to the 5 ′ end of the light chain fragment prepared in Example 1, and the Xbal recognition sequence and a part of the linker sequence are added to the 3 ′ end. In addition, an Nhe1 recognition sequence and a linker sequence were added to the 5 ′ end of the heavy chain fragment prepared in Example 1 by PCR using the sense primer shown in SEQ ID NOs: 84 to 89 and the antisense primer shown in SEQ ID NOs: 90 to 93. In part, a Not1 recognition sequence is added to the 3 ′ end. The light chain fragment PCR product is digested with XbaI and the heavy chain fragment PCR product is digested with NheI, and then ligated by a ligation reaction.

［一本鎖抗体遺伝子断片の増幅］
実施例３で作製した一本鎖抗体遺伝子断片を、再度ＸｂａＩとＮｈｅＩにより消化することにより、重鎖断片のＰＣＲ産物同士又は軽鎖断片のＰＣＲ産物同士の結合断片を消化し、目的とする重鎖断片−軽鎖断片の結合断片のみを調製した（図５）。このようにして得られた重鎖断片−リンカー−軽鎖断片からなる一本鎖抗体遺伝子断片を配列番号３２〜３７、４８〜５２、６０〜６２に示すプライマーを用いたＰＣＲ反応により増幅させた（図４Ｅ）。 [Amplification of single chain antibody gene fragment]
The single chain antibody gene fragment prepared in Example 3 is digested again with XbaI and NheI to digest the binding fragments between the PCR products of the heavy chain fragments or between the PCR products of the light chain fragments. Only the binding fragment of the chain fragment-light chain fragment was prepared (FIG. 5). The thus obtained single chain antibody gene fragment consisting of heavy chain fragment-linker-light chain fragment was amplified by PCR reaction using primers shown in SEQ ID NOs: 32-37, 48-52, 60-62. (FIG. 4E).

［最適なポリメラーゼの選択］
さらに、本法により得られた一本鎖抗体遺伝子断片の塩基配列を解析した（以下の全ての実験において大腸菌ＤＨ５αを宿主とした形質転換体１０〜１２コロニーについて検討した。）。前述の如く、発現する抗体遺伝子塩基配列はゲノム上の遺伝子からはある程度逸脱しており、単純ではあるが実験系の目的に則した以下の基準を設けた。
（１）配列が〈重鎖−リンカー−軽鎖〉の組合せになっていること。
（２）蛋白コード配列中の塩基欠失又は挿入によるフレームシフトを生じないこと。
（３）リンカー配列が健常であること（設計通りの配列になっていること）。
（４）重鎖及び軽鎖断片中の読み枠にストップコドンの出現しないこと。 [Selection of optimal polymerase]
Furthermore, the base sequence of the single-chain antibody gene fragment obtained by this method was analyzed (in all the following experiments, transformants 10 to 12 colonies using Escherichia coli DH5α as a host were examined). As described above, the expressed antibody gene base sequence deviates from the gene on the genome to some extent, and although it is simple, the following criteria are set in accordance with the purpose of the experimental system.
(1) The sequence is a combination of <heavy chain-linker-light chain>.
(2) No frame shift caused by base deletion or insertion in the protein coding sequence.
(3) The linker sequence is healthy (the sequence is as designed).
(4) No stop codon appears in the reading frame in the heavy and light chain fragments.

ＰＣＲ反応の全てのステップを一般に広く使用されているＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて行った場合、ライブラリーに使用可能な、上記（１）〜（４）の基準を満たす一本鎖抗体遺伝子断片の生成率は２０％であった（２／１０クローン）。ライブラリー作製に使用可能な一本鎖抗体遺伝子断片の生成率を向上させるためには、ＰＣＲ増幅反応の正確性を向上させることが必要であると考えられたため、最適な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを選出するための実験を行った。この実験では重鎖及び軽鎖断片を増幅させるためのＰＣＲ反応（１回目のＰＣＲ）において数種類のポリメラーゼを用いて検討を行い、ＰＣＲ産物量をアガロース電気泳動法にて比較した。   When all steps of the PCR reaction are performed using Taq DNA polymerase, which is generally widely used, the production rate of single-chain antibody gene fragments satisfying the above criteria (1) to (4) that can be used for the library Was 20% (2/10 clones). In order to improve the production rate of single-chain antibody gene fragments that can be used for library construction, it was considered necessary to improve the accuracy of the PCR amplification reaction, so the optimal thermostable DNA polymerase was selected. An experiment was conducted. In this experiment, a PCR reaction (first PCR) for amplifying heavy and light chain fragments was examined using several types of polymerases, and the amounts of PCR products were compared by agarose electrophoresis.

その結果、ＰＣＲ反応に複数のプライマーを用いる本実験系においては、正確性の高いproof-reading酵素（ＰＲ酵素）は重鎖断片の増幅効率が悪く、十分な量のＰＣＲ産物を得ることができなかった。一方、ＴａｑポリメラーゼとＰＲ酵素であるＰｆｕポリメラーゼを混合したタイプの酵素（混合酵素：PicoMaxx High Fidelity PCR system、STRATAGENE社）で十分な増幅の起きることが判明した（図１０）。全てのＰＣＲ反応を混合酵素で行った場合について一本鎖抗体遺伝子断片の塩基配列を上記と同様な基準で評価したところ、６６．７％（８／１２クローン）であった。即ち、全てのステップに混合酵素を用いた場合、約３倍の精度向上が認められ、本実験系には混合型酵素の使用が適すると判断された。   As a result, in this experimental system that uses multiple primers for the PCR reaction, a highly accurate proof-reading enzyme (PR enzyme) has a poor amplification efficiency of heavy chain fragments, and a sufficient amount of PCR product can be obtained. There wasn't. On the other hand, it was found that sufficient amplification occurred with a type of enzyme (mixed enzyme: PicoMaxx High Fidelity PCR system, STRATAGENE) in which Taq polymerase and Pfu polymerase, which is a PR enzyme, were mixed (FIG. 10). When all the PCR reactions were performed with a mixed enzyme, the base sequence of the single-chain antibody gene fragment was evaluated according to the same criteria as above, and it was 66.7% (8/12 clones). That is, when a mixed enzyme was used in all steps, an accuracy improvement of about 3 times was recognized, and it was determined that the use of a mixed enzyme was suitable for this experimental system.

［方法３によるヒト一本鎖抗体遺伝子ライブラリーの作製］
これまでに確立した系を用いてヒト一本鎖抗体遺伝子断片を作製し、制限酵素サイトＮｃｏＩ及びＮｏｔＩを利用してファージミドベクター（ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ；アマシャム社製）に組み込み、一本鎖抗体遺伝子ライブラリーを作製した。このライブラリーを大腸菌（ＴＧ１又はＪＭ１０９）にエレクトロポレーション法により導入した結果、図９に示すように、０．２μｇのベクターあたり約３ｘ１０７のコロニーが得られた。 [Preparation of human single-chain antibody gene library by Method 3]
A human single chain antibody gene fragment is prepared using a system established so far, and incorporated into a phagemid vector (pCANTAB5E; manufactured by Amersham) using restriction enzyme sites NcoI and NotI, and a single chain antibody gene library is prepared. Produced. As a result of introducing this library into E. coli (TG1 or JM109) by electroporation, about 3 × 10 7 colonies were obtained per 0.2 μg of vector, as shown in FIG.

［ファージライブラリーの作製］
ファージライブラリーの作製は、BradburyとMarks（Phage Display, Edited by Tim Clackson and Henry B. Lawman, Oxford University Press, Chapter 13 Phage antibody libraries, Andrew R. M. Bradbury and James D. Marks, P.243-288）などの標準的な実験室マニュアルに記載される方法に準じて行うことができる。例えば、ファージミドベクターを導入した大腸菌を２％グルコース及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｘＹＴ寒天培地にプレーティングし３０℃にて一晩培養する。これを２％グルコース及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｘＹＴ液体培地とスクレーパーを用いて寒天培地よりかきとり、終濃度１５％となるようにグリセリンを加えて−８０℃にて保存する。形質転換した大腸菌のプレーティング時に同時にその希釈系列を作製、別な寒天培地にプレーティングしてコロニー数を算出し、形質転換効率を算定しておく。実験の目的に応じて、必要なコロニー数が獲得されるまで同様な手順を繰り返し、十分なサイズのライブラリーを作出する。用いる大腸菌としてはＴＧ１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどのストレインのエレクトロコンピテントセルを用いることが望ましい。Ｍ１３ＫＯ７などのヘルパーファージを用いることで、ファージの外殻蛋白ｇ３ｐの一部に一本鎖抗体タンパクを発現する線維状ファージを発現させることができる。 [Preparation of phage library]
The preparation of phage libraries includes Bradbury and Marks (Phage Display, Edited by Tim Clackson and Henry B. Lawman, Oxford University Press, Chapter 13 Phage antibody libraries, Andrew RM Bradbury and James D. Marks, P.243-288) Can be performed according to the methods described in the standard laboratory manual. For example, E. coli introduced with a phagemid vector is plated on a 2 × YT agar medium containing 2% glucose and 100 μg / ml ampicillin and cultured at 30 ° C. overnight. This is scraped from an agar medium using a 2 × YT liquid medium containing 2% glucose and 100 μg / ml ampicillin and a scraper, glycerin is added to a final concentration of 15%, and the mixture is stored at −80 ° C. A dilution series is prepared at the same time as plating of transformed E. coli, plated on another agar medium, the number of colonies is calculated, and the transformation efficiency is calculated. Depending on the purpose of the experiment, repeat the same procedure until the required number of colonies is obtained, and create a library of sufficient size. As the Escherichia coli to be used, it is preferable to use a strain electrocompetent cell such as TG1, XL1-Blue. By using a helper phage such as M13KO7, a filamentous phage that expresses a single-chain antibody protein can be expressed in a part of the phage outer protein g3p.

従来技術によるＳｃＦｖ断片調製方法（従来法１；３断片結合法）を示す図である。It is a figure which shows the ScFv fragment preparation method by the prior art (Conventional method 1; 3 fragment | piece binding method). 従来技術によるＳｃＦｖ断片調製方法（従来法２；２断片結合法）を示す図である。It is a figure which shows the ScFv fragment preparation method by the prior art (conventional method 2; 2 fragment | piece binding method). 本発明のＳｃＦｖ断片調製方法（方法３；ライゲーションによる２断片結合法）を示す図である。It is a figure which shows the ScFv fragment preparation method (Method 3; 2 fragment | piece binding method by ligation) of this invention. 従来技術のＳｃＦｖ断片調製方法（３断片結合法及び２断片結合法）と本発明のＳｃＦｖ断片調製方法（ライゲーションによる２断片結合法）との比較結果を示す図である。It is a figure which shows the comparison result of the ScFv fragment preparation method of the prior art (3-fragment binding method and 2-fragment binding method) and the ScFv fragment preparation method of the present invention (2-fragment binding method by ligation). 本発明の重鎖及び軽鎖断片のライゲーションによる結合フローを示す図である。It is a figure which shows the binding flow by the ligation of the heavy chain and light chain fragment of this invention. 本発明の実行操作フローチャートを示す図である。It is a figure which shows the execution operation flowchart of this invention. 本発明の１回目のＰＣＲに供するプライマーの塩基配列を示す図である。It is a figure which shows the base sequence of the primer with which it uses for 1st PCR of this invention. 本発明の２回目及び３回目のＰＣＲに供するプライマーの塩基配列を示す図である。It is a figure which shows the base sequence of the primer with which it uses for 2nd time and 3rd time PCR of this invention. がん患者抹消リンパ球からの本発明のファージ抗体ライブラリーの作製方法を示す図である。It is a figure which shows the preparation methods of the phage antibody library of this invention from a cancer patient peripheral lymphocyte. 本発明のＰＣＲに用いる耐熱性ポリメラーゼの検討結果を示す図である。It is a figure which shows the examination result of the thermostable polymerase used for PCR of this invention.

Claims (20)

以下の（１）〜（５）の工程を順次備えたことを特徴とするヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（１）ヒト抗体重鎖遺伝子を、抗体重鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＨＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＨＶアンチセンス配列）からなるプライマー対を用いたＰＣＲ反応、並びに、ヒト抗体軽鎖遺伝子を、抗体軽鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＬＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＬＶアンチセンス配列）からなるプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、それぞれ抗体重鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（重鎖断片）及び軽鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（軽鎖断片）として増幅する工程；
（２）前記重鎖断片を、前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーと、制限酵素ＸｂａＩ認識配列、重鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応、並びに、前記軽鎖断片を、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、それぞれ重鎖断片−重鎖リンカー配列［Ｉ］−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む重鎖複合断片と、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−軽鎖リンカー配列［Ｉ］−軽鎖断片を含む軽鎖複合断片として増幅する工程；
（３）前記重鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、前記軽鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させる工程；
（４）ライゲーション産物を、制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＮｈｅＩで消化する工程；
（５）前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片を増幅する工程； A method for preparing a human ScFv fragment comprising the following steps (1) to (5) in sequence.
(1) PCR reaction using a human antibody heavy chain gene using a primer pair consisting of a sense primer sequence (HV sense sequence) and an antisense primer sequence (HV antisense sequence) specific to the antibody heavy chain variable region, and The human antibody light chain gene was subjected to anti-PCR by PCR reaction using a primer pair consisting of a sense primer sequence (LV sense sequence) and an antisense primer sequence (LV antisense sequence) specific to the antibody light chain variable region. Amplifying as a gene fragment (heavy chain fragment) encoding a weight chain variable region and a gene fragment (light chain fragment) encoding a light chain variable region;
(2) PCR reaction using the heavy chain fragment, a sense primer containing the HV sense sequence, and an antisense primer containing a restriction enzyme XbaI recognition sequence, heavy chain linker sequence [I] and the HV antisense sequence, And, the light chain fragment was subjected to PCR reaction using a restriction primer containing a restriction enzyme NheI recognition sequence, a light chain linker sequence [I] and the LV sense sequence, and an antisense primer containing the LV antisense sequence, As a heavy chain fragment comprising a heavy chain fragment-heavy chain linker sequence [I] -restriction enzyme XbaI recognition sequence and a restriction enzyme NheI recognition sequence-light chain linker sequence [I] -light chain fragment Amplifying;
(3) a step of digesting the heavy chain complex fragment with the restriction enzyme XbaI and the light chain complex fragment with the restriction enzyme NheI and then ligating them by ligation;
(4) a step of digesting the ligation product with a restriction enzyme XbaI and a restriction enzyme NheI;
(5) A step of amplifying a human ScFv fragment comprising a heavy chain fragment-linker sequence-light chain fragment by a PCR reaction using the sense primer containing the HV sense sequence and the antisense primer containing the LV antisense sequence. ; 以下の（１）〜（５）の工程を順次備えたことを特徴とするヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。
（１）ヒト抗体重鎖遺伝子を、抗体重鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＨＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＨＶアンチセンス配列）からなるプライマー対を用いたＰＣＲ反応、並びに、ヒト抗体軽鎖遺伝子を、抗体軽鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＬＶセンス配列）及びアンチセンスプライマー配列（ＬＶアンチセンス配列）からなるプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、それぞれ抗体重鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（重鎖断片）及び軽鎖可変部領域をコードする遺伝子断片（軽鎖断片）として増幅する工程；
（２）前記軽鎖断片を、前記ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーと、制限酵素ＸｂａＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［II］及び前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応、並びに、前記重鎖断片を、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、重鎖リンカー配列［II］及び前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、それぞれ軽鎖断片−軽鎖リンカー配列［II］−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む軽鎖複合断片と、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−重鎖リンカー配列［II］−重鎖断片を含む重鎖複合断片として増幅する工程；
（３）前記軽鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、前記重鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させる工程；
（４）ライゲーション産物を、制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＮｈｅＩで消化する工程；
（５）前記ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーと、前記ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ反応により、軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片からなるヒトＳｃＦｖ断片を増幅する工程； A method for preparing a human ScFv fragment comprising the following steps (1) to (5) in sequence.
(1) PCR reaction using a human antibody heavy chain gene using a primer pair consisting of a sense primer sequence (HV sense sequence) and an antisense primer sequence (HV antisense sequence) specific to the antibody heavy chain variable region, and The human antibody light chain gene was subjected to anti-PCR by PCR reaction using a primer pair consisting of a sense primer sequence (LV sense sequence) and an antisense primer sequence (LV antisense sequence) specific to the antibody light chain variable region. Amplifying as a gene fragment (heavy chain fragment) encoding a weight chain variable region and a gene fragment (light chain fragment) encoding a light chain variable region;
(2) PCR reaction using the light chain fragment using a sense primer containing the LV sense sequence and an antisense primer containing a restriction enzyme XbaI recognition sequence, a light chain linker sequence [II] and the LV antisense sequence, In addition, the heavy chain fragment is subjected to PCR reaction using a restriction primer containing a restriction enzyme NheI recognition sequence, a heavy chain linker sequence [II] and the HV sense sequence, and an antisense primer containing the HV antisense sequence, Light chain fragment-light chain linker sequence [II] -light chain complex fragment containing restriction enzyme XbaI recognition sequence and heavy chain complex fragment containing restriction enzyme NheI recognition sequence-heavy chain linker sequence [II] -heavy chain fragment Amplifying;
(3) a step of ligating by ligation after digesting the light chain complex fragment with restriction enzyme XbaI and the heavy chain complex fragment with restriction enzyme NheI;
(4) a step of digesting the ligation product with a restriction enzyme XbaI and a restriction enzyme NheI;
(5) A step of amplifying a human ScFv fragment comprising a light chain fragment-linker sequence-heavy chain fragment by PCR reaction using the sense primer containing the LV sense sequence and the antisense primer containing the HV antisense sequence. ; ヒトＳｃＦｖ断片が、両端部に、制限酵素ＸｂａＩ認識配列及び制限酵素ＮｈｅＩ認識配列以外の、制限酵素認識配列を有することを特徴とする請求項１又は２記載のＳｃＦｖ断片の調製方法。 The method for preparing an ScFv fragment according to claim 1 or 2, wherein the human ScFv fragment has a restriction enzyme recognition sequence other than the restriction enzyme XbaI recognition sequence and the restriction enzyme NheI recognition sequence at both ends. 抗体重鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＨＶセンス配列）が、配列番号１〜６に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。 The sense primer sequence (HV sense sequence) specific for the antibody heavy chain variable region is one or more of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1-6. 4. A method for preparing a human ScFv fragment according to any one of 3). 抗体重鎖可変部領域に特異的なアンチセンスプライマー配列（ＨＶアンチセンス配列）が、配列番号７〜１０に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。 The antisense primer sequence (HV antisense sequence) specific to the antibody heavy chain variable region is one or more of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 7 to 10. The preparation method of the human ScFv fragment | piece in any one of 1-4. 抗体軽鎖可変部領域に特異的なセンスプライマー配列（ＬＶセンス配列）が、配列番号１１〜１６及び２２〜２８に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。 The sense primer sequence (LV sense sequence) specific for the antibody light chain variable region is one or more of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 11 to 16 and 22 to 28 A method for preparing a human ScFv fragment according to any one of claims 1 to 5. 抗体軽鎖可変部領域に特異的なアンチセンスプライマー配列（ＬＶアンチセンス配列）が、配列番号１７〜２１及び２９〜３１に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。 The antisense primer sequence (LV antisense sequence) specific to the antibody light chain variable region is one or more of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 17 to 21 and 29 to 31 A method for preparing a human ScFv fragment according to any one of claims 1 to 6. ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーとして、配列番号３２〜３７に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項１及び３〜７のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。 The human ScFv according to any one of claims 1 and 3 to 7, wherein one or more of the primers consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 32-37 are used as the sense primer containing the HV sense sequence. Fragment preparation method. 制限酵素ＸｂａＩ認識配列、重鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとして、配列番号３８〜４１に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項１及び３〜８のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。 As an antisense primer containing the restriction enzyme XbaI recognition sequence, the heavy chain linker sequence [I] and the HV antisense sequence, one or more of the primers comprising the base sequences shown in SEQ ID NOs: 38 to 41 are used. A method for preparing a human ScFv fragment according to any one of claims 1 and 3-8. 制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［Ｉ］及び前記ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーとして、配列番号４２〜４７及び５３〜５９に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項１及び３〜９のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。 As a sense primer containing a restriction enzyme NheI recognition sequence, a light chain linker sequence [I] and the LV sense sequence, one or more of primers consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 42 to 47 and 53 to 59 are used. A method for preparing a human ScFv fragment according to any one of claims 1 and 3-9. ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとして、配列番号４８〜５２及び６０〜６２に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項１及び３〜１０のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。 The antisense primer comprising an LV antisense sequence, wherein one or more of the primers comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 48 to 52 and 60 to 62 are used. A method for preparing a human ScFv fragment according to any one of the above. ＬＶセンス配列を含むセンスプライマーとして、配列番号６３〜６８及び７４〜８０に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項２〜１１のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。 The sense primer containing an LV sense sequence uses one or more of the primers consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 63 to 68 and 74 to 80, according to any one of claims 2 to 11. Preparation method of human ScFv fragment. 制限酵素ＸｂａＩ認識配列、軽鎖リンカー配列［II］及び前記ＬＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとして、配列番号６９〜７３及び８１〜８３に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項２〜１２のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。 As an antisense primer containing a restriction enzyme XbaI recognition sequence, a light chain linker sequence [II] and the LV antisense sequence, one or more primers comprising the base sequences shown in SEQ ID NOs: 69 to 73 and 81 to 83 The method for preparing a human ScFv fragment according to any one of claims 2 to 12, wherein: 制限酵素ＮｈｅＩ認識配列、重鎖リンカー配列［II］及び前記ＨＶセンス配列を含むセンスプライマーとして、配列番号８４〜８９に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項２〜１３のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。 As a sense primer containing a restriction enzyme NheI recognition sequence, a heavy chain linker sequence [II] and the HV sense sequence, one or more primers comprising the base sequences shown in SEQ ID NOs: 84 to 89 are used. A method for preparing a human ScFv fragment according to any one of claims 2 to 13. ＨＶアンチセンス配列を含むアンチセンスプライマーとして、配列番号９０〜９３に示される塩基配列からなるプライマーの１種又は２種以上を用いることを特徴とする請求項２〜１４のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。 The human ScFv according to any one of claims 2 to 14, wherein one or more of the primers consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 90 to 93 are used as the antisense primer containing the HV antisense sequence. Fragment preparation method. ＰＣＲに、ポリメラーゼとして、改変型Ｔａｑポリメラーゼとproof-reading活性を持つ酵素であるＰｆｕポリメラーゼを混合したタイプの酵素（PicoMaxx High Fidelity PCR system、STRATAGENE社）を用いることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか記載のヒトＳｃＦｖ断片の調製方法。 16. The PCR uses a type of enzyme (PicoMaxx High Fidelity PCR system, STRATAGENE) in which modified Taq polymerase and Pfu polymerase, which is an enzyme having proof-reading activity, are used as a polymerase. A method for preparing a human ScFv fragment according to any one of the above. 請求項１〜１６のいずれか記載の調製方法により得られることを特徴とするヒトＳｃＦｖ断片。 A human ScFv fragment obtained by the preparation method according to any one of claims 1 to 16. 請求項１７記載のヒトＳｃＦｖ断片が組み込まれたことを特徴とするファージミドベクター又はファージベクター。 A phagemid vector or a phage vector into which the human ScFv fragment according to claim 17 is incorporated. 請求項１８記載のファージミドベクター又はファージベクターにより形質転換されたことを特徴とする大腸菌。 E. coli transformed with the phagemid vector or phage vector according to claim 18. 請求項１９記載の大腸菌を用いて作製されたことを特徴とするファージディスプレイヒト一本鎖抗体ライブラリー。 A phage display human single chain antibody library produced using the Escherichia coli according to claim 19.
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