JP2008237114A - Fertility diagnosis kit, mutation detection method, polynucleotide, polypeptide, expression vector, and expression kit - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性診断キット及び変異検出方法、並びに、不妊症の治療方法の研究に用いられる変異型のポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドに関するものである。 The present invention relates to a fertility diagnostic kit and a mutation detection method capable of estimating fertility and identifying the cause of infertility, and a mutant polypeptide used for research on a method for treating infertility and the same The present invention relates to a polynucleotide encoding.
近年、少子化の問題が頻繁に取り上げられ、この問題を解消するために様々な対策が模索されている。少子化の対策として、不妊症により子供を授からない夫婦を救済することが重要であることは言うまでもない。 In recent years, the problem of declining birthrate has been frequently taken up, and various measures are being sought to solve this problem. Needless to say, it is important to rescue couples who have no children due to infertility as a countermeasure to the declining birthrate.
非特許文献1では、子供を望む夫婦のうちの約15%が2年たっても妊娠できないという報告がなされている。近年では、体外受精(IVF;In Vitro Fertilization)の技術発展により、精子の活動能が低い場合においても妊娠出産が可能になっているが、不妊の背後にある分子メカニズムは依然として明らかになっていないのが現状である。
非特許文献2によると、マウスにおける雄性不妊の研究により、妊孕性に影響を与える多くの遺伝子の存在が明らかになっており、これらの遺伝子の変異がヒトにおいても男性不妊を引き起こす一因となっている可能性がある。
According to Non-Patent
哺乳類の雄性生殖細胞の成熟は、数々の構造的及び機能的変化を経てなされる。その過程は精子形成と呼ばれ、主として(1)精原細胞の増殖及び分化、(2)精母細胞の前期段階における減数分裂、及び(3)半数体円形精子細胞から精子への分化の際の急激な形態変化、の3つの段階を含んでいる。 Maturation of mammalian male germ cells occurs through a number of structural and functional changes. The process is called spermatogenesis, and is mainly involved in (1) proliferation and differentiation of spermatogonia, (2) meiosis in the early stage of spermatocytes, and (3) differentiation from haploid round sperm cells to sperm. It includes three stages of rapid shape change.
このような雄性生殖細胞が存在する精巣において特に多く発現するマウスのタンパク質として、Centrin1タンパク質が知られている(非特許文献3)。Centrinタンパク質は、酵母から哺乳類まで多種多様な生物に見られ、中心体を構成する部品の1つとして機能する。酵母などにおける実験から、Centrinタンパク質は中心体の複製や分離に重要な役割を果たすことが知られている。 Centrin1 protein is known as a mouse protein that is particularly highly expressed in the testis where such male germ cells are present (Non-patent Document 3). Centrin protein is found in a wide variety of organisms from yeast to mammals, and functions as one of the components constituting the centrosome. From experiments in yeast and the like, the Centrin protein is known to play an important role in the replication and separation of centrosomes.
マウスは、Centrinタンパク質をコードする3つの遺伝子、Centrin1、Centrin2、Centrin3を有している。これらのうち、Centrin1タンパク質は、成熟したオスの精巣において特に強く発現し、また、精子においては尾部に局在する。これらのことから、Centrin1タンパク質は減数分裂時の中心体の機能又は精子の鞭毛基部の構成に関与すると考えられている。 The mouse has three genes encoding Centrin protein, Centrin1, Centrin2, and Centrin3. Of these, the Centrin1 protein is particularly strongly expressed in mature male testis and is localized in the tail in sperm. From these facts, the Centrin1 protein is considered to be involved in the function of the centrosome during meiosis or the structure of the sperm flagella.
このCentrinタンパク質をコードする遺伝子はヒトにも存在する(非特許文献4)。なお、Centrinタンパク質をコードする遺伝子は、ヒトにおいても3つの遺伝子が存在することが知られている。中でも、ヒトCentrin1タンパク質は、マウスCentrin1タンパク質と高い相同性を有し、同じ起源に由来していると考えられている(非特許文献3)。
上述したように、Centrin1遺伝子は、哺乳類において種を越えて保存され、かつ、半数体生殖細胞に特に強く発現するタンパク質をコードするものであることから、これらの遺伝子における変異は不妊を引き起こし得ると考えられる。しかしながら、現在までに、Centrin1遺伝子の変異と不妊症との関係を示唆する症例は報告されていない。 As mentioned above, since the Centrin1 gene is conserved across species in mammals and encodes a protein that is particularly strongly expressed in haploid germ cells, mutations in these genes can cause infertility. Conceivable. However, to date, no case has been reported that suggests a relationship between a mutation in the Centrin1 gene and infertility.
ヒトCentrin1遺伝子の変異と妊孕性との関係が明らかになれば、妊孕性の診断を簡易な遺伝子診断で行うことができるようになる。具体的には、被験者が不妊症に罹患する可能性が高いか否かの判定、或いは、不妊症患者の原因がこれらの遺伝子によるものか否かの判定を簡易に行うことができるようになる。 If the relationship between the human Centrin1 gene mutation and fertility becomes clear, fertility can be diagnosed with a simple genetic diagnosis. Specifically, it is possible to easily determine whether or not a subject is highly likely to suffer from infertility, or whether or not the cause of the infertility patient is due to these genes. .
さらに、不妊症患者に見られる変異型ヒトCentrin1タンパク質があれば、上記の変異型タンパク質に起因する不妊症の治療を目的とした薬剤や治療法などの研究において極めて有用なツールとなる。 Furthermore, if there is a mutant human Centrin1 protein found in patients with infertility, it will be an extremely useful tool in research on drugs and treatment methods for the treatment of infertility caused by the mutant protein.
本発明は上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性診断キット及び変異検出方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to provide a fertility diagnostic kit and a mutation detection method that enable estimation of fertility and identification of the cause of infertility. is there.
また、本発明の別の目的は、不妊症の治療方法を研究する際に有用なツールを提供することにある。 Another object of the present invention is to provide a tool useful for studying a method for treating infertility.
本発明者らは、後述する実施例に示すように、男性不妊症患者及び健常者男性からなる集団について、ヒトCentrin1遺伝子の塩基配列を入念に解析した結果、ヒトCentrin1遺伝子の機能欠損を引き起こす変異と不妊症とが関連することを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of careful analysis of the base sequence of the human Centrin1 gene in a group consisting of male infertility patients and healthy males, as shown in the Examples described later, the present inventors have found mutations that cause functional defects in the human Centrin1 gene. And infertility were found to be related, and the present invention was completed.
すなわち、上記課題を解決するために、本発明に係る妊孕性診断キットは、ヒトCentrin1遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする。 That is, in order to solve the above-described problems, the fertility diagnostic kit according to the present invention includes a reagent for detecting the presence or absence of a mutation that causes a functional defect of the human Centrin1 gene.
また、上記試薬は、翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第1位の塩基としたときに、ヒトCentrin1遺伝子の第283位の塩基の変異の有無を検出するものであることが好ましい。 Moreover, it is preferable that the said reagent detects the presence or absence of the variation | mutation of the 283rd base of a human Centrin1 gene, when the adenine base which codes a translation start codon is made into the 1st base.
さらに、上記試薬は、ヒトCentrin1遺伝子の第283位の塩基がチミンに置換されていることを検出するものであることが好ましい。
Further, the reagent is preferably one that detects that the base at
また、上記試薬は、ヒトCentrin1遺伝子の上記第283位の塩基を含む領域を増幅させるためのプライマーの組と、上記領域の塩基配列を決定するための塩基配列決定試薬と、を含んだものであってもよい。
In addition, the reagent includes a primer set for amplifying the region containing the base at
或いは、上記試薬は、上記変異の有無をインベーダー法によって検出するものであってもよい。 Alternatively, the reagent may detect the presence or absence of the mutation by an invader method.
さらに或いは、上記試薬は、上記変異の有無をSMMD法によって検出するものであってもよい。 Alternatively, the reagent may detect the presence or absence of the mutation by the SMMD method.
また、上記課題を解決するために、本発明に係る変異検出方法は、ヒトCentrin1遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出する工程を含んでいることを特徴とする。 Moreover, in order to solve the said subject, the mutation detection method which concerns on this invention is characterized by including the process of detecting the presence or absence of the mutation which causes the functional defect | deletion of a human Centrin1 gene.
また、上記工程では、翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第1位の塩基としたときに、ヒトCentrin1遺伝子の第283位の塩基の変異の有無を検出することが好ましい。
In the above step, it is preferable to detect the presence or absence of a mutation in the
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第1位の塩基としたときに、ヒト野生型Centrin1遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第283位の塩基がチミンに置換した塩基配列からなることを特徴とする。
In the polynucleotide of the present invention, when the adenine base encoding the translation initiation codon is the first base, the base at
また、本発明に係るポリペプチドは、上記ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とする。 The polypeptide according to the present invention is characterized by comprising an amino acid sequence encoded by the polynucleotide.
また、本発明に係る発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドを有していることを特徴とする。そして、本発明に係る発現キットは、上記発現ベクターを含んでいることを特徴とする。 Moreover, the expression vector according to the present invention is characterized by having the above polynucleotide. And the expression kit which concerns on this invention is characterized by including the said expression vector.
本発明に係る妊孕性診断キット及び変異検出方法には、ヒトCentrin1遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出する試薬(工程)が含まれているので、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を行うことができる。 Since the fertility diagnostic kit and mutation detection method according to the present invention include a reagent (step) for detecting the presence or absence of a mutation that causes a functional defect in the human Centrin1 gene, estimation of fertility and infertility The cause of the can be identified.
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、置換変異を含むヒトCentrin1遺伝子を提供するものである。また、本発明に係るポリペプチド、発現ベクター及び発現キットは、不妊症患者に見られるヒト置換変異型Centrin1タンパク質を提供するものである。従って、Centrin1遺伝子の欠失変異に起因した不妊症を研究する上で有用なツールとなる。 The polynucleotide according to the present invention provides a human Centrin1 gene containing a substitution mutation. Moreover, the polypeptide, the expression vector, and the expression kit according to the present invention provide a human substitution mutant Centrin1 protein found in infertile patients. Therefore, it is a useful tool for studying infertility caused by a deletion mutation of the Centrin1 gene.
(1.妊孕性診断キット及び変異検出方法)
本発明に係る妊孕性診断キット及び変異検出方法について説明する。本発明に係る変異検出方法は、被験者(ヒト)から採取された生体サンプルを用いて被験者における遺伝子の変異を検出する方法であり、被験者が低妊孕性又は不妊症であるか否かを診断するために有用な情報を提供するものである。また、上記妊孕性診断キットは、上記変異検出方法を実施するためのものである。上記変異検出方法では、ヒトCentrin1遺伝子の変異の有無を検出する。なお、Centrin1は、単にCentrinと呼ばれたり、Cetn1と略称されたりすることもある。
(1. Fertility diagnostic kit and mutation detection method)
The fertility diagnostic kit and mutation detection method according to the present invention will be described. The mutation detection method according to the present invention is a method for detecting a gene mutation in a subject using a biological sample collected from the subject (human), and diagnoses whether the subject is hypofertile or infertile. It provides useful information for doing so. The fertility diagnostic kit is for carrying out the mutation detection method. In the mutation detection method, the presence or absence of a mutation in the human Centrin1 gene is detected. In addition, Centrin1 may be simply called Centrin or may be abbreviated as Cetn1.
配列番号1は、ジーンバンク(GenBank)にアクセッション番号gi3337234で登録されているヒトCentrin1遺伝子の転写産物の塩基配列の中から、翻訳領域のみを抽出したものである。配列番号1に示すように、Centrin1遺伝子は、519bpからなる翻訳領域を有している。また、配列番号2は、ヒトCentrin1タンパク質の推定アミノ酸配列を示すものである。 SEQ ID NO: 1 is obtained by extracting only the translation region from the base sequence of the transcription product of the human Centrin1 gene registered under the accession number gi3337234 in GeneBank. As shown in SEQ ID NO: 1, the Centrin1 gene has a translation region consisting of 519 bp. SEQ ID NO: 2 shows the deduced amino acid sequence of human Centrin1 protein.
Centrin1タンパク質は、上述したように、成熟したオスの精巣において特に強く発現し、また、精子においては尾部に局在することが報告されている。図1は、ヒトCentrin1遺伝子の構造を示す模式図である。ヒトゲノムプロジェクトによって構築されたヒトゲノムリソース(Human Genome Resources: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/)によれば、ヒトCentrin1遺伝子は、イントロンを持たないレトロポゾン様遺伝子であり、ヒト18番染色体短腕に位置している。この遺伝子の転写産物は約1.2kbである。 As described above, the Centrin1 protein is particularly strongly expressed in a mature male testis and has been reported to be localized in the tail in sperm. FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of the human Centrin1 gene. According to the Human Genome Resources (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/) constructed by the Human Genome Project, the human Centrin1 gene is a retroposon-like gene without an intron. And is located on the short arm of human chromosome 18. The transcript of this gene is about 1.2 kb.
本願発明者らは、後述する実施例に示す調査の結果、男性不妊症患者からなる集団の中に、配列番号1に示すヒトCentrin1遺伝子の翻訳領域における第283位のシトシン(以下、単に「C」という)が片方のアレルにおいてチミン(以下、単に「T」という)に置換している患者がいることを見出した。一方、この第283位のCの置換は、妊孕性が確認されている男性からなる集団では全く見られなかった。
As a result of the investigation shown in the Examples described later, the inventors of the present application have found that in the population of male infertility patients, cytosine at position 283 (hereinafter simply referred to as “C” in the translation region of the human Centrin1 gene shown in SEQ ID NO: 1). ")" Was found to be replaced by thymine (hereinafter simply "T") in one allele. On the other hand, the substitution of C at
ヒトCentrin1遺伝子に上記の置換変異が起こると、元々グルタミンをコードしていたこの置換部位が終止コドンをコードするようになるため、正常なタンパク質が発現しなくなってしまう。それゆえ、ヒトCentrin1遺伝子の上記第283位におけるCからTへの置換変異は、たとえ片方のアレルのみに起こっている場合であっても、正常なCentrin1タンパク質の翻訳量の低下などに基づき不妊症を引き起こす可能性が高いと推測される。
When the above substitution mutation occurs in the human Centrin1 gene, the substitution site that originally encoded glutamine will encode a stop codon, and thus normal protein will not be expressed. Therefore, even if the substitution mutation from C to T at
よって、被験者のCentrin1遺伝子について上記の第283位のCの置換変異の有無を調べ、Tへの置換変異が見つかった場合には、その被験者が不妊症或いは低妊孕性である(又はその可能性が高い)と考えられる。そして、不妊症或いは低妊孕性であると判定された被験者に対しては、ICSI(Intracytoplasmic sperm injection;顕微授精)などの現存の治療法の適格な選択を提示することができる。
Thus, the subject's Centrin1 gene is examined for the presence of the substitution mutation at position C at
また、上記第283位の置換変異以外であっても、ヒトCentrin1遺伝子の機能欠損を引き起こす変異は、不妊症を引き起こす可能性が高いと推測される。
In addition to the substitution mutation at
以上のことから、本発明に係る変異検出方法は、被験者(ヒト)から採取された生体サンプル(血液や頬の内側の粘膜など)に含まれるゲノムDNA、または、被験者の生体サンプルから単離されたゲノムDNAにおいて、ヒトCentrin1遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出する工程を含んでいる。 From the above, the mutation detection method according to the present invention is isolated from a genomic DNA contained in a biological sample (blood, mucous membrane inside cheek, etc.) collected from a subject (human) or from a biological sample of the subject. And detecting the presence or absence of a mutation causing a functional defect in the human Centrin1 gene.
また、本発明に係る妊孕性診断キットは、被験者から採取された生体サンプルに含まれるゲノムDNA、または、被験者の生体サンプルから単離されたゲノムDNAにおいて、ヒトCentrin1遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出する試薬を含んでいる。 In addition, the fertility diagnostic kit according to the present invention is a mutation that causes a functional defect of the human Centrin1 gene in genomic DNA contained in a biological sample collected from a subject or in genomic DNA isolated from a subject's biological sample. Reagents for detecting the presence or absence of
上記変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトCentrin1遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出するものであれば、その態様は特に限定されるものではない。例えば、変異検出方法及び妊孕性診断キットは、被験者のヒトCentrin1遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていることを検出するものであってもよいし、被験者のヒトCentrin1遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていないことを検出するものであってもよい。 The embodiment of the mutation detection method and fertility diagnostic kit is not particularly limited as long as it detects the presence or absence of a mutation that causes a functional defect in the human Centrin1 gene. For example, the mutation detection method and the fertility diagnostic kit may detect that the human Centrin1 gene of the subject contains a mutation that causes a functional defect in the gene, or the human Centrin1 gene of the subject Further, it may be detected that a mutation causing a functional defect of the gene is not included.
例えば、上記変異の存在を検出するものである場合、上記変異検出方法および妊孕性診断キットは、上記の機能欠損を引き起こす変異が少なくとも一方のアレルにおいて起こっていることを検出できればよい。一方、上記変異の非存在を検出するものである場合、上記変異検出方法および妊孕性診断キットは、上記の機能欠損を引き起こす変異が双方のアレルにおいて起こっていないことを検出することが好ましい。 For example, in the case of detecting the presence of the mutation, the mutation detection method and fertility diagnostic kit only need to be able to detect that the mutation causing the functional defect occurs in at least one allele. On the other hand, when detecting the absence of the mutation, the mutation detection method and the fertility diagnostic kit preferably detect that the mutation causing the functional defect does not occur in both alleles.
上記変異検出方法又は妊孕性診断キットにより、上記変異の有無を調べ、その結果、変異が検出されなかった場合は、妊孕性に問題がない可能性が高いと判定できる。また、被験者が不妊症患者である場合は、不妊症の原因が、Centrin1遺伝子の機能欠損以外のものによる可能性が高いと判定できる。 The presence or absence of the mutation is examined by the mutation detection method or the fertility diagnostic kit. As a result, if no mutation is detected, it can be determined that there is a high possibility that there is no problem with fertility. Moreover, when a test subject is an infertility patient, it can be determined that there is a high possibility that the cause of infertility is due to something other than a function defect of the Centrin1 gene.
一方、変異が検出された場合は、低妊孕性又は不妊症でない可能性が高いと判定できる。また、被験者が不妊症患者である場合は、不妊症の原因がCentrin1遺伝子の機能欠損による可能性が高いと判定できる。 On the other hand, when a mutation is detected, it can be determined that there is a high possibility that it is not low fertility or infertility. Moreover, when a test subject is an infertility patient, it can be determined that the cause of infertility is highly likely due to a functional defect of the Centrin1 gene.
このように、上記変異検出方法及び妊孕性診断キットによれば、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を行うことができる。すなわち、上記変異検出方法又は妊孕性診断キットによれば、不妊症の診断を行う上で有用な情報が提供される。それゆえ、上記変異検出方法における変異の有無を検出する工程は、低妊孕性又は不妊症の診断方法において用いられることが好ましいといえる。 Thus, according to the mutation detection method and fertility diagnostic kit, it is possible to estimate the possibility of fertility and identify the cause of infertility. That is, according to the mutation detection method or fertility diagnostic kit, information useful for diagnosing infertility is provided. Therefore, it can be said that the step of detecting the presence or absence of mutation in the mutation detection method is preferably used in a method for diagnosing hypofertility or infertility.
なお、上記変異検出方法および妊孕性診断キットは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第1位の塩基としたときに、ヒトCentrin1遺伝子の第283位の塩基の置換変異の有無を検出することが好ましい。
The mutation detection method and fertility diagnostic kit detect the presence or absence of a substitution mutation at the
さらに、上記変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトCentrin1遺伝子の第283位の塩基がチミンに置換していることを検出するものであることが好ましい。この場合、上記変異検出方法及び妊孕性診断キットによって、Centrin1遺伝子の第283位の塩基がチミンに置換していることが検出されれば、その被験者は、不妊症又は低妊孕性である可能性が高いと判定できる。また、被験者が不妊症患者である場合は、不妊症の原因がCentrin1遺伝子の変異によるものであると判定できる。従って、適切な不妊治療の提案を迅速に行うことができる。
Furthermore, the mutation detection method and the fertility diagnostic kit preferably detect that the base at
ところで、上記変異検出方法及び妊孕性診断キットとしては、公知の各種手法、例えば、塩基配列決定法、インベーダー法、又はSMMD法(simultaneous multiple mutation detection system)、PCR−RFLP法、MASA法、塩基伸長法、Taqmanプローブ法などに基づいたものを用いることができる。また、妊孕性診断キットには、使用方法が記載された取扱説明書が含まれていてもよい。 By the way, as the mutation detection method and fertility diagnostic kit, various known methods, for example, base sequence determination method, invader method, or SMMD method (simultaneous multiple mutation detection system), PCR-RFLP method, MASA method, base Those based on the extension method, Taqman probe method and the like can be used. The fertility diagnostic kit may include an instruction manual describing how to use it.
一実施形態において、上記変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトCentrin1遺伝子の上記第283位の塩基を含む領域の塩基配列を決定することにより、上記の置換変異の有無を検出するものであってもよい。塩基配列の決定には、サンガー法やこれを応用した公知の各種手法を用いることができる。
In one embodiment, the mutation detection method and the fertility diagnostic kit detect the presence or absence of the substitution mutation by determining the base sequence of the region containing the base at
この場合、妊孕性診断キットには、ヒトCentrin1遺伝子の第283位の塩基を含む領域を増幅させるために、第283位を挟むようにして設計されたプライマーの組が含まれることが好ましい。このプライマーの組には、より詳細には、ヒトCentrin1遺伝子の第283位よりも上流の塩基配列の一部または全部を有するプライマーと、ヒトCentrin1遺伝子の第283位よりも下流の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列を有するプライマーとが含まれる。
In this case, it is preferable that the fertility diagnostic kit includes a set of primers designed so as to
被験者から採取された生体サンプルに含まれるゲノムDNAを鋳型として上記のプライマーの組を用いてPCR(polymerase chain reaction)を行えば、ヒトCentrin1遺伝子の第283位の塩基を含む領域がDNAフラグメントとして増幅され、さらに、上記のプライマーの組の一方又は両方のプライマーを用いて塩基配列の決定を行えば、置換変異の有無を確実かつ簡便に検出することができる。塩基配列の決定は、例えばABI−PRISM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems Inc.)などを取扱説明書に従って使用することにより、簡単に実施することができる。なお、塩基配列の決定に用いられるプライマーは、DNAフラグメントの増幅のためのPCRに用いられるプライマーとは別のものであってもよい。
When PCR (polymerase chain reaction) is performed using genomic DNA contained in a biological sample collected from a subject as a template and the above primer set, a region containing the base at
なお、それぞれのプライマーは、Centrin1遺伝子又はその周辺と同一の塩基配列、或いは相補的な塩基配列を少なくとも10塩基以上有することが好ましく、15塩基以上有することがより好ましく、18塩基以上有することがさらに好ましく、20塩基以上有することが特に好ましい。Centrin1遺伝子又はその周辺と同一の(或いは相補的な)塩基配列の長さを長くすることにより、Centrin1遺伝子の第283位を含む目的の領域のみを確実に増幅させることができる。 Each primer preferably has at least 10 bases, more preferably 15 bases or more, and more preferably 18 bases or more, the same base sequence as the Centrin1 gene or its periphery, or a complementary base sequence. It is preferable to have 20 bases or more. By increasing the length of the same (or complementary) base sequence as the Centrin1 gene or its periphery, only the target region including the 283rd position of the Centrin1 gene can be reliably amplified.
また、上記のプライマーの組は、互いのプライマーによって挟まれる領域の長さが5kb以下であることが好ましく、3kb以下であることがより好ましく、2kb以下であることがさらに好ましく、1.5kb以下であることが特に好ましい。互いのプライマーによって挟まれる領域の長さを短くすることによって、上記の第283位の塩基を含む領域の増幅を効果的に行うことができる。 Further, in the above primer pair, the length of the region sandwiched between the primers is preferably 5 kb or less, more preferably 3 kb or less, further preferably 2 kb or less, and 1.5 kb or less. It is particularly preferred that By shortening the length of the region sandwiched between the primers, the region containing the 283rd base can be effectively amplified.
また、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記の第283位の塩基から2kb以内の位置に設定されることが好ましく、1.5kb以内の位置に設定されることが好ましく、1.0kb以内の位置に設定されることがより好ましく、0.7kb以内の位置に設定されることが特に好ましい。上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
Further, the primer used for determining the base sequence is preferably set at a position within 2 kb from the base at
さらに、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記第283位の塩基から20bp以上離れた位置に設定されることが好ましく、30bp以上離れた位置に設定されることがより好ましく、40bp以上離れた位置に設定されることがさらに好ましく、50bp以上離れた位置に設定されることが特に好ましい。また、上記プライマーの組は、ヒトCentrin1遺伝子の上記第283位の塩基を含む20bp以上の領域を増幅させるものであることが好ましい。プライマーの近傍は、塩基配列の決定結果が不正確になる傾向にあるが、上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
Furthermore, the primer used for determining the base sequence is preferably set at a position that is 20 bp or more away from the base at
上記のプライマーの組としては、例えば、それぞれ配列番号5,配列番号6に示す塩基配列からなるプライマー(図1のPrimerF1及びPrimerR1)を用いることができるが、本発明に用いることのできるプライマーの塩基配列がこの配列に限定されないことはいうまでもない。ヒトCentrin1遺伝子の塩基配列及びその周辺の塩基配列は、当業者であれば上述したヒトゲノムリソースやジーンバンク(GenBank)から容易に入手することができるので、入手した塩基配列を基に、Oligo(登録商標、National Bioscience Inc.)又はGENETYX(ソフトウェア開発)などを用いてプライマーを設計することができる。 As the above primer set, for example, primers (PrimerF1 and PrimerR1 in FIG. 1) having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 can be used, respectively, but the primer bases that can be used in the present invention Needless to say, the sequence is not limited to this sequence. A person skilled in the art can easily obtain the base sequence of the human Centrin1 gene and the surrounding base sequence from the above-described human genome resources and GeneBank, and therefore, Oligo (registered) based on the obtained base sequence. Primers can be designed using trademarks such as National Bioscience Inc.) or GENETYX (software development).
各プライマーは、例えばホスホロアミダイト法などの公知の方法によって合成することができ、例えばApplied Biosystems Inc.の392型シンセサイザーなどを取扱説明書に従って使用することによって簡単に合成することができる。 Each primer can be synthesized by a known method such as a phosphoramidite method, and can be easily synthesized by using, for example, an Applied Biosystems Inc. type 392 synthesizer according to the instruction manual.
なお、上記の各プライマーには、蛍光標識が付されていてもよい。プライマーに蛍光標識が付されている場合、ダイプライマー法によって、放射性同位元素を用いることなく増幅領域の塩基配列を決定することができる。 Each primer described above may have a fluorescent label. When a fluorescent label is attached to the primer, the base sequence of the amplification region can be determined by the die primer method without using a radioisotope.
一方、各プライマーに蛍光標識が付されていない場合、ダイターミネータ法によって塩基配列を決定することができる。この場合、上記妊孕性診断キットには、上記のプライマーの組に加えて、A,T,G,Cの各単量体からなるデオキシリボ核酸、蛍光標識されA,T,G,Cの各単量体からなるジデオキシリボ核酸(所謂ダイターミネータ)、及びポリメラーゼなどがさらに含まれていてもよい。 On the other hand, when the fluorescent label is not attached to each primer, the base sequence can be determined by the dye terminator method. In this case, the fertility diagnostic kit includes deoxyribonucleic acid composed of monomers A, T, G, and C, fluorescently labeled A, T, G, and C, in addition to the above primer set. A dideoxyribonucleic acid (so-called dye terminator) comprising a monomer, a polymerase, and the like may further be included.
一実施形態において、上記変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトCentrin1遺伝子の上記第283位の塩基の置換変異の有無をインベーダー法によって検出するものであってもよい。インベーダー法の詳細については、Lyamichevらによる論文(Lyamichev V et al., Nat biotechnol. 17, 292, 1999)に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
In one embodiment, the mutation detection method and the fertility diagnostic kit may detect the presence or absence of a substitution mutation at the
図2は、インベーダー法の原理を説明する模式図である。インベーダー法では、非蛍光標識プローブのインベーダープローブ2及びシグナルプローブ3と、蛍光標識プローブのフレットプローブ5とが用いられる。
FIG. 2 is a schematic diagram illustrating the principle of the invader method. In the invader method, an
インベーダープローブ2は、ターゲット遺伝子1と相補的な塩基配列を有し、かつ、3’末端の塩基がターゲット遺伝子1の変異(又は一塩基多型)検出部位1aと対応するように設計される。一方、シグナルプローブ3は、ターゲット遺伝子1とは無関係な塩基配列であるフラップ3bと、ターゲット遺伝子1と相補的な塩基配列を有し、かつ、5’末端の塩基がターゲット遺伝子1の変異(又は一塩基多型)検出部位1aに対応するように設計されたヌクレオチド3aとが連結したものである。ここで、フラップ3bは、ヌクレオチド3aの5’末端側に連結されている。
The
このように設計されたプローブ2・3をターゲット遺伝子1とハイブリダイゼーションさせると、変異検出部位1aでは、ターゲット遺伝子1、インベーダープローブ2及びシグナルプローブ3が3重鎖を形成する。すると、フラップエンドヌクレアーゼ(「クリアベース(cleavase)」ともいう)4がこの3重鎖を認識し、シグナルプローブ3を3重鎖の3’側で切断する。その結果、フラップ3bと変異検出部位とが連結したフラップ遊離体3cが生成される。
When the
フレットプローブ5は、5’末端側が自身とハイブリダイゼーションでき、かつ、3’末端側がフラップ3bとハイブリダイゼーションできるヌクレオチド5aと、蛍光色素5bと、クエンチャー(発光抑制体)5cとからなる。ここで、ヌクレオチド5aは、5’末端がフラップ遊離体3cの変異検出部位と相補的な塩基配列となっている。また、蛍光色素5bは、ヌクレオチド5aの5’末端に結合している。ただし、フレットプローブ5においては、クエンチャー5cにより蛍光色素5bの蛍光が抑制されている。
The fret
このようなフレットプローブ5に対してフラップ遊離体3cがハイブリダイゼーションすると、フラップ遊離体3cの変異検出部位について、再び3重鎖が形成される。その結果、上述のフラップエンドヌクレアーゼ4がこの3重鎖を再び認識し、フレットプローブ5の5’末端部分が切断される。その結果、フレットプローブ5の5’末端に結合していた蛍光色素5bが遊離し、蛍光が生じる。
When the flap
従って、妊孕性診断キットがインベーダー法により上記の置換変異の有無を検出するものである場合、妊孕性診断キットには、インベーダープローブ2、シグナルプローブ3及びフレットプローブ5などが含まれることが好ましい。
Therefore, when the fertility diagnostic kit detects the presence or absence of the above substitution mutation by the invader method, the fertility diagnostic kit may include the
置換変異が有る場合に蛍光が生じるようにする場合、インベーダープローブ2は、配列番号1に示す塩基配列からなるヒトCentrin1遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、3’末端の塩基が変異型Centrin1遺伝子の第283位の塩基(T)と対応するように設計される。また、シグナルプローブ3のヌクレオチド3aは、ヒトCentrin1遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、5’末端の塩基が変異型Centrin1遺伝子の第283位の塩基と対応するように設計される。そして、フレットプローブ5は、上記インベーダープローブ2及び上記シグナルプローブ3が変異型Centrin1遺伝子とハイブリダイズして3重鎖構造が形成された場合にフラップエンドヌクレアーゼ4によって切断されるフラップ遊離体3cを検出できるように設計される。
When fluorescence is generated when there is a substitution mutation, the
上記の構成により、被験者のCentrin1遺伝子の第283位の塩基がTに置換している場合は、ヌクレオチド3aの3’末端とインベーダープローブ2の5’末端とがオーバーラップすることにより3重鎖が形成されて蛍光が生じる。一方、被験者のCentrin1遺伝子が野生型である場合は、インベーダープローブ2の末端部分で3重鎖が形成されないので蛍光が生じない。
When the base at
また、上記の例では、被験者の有するCentrin1遺伝子が置換変異型の場合に蛍光が生じる構成としたが、本発明はこれに限定されず、被験者の有するCentrin1遺伝子が野生型の場合に蛍光が生じ、置換変異型の場合に蛍光が抑制される構成としてもよく、様々に改変することができる。 In the above example, the fluorescence is generated when the subject's Centrin1 gene is a substitution mutation type. However, the present invention is not limited to this, and the subject's Centrin1 gene has a wild-type fluorescence. In the case of the substitution mutant type, the fluorescence may be suppressed, and various modifications can be made.
一実施形態において、上記変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトCentrin1遺伝子の上記第283位の塩基の置換変異の有無をSMMD法によって検出するものであってもよい。SMMD法の詳細については、Wakaiらによる論文(Wakai J et al., Nucleic Acids Res., 2004. 32(18), e141.)に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
In one embodiment, the mutation detection method and the fertility diagnostic kit may detect the presence or absence of a substitution mutation at the
図3は、SMMD法の原理を説明する模式図である。SMMD法は、電気化学的反応を利用して一塩基多型、置換変異、欠失変異、又は挿入変異などを検出するものである。まず、図3に示すように、被験者のゲノムDNA11を鋳型として変異検出部位を含む領域をPCRによって増幅させるため、カウンタープライマー13と特別プライマー12とを1:4の割合で用いて非対称PCRを行う(工程A)。ここで、特別プライマー12は、変異を検出したい遺伝子11の変異検出部位11aよりも下流の領域と相補的な塩基配列からなるオリゴマー12aと、タグ12bとからなる。タグ12bは、遺伝子11の変異検出部位11aよりも1塩基下流の塩基から、オリゴマー12aがハイブリダイゼーションする塩基よりも1塩基上流の塩基までの領域と相補的な塩基配列を有しており、オリゴマー12aの5’末端に連結されている。
FIG. 3 is a schematic diagram for explaining the principle of the SMMD method. The SMMD method detects single nucleotide polymorphisms, substitution mutations, deletion mutations, or insertion mutations using an electrochemical reaction. First, as shown in FIG. 3, in order to amplify a region including a mutation detection site using
上記の非対称PCRの結果、工程Bに示すPCR産物14が生成される(工程B)。このPCR産物14のうち、特別プライマー12を含む一本鎖の非対称PCR産物14は、タグ12bを含んでいるため、自己ループを形成して特別ターゲットを形成する(工程C・D)。
As a result of the asymmetric PCR, the
次に、変異型プローブ20及び野生型プローブ30を用意する。プローブ20・30は、ともに、変異を検出したい遺伝子11と同一の塩基配列を有し、かつ、変異検出部位11a・11bを3’末端とするオリゴマーをその5’末端側で金電極25に固定したものである。ここで、変異型プローブ20はオリゴマーの3’末端が変異型の塩基(T)となっているのに対して、野生型プローブ30はオリゴマーの3’末端が野生型の塩基(C)となっている。これらの変異型プローブ20及び野生型プローブ30は、オリゴマーが上述した特別ターゲット15の3’末端側と相補的な塩基配列を有しているため、特別ターゲット15とハイブリダイゼーションすることができる。なお、金電極25にオリゴマーを固定するための詳細な方法は、Takenakaらによる論文(Takenaka S et al., Anal Chem., 2000, 72, 1334-1341)に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
Next, the
プローブ20・30を特別ターゲット15とハイブリダイゼーションさせる前に、フェロセニルナフタレンジイミド(ferrocenylnaphtalene diimide;以下「FND」と略称する)を含む溶液中で、予めバックグラウンド応答を行い、電流I0を測定しておく(工程E)。
Before the
そして、特別ターゲット15と変異型プローブ20及び野生型プローブ30とのハイブリダイゼーション及びライゲーションを行う。ここで、特別ターゲット15が変異型のものである場合(すなわち、被験者が変異型遺伝子を有している場合)、特別ターゲット15は変異型プローブ20と塩基配列が完全に一致するのでライゲーションが行われる一方で、野生型プローブ30とは塩基配列が末端部分で相違するのでライゲーションが行われない(工程F)。
Then, hybridization and ligation of the
その後、変性処理を行うと、野生型プローブ30と変異型の特別ターゲット15との組では、野生型プローブ30から変異型特別ターゲット15が解離する。一方、変異型プローブ20と変異型の特別ターゲット15との組では、ライゲーションが行われているので、解離が起こらない(工程G)。
Thereafter, when a denaturation treatment is performed, the mutant
そして、それぞれのサンプルを洗浄して余剰のDNAを除去し、FNDを添加して、FND分子の電気化学的電流I1を測定する(工程H)。ここで、2本鎖DNAを有する電極では、1本鎖DNAを有する電極に比べて電流I1が大きくなる(工程I)。 Then, each sample is washed to remove excess DNA, FND is added, and the electrochemical current I 1 of the FND molecule is measured (step H). Here, in the electrode having the double-stranded DNA, the current I 1 is larger than that of the electrode having the single-stranded DNA (Step I).
これにより、被験者のゲノムDNAが変異型であるか野生型であるかを測定した電流値に基づいて判定することができる。なお、SMMD法では、上記の変異型プローブ20及び野生型プローブ30をECA(Electrochemial array)チップとしてアレイ状に形成することにより、多数の変異を同時進行的に検出することができる。
Thereby, it can determine based on the electric current value which measured whether a test subject's genomic DNA was a mutant type or a wild type. In the SMMD method, a large number of mutations can be detected simultaneously by forming the
従って、本発明に係る妊孕性診断キットがSMMD法により上記の置換変異の有無を検出するものである場合、妊孕性診断キットには、特別プライマー12、カウンタープライマー13、変異型プローブ20及び野生型プローブ30などが含まれていることが好ましい。なお、変異型プローブ20及び野生型プローブ30は、何れか一方のみでもよい。
Therefore, when the fertility diagnostic kit according to the present invention detects the presence or absence of the above substitution mutation by the SMMD method, the fertility diagnostic kit includes a
上記特別プライマー12は、配列番号1に示すヒトCentrin1遺伝子の第283位よりも下流の所定領域と相補的な塩基配列からなるオリゴマー12aと、タグ12bとからなる。タグ12bは、配列番号1に示すヒトCentrin1遺伝子の第284位から、オリゴマー12aがハイブリダイゼーションする部位までの領域と相補的な塩基配列を有しており、オリゴマー12aの5’末端に連結される。一方、上記カウンタープライマー13は、ヒトCentrin1遺伝子の第283位よりも上流の所定領域と同一の塩基配列からなる。
The
また、上記変異型プローブ20は、ヒト変異型Centrin1遺伝子と同一の塩基配列からなり、かつ、第283位の塩基(T)が3’末端になるオリゴマーを有するように設計される。また、上記野生型プローブ30は、ヒト野生型Centrin1遺伝子と同一の塩基配列からなり、かつ、第283位の塩基(C)が3’末端になるオリゴマーを有するように設計される。
The
上記の構成によれば、被験者のCentrin1遺伝子が置換変異型の場合、特別ターゲット15は、変異型プローブ20とライゲーションできるが、野生型プローブ30とはライゲーションできない。一方、被験者のCentrin1遺伝子が野生型の場合、特別ターゲット15は、野生型プローブ30とライゲーションできるが、変異型プローブ20とはライゲーションできない。
According to the above configuration, when the subject's Centrin1 gene is a substitution mutant type, the
なお、上記の各方法において、Centrin1遺伝子のセンス鎖(コドンをコードする側の鎖)を調べることによって置換変異の有無を判定する構成について詳細に説明したが、アンチセンス鎖を調べることによっても同様に判定することができるのはいうまでもない。 In each of the above methods, the configuration for determining the presence or absence of a substitution mutation by examining the sense strand of the Centrin1 gene (the strand on the codon-encoding side) has been described in detail, but the same is true by examining the antisense strand. Needless to say, it is possible to make a judgment.
本明細書では、ヒト野生型Centrin1遺伝子の代表的な塩基配列として、配列番号1に示す塩基配列を例示したが、特許請求の範囲に記載の「ヒトCentrin1遺伝子」及び「ヒト野生型Centrin1遺伝子」は、配列番号1に示された塩基配列のもののみに限定されない。なぜならば、ヒト遺伝子には多くの一塩基多型が存在し、ヒトCentrin1遺伝子においても例外ではないからである。従って、特許請求の範囲に記載の「ヒトCentrin1遺伝子」及び「ヒト野生型Centrin1遺伝子」には、配列番号1に示される塩基配列のみならず、配列番号1に示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドからなり、かつ妊孕性に関与するポリヌクレオチド(すなわち、自身のコードするポリペプチドが配列番号2に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド)も含まれ、特に、配列番号1に示される塩基配列において一塩基多型により1又は数個の塩基が置換された塩基配列のものも含まれる。 In the present specification, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is exemplified as a representative base sequence of the human wild-type Centrin1 gene. However, the “human Centrin1 gene” and the “human wild-type Centrin1 gene” described in the claims are exemplified. Is not limited to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. This is because many single nucleotide polymorphisms exist in human genes, and there is no exception in the human Centrin1 gene. Therefore, in the “human Centrin1 gene” and “human wild-type Centrin1 gene” described in the claims, one or several of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 as well as the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 are used. A polynucleotide in which the base of is deleted, substituted, or added, and is involved in fertility (that is, a function equivalent to that of a polypeptide in which the polypeptide encoded by it consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) In particular, a nucleotide sequence in which one or several bases are substituted by a single nucleotide polymorphism in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is also included.
ここで、数個とは、当業者に期待しうる程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなく当業者が作ることができる程度の数を意図し、例えば、20個以下が好ましく、より好ましくは10個以下、さらに好ましくは5個以下の塩基を意図する。このことは、ヒト変異型Centrin1遺伝子についても同様である。 Here, the term “several” means a number that can be made by a person skilled in the art without performing trial and error or complicated advanced experiments exceeding the level that can be expected by those skilled in the art. More preferably, no more than 10, and even more preferably no more than 5 bases are contemplated. The same applies to the human mutant Centrin1 gene.
(2.ポリヌクレオチド及びポリペプチド)
次に、本発明に係るポリヌクレオチドについて説明する。本発明に係るポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第1位の塩基としたときに、ヒト野生型Centrin1遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第283位の塩基がTに置換した塩基配列からなるものである。
(2. Polynucleotides and polypeptides)
Next, the polynucleotide according to the present invention will be described. The polynucleotide according to the present invention is a base sequence in which the base at
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号3に示す塩基配列からなるものであってもよい。ただし、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号3に示す塩基配列に限定されない。本発明に係るポリヌクレオチドには、配列番号3に示される塩基配列のみならず、配列番号3に示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドからなり、かつ低妊孕性又は不妊症に関与するポリヌクレオチドも含まれ、特に、配列番号3に示される塩基配列において一塩基多型により1又は数個の塩基が置換された塩基配列のものも含まれる。 In one embodiment, the polynucleotide according to the present invention may consist of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. However, the polynucleotide according to the present invention is not limited to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. The polynucleotide according to the present invention comprises not only the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 but also a polynucleotide in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, In addition, a polynucleotide involved in hypofertility or infertility is also included, and in particular, a nucleotide sequence in which one or several bases are substituted by a single nucleotide polymorphism in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 is also included. .
ここで、数個とは、当業者に期待しうる程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなく当業者が作ることができる程度の数を意図し、例えば、20個以下が好ましく、より好ましくは10個以下、さらに好ましくは5個以下の塩基を意図する。 Here, the term “several” means a number that can be made by a person skilled in the art without performing trial and error or complicated advanced experiments exceeding the level that can be expected by those skilled in the art. More preferably, no more than 10, and even more preferably no more than 5 bases are contemplated.
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」、または「核酸分子」と同義であり、ヌクレオチドの重合体を指す。本明細書において、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と同義であり、デオキシリボヌクレオチド(A、G、CおよびTと省略される)の配列として示される。 As used herein, “polynucleotide” is synonymous with “gene”, “nucleic acid”, or “nucleic acid molecule” and refers to a polymer of nucleotides. In the present specification, “base sequence” is synonymous with “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence” and is shown as a sequence of deoxyribonucleotides (abbreviated as A, G, C, and T).
上記ポリヌクレオチドは、RNA(例えば、mRNA)の形態、DNAの形態(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)の何れであってもよい。さらに、DNAの場合、二本鎖、一本鎖の何れであってもよい。さらに、一本鎖DNAまたはRNAは、コード鎖(センス鎖としても知られる)でもよいし、非コード鎖(アンチセンス鎖としても知られる)でもよい。 The polynucleotide may be in the form of RNA (eg, mRNA) or DNA (eg, cDNA or genomic DNA). Furthermore, in the case of DNA, it may be either double-stranded or single-stranded. Furthermore, the single-stranded DNA or RNA may be a coding strand (also known as a sense strand) or a non-coding strand (also known as an antisense strand).
なお、上記ポリヌクレオチドは、その5’末端又は3’末端に、タグ標識(タグ配列又はマーカー配列)をコードするポリヌクレオチドが連結されていてもよい。 The polynucleotide may be linked to a polynucleotide encoding a tag label (tag sequence or marker sequence) at the 5 'end or 3' end.
上記ポリヌクレオチドを取得する方法としては、PCRを用いる方法が挙げられる。具体的には、上記第283位の塩基がTに置換した変異型Centrin1遺伝子を有している人のゲノムDNAを鋳型としてPCRによって得ることもできるし、また、変異を入れたプライマーを用いてPCRを行うことにより、野生型Centrin1遺伝子から得ることもできる。
Examples of the method for obtaining the polynucleotide include a method using PCR. Specifically, it can be obtained by PCR using a genomic DNA of a person having a mutant Centrin1 gene in which the base at
また、上記ポリヌクレオチドは、組換えベクターに挿入されていてもよい。この組換えベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。 In addition, the polynucleotide may be inserted into a recombinant vector. This recombinant vector may be a vector used for in vitro translation or a vector used for recombinant expression.
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択できる。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に上記ポリヌクレオチドからヒト変異型Centrin1タンパク質を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと上記ポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。 The specific type of vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in a host cell can be appropriately selected. That is, according to the type of host cell, an appropriate promoter sequence is selected from the above polynucleotide to ensure that the human mutant Centrin1 protein is expressed, and a vector incorporating this and the above polynucleotide in various plasmids is used as an expression vector. Use it.
上記発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に応じた発現制御領域(例えば、プロモーター、ターミネーター、および/または複製起点等)を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター(例えば、trcプロモーター、tacプロモーター、lacプロモーター等)が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、PH05プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、trpC等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター(例えば、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター等)が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および/またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。 The expression vector contains an expression control region (for example, promoter, terminator, and / or replication origin) according to the type of host to be introduced. Conventional promoters (eg, trc promoter, tac promoter, lac promoter, etc.) are used as promoters for bacterial expression vectors, and examples of yeast promoters include glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter, PH05 promoter, etc. Examples of the promoter for filamentous fungi include amylase and trpC. Examples of animal cell host promoters include viral promoters (eg, SV40 early promoter, SV40 late promoter, etc.). The expression vector can be prepared according to a conventional technique using a restriction enzyme and / or ligase. Transformation of the host with the expression vector can also be performed according to conventional techniques.
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物等から慣用的な手法(例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等)に従って、変異型Centrin1タンパク質を回収・精製することができる。 A host transformed with the above expression vector is cultured, cultivated or bred, and then subjected to conventional techniques (eg, filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography) from the culture. Etc.), the mutant Centrin1 protein can be recovered and purified.
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、上記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを昆虫で発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。 A method for introducing the expression vector into a host cell, that is, a transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, or a DEAE dextran method can be suitably used. . In addition, for example, when a polypeptide encoded by the polynucleotide is expressed in insects, an expression system using baculovirus may be used.
上記組換えベクターを使用すれば、上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入することができ、結果として当該生物または細胞中に変異型Centrin1タンパク質を発現させることができる。さらに、上記組換えベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、変異型Centrin1タンパク質を選択的に合成することができる。 If the recombinant vector is used, the polynucleotide can be introduced into an organism or cell, and as a result, the mutant Centrin1 protein can be expressed in the organism or cell. Furthermore, when the above recombinant vector is used in a cell-free protein synthesis system, a mutant Centrin1 protein can be selectively synthesized.
また、上述した組換えベクターを含み、かつ、上述した変異型Centrin1タンパク質を細胞に発現させるために用いられる発現キットの形態にしてもよい。 Moreover, you may make it the form of the expression kit used in order to make a cell express the mutant type | mold Centrin1 protein mentioned above containing the recombinant vector mentioned above.
上記発現キットには、上記の組換えベクター以外の他の試薬を含んでいてもよい。他の試薬としては、例えば、組換えベクターを宿主細胞に導入するための導入用試薬、その宿主細胞、組換えベクターが宿主細胞内に導入されているかどうかを検定するためのプローブ群などが挙げられるがこれに限定されない。つまり、変異型Centrin1タンパク質の発現実験を、確実かつ簡便にできるように支援する試薬であればどのようなものが含まれていてもよい。上記発現キットを用いることにより、目的の宿主細胞において、確実に、かつ簡便に、変異型Centrin1タンパク質を発現させることができる。 The expression kit may contain a reagent other than the above recombinant vector. Other reagents include, for example, an introduction reagent for introducing a recombinant vector into a host cell, the host cell, a probe group for testing whether the recombinant vector has been introduced into the host cell, and the like. However, it is not limited to this. In other words, any reagent may be included as long as it supports the expression experiment of the mutant Centrin1 protein reliably and simply. By using the above expression kit, the mutant Centrin1 protein can be expressed reliably and simply in the target host cell.
また、本発明に係るポリペプチドは、上述したポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるものである。 The polypeptide according to the present invention consists of an amino acid sequence encoded by the above-described polynucleotide.
一実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるものであってもよい。ただし、本発明に係るポリペプチドは、配列番号4に示すアミノ酸配列に限定されない。本発明に係るポリペプチドには、配列番号4に示されるアミノ酸配列のみならず、配列番号4に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低妊孕性又は不妊症に関与するタンパク質も含まれ、特に、配列番号4に示されるアミノ酸配列において一塩基多型により1又は複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列のものも含まれる。 In one embodiment, the polypeptide may consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. However, the polypeptide according to the present invention is not limited to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. The polypeptide according to the present invention comprises not only the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, but also an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. In addition, a protein involved in hypofertility or infertility is also included, and in particular, an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted by a single nucleotide polymorphism in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is also included.
ここで、数個とは、当業者に期待しうる程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなく当業者が作ることができる程度の数を意図し、例えば、20個以下が好ましく、より好ましくは10個以下、さらに好ましくは5個以下のアミノ酸残基を意図する。 Here, the term “several” means a number that can be made by a person skilled in the art without performing trial and error or complicated advanced experiments exceeding the level that can be expected by those skilled in the art. More preferably, no more than 10, and even more preferably no more than 5 amino acid residues are contemplated.
本明細書において、「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と同義である。また、本発明に係るポリペプチドは、天然供給源より単離したものであっても、化学合成したものであってもよい。 In the present specification, “polypeptide” is synonymous with “peptide” or “protein”. The polypeptide according to the present invention may be isolated from a natural source or chemically synthesized.
「単離した」ポリペプチドとは、天然の環境から取り出されたポリペプチドを指す。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生ポリペプチドは、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドと同様に、単離されていると考えられる。本発明に係るポリペプチドは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドの利用方法に従って取得することができる。 An “isolated” polypeptide refers to a polypeptide that has been removed from its natural environment. For example, a recombinantly produced polypeptide expressed in a host cell is considered isolated, as are natural or recombinant polypeptides that have been substantially purified by any suitable technique. The polypeptide according to the present invention can be obtained according to the method for using the polynucleotide according to the present invention described above.
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主(例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む)において組換え技術によって産生された産物を含む。なお、上記ポリペプチドは、組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、グリコシル化されたり、非グリコシル化されたりしたものであってもよい。さらに、上記ポリペプチドは、宿主媒介プロセスの結果として、翻訳開始を示すメチオニン残基が改変されたものであってもよい。 Polypeptides according to the present invention include natural purified products, products of chemical synthesis procedures, and prokaryotic or eukaryotic hosts (eg, bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insect cells, and mammalian cells). ) Including products produced by recombinant techniques. The polypeptide may be glycosylated or non-glycosylated depending on the host used in the recombinant production procedure. Furthermore, the polypeptide may have a modified methionine residue that indicates translation initiation as a result of a host-mediated process.
本発明に係るポリヌクレオチド、発現ベクター、又はポリペプチドによれば、ヒトの不妊症患者に見られる置換変異型Centrin1タンパク質が得られる。従って、ヒトCentrin1遺伝子の第283位の塩基の置換変異に起因する不妊症の治療を目的とした薬剤及び治療方法を開発する上で、極めて有用なツールを得ることができる。
According to the polynucleotide, the expression vector, or the polypeptide of the present invention, a substitution mutant Centrin1 protein found in human infertility patients can be obtained. Therefore, a very useful tool can be obtained in developing a drug and a treatment method for the treatment of infertility caused by a substitution mutation at the
(3.ヒトCentrin1遺伝子における置換変異の解析)
(3−1.材料及び方法)
(3−1−a.参加者)
不妊症の日本人男性被験者(N=282)を精子形成の欠損の程度に基づいてサブグループに分割した。これらの不妊症被験者のうち、192人(68%)は非閉塞性無精子症であり、90人(32%)は重症精子過少症(<5×106細胞/mL)であった。遺伝的要因を調べたところ、これらの被験者は何れも原発性特発性不妊症であった(Birmingham A et al. Fertil Steril 2004; 9: 2313-2317)。
(3. Analysis of substitution mutations in the human Centrin1 gene)
(3-1. Materials and methods)
(3-1-a. Participants)
Infertile Japanese male subjects (N = 282) were divided into subgroups based on the degree of deficiency of spermatogenesis. Of these infertile subjects, 192 (68%) had nonocclusive azoospermia and 90 (32%) had severe hypospermia (<5 × 10 6 cells / mL). When examined for genetic factors, all of these subjects had primary idiopathic infertility (Birmingham A et al. Fertil Steril 2004; 9: 2313-2317).
一方、妊孕性が確認された男性のコントロールグループ(N=96)として、産婦人科医院にいる妊婦のもとに生まれた子供の父親を選択した。 On the other hand, as a control group (N = 96) of males whose fertility was confirmed, the father of a child born to a pregnant woman in a gynecology clinic was selected.
なお、ドナーは、本研究において血液をゲノムDNAの解析に使用することに同意した。 The donor agreed to use blood for analysis of genomic DNA in this study.
(3−1−b.PCR増幅DNAのダイレクトシーケンシングによるCentrin1遺伝子の変異の同定)
以下の各工程では、特に断りがない限り、常法又はキットに添付されている取扱説明書に従って処理を行った。ゲノムDNAは、プロテアーゼ処理及びフェノール抽出により血液サンプルから単離した(Sambrook J et al., Isolation of DNA from Mammalian Cells. New York: Cold Spring Harbor Press. 1989: pp. 9.16-9.21)。また、Centrin1遺伝子を含む領域を増幅させるために、PCRに用いるプライマーの組として、PrimerF1及びPrimerR1を設計した(図1参照)。PrimerF1は、図1に示すように、Centrin1遺伝子の上流領域(Centrin1遺伝子の翻訳開始点を+1とすると−104〜−85の領域)と同一の塩基配列(配列番号5;5’−GCGTTGGCAGTGAGCGAGGG−3’)からなる。また、PrimerR1は、Centrin1遺伝子の下流領域(+1148〜+1171の領域)と相補的な塩基配列(配列番号6;5’−TACATACTAGCCCTAGATAAACCC−3’)からなる。
(3-1-b. Identification of a mutation in the Centrin1 gene by direct sequencing of PCR amplified DNA)
In each of the following steps, unless otherwise specified, the treatment was performed according to a conventional method or an instruction manual attached to the kit. Genomic DNA was isolated from blood samples by protease treatment and phenol extraction (Sambrook J et al., Isolation of DNA from Mammalian Cells. New York: Cold Spring Harbor Press. 1989: pp. 9.16-9.21). In order to amplify the region containing the Centrin1 gene, PrimerF1 and PrimerR1 were designed as primer pairs used for PCR (see FIG. 1). As shown in FIG. 1, PrimerF1 has the same base sequence (SEQ ID NO: 5; 5′-GCGTTGGCAGTGGAGCGAGGGG-3 as the upstream region of the Centrin1 gene (region of −104 to −85 when the translation start point of the Centrin1 gene is +1). '). PrimerR1 is composed of a base sequence (SEQ ID NO: 6; 5′-TACATACTAGCCCTAGATAAAACCC-3 ′) complementary to the downstream region of the Centrin1 gene (region of +1148 to +1171).
PCRは以下の条件で行った:98℃で10秒間変性、62℃で30秒間アニーリング、及び72℃で1分間伸長を1サイクルとして、これを35サイクル。PCR増幅フラグメントはSUPREC PCRスピンカラム(タカラバイオ)を用いて精製した。 PCR was performed under the following conditions: 35 cycles of denaturation at 98 ° C for 10 seconds, annealing at 62 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 1 minute. The PCR amplified fragment was purified using a SUPREC PCR spin column (Takara Bio).
PrimerF1及びPrimerR1からなるプライマーの組によって増幅したフラグメント(約1.3kb)に対して、上述したPrimerF1、PrimerR1、そして新規のPrimerF2、PrimerR2のそれぞれを用いてシーケンシングを行った。なお、PrimerF2は、図1に示すように、Centrin1遺伝子の内側領域(+537〜−556の領域)と同一の塩基配列(配列番号7;5’−AAGTGACTCTCTGGGTTGCC−3’)からなる。また、PrimerR2は、Centrin1遺伝子の内側領域(+617〜+640の領域)と相補的な塩基配列(配列番号8;5’−ATAGATCTAGACAAATTATGGGGG−3’)からなる。このとき、サーマルサイクルシーケンシングキット(アプライドバイオシステムズ)を用いて反応を行い、反応産物をABI−PRISM 310 Genetic Analyzer(アプライドバイオシステムズ)によって解析した。両方向の決定結果を比較し、塩基配列を決定した。 The fragment (about 1.3 kb) amplified by the primer pair consisting of PrimerF1 and PrimerR1 was sequenced using the above-described PrimerF1, PrimerR1, and each of the new PrimerF2 and PrimerR2. As shown in FIG. 1, PrimerF2 is composed of the same base sequence (SEQ ID NO: 7; 5'-AAGTGAACTCTCTGGGTTGCC-3 ') as the inner region of the Centrin1 gene (region of +537 to -556). PrimerR2 is composed of a base sequence (SEQ ID NO: 8; 5'-ATAGATCTAGACAAATTATGGGG-3 ') that is complementary to the inner region of the Centrin1 gene (region from +617 to +640). At this time, the reaction was performed using a thermal cycle sequencing kit (Applied Biosystems), and the reaction product was analyzed by ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). The base sequence was determined by comparing the determination results in both directions.
(3−2.結果)
不妊症被験者及び妊孕性確認被験者のそれぞれについてCentrin1遺伝子の塩基配列を解析したところ、Centrin1遺伝子の第283位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者の中に1人見出された。この被験者は、精子濃度が600万/mlの乏精子症(oligo-asthenozoospermia)であり、かつ精子の運動率が0%の精子無力症であった。一方、妊孕性確認被験者からは、上記の置換変異が全く見出されなかった。
(3-2. Results)
When the nucleotide sequence of the Centrin1 gene was analyzed for each of the infertile subject and the fertility confirmed subject, a subject in which the cytosine at
配列番号1に示すヒトCentrin1遺伝子の第283位のシトシン塩基がチミン塩基に置換すると、この部位が終止コドンをコードするようになる。その結果、配列番号2に示すCentrin1タンパク質の第95位のグルタミン以降のアミノ酸が欠失する(配列番号5参照)。
When the cytosine base at
Centrin1遺伝子は哺乳類に広く保存されていること、並びに、そのタンパク質が精巣の半数体生殖細胞に特に強く発現することから、Centrin1タンパク質の変異(又は発現量低下)は、男性不妊を引き起こす(或いは引き起こしやすい)と考えられる。従って、上記の置換変異が見出された上記被験者は、正常なCentrin1タンパク質の翻訳量が低減したことにより、不妊症になったものと推測された。 Because the Centrin1 gene is widely conserved in mammals and the protein is particularly strongly expressed in testicular haploid germ cells, mutations (or decreased expression) of the Centrin1 protein cause (or cause) male infertility. Easy). Therefore, it was speculated that the subject in which the substitution mutation was found became infertile due to a reduction in the translation amount of normal Centrin1 protein.
なお、本研究により、上記の置換変異以外にも様々な一塩基多型がCentrin1遺伝子内に見出されたが、これらの一塩基多型は、そのパターンが不妊症被験者と妊孕性確認被験者との間で有意な相違を見せず、特に妊孕性に影響を与えるものとは認められなかった。 In this study, various single nucleotide polymorphisms were found in the Centrin1 gene in addition to the substitution mutations described above. These single nucleotide polymorphisms have patterns infertility and fertility confirmed subjects. There was no significant difference between the two and it was not found to affect fertility.
本発明は上述した実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention is not limited to the embodiments and examples described above, and various modifications are possible within the scope of the claims. That is, embodiments obtained by combining technical means appropriately changed within the scope of the claims are also included in the technical scope of the present invention.
また、本明細書で示した数値範囲以外であっても、本発明の趣旨に反しない合理的な範囲であれば、本発明に含まれることはいうまでもない。 In addition, it goes without saying that the present invention includes a numerical range other than the numerical range shown in the present specification as long as it is within a reasonable range that does not contradict the gist of the present invention.
本発明に係る妊孕性診断キットは、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定に用いることができるので、医療現場において利用可能である。 Since the fertility diagnostic kit according to the present invention can be used for estimation of fertility possibility and identification of the cause of infertility, it can be used in a medical field.
また、本発明に係るポリヌクレオチド、発現ベクター及びポリペプチドは、上述した遺伝子の変異に基づく不妊症患者において見られる変異型のポリペプチドを提供するものである。従って、この変異型のポリペプチドを利用して研究を行うことにより、有効な薬剤や治療法の確立が期待される。これらのポリヌクレオチド、発現ベクター及びポリペプチドは、研究現場へ販売することができ、十分に産業上利用可能である。また、これらをキット化することにより、産業上の利用可能性は一層向上する。 The polynucleotide, expression vector and polypeptide according to the present invention provide a mutated polypeptide found in infertile patients based on the gene mutation described above. Therefore, establishment of effective drugs and treatment methods is expected by conducting research using this mutant polypeptide. These polynucleotides, expression vectors and polypeptides can be sold to research sites and are sufficiently industrially available. Moreover, industrial applicability improves further by making these into kits.
1 ターゲット遺伝子
1a 変異検出部位
2 インベーダープローブ
3 シグナルプローブ
3a ヌクレオチド
3b フラップ
3c フラップ遊離体
4 フラップエンドヌクレアーゼ
5 フレットプローブ
5a ヌクレオチド
5b 蛍光色素
5c クエンチャー
11 遺伝子
11a・11b 変異検出部位
12 特別プライマー
12a オリゴマー
12b タグ
13 カウンタープライマー
14 PCR産物
15 特別ターゲット
20 変異型プローブ
25 金電極
30 野生型プローブ
1
Claims (12)
ヒトCentrin1遺伝子の上記第283位の塩基を含む領域を増幅させるためのプライマーの組と、
上記領域の塩基配列を決定するための塩基配列決定試薬と、
を含んでいることを特徴とする請求項2に記載の妊孕性診断キット。 The reagent is
A set of primers for amplifying the region containing the base at position 283 of the human Centrin1 gene;
A base sequence determination reagent for determining the base sequence of the region,
The fertility diagnostic kit according to claim 2, comprising:
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010106788A1 (en) | 2009-03-17 | 2010-09-23 | 凸版印刷株式会社 | Fertility test method, fertility test kit, polynucleotide, polypeptide and antibody |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003068969A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Japan Science And Technology Agency | Mouse spermatogenesis genes, human male sterility-associated genes and diagnostic system using the same |
JP2003525574A (en) * | 1998-04-06 | 2003-09-02 | ミレニアム ファーマシューティカルズ インク. | Methods and compositions for diagnosing and treating neuropsychiatric disorders |
-
2007
- 2007-03-27 JP JP2007082574A patent/JP2008237114A/en active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003525574A (en) * | 1998-04-06 | 2003-09-02 | ミレニアム ファーマシューティカルズ インク. | Methods and compositions for diagnosing and treating neuropsychiatric disorders |
WO2003068969A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Japan Science And Technology Agency | Mouse spermatogenesis genes, human male sterility-associated genes and diagnostic system using the same |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010106788A1 (en) | 2009-03-17 | 2010-09-23 | 凸版印刷株式会社 | Fertility test method, fertility test kit, polynucleotide, polypeptide and antibody |
US9194874B2 (en) | 2009-03-17 | 2015-11-24 | Toppan Printing Co., Ltd. | Test method for male fertility by detecting a mutation in the PGAM4 gene |
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