JP2009065882A - Polynucleotide related to fertility and use thereof - Google Patents

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Hiromitsu Tanaka
宏光 田中
Yoshitake Nishimune
義武 西宗
Akihiko Okuyama
明彦 奥山
Akira Tsujimura
晃 辻村
Yasushi Miyagawa
康 宮川
Shinji Irie
新司 入江
Yasuhisa Matsui
靖久 松居
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Osaka Univ
国立大学法人大阪大学
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a technology useful for diagnosing pathological conditions of low fertility or infertility. <P>SOLUTION: A tool for detecting substitution mutation in the tenth exon of Meisetz gene and its use are provided. In more detail, a reagent for detecting presence of deficiency or mutation of human Meisetz gene and its use are provided. An antibody specifically binding a mutant-type human Meisetz polypeptide and its use are provided. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にする技術に関するものでもある。   The present invention also relates to a technique that makes it possible to estimate fertility and identify the cause of infertility.
近年、少子化の問題が頻繁に取り上げられ、この問題を解消するために様々な対策が模索されている。少子化の対策として、不妊症により子供を授からない夫婦を救済することが重要であることは言うまでもない。   In recent years, the problem of declining birthrate has been frequently taken up, and various measures are being sought to solve this problem. Needless to say, it is important to rescue couples who have no children due to infertility as a countermeasure to the declining birthrate.
非特許文献1では、子供を望む夫婦のうちの約15%が2年たっても妊娠できないことが報告されている。近年では、体外受精(IVF;In Vitro Fertilization)の技術発展により、精子の活動能が低い場合においても妊娠出産が可能になっているが、不妊の背後にある分子メカニズムは依然として明らかになっていない。   Non-Patent Document 1 reports that about 15% of couples who want children can not get pregnant even after two years. In recent years, the development of in vitro fertilization (IVF) technology has enabled pregnancy and birth even when sperm activity is low, but the molecular mechanism behind infertility remains unclear. .
非特許文献2によると、マウスにおける雄性不妊の研究により、妊孕性に影響を与える多くの遺伝子の存在が明らかになっており、これらの遺伝子の変異がヒトにおいても男性不妊を引き起こす一因となっている可能性がある。   According to Non-Patent Document 2, studies on male infertility in mice have revealed the existence of many genes that affect fertility, and mutations in these genes contribute to male infertility in humans. It may have become.
哺乳類の雄性生殖細胞の成熟は、数々の構造的及び機能的変化を経てなされる。その過程は精子形成と呼ばれ、主として(1)精原細胞の増殖及び分化、(2)精母細胞の前期段階における減数分裂、及び(3)半数体円形精子細胞から精子への分化の際の急激な形態変化、の3つの段階を含んでいる。   Maturation of mammalian male germ cells occurs through a number of structural and functional changes. The process is called spermatogenesis, and is mainly involved in (1) proliferation and differentiation of spermatogonia, (2) meiosis in the early stage of spermatocytes, and (3) differentiation from haploid round sperm cells to sperm. It includes three stages of rapid shape change.
上記の(2)の減数分裂前期の初期段階に特異的に発現する遺伝子としてMeisetzが知られている。Meisetzは推定上の転写因子として同定され、meiosis-induced factor containing a PR/SET domain and zinc-finger motifの頭文字をとってMeisetzと名付けられた。Meisetz遺伝子のノックアウトマウスは雌雄とも不妊であり、精巣では減数分裂関連遺伝子発現が変化していた(非特許文献3)。Meisetzタンパク質の中央部には、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性(ヒストンH3のリジン4のトリメチル化)を有するPR/SET(Suvar3-9,Enhancer-of-zeste, Trithorax)ドメイン、カルボキシル基末端側にCys(2)His(2)タイプのzinc−fingerモチーフを有する。Meisetz遺伝子は、最初にマウスにおいて単離されたが、アミノ酸配列はヒトでも高く保存されている。   Meisetz is known as a gene that is specifically expressed in the early stage of meiotic prophase (2) above. Meisetz was identified as a putative transcription factor and was named Meisetz after the initials of meiosis-induced factor containing a PR / SET domain and zinc-finger motif. Meisez gene knockout mice were infertile in both sexes, and meiosis-related gene expression was changed in the testis (Non-patent Document 3). At the center of the Meisetz protein is a PR / SET (Suvar3-9, Enhancer-of-zeste, Trithorax) domain having histone methyltransferase activity (trimethylation of lysine 4 of histone H3), and Cys (2 ) Has a His (2) type zinc-finger motif. The Meisetz gene was first isolated in mice, but the amino acid sequence is also highly conserved in humans.
また、Meisetzタンパク質にはKRAB(Kruppel-associated box)モチーフが含まれ、ウニやホヤ貝にも存在していることが知られている(非特許文献4)。
de Kretser DM et al., J Clin Endocrinol Metab. 1999; 84: 3443-3450. Matzuk MM et al., Nat Cell Biol. 2002; 4(Supp1): S41-S49 / Nat Med. 2002; 8 (Supp1): S33-S40. Hayashi K et al., Nature. 2005 Nov; 438(7066): 374-378. Britle Z et al., Bioinformatics. 2006 Dec; 22(23): 2841-2845.
In addition, the Meisetz protein contains a KRAB (Kruppel-associated box) motif and is known to exist in sea urchins and squirts (Non-patent Document 4).
de Kretser DM et al., J Clin Endocrinol Metab. 1999; 84: 3443-3450. Matzuk MM et al., Nat Cell Biol. 2002; 4 (Supp1): S41-S49 / Nat Med. 2002; 8 (Supp1): S33-S40. Hayashi K et al., Nature. 2005 Nov; 438 (7066): 374-378. Britle Z et al., Bioinformatics. 2006 Dec; 22 (23): 2841-2845.
男性不妊を診断するための有効な遺伝子診断方法は未だ十分に確立されていない。一口に男性不妊といっても、その原因は、生殖細胞自体の欠失から精子の受精不全まで多岐に渡る。従って、病態に応じた有効な治療法を確立するためには、様々な病態の原因を特定できる診断法が望まれている。   An effective genetic diagnosis method for diagnosing male infertility has not yet been established. The cause of male infertility ranges from the loss of germ cells themselves to the failure of fertilization of sperm. Therefore, in order to establish an effective treatment method according to a disease state, a diagnostic method capable of identifying the cause of various disease states is desired.
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にすることにある。   This invention is made | formed in view of the said subject, The objective is to enable estimation of the fertility possibility and identification of the cause of infertility.
本願発明者は、Meisetz遺伝子が欠損したマウスが不妊症になることから、後述する実施例に示すように、ヒトMeisetz遺伝子に男性不妊症に関連した変異を見出し、本発明を完成させるに至った。   The inventor of the present application found a mutation associated with male infertility in the human Meisetz gene, as shown in the examples described later, since the mouse lacking the Meisetz gene became infertile. .
本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号1に示される塩基配列の第1298位および第2054位に対応する塩基の少なくとも一方が野生型ヒトMeisetz遺伝子から変異していることを特徴としている。   The polynucleotide according to the present invention is characterized in that at least one of bases corresponding to positions 1298 and 2054 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is mutated from the wild-type human Meisetz gene.
また、本発明に係るポリペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の第433位および第685位に対応するアミノ酸の少なくとも一方が野生型ヒトMeisetzタンパク質から変異していることを特徴としている。   In addition, the polypeptide according to the present invention is characterized in that at least one of amino acids corresponding to positions 433 and 685 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is mutated from a wild-type human Meisetz protein.
本発明に係る試薬は、配列番号1に示される塩基配列の第1298位および第2054位に対応する塩基の少なくとも一方が野生型ヒトMeisetz遺伝子から変異しているポリヌクレオチドの存在の有無を検出することを特徴としている。   The reagent according to the present invention detects the presence or absence of a polynucleotide in which at least one of bases corresponding to positions 1298 and 2054 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is mutated from the wild-type human Meisetz gene. It is characterized by that.
本発明に係る妊孕性診断キットは上記試薬を含んでいることを特徴としている。   The fertility diagnostic kit according to the present invention is characterized by containing the above-mentioned reagent.
本発明に係る妊孕性診断方法は、ヒトから採取された生体サンプルにおける、配列番号1に示される塩基配列の第1298位および第2054位に対応する塩基の少なくとも一方が野生型ヒトMeisetz遺伝子から変異しているポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含んでいることを特徴としている。   In the fertility diagnostic method according to the present invention, in a biological sample collected from a human, at least one of bases corresponding to positions 1298 and 2054 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is derived from a wild-type human Meisetz gene. It includes a step of detecting the presence of a mutated polynucleotide.
本発明に係る抗体は、配列番号2に示されるアミノ酸配列の第433位および第685位に対応するアミノ酸の少なくとも一方が野生型ヒトMeisetzポリペプチドから変異している変異型ヒトMeisetzポリペプチドと結合し、かつ、野生型ヒトMeisetzポリペプチドと結合しないことを特徴としている。   The antibody according to the present invention binds to a mutant human Meisetz polypeptide in which at least one of the amino acids corresponding to positions 433 and 685 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is mutated from the wild-type human Meisetz polypeptide. And does not bind to wild-type human Meisetz polypeptide.
本発明に係る妊孕性診断方法は、ヒトから採取された生体サンプルにおける、配列番号2に示されるアミノ酸配列の第433位および第685位に対応するアミノ酸の少なくとも一方が野生型ヒトMeisetzポリペプチドから変異している変異型ヒトMeisetzポリペプチドの存在を、請求項14に記載の抗体によって検出する工程を含んでいることを特徴としている。   The method for diagnosing fertility according to the present invention includes a wild-type human Meisetz polypeptide in which at least one of amino acids corresponding to positions 433 and 685 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in a biological sample collected from a human is The method further comprises the step of detecting the presence of a mutated human Meisetz polypeptide mutated by the antibody according to claim 14.
本発明に係る妊孕性診断キットは、ヒトMeisetz遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする。   The fertility diagnostic kit according to the present invention includes a reagent for detecting the presence or absence of a deficiency or mutation in the human Meisetz gene.
上記試薬は、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第1位の塩基としたときに、ヒトMeisetz遺伝子の第1298位の塩基及び第2054位の塩基のうちの少なくとも一方の塩基の変異の有無を検出するものであることが好ましい。   The reagent detects the presence or absence of a mutation in at least one of the 1298th base and the 2054th base of the human Meisetz gene when the adenine encoding the translation initiation codon is the 1st base. It is preferable that
具体的には、上記試薬は、ヒトMeisetz遺伝子の上記第1298位の塩基及び第2054位の塩基のうちの少なくとも一方の塩基を含む領域を増幅させるためのプライマーの組と、上記領域の塩基配列を決定するための塩基配列決定試薬とを含んでいてもよい。   Specifically, the reagent comprises a primer set for amplifying a region containing at least one of the base at position 1298 and the base at position 2054 of the human Meisetz gene, and the base sequence of the region And a nucleotide sequence determination reagent for determining.
或いは、上記試薬は、上記変異の有無をインベーダー法によって検出するものであってもよい。   Alternatively, the reagent may detect the presence or absence of the mutation by an invader method.
さらに或いは、上記試薬は、上記変異の有無をSMMD法によって検出するものであってもよい。   Alternatively, the reagent may detect the presence or absence of the mutation by the SMMD method.
また、本発明に係る検出方法は、ヒトから単離された生体サンプルを用いて上記ヒトにおける遺伝子の欠損又は変異を検出する検出方法であって、ヒトMeisetz遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する工程を含んでいることを特徴とする。   The detection method according to the present invention is a detection method for detecting a deletion or mutation of a gene in the human using a biological sample isolated from human, and detects the presence or absence of a deletion or mutation of the human Meisetz gene. It includes a process.
Meisetz遺伝子の欠損又は変異は男性の妊孕性に影響を与えるため、上記妊孕性診断キット又は検出方法により、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定が可能になる。   Since the Meisetz gene deficiency or mutation affects male fertility, the fertility diagnostic kit or detection method enables estimation of fertility and identification of the cause of infertility.
一方、本発明に係る抗体は、変異型ヒトMeisetzポリペプチドと結合し、かつ、野生型ヒトMeisetzポリペプチドと結合しないことを特徴とする。   On the other hand, the antibody according to the present invention is characterized by binding to a mutant human Meisetz polypeptide and not binding to a wild-type human Meisetz polypeptide.
また、本発明に係る検出方法は、ヒトから採取沙汰生体サンプルを用いて上記ヒトにおいて発現しているMeisetzポリペプチドの変異を検出する検出方法であって、上述した抗体によってMeisetzポリペプチドの変異を検出する工程を含んでいることを特徴とする。   The detection method according to the present invention is a detection method for detecting a mutation of the Meisetz polypeptide expressed in the human using a biological sample collected from a human, wherein the mutation of the Meisetz polypeptide is detected by the antibody described above. It includes a detecting step.
また、本発明に係る別の妊孕性診断キットは、抗ヒトMeisetz抗体を含んでいることを特徴とする。   Another fertility diagnostic kit according to the present invention includes an anti-human Meisetz antibody.
以上のように、本発明に係る妊孕性診断キット及び検出方法には、ヒトMeisetz遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する試薬(工程)が含まれているので、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を行うことができる。   As described above, the fertility diagnostic kit and the detection method according to the present invention include a reagent (step) for detecting the presence or absence of a human Meisetz gene deletion or mutation. The cause of infertility can be identified.
本発明は、変異型ヒトMeisetz遺伝子を提供する。本明細書中で使用される場合、「ヒトMeisetz遺伝子(野生型ヒトMeisetz遺伝子)」は妊孕性にポジティブに関与するポリヌクレオチドが意図され、「変異型ヒトMeisetz遺伝子」は「野生型ヒトMeisetz遺伝子」の塩基配列に1つ以上の塩基の欠失、置換又は付加が生じている、妊孕性にネガティブに関与する(すなわち、低妊孕性又は不妊症の原因となり得る)ポリヌクレオチドが意図される。   The present invention provides a mutant human Meisetz gene. As used herein, “human Meisetz gene (wild-type human Meisetz gene)” is intended to be a polynucleotide positively involved in fertility, and “mutant human Meisetz gene” is referred to as “wild-type human Meisetz gene”. Intended for polynucleotides that are negatively involved in fertility (ie, can cause hypofertility or infertility) in which one or more base deletions, substitutions or additions have occurred in the base sequence of the “gene” Is done.
本明細書では、野生型ヒトMeisetz遺伝子の翻訳領域の代表的な塩基配列として、配列番号1に示す塩基配列を例に挙げて説明するが、特許請求の範囲に記載の「ヒトMeisetz遺伝子」及び「野生型ヒトMeisetz遺伝子」の翻訳領域は、配列番号1に示された塩基配列のもののみに限定されない。なぜならば、ヒト遺伝子には多くの一塩基多型が存在し、ヒトMeisetz遺伝子においても例外ではないからであり、塩基が一部異なっていてもコードされるポリペプチドが同一の機能を奏し得ることは、当該分野における技術常識である。従って、特許請求の範囲に記載の「ヒトMeisetz遺伝子」及び「野生型ヒトMeisetz遺伝子」には、配列番号1に示される塩基配列のみならず、配列番号1に示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された翻訳領域を有し、かつ妊孕性にポジティブに関与するもの(すなわち、自身のコードするポリペプチドが配列番号2に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド)も含まれ、特に、配列番号1に示される塩基配列において一塩基多型により1又は数個の塩基が置換された塩基配列を翻訳領域として有するものも含まれる。   In the present specification, as a representative base sequence of the translation region of the wild-type human Meisetz gene, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 will be described as an example, but the “human Meisetz gene” described in the claims and The translation region of “wild-type human Meisetz gene” is not limited to that of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. This is because many single nucleotide polymorphisms exist in human genes, and there is no exception in the human Meisetz gene, and even if the bases are partially different, the encoded polypeptides can perform the same function. Is common technical knowledge in the field. Accordingly, the “human Meisetz gene” and “wild-type human Meisetz gene” described in the claims include not only the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 but also one or several nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 1. Having a translation region in which the base of is deleted, substituted or added, and is positively involved in fertility (ie, the polypeptide encoded by itself is equivalent to the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) A polynucleotide having a base sequence in which one or several bases are substituted by a single nucleotide polymorphism in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a translation region.
ここで、数個とは、当業者に期待しうる程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなく当業者が作ることができる程度の数を意図し、例えば、20個以下が好ましく、より好ましくは10個以下、さらに好ましくは5個以下を意図する。このことは、変異型ヒトMeisetz遺伝子についても同様である。   Here, the term “several” means a number that can be made by a person skilled in the art without performing trial and error or complicated advanced experiments exceeding the level that can be expected by those skilled in the art. More preferably, it is 10 or less, and more preferably 5 or less. The same applies to the mutant human Meisetz gene.
なお、配列番号1は、ジーンバンク(GenBank)にアクセッション番号DQ388610で登録されている野生型Meisetz遺伝子の転写産物の塩基配列の中から、翻訳領域のみを抽出したものである。配列番号1に示すように、野生型ヒトMeisetz遺伝子は、2682bpからなる翻訳領域を有している。図1は、野生型ヒトMeisetz遺伝子の構造を示す模式図である。ヒトゲノムプロジェクトによって構築されたヒトゲノムリソースによれば、ヒトMeisetz遺伝子は、ヒト5番染色体短腕に位置している(5p14)。   SEQ ID NO: 1 is obtained by extracting only the translation region from the base sequence of the transcription product of the wild-type Meisetz gene registered in GeneBank under the accession number DQ388610. As shown in SEQ ID NO: 1, the wild type human Meisetz gene has a translation region consisting of 2682 bp. FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of a wild-type human Meisetz gene. According to the human genome resource constructed by the Human Genome Project, the human Meisetz gene is located on the short arm of human chromosome 5 (5p14).
本願発明者らは、後述する実施例に示す調査の結果、男性不妊症患者からなる集団の中に、配列番号1に示すヒトMeisetz遺伝子の翻訳領域における第1298位のグアニン(以下、単に「G」という)が片方のアレルにおいてチミン(以下、単に「T」という)に置換している患者、及び、第2054位のシトシン(以下、単に「C」という)が片方のアレルにおいてGに置換している患者がいることを見出した。一方、この第1298位及び第2054位の塩基置換は、妊孕性が確認されている男性からなる集団では全く見られなかった。なお、これらの置換部位は、図1に示すようにいずれもMeisetz遺伝子の第10エクソン内にある。   As a result of the investigation shown in Examples described later, the inventors of the present application have found that the guanine at position 1298 in the translation region of the human Meisetz gene shown in SEQ ID NO: 1 (hereinafter simply referred to as “G” )) Is replaced with thymine (hereinafter simply “T”) in one allele, and cytosine at position 2054 (hereinafter simply “C”) is replaced with G in one allele. Found that there are patients. On the other hand, the base substitutions at the 1298th position and the 2054th position were not seen at all in the group consisting of males with confirmed fertility. These substitution sites are all in the 10th exon of the Meisetz gene as shown in FIG.
ヒトMeisetz遺伝子に上記の置換変異が起こると、元々グリシン、トレオニンをコードしていたこれらの部位がバリン、アルギニンをコードするようになるため、正常なタンパク質が発現しなくなってしまう。それゆえ、ヒトMeisetz遺伝子の上記第1298位及び第2054位における置換変異は、たとえ片方のアレルのみに起こっている場合であっても、正常なMeisetzタンパク質の翻訳量が低下することにより、或いは、変異型Meisetzタンパク質がドミナントネガティブに作用することにより、不妊症を引き起こす可能性が高いと推測される。   When the above substitution mutation occurs in the human Meisetz gene, these sites that originally encoded glycine and threonine will encode valine and arginine, and thus normal proteins will not be expressed. Therefore, substitution mutations at the above positions 1298 and 2054 of the human Meisetz gene, even when occurring only in one of the alleles, due to a decrease in the translation amount of the normal Meisetz protein, or It is speculated that the mutant Meisetz protein is likely to cause infertility by acting dominant negative.
本発明に係る変異型ヒトMeisetz遺伝子は、配列番号1に示される塩基配列の第1298位および第2054位に対応する塩基の少なくとも一方が、野生型ヒトMeisetz遺伝子から変異しているポリヌクレオチドであることが好ましい。本発明に係る変異型ヒトMeisetz遺伝子は、妊孕性にネガティブに関与するポリヌクレオチドであり、本遺伝子を利用する(例えば、本遺伝子の存在の有無を調べる)ことにより低妊孕性又は不妊症の指標を検出し得、その結果これらの疾患の診断、推定、予測を行うことができる。なお、上述したように、野生型ヒトMeisetz遺伝子の塩基配列は配列番号1に示される塩基配列に限定されないが、当業者は、いずれの野生型ヒトMeisetz遺伝子の塩基配列も、配列番号1に示される塩基配列と整列させて、互いを容易に対応させることができる。すなわち、配列番号1に示される塩基配列とは異なる塩基配列からなる野生型ヒトMeisetz遺伝子であっても、当業者は、配列番号1に示される塩基配列の第1298位または第2054位に対応する塩基を容易に知ることができる。   The mutant human Meisetz gene according to the present invention is a polynucleotide in which at least one of the bases corresponding to positions 1298 and 2054 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is mutated from the wild-type human Meisetz gene. It is preferable. The mutant human Meisetz gene according to the present invention is a polynucleotide that is negatively involved in fertility, and is low fertility or infertility by using this gene (for example, examining the presence or absence of this gene). Can be detected, and as a result, these diseases can be diagnosed, estimated and predicted. As described above, the base sequence of the wild-type human Meisetz gene is not limited to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, but those skilled in the art also show the base sequence of any wild-type human Meisetz gene in SEQ ID NO: 1. Can be easily matched with each other. That is, even in the case of a wild-type human Meisetz gene having a base sequence different from the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, those skilled in the art correspond to positions 1298 or 2054 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. The base can be easily known.
一実施形態において、本発明に係る変異型ヒトMeisetz遺伝子は、配列番号1に示される塩基配列の第1298位に対応する塩基にG−T変異が生じているポリヌクレオチドであり得る。他の実施形態において、本発明に係る変異型ヒトMeisetz遺伝子は、配列番号1に示される塩基配列の第2054位に対応する塩基にC−G変異が生じているポリヌクレオチドであり得る。別の実施形態において、本発明に係る変異型ヒトMeisetz遺伝子は、配列番号1に示される塩基配列の第1298位に対応する塩基にG−T変異が生じかつ第2054位に対応する塩基にC−G変異が生じているポリヌクレオチドであり得る。   In one embodiment, the mutant human Meisetz gene according to the present invention may be a polynucleotide in which a GT mutation has occurred in the base corresponding to position 1298 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. In another embodiment, the mutant human Meisetz gene according to the present invention may be a polynucleotide having a CG mutation at the base corresponding to position 2054 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. In another embodiment, the mutant human Meisetz gene according to the present invention has a GT mutation at the base corresponding to position 1298 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and C at the base corresponding to position 2054. It can be a polynucleotide in which a -G mutation has occurred.
好ましくは、本発明に係る変異型ヒトMeisetz遺伝子は、配列番号5〜7のいずれか1つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり得る。また、好ましくは、本発明に係る変異型ヒトMeisetz遺伝子は、変異型ヒトMeisetzポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでもあり得る。   Preferably, the mutant human Meisetz gene according to the present invention may be a polynucleotide consisting of the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7. Also preferably, the mutant human Meisetz gene according to the present invention may be a polynucleotide encoding a mutant human Meisetz polypeptide.
本発明はさらに、妊孕性を診断するための変異型ヒトMeisetz遺伝子の利用を提供する。一実施形態において、本発明は、野生型ヒトMeisetz遺伝子における、配列番号1に示される塩基配列の第1298位および第2054位に対応する塩基の少なくとも一方のSNPを検出するためのツール(試薬)を含んでいる妊孕性診断キットを提供する。上記ツールは、例えば、ヒトMeisetz遺伝子のフラグメントからなるオリゴヌクレオチドであり得る。インベーダー法やSMMD法などを利用する場合は、上記オリゴヌクレオチドは上記SNP部位をその末端部分に含む。また、上記オリゴヌクレオチドは、上記SNP部位を含む領域を増幅するプライマーであり得、この場合、このオリゴヌクレオチドはSNP部位を含まない。なお、当業者は、本発明に係る変異型ヒトMeisetz遺伝子の情報に基づいて、このようなオリゴヌクレオチドの部位および長さを、過度の実験を行うことなく適宜設計し得る。すなわち、本発明に係る変異型ヒトMeisetz遺伝子は、上記オリゴヌクレオチドを設計するために利用される。他の実施形態において、本発明は、野生型ヒトMeisetz遺伝子における、配列番号1に示される塩基配列の第1298位および第2054位に対応する塩基の少なくとも一方のSNPを検出する工程を包含する妊孕性診断方法を提供する。本方法は、上記ツールを用いる方法であれば特に限定されない。   The present invention further provides the use of the mutant human Meisetz gene for diagnosing fertility. In one embodiment, the present invention provides a tool (reagent) for detecting at least one SNP of a base corresponding to positions 1298 and 2054 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in a wild-type human Meisetz gene. A fertility diagnostic kit is provided. The tool can be, for example, an oligonucleotide consisting of a fragment of the human Meisetz gene. When the invader method, the SMMD method, or the like is used, the oligonucleotide includes the SNP site at the terminal portion. The oligonucleotide may be a primer that amplifies a region including the SNP site, and in this case, the oligonucleotide does not include a SNP site. A person skilled in the art can appropriately design the site and length of such an oligonucleotide based on the information of the mutant human Meisetz gene according to the present invention without undue experimentation. That is, the mutant human Meisetz gene according to the present invention is used to design the oligonucleotide. In another embodiment, the present invention includes a step of detecting a SNP of at least one of the bases corresponding to positions 1298 and 2054 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the wild-type human Meisetz gene. Provide dwarf diagnostic methods. This method is not particularly limited as long as it uses the above tool.
本発明は、変異型ヒトMeisetzポリペプチド(タンパク質)を提供する。本明細書中で使用される場合、「野生型ヒトMeisetzポリペプチド」は妊孕性にポジティブに関与するポリペプチドが意図され、「変異型ヒトMeisetzポリペプチド」は「野生型ヒトMeisetzポリペプチド」のアミノ酸配列に1つ以上のアミノ酸の欠失、置換又は付加が生じている、妊孕性にネガティブに関与する(すなわち、低妊孕性又は不妊症の原因となり得る)ポリペプチドが意図される。   The present invention provides mutant human Meisetz polypeptides (proteins). As used herein, “wild-type human Meisetz polypeptide” is intended to be a polypeptide that is positively involved in fertility, and “mutant human Meisetz polypeptide” is referred to as “wild-type human Meisetz polypeptide”. Polypeptides that are negatively involved in fertility (ie, can cause hypofertility or infertility) are contemplated wherein one or more amino acid deletions, substitutions or additions have occurred in the amino acid sequence of .
本明細書では、「野生型ヒトMeisetz遺伝子」の場合と同様に野生型ヒトMeisetzポリペプチドの代表的なアミノ酸配列として、配列番号2に示すアミノ酸配列を例に挙げて説明するが、特許請求の範囲に記載の「ヒトMeisetzポリペプチド」及び「野生型ヒトMeisetzポリペプチド」の翻訳領域は、配列番号2に示されたアミノ酸配列のもののみに限定されない。なぜならば、ヒト遺伝子には多くの一塩基多型が存在し、ヒトMeisetz遺伝子においても例外ではないからであり、アミノ酸が一部異なっていても同一の機能を奏するポリペプチドが存在することは、当該分野における技術常識である。従って、特許請求の範囲に記載の「ヒトMeisetzポリペプチド」及び「野生型ヒトMeisetzポリペプチド」には、配列番号2に示されるアミノ酸配列のみならず、配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものであり、かつ妊孕性にポジティブに関与するもの(すなわち、配列番号2に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド)も含まれる。   In the present specification, as in the case of the “wild-type human Meisetz gene”, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 will be described as an example of the representative amino acid sequence of the wild-type human Meisetz polypeptide. The translation regions of “human Meisetz polypeptide” and “wild-type human Meisetz polypeptide” described in the scope are not limited to those having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. This is because there are many single nucleotide polymorphisms in human genes, and there is no exception in the human Meisetz gene, and there are polypeptides that have the same function even if some amino acids are different. This is common technical knowledge in this field. Accordingly, the “human Meisetz polypeptide” and “wild-type human Meisetz polypeptide” described in the claims include not only the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 but also 1 or 2 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Those in which several amino acids are deleted, substituted or added, and are positively involved in fertility (that is, a polypeptide having a function equivalent to the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) Is also included.
ここで、数個とは、当業者に期待しうる程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなく当業者が作ることができる程度の数を意図し、例えば、20個以下が好ましく、より好ましくは10個以下、さらに好ましくは5個以下を意図する。このことは、変異型ヒトMeisetzポリペプチドについても同様である。   Here, the term “several” means a number that can be made by a person skilled in the art without performing trial and error or complicated advanced experiments exceeding the level that can be expected by those skilled in the art. More preferably, it is 10 or less, and more preferably 5 or less. The same applies to the mutant human Meisetz polypeptide.
なお、配列番号2は、配列番号1に示される塩基配列からなる野生型Meisetz遺伝子(翻訳領域)にコードされる野生型ヒトMeisetzタンパク質の推定アミノ酸配列を示すものである。野生型ヒトMeisetzタンパク質は、上述したように、減数分裂前期の初期段階に発現することが報告されている。   SEQ ID NO: 2 shows the deduced amino acid sequence of the wild-type human Meisetz protein encoded by the wild-type Meisetz gene (translation region) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Wild-type human Meisetz protein has been reported to be expressed at an early stage of meiosis, as described above.
本発明に係る変異型ヒトMeisetzポリペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の第433位および第685位に対応するアミノ酸の少なくとも一方が、野生型ヒトMeisetzポリペプチドから変異しているポリペプチドである。本発明に係る変異型ヒトMeisetzポリペプチドは、妊孕性にネガティブに関与するポリペプチドであり、本ポリペプチドを利用する(例えば、本ポリペプチドの存在の有無を調べる)ことにより低妊孕性又は不妊症の指標を検出し得、その結果これらの疾患の診断、推定、予測を行うことができる。なお、上述したように、野生型ヒトMeisetzポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号2に示されるアミノ酸配列に限定されないが、当業者は、いずれの野生型ヒトMeisetzポリペプチドのアミノ酸配列も、配列番号2に示されるアミノ酸配列と整列させて、互いを容易に対応させることができる。すなわち、配列番号2に示されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなる野生型ヒトMeisetzポリペプチドであっても、当業者は、配列番号2に示されるアミノ酸配列の第433位または第685位に対応するアミノ酸を容易に知ることができる。   The mutant human Meisetz polypeptide according to the present invention is a polypeptide in which at least one of amino acids corresponding to positions 433 and 685 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is mutated from the wild-type human Meisetz polypeptide. It is. The mutant human Meisetz polypeptide according to the present invention is a polypeptide that is negatively involved in fertility, and has low fertility by using this polypeptide (for example, examining the presence or absence of this polypeptide). Alternatively, an infertility index can be detected, so that these diseases can be diagnosed, estimated and predicted. As described above, the amino acid sequence of the wild-type human Meisetz polypeptide is not limited to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, but those skilled in the art will recognize that the amino acid sequence of any wild-type human Meisetz polypeptide is SEQ ID NO: 2. Can be easily matched to each other. That is, even in the case of a wild-type human Meisetz polypeptide consisting of an amino acid sequence different from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, those skilled in the art correspond to positions 433 or 685 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. You can easily know the amino acid to do.
一実施形態において、本発明に係る変異型ヒトMeisetzポリペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の第433位に対応する位置においてG−V変異(グリシンからバリンへの変異)が生じているポリペプチドであり得る。他の実施形態において、本発明に係る変異型ヒトMeisetzポリペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の第685位に対応する位置においてT−R変異(トレオニンからアルギニンへの変異)が生じているポリペプチドであり得る。別の実施形態において、本発明に係る変異型ヒトMeisetzポリペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の第433位に対応する位置においてG−V変異が生じかつ第685位に対応する位置においてT−R変異が生じているポリペプチドであり得る。好ましくは、本発明に係る変異型ヒトMeisetzポリペプチドは、配列番号8〜10のいずれか1つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり得る。また、好ましくは、本発明に係る変異型ヒトMeisetzポリペプチドは、変異型ヒトMeisetzポリペプチドをコードするポリペプチドでもあり得る。   In one embodiment, the mutant human Meisetz polypeptide according to the present invention has a GV mutation (mutation from glycine to valine) at a position corresponding to position 433 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. It can be a polypeptide. In another embodiment, the mutant human Meisetz polypeptide according to the present invention has a T-R mutation (mutation from threonine to arginine) at a position corresponding to position 685 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Polypeptide. In another embodiment, the mutant human Meisetz polypeptide according to the present invention has a GV mutation at a position corresponding to position 433 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a position corresponding to position 685. It can be a polypeptide in which a TR mutation has occurred. Preferably, the mutant human Meisetz polypeptide according to the present invention may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 8 to 10. Also preferably, the mutant human Meisetz polypeptide according to the present invention may be a polypeptide encoding the mutant human Meisetz polypeptide.
本発明はさらに、妊孕性を診断するための変異型ヒトMeisetzポリペプチドの利用を提供する。一実施形態において、本発明は、野生型ヒトMeisetzポリペプチドにおける、配列番号2に示されるアミノ酸配列の第433位および第685位に対応するアミノ酸の少なくとも一方に変異を有しているポリペプチドを検出するためのツール(試薬)を含んでいる妊孕性診断キットを提供する。このようなツールとしては、配列番号2に示されるアミノ酸配列の第433位および第685位に対応するアミノ酸の少なくとも一方が、野生型ヒトMeisetzタンパク質にて変異してなる変異型ヒトMeisetzポリペプチドと特異的に結合しかつ野生型ヒトMeisetzタンパク質と結合しない抗体が挙げられる。すなわち、本発明に係る変異型ヒトMeisetzポリペプチドは、上記抗体を惹起するために利用される。他の実施形態において、本発明は、野生型ヒトMeisetzポリペプチドにおける、配列番号2に示されるアミノ酸配列の第433位および第685位に対応するアミノ酸の少なくとも一方に変異を有しているポリペプチドを検出する工程を包含する妊孕性診断方法を提供する。本方法は、上記抗体を用いる方法であれば特に限定されない。   The present invention further provides the use of mutant human Meisetz polypeptides for diagnosing fertility. In one embodiment, the present invention provides a polypeptide having a mutation in at least one of the amino acids corresponding to positions 433 and 685 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the wild-type human Meisetz polypeptide. A fertility diagnostic kit including a tool (reagent) for detection is provided. Such a tool includes a mutant human Meisetz polypeptide in which at least one of the amino acids corresponding to positions 433 and 685 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is mutated in a wild-type human Meisetz protein; Antibodies that specifically bind and do not bind to the wild type human Meisetz protein. That is, the mutant human Meisetz polypeptide according to the present invention is used for raising the antibody. In another embodiment, the present invention provides a polypeptide having a mutation in at least one of the amino acids corresponding to positions 433 and 685 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the wild-type human Meisetz polypeptide. A method for diagnosing fertility is provided which includes a step of detecting. This method is not particularly limited as long as it uses the above antibody.
本発明の具体的な実施形態を以下に詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。   Specific embodiments of the present invention will be described in detail below, but the present invention is not limited to the following description.
Meisetz遺伝子の欠損又は変異は、ヒトにおいても低妊孕性又は不妊症の原因になると考えられる。従って、被験者から生体サンプルを採取し、この生体サンプルを用いて被験者のMeisetz遺伝子に欠損又は変異があるか否かを調べることにより、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定が可能になる。   The Meisetz gene deletion or mutation is considered to cause hypofertility or infertility in humans. Therefore, it is possible to estimate fertility and identify the cause of infertility by collecting a biological sample from the subject and examining whether the subject's Meisetz gene is defective or mutated using this biological sample. Become.
すなわち、本発明は、妊孕性診断方法を提供する。本発明に係る妊孕性診断方法は、ヒトから採取された生体サンプルを用いて上記ヒトにおける遺伝子の欠損又は変異を検出する検出方法でもあり得、ヒトMeisetz遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する工程を含んでいることを特徴とする。   That is, the present invention provides a fertility diagnostic method. The fertility diagnostic method according to the present invention may be a detection method for detecting a gene deficiency or mutation in a human using a biological sample collected from a human, and detects the presence or absence of a deficiency or mutation in a human Meisetz gene. It includes a process.
また、本発明は、妊孕性診断キットを提供する。本発明に係る妊孕性診断キットは、上記診断方法(検出方法)に用いられる試薬を含んでいる。なお、妊孕性診断キットには、使用方法が記載された取扱説明書が含まれていてもよい。   The present invention also provides a fertility diagnostic kit. The fertility diagnostic kit according to the present invention includes a reagent used in the diagnostic method (detection method). The fertility diagnostic kit may include an instruction manual describing how to use it.
被験者から採取する生体サンプルは特に限定されず、例えば血液や頬の内側の粘膜などを挙げることができる。また、ヒトMeisetz遺伝子の欠損又は変異を検出する方法としては特に限定されず、公知の各種手法、例えば、サンガー法を基礎とする塩基配列決定法、インベーダー法、SMMD法(simultaneous multiple mutation detection system)、PCR−RFLP法、MASA法、塩基伸長法、Taqmanプローブ法や、それらを改変した方法などを用いることができる。   The biological sample collected from the subject is not particularly limited, and examples thereof include blood and a mucous membrane inside the cheek. In addition, the method for detecting a deficiency or mutation of the human Meisetz gene is not particularly limited, and various known methods such as a base sequencing method based on the Sanger method, an invader method, a SMMD method (simultaneous multiple mutation detection system) , PCR-RFLP method, MASA method, base extension method, Taqman probe method, a modified method thereof, and the like can be used.
ヒトMeisetz遺伝子及びその周辺の塩基配列は、例えばNCBIヒトゲノムリソース(NCBI Human Genome Resources: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/)から当業者であれば容易に入手することができる。なお、NCBIヒトゲノムリソースにおいて、MeisetzはPRDM9(PR-domain containing protein 9)とも称される。ヒトMeisetz遺伝子の欠損又は変異を検出するためのプライマーやプローブなどは、ヒトMeisetz遺伝子及びその周辺の塩基配列を基に設計することができる。   The human Meisetz gene and the surrounding nucleotide sequences can be easily obtained by those skilled in the art from, for example, NCBI Human Genome Resources (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/). It can be obtained. In the NCBI human genome resource, Meisetz is also referred to as PRDM9 (PR-domain containing protein 9). Primers, probes, and the like for detecting a deletion or mutation of the human Meisetz gene can be designed based on the human Meisetz gene and its surrounding base sequences.
上記検出方法又は妊孕性診断キットによってMeisetz遺伝子に変異が見出された場合、その被験者は、妊孕可能性が低いと推定される。また、被験者が不妊症患者であれば、その原因がMeisetz遺伝子の欠損又は変異であることが分かる。従って、そのような被験者に対して適切な処置を施すことにより、早期に疾患を治癒することができる。つまり、本発明の検出方法は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を目的とした診断方法ともいえる。   If a mutation is found in the Meisetz gene by the detection method or fertility diagnostic kit, the subject is presumed to have a low fertility potential. Moreover, if a test subject is an infertility patient, it turns out that the cause is a defect or a variation | mutation of a Meisetz gene. Therefore, the disease can be cured at an early stage by applying an appropriate treatment to such a subject. That is, it can be said that the detection method of the present invention is a diagnostic method for the purpose of estimating fertility and identifying the cause of infertility.
本発明に係る検出方法は、被験者(ヒト)から採取された生体サンプル(血液や頬の内側の粘膜など)に含まれるゲノムDNA、または、被験者の生体サンプルから単離されたゲノムDNAにおいて、ヒトMeisetz遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出する工程を含んでいる。   The detection method according to the present invention is a method in which genomic DNA contained in a biological sample (blood, mucous membrane inside cheek, etc.) collected from a subject (human), or genomic DNA isolated from a subject's biological sample, A step of detecting the presence or absence of a mutation causing a functional defect in the Meisetz gene.
また、本発明に係る妊孕性診断キットは、被験者から採取された生体サンプルに含まれるゲノムDNA、または、被験者の生体サンプルから単離されたゲノムDNAにおいて、ヒトMeisetz遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出する試薬を含んでいる。   In addition, the fertility diagnostic kit according to the present invention is a mutation that causes a functional defect of the human Meisetz gene in genomic DNA contained in a biological sample collected from a subject or in genomic DNA isolated from a subject's biological sample. Reagents for detecting the presence or absence of
上記検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトMeisetz遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出するものであれば、その態様は特に限定されるものではない。例えば、検出方法及び妊孕性診断キットは、被験者のヒトMeisetz遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていることを検出するものであってもよいし、被験者のヒトMeisetz遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていないことを検出するものであってもよい。   The above-described detection method and fertility diagnostic kit are not particularly limited as long as they detect the presence or absence of a mutation that causes a functional defect in the human Meisetz gene. For example, the detection method and the fertility diagnostic kit may detect that a human Meisetz gene of a subject contains a mutation that causes a loss of function of the gene, or the human Meisetz gene of the subject , It may be detected that a mutation causing a functional defect of the gene is not included.
例えば、上記変異の存在を検出するものである場合、上記検出方法及び妊孕性診断キットは、上記の機能欠損を引き起こす変異が少なくとも一方のアレルにおいて起こっていることを検出できればよい。一方、上記変異の非存在を検出するものである場合、上記検出方法及び妊孕性診断キットは、上記の機能欠損を引き起こす変異が双方のアレルにおいて起こっていないことを検出することが好ましい。   For example, in the case of detecting the presence of the mutation, the detection method and the fertility diagnostic kit need only be able to detect that the mutation causing the functional defect occurs in at least one allele. On the other hand, when detecting the absence of the mutation, the detection method and the fertility diagnostic kit preferably detect that the mutation causing the functional defect does not occur in both alleles.
上記検出方法又は妊孕性診断キットにより、上記変異の有無を調べ、その結果、変異が検出されなかった場合は、妊孕性に問題がない可能性が高いと推定できる。また、被験者が不妊症患者である場合は、不妊症の原因が、Meisetz遺伝子の機能欠損以外のものによる可能性が高いと判定できる。   The presence or absence of the mutation is examined by the detection method or the fertility diagnostic kit. As a result, if no mutation is detected, it can be estimated that there is a high possibility that there is no problem with fertility. Moreover, when a test subject is an infertility patient, it can be determined that there is a high possibility that the cause of infertility is due to something other than a functional defect of the Meisetz gene.
一方、変異が検出された場合は、低妊孕性又は不妊症である可能性が高いと推定できる。また、被験者が不妊症患者である場合は、不妊症の原因がMeisetz遺伝子の機能欠損による可能性が高いと判定できる。よって、この場合は、TESE−ICSI(Testicular sperm extraction - Intracytoplasmic sperm injection;精巣生検−顕微授精)などの現存の治療法の適格な選択を提示することができる。   On the other hand, if a mutation is detected, it can be estimated that there is a high possibility of low fertility or infertility. When the subject is an infertility patient, it can be determined that the cause of infertility is highly likely due to a functional defect of the Meisetz gene. Therefore, in this case, it is possible to present an appropriate selection of an existing treatment method such as TSE-ICSI (Testicular sperm extraction-intracytoplasmic sperm injection).
このように、上記検出方法及び妊孕性診断キットによれば、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を行うことができる。すなわち、上記検出方法又は妊孕性診断キットによれば、不妊症の診断を行う上で有用な情報が提供される。それゆえ、上記検出方法における変異の有無を検出する工程は、低妊孕性又は不妊症の診断方法において用いられることが好ましいといえる。   Thus, according to the detection method and fertility diagnostic kit, it is possible to estimate the possibility of fertility and identify the cause of infertility. That is, according to the detection method or fertility diagnostic kit, information useful for diagnosing infertility is provided. Therefore, it can be said that the step of detecting the presence or absence of mutation in the detection method is preferably used in a method for diagnosing hypofertility or infertility.
なお、上記検出方法及び妊孕性診断キットは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第1位の塩基としたときに、ヒトMeisetz遺伝子の翻訳領域の上記の第1298位及び第2054位のうちの少なくとも一方の塩基の置換変異の有無を検出することが好ましい。   The detection method and the fertility diagnostic kit have the above-mentioned positions 1298 and 2054 in the translation region of the human Meisetz gene when adenine encoding the translation initiation codon is the first base. It is preferable to detect the presence or absence of a substitution mutation in at least one base.
さらに、上記検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトMeisetz遺伝子の上記の第1298位の塩基がトレオニンに置換していること、或いは、上記の第2054位の塩基がグアニンに置換していることを検出するものであることが好ましい。このように、変異を検出する箇所や検出する変異の種類を絞ることにより、低妊孕性又は不妊症の原因となる変異の有無を効率よく調べることができる。   Further, in the detection method and fertility diagnostic kit, the base at position 1298 of the human Meisetz gene is replaced with threonine, or the base at position 2054 is replaced with guanine. It is preferable to detect this. Thus, by narrowing down the location where mutation is detected and the type of mutation to be detected, the presence or absence of a mutation causing low fertility or infertility can be efficiently examined.
ただし、上記の第1298位または第2054位の置換変異以外であっても、ヒトMeisetz遺伝子に起こった変異(置換変異、挿入変異及び欠失変異を含む)は、不妊症を引き起こす可能性が高いと推測されるので、本発明は、上記の第1298位または第2054位の置換変異を検出するものに限定されない。   However, mutations (including substitution mutations, insertion mutations, and deletion mutations) occurring in the human Meisetz gene are highly likely to cause infertility, even if they are other than the substitution mutations at positions 1298 or 2054. Therefore, the present invention is not limited to the detection of the substitution mutation at position 1298 or position 2054.
一実施形態において、上記検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトMeisetz遺伝子内の領域のうち、上記の第1298位及び第2054位のうちの少なくとも一方(以下、「変異検出部位」という)の塩基を含む領域の塩基配列を決定することにより、上記の置換変異の有無を検出するものであってもよい。塩基配列の決定には、サンガー法やこれを応用した公知の各種手法を用いることができる。   In one embodiment, the detection method and the fertility diagnostic kit include at least one of the above-mentioned positions 1298 and 2054 (hereinafter referred to as “mutation detection site”) in the region within the human Meisetz gene. The presence or absence of the above substitution mutation may be detected by determining the base sequence of the region containing the base. For the determination of the base sequence, the Sanger method or various known techniques applying the Sanger method can be used.
この場合、妊孕性診断キットには、ヒトMeisetz遺伝子の上記の変異検出部位を含む領域を増幅させるために、変異検出部位を挟むようにして設計されたプライマーの組が含まれることが好ましい。このプライマーの組には、より詳細には、ヒトMeisetz遺伝子の変異検出部位よりも上流の塩基配列の一部または全部を有するプライマーと、ヒトMeisetz遺伝子の変異検出部位よりも下流の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列を有するプライマーとが含まれる。   In this case, it is preferable that the fertility diagnostic kit includes a pair of primers designed so as to sandwich the mutation detection site in order to amplify the region including the mutation detection site of the human Meisetz gene. More specifically, the primer set includes a primer having a part or all of the base sequence upstream of the mutation detection site of the human Meisetz gene and a base sequence downstream of the mutation detection site of the human Meisetz gene. And a primer having a base sequence complementary to part or all.
被験者から採取された生体サンプルに含まれるゲノムDNAを鋳型として上記のプライマーの組を用いてPCR(polymerase chain reaction)を行えば、ヒトMeisetz遺伝子の変異検出部位の塩基を含む領域がDNAフラグメントとして増幅され、さらに、上記のプライマーの組の一方又は両方のプライマーを用いて塩基配列の決定を行えば、置換変異の有無を確実かつ簡便に検出することができる。塩基配列の決定は、例えばABI−PRISM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems Inc.)などを取扱説明書に従って使用することにより、簡単に実施することができる。なお、塩基配列の決定に用いられるプライマーは、DNAフラグメントの増幅のためのPCRに用いられるプライマーとは別のものであってもよい。   When PCR (polymerase chain reaction) is performed using genomic DNA contained in a biological sample collected from a subject as a template and the above primer set, the region containing the base of the mutation detection site of the human Meisetz gene is amplified as a DNA fragment. Furthermore, if the nucleotide sequence is determined using one or both primers of the above primer set, the presence or absence of a substitution mutation can be reliably and easily detected. The base sequence can be easily determined by using, for example, ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc.) according to the instruction manual. The primer used for determining the base sequence may be different from the primer used for PCR for amplification of the DNA fragment.
なお、それぞれのプライマーは、Meisetz遺伝子又はその周辺と同一の塩基配列、或いは相補的な塩基配列を少なくとも10塩基以上有することが好ましく、15塩基以上有することがより好ましく、18塩基以上有することがさらに好ましく、20塩基以上有することが特に好ましい。Meisetz遺伝子又はその周辺と同一の(或いは相補的な)塩基配列の長さを長くすることにより、Meisetz遺伝子の第1298位及び第2054位のうちの少なくとも一方を含む目的の領域のみを確実に増幅させることができる。   Each primer preferably has at least 10 bases, more preferably 15 bases or more, and more preferably 18 bases or more of the same base sequence as the Meisetz gene or its periphery, or a complementary base sequence. It is preferable to have 20 bases or more. By lengthening the length of the same (or complementary) base sequence from or around the Meisetz gene, only the target region containing at least one of the positions 1298 and 2054 of the Meisetz gene is reliably amplified. Can be made.
また、上記のプライマーの組は、互いのプライマーによって挟まれる領域の長さが5kb以下であることが好ましく、3kb以下であることがより好ましく、2kb以下であることがさらに好ましく、1.5kb以下であることが特に好ましい。互いのプライマーによって挟まれる領域の長さを短くすることによって、上記の変異検出部位の塩基を含む領域の増幅を効果的に行うことができる。   Further, in the above primer pair, the length of the region sandwiched between the primers is preferably 5 kb or less, more preferably 3 kb or less, further preferably 2 kb or less, and 1.5 kb or less. It is particularly preferred that By shortening the length of the region sandwiched between the primers, the region including the base of the mutation detection site can be effectively amplified.
また、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から2kb以内の位置に設定されることが好ましく、1.5kb以内の位置に設定されることが好ましく、1.0kb以内の位置に設定されることがより好ましく、0.7kb以内の位置に設定されることが特に好ましい。上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。   The primer used for determining the base sequence is preferably set at a position within 2 kb from the base of the mutation detection site, preferably set at a position within 1.5 kb, and within 1.0 kb. More preferably, the position is set to a position within 0.7 kb. With the above configuration, the base sequence can be accurately determined.
さらに、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から20bp以上離れた位置に設定されることが好ましく、30bp以上離れた位置に設定されることがより好ましく、40bp以上離れた位置に設定されることがさらに好ましく、50bp以上離れた位置に設定されることが特に好ましい。また、上記プライマーの組は、ヒトMeisetz遺伝子の変異検出部位の塩基を含む20bp以上の領域を増幅させるものであることが好ましい。プライマーの近傍は、塩基配列の決定結果が不正確になる傾向にあるが、上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。   Furthermore, the primer used for determining the base sequence is preferably set at a position separated by 20 bp or more from the base of the mutation detection site, more preferably set at a position separated by 30 bp or more, and separated by 40 bp or more. It is more preferable that the position is set, and it is particularly preferable that the position is set at a position separated by 50 bp or more. Moreover, it is preferable that the said primer group amplifies the area | region 20 bp or more containing the base of the mutation detection site | part of a human Meisetz gene. In the vicinity of the primer, the determination result of the base sequence tends to be inaccurate, but the base sequence can be accurately determined by the above configuration.
上記のプライマーの組としては、例えば、それぞれ配列番号3,4に示す塩基配列からなるプライマー(図1のMeisetz−P7及びMeisetz−P8R)を用いることができるが、本発明に用いることのできるプライマーの塩基配列がこの配列に限定されないことはいうまでもない。ヒトMeisetz遺伝子の塩基配列及びその周辺の塩基配列は、当業者であれば上述したヒトゲノムリソースやジーンバンク(GenBank)から容易に入手することができるので、入手した塩基配列を基に、Oligo(登録商標、National Bioscience Inc.)又はGENETYX(ソフトウェア開発)などを用いてプライマーを設計することができる。   As the above primer set, for example, primers (Meisetz-P7 and Meisetz-P8R in FIG. 1) each having a base sequence shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 can be used, but primers that can be used in the present invention It goes without saying that the base sequence is not limited to this sequence. A person skilled in the art can easily obtain the base sequence of the human Meisetz gene and the surrounding base sequence from the above-described human genome resources and GeneBank, and therefore, Oligo (registered) based on the obtained base sequence. Primers can be designed using trademarks such as National Bioscience Inc.) or GENETYX (software development).
各プライマーは、例えばホスホロアミダイト法などの公知の方法によって合成することができ、例えばApplied Biosystems Inc.の392型シンセサイザーなどを取扱説明書に従って使用することによって簡単に合成することができる。   Each primer can be synthesized by a known method such as a phosphoramidite method, and can be easily synthesized by using, for example, an Applied Biosystems Inc. type 392 synthesizer according to the instruction manual.
なお、上記の各プライマーには、蛍光標識が付されていてもよい。プライマーに蛍光標識が付されている場合、ダイプライマー法によって、放射性同位元素を用いることなく増幅領域の塩基配列を決定することができる。   Each primer described above may have a fluorescent label. When a fluorescent label is attached to the primer, the base sequence of the amplification region can be determined by the die primer method without using a radioisotope.
一方、各プライマーに蛍光標識が付されていない場合、ダイターミネータ法によって塩基配列を決定することができる。この場合、上記妊孕性診断キットには、上記のプライマーの組に加えて、A,T,G,Cの各単量体からなるデオキシリボ核酸、蛍光標識されA,T,G,Cの各単量体からなるジデオキシリボ核酸(所謂ダイターミネータ)、及びポリメラーゼなどがさらに含まれていてもよい。   On the other hand, when the fluorescent label is not attached to each primer, the base sequence can be determined by the dye terminator method. In this case, the fertility diagnostic kit includes deoxyribonucleic acid composed of monomers A, T, G, and C, fluorescently labeled A, T, G, and C, in addition to the above primer set. A dideoxyribonucleic acid (so-called dye terminator) comprising a monomer, a polymerase, and the like may further be included.
一実施形態において、上記検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトMeisetz遺伝子の上記の変異検出部位における塩基の置換変異の有無をインベーダー法によって検出するものであってもよい。インベーダー法の詳細については、Lyamichevらによる論文(Lyamichev V et al., Nat biotechnol. 17, 292, 1999)に記載されており、本明細書ではこれを援用する。   In one embodiment, the detection method and the fertility diagnostic kit may detect the presence or absence of a base substitution mutation at the mutation detection site of the human Meisetz gene by an invader method. Details of the invader method are described in a paper by Lyamichev et al. (Lyamichev V et al., Nat biotechnol. 17, 292, 1999), which is incorporated herein by reference.
図2は、インベーダー法の原理を説明する模式図である。インベーダー法では、非蛍光標識プローブのインベーダーオリゴ2及びアレルオリゴ3と、蛍光標識プローブのフレットプローブ5とが用いられる。   FIG. 2 is a schematic diagram illustrating the principle of the invader method. In the invader method, an invader oligo 2 and an allele oligo 3 which are non-fluorescently labeled probes and a fret probe 5 which is a fluorescently labeled probe are used.
インベーダープローブ2は、ターゲット遺伝子1と相補的な塩基配列を有し、かつ、3’末端の塩基がターゲット遺伝子1の変異(又は一塩基多型)検出部位1aと対応するように設計される(いずれの塩基とも相補的な塩基ではない)。一方、アレルオリゴ3は、ターゲット遺伝子1とは無関係な塩基配列であるフラップ3bと、ターゲット遺伝子1と相補的な塩基配列を有し、かつ、5’末端の塩基がターゲット遺伝子1の変異(又は一塩基多型)検出部位1aに相補するように設計されたヌクレオチド3aとが連結したものである。ここで、フラップ3bは、ヌクレオチド3aの5’末端側に連結されている。   The invader probe 2 has a base sequence complementary to the target gene 1 and is designed so that the base at the 3 ′ end corresponds to the mutation (or single nucleotide polymorphism) detection site 1a of the target gene 1 ( It is not a complementary base to any base). On the other hand, the allele oligo 3 has a base sequence complementary to the flap 3b, which is a base sequence irrelevant to the target gene 1, and a target gene 1, and the 5 ′ terminal base is a mutation (or one) of the target gene 1. Nucleotide polymorphism) A nucleotide 3a designed to complement the detection site 1a is linked. Here, the flap 3b is linked to the 5 'end of the nucleotide 3a.
このように設計されたインベーダープローブ2とアレルオリゴ3をターゲット遺伝子1とハイブリダイゼーションさせると、ターゲット遺伝子1に対してアレルオリゴ3とインベーダープローブ2が重なり合った構造をとりながらハイブリダイズし、変異検出部位1aにおいてインベーダープローブ2がアレルオリゴ3の下に1塩基のみ侵入する。すると、フラップエンドヌクレアーゼ(「クリアベース(cleavase)」ともいう)4がこの侵入構造を認識し、アレルオリゴ3を重なった塩基の3’側で切断する。その結果、フラップ3bと変異検出部位とが連結したフラップ遊離体3cが生成される。   When the invader probe 2 and the allele oligo 3 designed in this way are hybridized with the target gene 1, they hybridize with the target gene 1 while taking the structure in which the allele oligo 3 and the invader probe 2 overlap each other, and at the mutation detection site 1a. The invader probe 2 enters only one base under the allele oligo 3. Then, the flap endonuclease (also referred to as “cleavase”) 4 recognizes this invasion structure and cleaves the allele oligo 3 on the 3 ′ side of the overlapped base. As a result, a flap free body 3c in which the flap 3b and the mutation detection site are linked is generated.
フレットプローブ5は、5’末端側が自身とハイブリダイゼーションでき、かつ、3’末端側がフラップ3bとハイブリダイゼーションできるヌクレオチド5aと、蛍光色素5bと、クエンチャー(発光抑制体)5cとからなる。ここで、ヌクレオチド5aは、5’末端がフラップ遊離体3cと相補的な塩基配列となっている。また、蛍光色素5bは、ヌクレオチド5aの5’末端に結合している。ただし、フレットプローブ5においては、クエンチャー5cにより蛍光色素5bの蛍光が抑制されている。   The fret probe 5 is composed of a nucleotide 5a capable of hybridizing with itself on the 5 'end side and hybridizing with the flap 3b on the 3' end side, a fluorescent dye 5b, and a quencher (luminescence inhibitor) 5c. Here, nucleotide 5a has a base sequence complementary to flap free body 3c at the 5 'end. The fluorescent dye 5b is bonded to the 5 'end of the nucleotide 5a. However, in the fret probe 5, the fluorescence of the fluorescent dye 5b is suppressed by the quencher 5c.
このようなフレットプローブ5に対してフラップ遊離体3cがハイブリダイゼーションすると、フラップ遊離体3cの変異検出部位について、再び侵入構造が形成される。その結果、上述のフラップエンドヌクレアーゼ4がこの侵入構造を再び認識し、フレットプローブ5の5’末端部分が切断される。その結果、フレットプローブ5の5’末端に結合していた蛍光色素5bが遊離し、蛍光が生じる。   When the flap free body 3c hybridizes to such a fret probe 5, an invasion structure is formed again at the mutation detection site of the flap free body 3c. As a result, the above-described flap endonuclease 4 recognizes this invasion structure again, and the 5 'end portion of the fret probe 5 is cleaved. As a result, the fluorescent dye 5b bonded to the 5 'end of the fret probe 5 is released, and fluorescence is generated.
従って、妊孕性診断キットがインベーダー法により上記の置換変異の有無を検出するものである場合、妊孕性診断キットには、インベーダープローブ2、アレルオリゴ3及びフレットプローブ5などが含まれることが好ましい。   Therefore, when the fertility diagnostic kit detects the presence or absence of the above-described substitution mutation by the invader method, the fertility diagnostic kit preferably includes the invader probe 2, the allele oligo 3, the fret probe 5, and the like. .
置換変異が有る場合に蛍光が生じるようにする場合、インベーダープローブ2は、ヒトMeisetz遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、3’末端の塩基が変異型Meisetz遺伝子の上記の第1298位の塩基(T)又は第2054位の塩基(G)と対応するように設計される(相補的でない)。また、アレルオリゴ3のヌクレオチド3aは、ヒトMeisetz遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、5’末端の塩基が変異型Meisetz遺伝子の上記の第1298位の塩基(T)又は第2054位の塩基(G)と相補するように設計される。そして、フレットプローブ5は、上記インベーダープローブ2及び上記アレルオリゴ3が変異型Meisetz遺伝子とハイブリダイズしてインベーダープローブ2による侵入構造が形成された場合にフラップエンドヌクレアーゼ4によって切断されるフラップ遊離体3cを検出できるように設計される。   When fluorescence is generated when there is a substitution mutation, the invader probe 2 has a base sequence complementary to the human Meisetz gene, and the base at the 3 ′ end is the above-mentioned position 1298 of the mutant Meisetz gene. Of base (T) or 2054 base (G) (not complementary). Further, nucleotide 3a of allele oligo 3 has a base sequence complementary to the human Meisetz gene, and the base at the 5 ′ end is the base (T) at position 1298 or the position 2054 of the mutant Meisetz gene. Designed to complement the base (G). The fret probe 5 is a flap free body 3c that is cleaved by the flap endonuclease 4 when the invader probe 2 and the allele oligo 3 are hybridized with the mutant Meisetz gene to form an invasion structure by the invader probe 2. Designed to be detectable.
上記の構成により、被験者のMeisetz遺伝子の上記の第1298位又は第2054位の塩基が置換している場合は、ターゲット遺伝子にハイブリダイズしたヌクレオチド3aの5’末端にインベーダープローブ2の3’末端が侵入することにより、ヌクレオチド3cが切り出されて蛍光が生じる。一方、被験者のMeisetz遺伝子が野生型である場合は、インベーダープローブ2の末端部分による侵入構造が形成されないのでヌクレオチド3cが切り出されないため蛍光が生じない。   When the base at position 1298 or position 2054 of the Meisetz gene of the subject is substituted by the above configuration, the 3 ′ end of invader probe 2 is located at the 5 ′ end of nucleotide 3a hybridized to the target gene. By entering, nucleotide 3c is cut out and fluorescence is generated. On the other hand, when the subject's Meisetz gene is a wild type, no invasion structure is formed by the terminal portion of the invader probe 2, and therefore no nucleotide 3c is cut out, so that no fluorescence occurs.
また、上記の例では、被験者の有するMeisetz遺伝子が置換変異型の場合に蛍光が生じる構成としたが、本発明はこれに限定されず、被験者の有するMeisetz遺伝子が野生型の場合に蛍光が生じ、置換変異型の場合に蛍光が抑制される構成としてもよく、或いは野生型と変異型で異なった蛍光色素を使用するなど様々に改変することができる。   In the above example, the fluorescence occurs when the Meisetz gene possessed by the subject is a substitution mutation type. However, the present invention is not limited to this, and the fluorescence occurs when the Meisetz gene possessed by the subject is a wild type. In the case of the substitution mutant type, the fluorescence may be suppressed, or various modifications may be made such as using different fluorescent dyes for the wild type and the mutant type.
一実施形態において、上記検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトMeisetz遺伝子の上記変異検出部位における塩基の置換変異の有無をSMMD法によって検出するものであってもよい。SMMD法の詳細については、Wakaiらによる論文(Wakai J et al., Nucleic Acids Res., 2004. 32(18), e141.)に記載されており、本明細書ではこれを援用する。   In one embodiment, the detection method and fertility diagnostic kit may detect the presence or absence of a base substitution mutation at the mutation detection site of the human Meisetz gene by the SMMD method. Details of the SMMD method are described in a paper by Wakai et al. (Wakai J et al., Nucleic Acids Res., 2004. 32 (18), e141.), Which is incorporated herein by reference.
図3は、SMMD法の原理を説明する模式図である。なお、この図は、ヒトMeisetz遺伝子における変異のうち、上記の第1298位の塩基の置換変異の有無を検出する場合の例を示している。SMMD法は、電気化学的反応を利用して一塩基多型、置換変異、欠失変異、又は挿入変異などを検出するものである。まず、図3に示すように、被験者のゲノムDNA11を鋳型として変異検出部位を含む領域をPCRによって増幅させるため、カウンタープライマー13と特別プライマー12とを1:4の割合で用いて非対称PCRを行う(工程A)。ここで、特別プライマー12は、変異を検出したい遺伝子11の変異検出部位11aよりも下流の領域と相補的な塩基配列からなるオリゴマー12aと、タグ12bとからなる。タグ12bは、遺伝子11の変異検出部位11aよりも1塩基下流の塩基から、オリゴマー12aがハイブリダイゼーションする塩基よりも1塩基上流の塩基までの領域と相補的な塩基配列を有しており、オリゴマー12aの5’末端に連結されている。   FIG. 3 is a schematic diagram for explaining the principle of the SMMD method. In addition, this figure has shown the example in the case of detecting the presence or absence of said 1298th base substitution mutation among the variation | mutations in a human Meisetz gene. The SMMD method detects single nucleotide polymorphisms, substitution mutations, deletion mutations, or insertion mutations using an electrochemical reaction. First, as shown in FIG. 3, in order to amplify a region including a mutation detection site using genomic DNA 11 of a subject as a template by PCR, asymmetric PCR is performed using counter primer 13 and special primer 12 in a ratio of 1: 4. (Process A). Here, the special primer 12 includes an oligomer 12a having a base sequence complementary to a region downstream of the mutation detection site 11a of the gene 11 whose mutation is to be detected, and a tag 12b. The tag 12b has a base sequence complementary to the region from the base one base downstream of the mutation detection site 11a of the gene 11 to the base one base upstream of the base to which the oligomer 12a is hybridized. It is linked to the 5 'end of 12a.
上記の非対称PCRの結果、工程Bに示すPCR産物14が生成される(工程B)。このPCR産物14のうち、特別プライマー12を含む一本鎖の非対称PCR産物14は、タグ12bを含んでいるため、自己ループを形成して特別ターゲットを形成する(工程C・D)。   As a result of the asymmetric PCR, the PCR product 14 shown in Step B is generated (Step B). Among the PCR products 14, the single-stranded asymmetric PCR product 14 including the special primer 12 includes the tag 12b, and thus forms a self-loop to form a special target (steps C and D).
次に、変異型プローブ20及び野生型プローブ30を用意する。プローブ20・30は、ともに、変異を検出したい遺伝子11と同一の塩基配列を有し、かつ、変異検出部位11a・11bを3’末端とするオリゴマーをその5’末端側で金電極25に固定したものである。ここで、変異型プローブ20はオリゴマーの3’末端が変異型の塩基(C)となっているのに対して、野生型プローブ30はオリゴマーの3’末端が野生型の塩基(A)となっている。これらの変異型プローブ20及び野生型プローブ30は、オリゴマーが上述した特別ターゲット15の3’末端側と相補的な塩基配列を有しているため、特別ターゲット15とハイブリダイゼーションすることができる。なお、金電極25にオリゴマーを固定するための詳細な方法は、Takenakaらによる論文(Takenaka S et al., Anal Chem., 2000, 72, 1334-1341)に記載されており、本明細書ではこれを援用する。   Next, the mutant type probe 20 and the wild type probe 30 are prepared. The probes 20 and 30 both have the same base sequence as the gene 11 whose mutation is to be detected, and an oligomer having the mutation detection sites 11a and 11b as the 3 ′ end is fixed to the gold electrode 25 on the 5 ′ end side. It is a thing. Here, in the mutant probe 20, the 3 ′ end of the oligomer is a mutant base (C), whereas in the wild type probe 30, the 3 ′ end of the oligomer is a wild type base (A). ing. These mutant probe 20 and wild type probe 30 can hybridize with the special target 15 because the oligomer has a base sequence complementary to the 3 ′ end of the special target 15 described above. A detailed method for immobilizing the oligomer on the gold electrode 25 is described in a paper by Takenaka et al. (Takenaka S et al., Anal Chem., 2000, 72, 1334-1341). This is used.
プローブ20・30を特別ターゲット15とハイブリダイゼーションさせる前に、フェロセニルナフタレンジイミド(ferrocenylnaphtalene diimide;以下「FND」と略称する)を含む溶液中で、予めバックグラウンド応答を行い、電流Iを測定しておく(工程E)。 Before the probes 20 and 30 are hybridized with the special target 15, a background response is made in advance in a solution containing ferrocenylnaphthalene diimide (hereinafter abbreviated as “FND”), and the current I 0 is measured. (Step E).
そして、特別ターゲット15と変異型プローブ20及び野生型プローブ30とのハイブリダイゼーション及びライゲーションを行う。ここで、特別ターゲット15が変異型のものである場合(すなわち、被験者が変異型遺伝子を有している場合)、特別ターゲット15は変異型プローブ20と塩基配列が完全に一致するのでライゲーションが行われる一方で、野生型プローブ30とは塩基配列が末端部分で相違するのでライゲーションが行われない(工程F)。   Then, hybridization and ligation of the special target 15 with the mutant probe 20 and the wild type probe 30 are performed. Here, when the special target 15 is a mutant type (that is, when the subject has a mutant gene), the special target 15 is ligated because the nucleotide sequence is completely identical to the mutant probe 20. On the other hand, since the base sequence is different from that of the wild-type probe 30, the ligation is not performed (step F).
その後、変性処理を行うと、野生型プローブ30と変異型の特別ターゲット15との組では、野生型プローブ30から変異型特別ターゲット15が解離する。一方、変異型プローブ20と変異型の特別ターゲット15との組では、ライゲーションが行われているので、解離が起こらない(工程G)。   Thereafter, when a denaturation treatment is performed, the mutant special target 15 is dissociated from the wild type probe 30 in the combination of the wild type probe 30 and the mutant special target 15. On the other hand, in the set of the mutant probe 20 and the mutant special target 15, since ligation is performed, dissociation does not occur (step G).
そして、それぞれのサンプルを洗浄して余剰のDNAを除去し、FNDを添加して、FND分子の電気化学的電流I1を測定する(工程H)。ここで、2本鎖DNAを有する電極では、1本鎖DNAを有する電極に比べて電流I1が大きくなる(工程I)。   Then, each sample is washed to remove excess DNA, FND is added, and the electrochemical current I1 of the FND molecule is measured (step H). Here, in the electrode having the double-stranded DNA, the current I1 is larger than that of the electrode having the single-stranded DNA (Step I).
これにより、被験者のゲノムDNAが変異型であるか野生型であるかを測定した電流値に基づいて判定することができる。なお、SMMD法では、上記の変異型プローブ20及び野生型プローブ30をECA(Electrochemical array)チップとしてアレイ状に形成することにより、多数の変異を同時進行的に検出することができる。   Thereby, it can determine based on the electric current value which measured whether a test subject's genomic DNA was a mutant type or a wild type. In the SMMD method, a large number of mutations can be detected simultaneously by forming the mutant probe 20 and the wild-type probe 30 as an ECA (Electrochemical array) chip in an array.
従って、本発明に係る妊孕性診断キットがSMMD法により上記の置換変異の有無を検出するものである場合、妊孕性診断キットには、特別プライマー12、カウンタープライマー13、変異型プローブ20及び野生型プローブ30などが含まれていることが好ましい。なお、変異型プローブ20及び野生型プローブ30は、何れか一方のみでもよい。   Therefore, when the fertility diagnostic kit according to the present invention detects the presence or absence of the above substitution mutation by the SMMD method, the fertility diagnostic kit includes a special primer 12, a counter primer 13, a mutant probe 20, and It is preferable that the wild-type probe 30 and the like are included. Only one of the mutant probe 20 and the wild-type probe 30 may be used.
上記特別プライマー12は、ヒトMeisetz遺伝子の変異検出部位よりも下流の所定領域と相補的な塩基配列からなるオリゴマー12aと、タグ12bとからなる。タグ12bは、ヒトMeisetz遺伝子の変異検出部位から、オリゴマー12aがハイブリダイゼーションする部位までの領域と相補的な塩基配列を有しており、オリゴマー12aの5’末端に連結される。一方、上記カウンタープライマー13は、ヒトMeisetz遺伝子の変異検出部位よりも上流の所定領域と同一の塩基配列からなる。   The special primer 12 includes an oligomer 12a having a base sequence complementary to a predetermined region downstream from the mutation detection site of the human Meisetz gene, and a tag 12b. The tag 12b has a base sequence complementary to the region from the mutation detection site of the human Meisetz gene to the site where the oligomer 12a hybridizes, and is linked to the 5 'end of the oligomer 12a. On the other hand, the counter primer 13 has the same base sequence as the predetermined region upstream from the mutation detection site of the human Meisetz gene.
また、上記変異型プローブ20は、変異型ヒトMeisetz遺伝子と同一の塩基配列からなり、かつ、上記の第1298位の塩基(T)または第2054位の塩基(G)が3’末端になるオリゴマーを有するように設計される。また、上記野生型プローブ30は、野生型ヒトMeisetz遺伝子と同一の塩基配列からなり、かつ、上記の第1298位の塩基(G)または第2054位の塩基(C)が3’末端になるオリゴマーを有するように設計される。   The mutant probe 20 is an oligomer having the same base sequence as that of the mutant human Meisetz gene and having the base at position 1298 (T) or the base at position 2054 (G) as the 3 ′ end. Designed to have The wild-type probe 30 is an oligomer having the same base sequence as the wild-type human Meisetz gene and having the base at position 1298 (G) or the base at position 2054 (C) at the 3 ′ end. Designed to have
上記の構成によれば、被験者のMeisetz遺伝子が置換変異型の場合、特別ターゲット15は、変異型プローブ20とライゲーションできるが、野生型プローブ30とはライゲーションできない。一方、被験者のMeisetz遺伝子が野生型の場合、特別ターゲット15は、野生型プローブ30とライゲーションできるが、変異型プローブ20とはライゲーションできない。   According to the above configuration, when the subject's Meisetz gene is a substitution mutant type, the special target 15 can be ligated with the mutant probe 20 but cannot be ligated with the wild type probe 30. On the other hand, when the subject's Meisetz gene is wild-type, the special target 15 can be ligated with the wild-type probe 30, but cannot be ligated with the mutant-type probe 20.
なお、上記の各方法において、Meisetz遺伝子のセンス鎖(コドンをコードする側の鎖)を調べることによって置換変異の有無を判定する構成について詳細に説明したが、アンチセンス鎖を調べることによっても同様に判定することができるのはいうまでもない。   In each of the above methods, the configuration for determining the presence or absence of a substitution mutation by examining the sense strand of the Meisetz gene (codon-encoding side strand) has been described in detail, but the same applies by examining the antisense strand. Needless to say, it is possible to make a judgment.
次に、本発明に係るポリヌクレオチドについて説明する。本発明に係るポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第1位の塩基としたときに、野生型ヒトMeisetz遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第1298位の塩基がTに置換した塩基配列からなるものである。また、本発明に係る別のポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第1位の塩基としたときに、野生型ヒトMeisetz遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第2054位の塩基がGに置換した塩基配列からなるものである。また、本発明に係るさらに別のポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第1位の塩基としたときに、野生型ヒトMeisetz遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第1298位の塩基がTに置換し、さらに第2054位の塩基がGに置換した塩基配列からなるものである。   Next, the polynucleotide according to the present invention will be described. The polynucleotide according to the present invention is a base sequence in which the base at position 1298 is substituted with T in the base sequence of the translation region of the wild-type human Meisetz gene when adenine encoding the translation initiation codon is used as the base at position 1. It consists of Another polynucleotide according to the present invention is such that when adenine encoding a translation initiation codon is the first base, the base at position 2054 is G in the base sequence of the translation region of the wild-type human Meisetz gene. It consists of a substituted base sequence. Furthermore, in another polynucleotide according to the present invention, when the adenine encoding the translation initiation codon is the first base, the base at the 1298th position in the base sequence of the translation region of the wild-type human Meisetz gene is T And a base sequence in which the base at position 2054 is substituted with G.
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号5から7の何れかに示す塩基配列からなるものであってもよい。ただし、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号5から7の何れかに示す塩基配列のものに限定されない。本発明に係るポリヌクレオチドには、配列番号5から7の何れかに示される塩基配列のみならず、配列番号5から7の何れかに示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドからなり、かつ低妊孕性又は不妊症に関与するポリヌクレオチドも含まれ、特に、配列番号5から7の何れかに示される塩基配列において一塩基多型により1又は数個の塩基が置換された塩基配列のものも含まれる。   In one embodiment, the polynucleotide according to the present invention may consist of the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7. However, the polynucleotide according to the present invention is not limited to the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7. In the polynucleotide according to the present invention, not only the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7, but also one or several bases are deleted in the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7, A polynucleotide comprising a substituted or added polynucleotide and involved in hypofertility or infertility is also included. In particular, in the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7, 1 or Those having a base sequence in which several bases are substituted are also included.
ここで、数個とは、当業者に期待しうる程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなく当業者が作ることができる程度の数を意図し、例えば、20個以下が好ましく、より好ましくは10個以下、さらに好ましくは5個以下を意図する。   Here, the term “several” means a number that can be made by a person skilled in the art without performing trial and error or complicated advanced experiments exceeding the level that can be expected by those skilled in the art. More preferably, it is 10 or less, and more preferably 5 or less.
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」、または「核酸分子」と同義であり、ヌクレオチドの重合体を指す。本明細書において、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と同義であり、デオキシリボヌクレオチド(A、G、C及びTと省略される)の配列として示される。   As used herein, “polynucleotide” is synonymous with “gene”, “nucleic acid”, or “nucleic acid molecule” and refers to a polymer of nucleotides. In the present specification, “base sequence” is synonymous with “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence” and is shown as a sequence of deoxyribonucleotides (abbreviated as A, G, C, and T).
上記ポリヌクレオチドは、RNA(例えば、mRNA)の形態、DNAの形態(例えば、合成DNA、cDNAまたはゲノムDNA)の何れであってもよい。さらに、DNAの場合、二本鎖、一本鎖の何れであってもよい。さらに、一本鎖DNAまたはRNAは、コード鎖(センス鎖としても知られる)でもよいし、非コード鎖(アンチセンス鎖としても知られる)でもよい。   The polynucleotide may be in the form of RNA (for example, mRNA) or DNA (for example, synthetic DNA, cDNA, or genomic DNA). Furthermore, in the case of DNA, it may be either double-stranded or single-stranded. Furthermore, the single-stranded DNA or RNA may be a coding strand (also known as a sense strand) or a non-coding strand (also known as an antisense strand).
なお、上記ポリヌクレオチドは、その5’末端又は3’末端に、タグ標識(タグ配列又はマーカー配列)をコードするポリヌクレオチドが連結されていてもよい。   The polynucleotide may be linked to a polynucleotide encoding a tag label (tag sequence or marker sequence) at the 5 'end or 3' end.
上記ポリヌクレオチドを取得する方法としては、PCRを用いる方法が挙げられる。具体的には、変異型Meisetz遺伝子を有している人のゲノムDNAを鋳型としてPCRによって得ることもできるし、また、変異を入れたプライマーを用いてPCRを行うことにより、野生型Meisetz遺伝子から得ることもできる。   Examples of the method for obtaining the polynucleotide include a method using PCR. Specifically, it can be obtained by PCR using a genomic DNA of a person having a mutant Meisetz gene as a template, or by performing PCR using a primer with a mutation, from a wild-type Meisetz gene. It can also be obtained.
また、上記ポリヌクレオチドは、組換えベクターに挿入されていてもよい。この組換えベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであってもよいし、組換え発現に用いるベクターであってもよい。   In addition, the polynucleotide may be inserted into a recombinant vector. This recombinant vector may be a vector used for in vitro translation or a vector used for recombinant expression.
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択できる。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に上記ポリヌクレオチドから変異型ヒトMeisetzタンパク質を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと上記ポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。   The specific type of vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in a host cell can be appropriately selected. That is, according to the type of host cell, an appropriate promoter sequence is selected from the above polynucleotide to ensure expression of the mutant human Meisetz protein, and a vector incorporating this and the above polynucleotide in various plasmids is used as an expression vector. Use it.
上記発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に応じた発現制御領域(例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、及び/または複製起点等)を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター(例えば、trcプロモーター、tacプロモーター、lacプロモーター等)が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、PH05プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、trpC等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター(例えば、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター等)が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素及び/またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。   The expression vector contains an expression control region (for example, a promoter, an enhancer, a terminator, and / or an origin of replication) depending on the type of host to be introduced. Conventional promoters (eg, trc promoter, tac promoter, lac promoter, etc.) are used as promoters for bacterial expression vectors, and examples of yeast promoters include glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter, PH05 promoter, etc. Examples of the promoter for filamentous fungi include amylase and trpC. Examples of animal cell host promoters include viral promoters (eg, SV40 early promoter, SV40 late promoter, etc.). The expression vector can be prepared according to a conventional method using a restriction enzyme and / or ligase. Transformation of the host with the expression vector can also be performed according to conventional techniques.
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物等から慣用的な手法(例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等)に従って、変異型Meisetzタンパク質を回収・精製することができる。   A host transformed with the above expression vector is cultured, cultivated or bred, and then subjected to conventional techniques (eg, filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography) from the culture. Etc.), the mutant Meisetz protein can be recovered and purified.
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、上記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを昆虫で発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。   A method for introducing the expression vector into a host cell, that is, a transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, or a DEAE dextran method can be suitably used. . In addition, for example, when a polypeptide encoded by the polynucleotide is expressed in insects, an expression system using baculovirus may be used.
上記組換えベクターを使用すれば、上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入することができ、結果として当該生物または細胞中に変異型Meisetzタンパク質を発現させることができる。さらに、上記組換えベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、変異型Meisetzタンパク質を選択的に合成することができる。   If the above recombinant vector is used, the above polynucleotide can be introduced into an organism or cell, and as a result, the mutant Meisetz protein can be expressed in the organism or cell. Furthermore, when the above recombinant vector is used in a cell-free protein synthesis system, a mutant Meisetz protein can be selectively synthesized.
また、上述した組換えベクターを含み、かつ、上述した変異型Meisetzタンパク質を細胞に発現させるために用いられる発現キットの形態にしてもよい。   Moreover, you may make it the form of the expression kit used in order to make the cell express the mutant Meisetz protein mentioned above including the recombinant vector mentioned above.
上記発現キットには、上記の組換えベクター以外の他の試薬を含んでいてもよい。他の試薬としては、例えば、組換えベクターを宿主細胞に導入するための導入用試薬、その宿主細胞、組換えベクターが宿主細胞内に導入されているかどうかを検定するためのプローブ群などが挙げられるがこれに限定されない。つまり、変異型Meisetzタンパク質の発現実験を、確実かつ簡便にできるように支援する試薬であればどのようなものが含まれていてもよい。上記発現キットを用いることにより、目的の宿主細胞において、確実に、かつ簡便に、変異型Meisetzタンパク質を発現させることができる。   The expression kit may contain a reagent other than the above recombinant vector. Other reagents include, for example, an introduction reagent for introducing a recombinant vector into a host cell, the host cell, a probe group for testing whether the recombinant vector has been introduced into the host cell, and the like. However, it is not limited to this. That is, any reagent may be included as long as it supports a mutant Meisetz protein expression experiment in a reliable and simple manner. By using the above expression kit, the mutant Meisetz protein can be expressed reliably and simply in the target host cell.
また、本発明に係るポリペプチドは、上述したポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるものである。   The polypeptide according to the present invention consists of an amino acid sequence encoded by the above-described polynucleotide.
一実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号8から10の何れかに示すアミノ酸配列からなるものであってもよい。ただし、本発明に係るポリペプチドは、配列番号8から10の何れかに示すアミノ酸配列に限定されない。本発明に係るポリペプチドには、配列番号8から10の何れかに示されるアミノ酸配列のみならず、配列番号8から10の何れかに示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低妊孕性又は不妊症に関与するポリペプチドも含まれ、特に、配列番号8から10の何れかに示されるアミノ酸配列において一塩基多型により1又は複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列のものも含まれる。   In one embodiment, the polypeptide may consist of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 8 to 10. However, the polypeptide according to the present invention is not limited to the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 8 to 10. In the polypeptide according to the present invention, not only the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 8 to 10, but also one or several amino acids in the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 8 to 10 are deleted, A polypeptide comprising an amino acid sequence that has been substituted or added and that is involved in hypofertility or infertility is also included. In particular, in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 8 to 10, 1 or An amino acid sequence in which a plurality of amino acids are substituted is also included.
ここで、数個とは、当業者に期待しうる程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなく当業者が作ることができる程度の数を意図し、例えば、20個以下が好ましく、より好ましくは10個以下、さらに好ましくは5個以下を意図する。   Here, the term “several” means a number that can be made by a person skilled in the art without performing trial and error or complicated advanced experiments exceeding the level that can be expected by those skilled in the art. More preferably, it is 10 or less, and more preferably 5 or less.
本明細書において、「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と同義である。また、本発明に係るポリペプチドは、天然供給源より単離したものであっても、化学合成したものであってもよい。   In the present specification, “polypeptide” is synonymous with “peptide” or “protein”. The polypeptide according to the present invention may be isolated from a natural source or chemically synthesized.
「単離した」ポリペプチドとは、天然の環境から取り出されたポリペプチドを指す。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生ポリペプチドは、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドと同様に、単離されていると考えられる。本発明に係るポリペプチドは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドの利用方法に従って取得することができる。   An “isolated” polypeptide refers to a polypeptide that has been removed from its natural environment. For example, a recombinantly produced polypeptide expressed in a host cell is considered isolated, as are natural or recombinant polypeptides that have been substantially purified by any suitable technique. The polypeptide according to the present invention can be obtained according to the method for using the polynucleotide according to the present invention described above.
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、及び原核生物宿主または真核生物宿主(例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む)において組換え技術によって産生された産物を含む。なお、上記ポリペプチドは、組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、グリコシル化されたり、非グリコシル化されたりしたものであってもよい。さらに、上記ポリペプチドは、宿主媒介プロセスの結果として、翻訳開始を示すメチオニン残基が改変されたものであってもよい。   Polypeptides according to the present invention include natural purified products, products of chemical synthesis procedures, and prokaryotic or eukaryotic hosts (eg, bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insect cells, and mammalian cells). ) Including products produced by recombinant techniques. The polypeptide may be glycosylated or non-glycosylated depending on the host used in the recombinant production procedure. Furthermore, the polypeptide may have a modified methionine residue that indicates translation initiation as a result of a host-mediated process.
本発明に係るポリヌクレオチド、発現ベクター、又はポリペプチドによれば、ヒトの不妊症患者に見られる変異型Meisetzタンパク質が得られる。従って、これらの発明は、ヒトMeisetz遺伝子の第1298位及び第2054位の少なくとも一方の塩基の置換変異に起因する低妊孕性又は不妊症の治療を目的とした薬剤及び治療方法を開発する上で極めて有用なツールであり、研究現場へ販売することができる。また、これらをキット化することにより、産業上の利用可能性が一層向上する。   According to the polynucleotide, expression vector, or polypeptide of the present invention, a mutant Meisetz protein found in human infertility patients can be obtained. Therefore, these inventions are intended to develop a drug and a therapeutic method for the treatment of hypofertility or infertility resulting from a substitution mutation of at least one base at positions 1298 and 2054 of the human Meisetz gene. It is a very useful tool and can be sold to research sites. Moreover, industrial applicability improves further by making these into kits.
本発明に係る検出方法及び妊孕性診断キットの変形例として、タンパク質レベルでも遺伝子レベルと同様に妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を行うことは可能である。   As a modification of the detection method and fertility diagnostic kit according to the present invention, it is possible to estimate fertility and identify the cause of infertility at the protein level as well as the gene level.
すなわち、一実施形態において、本発明に係る検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトにおいて正常なヒトMeisetz蛋白質が発現しているか否かを判定するものであってもよい。より具体的には、上記検出方法は、ヒトMeisetzタンパク質と結合する抗ヒトMeisetz抗体を用いて、ヒトから採取された生体サンプル中にヒトMeisetzタンパク質が発現しているか否かを判定する工程を含んでいてもよい。また、上記妊孕性診断キットは、試薬として抗ヒトMeisetz抗体を含んでいてよい。   That is, in one embodiment, the detection method and fertility diagnostic kit according to the present invention may determine whether normal human Meisetz protein is expressed in humans. More specifically, the detection method includes a step of determining whether or not the human Meisetz protein is expressed in a biological sample collected from a human using an anti-human Meisetz antibody that binds to the human Meisetz protein. You may go out. The fertility diagnostic kit may contain an anti-human Meisetz antibody as a reagent.
上記検出方法及び妊孕性診断キットにおいて、抗Meisetz抗体を用いてヒトMeisetzタンパク質の発現の有無を判定する手法は特に限定されず、公知のウェスタンブロッティング及びELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)などが挙げられる。また、ヒトから採取する生体サンプルとしては、精巣生検によって被験者から採取した精巣内の組織(例えば精細管)、精子細胞または精漿などが挙げられる。精漿は、たとえ精子細胞を含んでいなくても、精子細胞が破壊などされることにより放出された、精子細胞で発現するタンパク質を含んでいると考えられている。また、抗ヒトMeisetz抗体としては、例えば上述したポリペプチドを抗原としてポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を作製することができる。   In the detection method and fertility diagnostic kit, the method for determining the presence or absence of human Meisetz protein expression using an anti-Meisetz antibody is not particularly limited, and examples include known Western blotting and ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). It is done. Examples of biological samples collected from humans include testicular tissue (eg, seminiferous tubules), sperm cells, or seminal plasma collected from a subject by testicular biopsy. The seminal plasma is considered to contain a protein expressed in the sperm cell, which is released when the sperm cell is destroyed, even if it does not contain the sperm cell. Moreover, as an anti-human Meisetz antibody, for example, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be prepared using the above-mentioned polypeptide as an antigen.
妊孕性診断キットがウェスタンブロッティングまたはELISAを利用するものである場合、妊孕性診断キットには、抗Meisetz抗体に加え、発色反応に必要なペルオキシダーゼなどの特異的酵素で標識した抗グロブリン抗体が含まれていてもよい。   When the fertility diagnostic kit uses Western blotting or ELISA, the fertility diagnostic kit includes an anti-globulin antibody labeled with a specific enzyme such as peroxidase necessary for the color reaction in addition to the anti-Meisetz antibody. It may be included.
抗Meisetz抗体を用いてヒトMeisetzタンパク質が発現しているか否かを調べ、被験者においてヒトMeisetzタンパク質が発現していないと判定された場合は、ヒトMeisetz遺伝子が欠失または変異していることが示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合には、不妊症の原因が正常なヒトMeisetzタンパク質が発現していないことによるものと推定することができる。   Check whether human Meisetz protein is expressed using anti-Meisetz antibody, and if it is determined that human Meisetz protein is not expressed in the subject, it suggests that human Meisetz gene is deleted or mutated At the same time, it can be estimated that the subject has a low possibility of fertility or a high possibility of infertility. Moreover, when a test subject is infertile, it can be estimated that the cause of infertility is due to the fact that normal human Meisetz protein is not expressed.
また、他の実施形態において、本発明に係る検出方法及び妊孕性診断キットは、上述した第1298位及び第2054位のうち少なくとも一方の塩基置換を含む変異型ヒトMeisetz遺伝子によってコードされる変異型ヒトMeisetzタンパク質と結合し、かつ、野生型ヒトMeisetzタンパク質と結合しない抗体を用いて、ヒトから採取された生体サンプル中に変異型ヒトMeisetzタンパク質が発現しているかを判定するものであってもよい。この場合に用いられる抗体の詳細については後述する。   In another embodiment, the detection method and fertility diagnostic kit according to the present invention include a mutation encoded by a mutant human Meisetz gene containing at least one base substitution of positions 1298 and 2054 described above. Even if it is used to determine whether a mutant human Meisetz protein is expressed in a biological sample collected from a human using an antibody that binds to a human human Meisetz protein and does not bind to a wild-type human Meisetz protein Good. Details of the antibody used in this case will be described later.
上記抗体を用いて変異型ヒトMeisetzタンパク質が発現しているか否かを調べ、被験者において変異型ヒトMeisetzタンパク質が発現されていると判定された場合は、ヒトMeisetz遺伝子に上述した置換変異が生じていることが強く示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合、は、不妊症の原因がヒトMeisetz遺伝子の異常に起因していると推定することができる。   The above antibody is used to examine whether or not the mutant human Meisetz protein is expressed. When it is determined that the mutant human Meisetz protein is expressed in the subject, the above-described substitution mutation occurs in the human Meisetz gene. At the same time, it can be estimated that the subject is less likely to be fertile or likely to be infertile. Moreover, when a test subject is infertile, it can be estimated that the cause of infertility originates in abnormality of a human Meisetz gene.
本発明に係る抗体は、変異型ヒトMeisetzポリペプチド(すなわち上述した本発明に係るポリペプチド)と結合し、かつ、野生型Meisetzポリペプチドと結合しないものである。本発明に係る抗体を用いれば、上述したように、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定をタンパク質レベルで検出することができる。   The antibody according to the present invention binds to a mutant human Meisetz polypeptide (that is, the above-mentioned polypeptide according to the present invention) and does not bind to a wild-type Meisetz polypeptide. By using the antibody according to the present invention, as described above, estimation of fertility and identification of the cause of infertility can be detected at the protein level.
一実施形態において、本発明に係る抗体は、配列番号5から7の何れかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと特異的に結合するものであることが望ましい。換言すれば、本発明に係る抗体は、配列番号8から10の何れかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合するものであることが好ましい。   In one embodiment, it is desirable that the antibody according to the present invention specifically binds to a polypeptide encoded by a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7. In other words, the antibody according to the present invention preferably binds specifically to a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 8 to 10.
本発明に係る抗体は、上述したアミノ酸の置換変異を含む変異型ヒトMeisetzポリペプチドまたは変異部分を含むそのフラグメントを抗原として実験動物を免疫処置することができる。たとえば、Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914; 及びBittle, F. J. et al., J. Gen. Virol. 66: 2347-2354n (1985)を参照のこと。   The antibody according to the present invention can immunize experimental animals using the above-mentioned mutant human Meisetz polypeptide containing amino acid substitution mutations or a fragment thereof containing a mutation part as an antigen. See, for example, Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914; and Bittle, FJ et al., J. Gen. Virol. 66: 2347-2354n (1985). thing.
一般的には、動物は遊離ペプチドによって免疫化することができる。ただし、遊離ペプチドを高分子キャリア(たとえば、ヒーホールリンペットヘモシアニン(KLH)または破傷風トキシド)にカップリングすることによって効率的に免疫化できるようになる場合もある。たとえば、システインを含有するペプチドは、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)のようなリンカーによってキャリアにカップリングすることができる。一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングすることができる。   In general, animals can be immunized with free peptides. However, it may be possible to efficiently immunize by coupling the free peptide to a macromolecular carrier (eg, heal limpet hemocyanin (KLH) or tetanus toxide). For example, a peptide containing cysteine can be coupled to a carrier by a linker such as m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS). On the other hand, other peptides can be coupled to the carrier using more common linking agents such as glutaraldehyde.
ウサギ、ラット及びマウスのような動物は、遊離ペプチドまたはキャリア−カップリングペプチドと、Freundのアジュバントとを含むエマルジョンを腹腔内及び/または皮内に注射することにより免疫化することができる。ELISAにより検出できる程度に有用な力価の抗ペプチド抗体を得るためには、約2週間の間隔で追加免疫注射を行うことが望ましい。   Animals such as rabbits, rats and mice can be immunized by intraperitoneal and / or intradermal injection of an emulsion containing free peptide or carrier-coupled peptide and Freund's adjuvant. In order to obtain an anti-peptide antibody with a useful titer that can be detected by ELISA, booster injections are preferably performed at intervals of about 2 weeks.
そして、免疫化された動物から血液を採取し、血清からIgG画分を抽出することにより抗体を得ることができる。また、抗体を公知の技術によって精製することにより、抗体の力価が向上する。   The antibody can be obtained by collecting blood from the immunized animal and extracting the IgG fraction from the serum. Further, the antibody titer is improved by purifying the antibody by a known technique.
本発明に係る抗体は、上述した変異型ヒトMeisetzポリペプチドに結合する一方で、野生型ヒトMeisetzポリペプチドには結合しないものである。それゆえ、上記の手順によって得られた抗体のうち、野生型ヒトMeisetzタンパク質と結合しないものを選出することによって、本発明に係る抗体を得ることができる。上記の選出を容易にするためには、動物に注射する抗原ペプチドとして、変異型ヒトMeisetzポリペプチドの変異部分とその周辺のアミノ酸配列からなる10残基程度のオリゴペプチドを選択することが望ましい。   The antibody according to the present invention binds to the mutant human Meisetz polypeptide described above, but does not bind to the wild-type human Meisetz polypeptide. Therefore, the antibody according to the present invention can be obtained by selecting antibodies that do not bind to the wild-type human Meisetz protein from the antibodies obtained by the above procedure. In order to facilitate the above selection, it is desirable to select an oligopeptide having about 10 residues consisting of the mutant portion of the mutant human Meisetz polypeptide and the surrounding amino acid sequence as the antigenic peptide to be injected into the animal.
以下では、本発明の別の実施例について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本実施例では、ヒトMeisetz遺伝子における置換変異の解析を行った。なお、以下の各工程では、特に断りがない限り、常法又はキットに添付されている取扱説明書に従って各処理を行った。   Hereinafter, another embodiment of the present invention will be described, but the present invention is not limited thereto. In this example, substitution mutations in the human Meisetz gene were analyzed. In each of the following steps, each treatment was performed according to a conventional method or an instruction manual attached to the kit unless otherwise specified.
〔参加者〕
不妊症の日本人男性被験者(N=198以上)を精子形成の欠損の程度に基づいてサブグループに分割した。これらの不妊症被験者のうち、約4割は非閉塞性無精子症であり、残り6割は重症精子過少症(<5×10細胞/mL)であった。遺伝的要因を調べたところ、これらの被験者は何れも原発性特発性不妊症であった(Birmingham A et al. Fertil Steril 2004; 9: 2313-2317)。
〔participant〕
Infertile Japanese male subjects (N = 198 or more) were divided into subgroups based on the degree of spermatogenesis deficiency. Of these infertile subjects, approximately 40% had non-occlusive azoospermia and the remaining 60% had severe sperm deficiency (<5 × 10 6 cells / mL). When examined for genetic factors, all of these subjects had primary idiopathic infertility (Birmingham A et al. Fertil Steril 2004; 9: 2313-2317).
一方、妊孕性が確認された男性のコントロールグループ(N=161以上)として、産婦人科医院にいる妊婦のもとに生まれた子供の父親を選択した。   On the other hand, as a control group (N = 161 or more) of men whose fertility was confirmed, a father of a child born under a pregnant woman in an obstetrics and gynecology clinic was selected.
なお、ドナーは、本研究において血液をゲノムDNAの解析に使用することに同意した。   The donor agreed to use blood for analysis of genomic DNA in this study.
〔PCR増幅DNAのダイレクトシーケンシングによるMeisetz遺伝子の変異の同定〕
以下の各工程では、特に断りがない限り、常法又はキットに添付されている取扱説明書に従って処理を行った。ゲノムDNAは、プロテアーゼ処理及びフェノール抽出により血液サンプルから単離した(Sambrook J et al., Isolation of DNA from Mammalian Cells. New York: Cold Spring Harbor Press. 1989: pp. 9.16-9.21)。また、Meisetz遺伝子の第10エクソンを含む領域を増幅させるために、PCRに用いるプライマーの組として、Meisetz−P7及びMeisetz−P8Rを設計した(図1参照)。Meisetz−P7は、図1に示すように、Meisetz遺伝子の第10エクソンの上流領域と同一の塩基配列(配列番号3:5’−GGACTGTAAAGGTCCATCCAGCACTTGG−3’)からなる。また、Meisetz−P8Rは、Meisetz遺伝子の第10エクソンの下流領域と相補的な塩基配列(配列番号4:5’−AAAGAACCACACATGCTGATGTCC−3’)からなる。
[Identification of mutations in the Meisetz gene by direct sequencing of PCR-amplified DNA]
In each of the following steps, unless otherwise specified, the treatment was performed according to a conventional method or an instruction manual attached to the kit. Genomic DNA was isolated from blood samples by protease treatment and phenol extraction (Sambrook J et al., Isolation of DNA from Mammalian Cells. New York: Cold Spring Harbor Press. 1989: pp. 9.16-9.21). In addition, in order to amplify the region containing exon 10 of the Meisetz gene, Meisetz-P7 and Meisetz-P8R were designed as primer sets used for PCR (see FIG. 1). As shown in FIG. 1, Meisetz-P7 consists of the same base sequence (SEQ ID NO: 3: 5′-GGACTGTAAAGGTCCATCCAGCACTTGG-3 ′) as the upstream region of the 10th exon of the Meisetz gene. In addition, Meisetz-P8R is composed of a base sequence (SEQ ID NO: 5′-AAAGAACCACACATGCTGATGTCC-3 ′) complementary to the downstream region of exon 10 of the Meisetz gene.
PCRは以下の条件で行った:96℃で30秒間変性、68℃で30秒間アニーリング、及び72℃で180秒間伸長を1サイクルとして、これを40サイクル。PCR増幅フラグメントはAMPure(Agencourt)にて精製した。   PCR was performed under the following conditions: one cycle of denaturation at 96 ° C. for 30 seconds, annealing at 68 ° C. for 30 seconds, and extension at 72 ° C. for 180 seconds, for 40 cycles. The PCR amplified fragment was purified with AMPure (Agencourt).
Meisetz−P7及びMeisetz−P8Rからなるプライマーの組によって増幅したフラグメントについて、同じMeisetz−P7―2(配列番号11:5’−CATACCTTCATATGTGGTAAGGCC−3’)、Meisetz−P8R2(配列番号12:5’−TATAAGGGGTCAGCAGACTTCCGC−3’)及びMeisetz−S(配列番号13:5’−AAAGTCAAGTATGGAGAGTGTGG−3’)、のそれぞれを用いてシーケンシングを行った。このとき、サーマルサイクルシーケンシングキット(アプライドバイオシステムズ)を用いて反応を行い、CleanSEQ(Agencourt)にて精製した反応産物をABI−PRISM 3100 Genetic Analyzer(アプライドバイオシステムズ)によって解析した。両方向の決定結果を比較し、塩基配列を決定した。   The same Meisetz-P7-2 (SEQ ID NO: 11: 5′-CATACCTTCATATGTGGTAAGGCC-3 ′), Meisetz-P8R2 (SEQ ID NO: 12: 5′-TATAAGGGGTCAGCAGACTTCCGC) -3 ′) and Meisetz-S (SEQ ID NO: 13: 5′-AAAGTCAAGTATGGAGAGTGTGG-3 ′) were used for sequencing. At this time, the reaction was carried out using a thermal cycle sequencing kit (Applied Biosystems), and the reaction product purified by CleanSEQ (Agencourt) was analyzed by ABI-PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). The base sequence was determined by comparing the determination results in both directions.
〔結果〕
不妊症被験者及び妊孕性確認被験者のそれぞれについてMeisetz遺伝子の第10エクソンの塩基配列を解析したところ、Meisetz遺伝子の翻訳領域の第1298位のグリシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者198人
の中に1人見出された。この被験者は、無精子症であった。一方、妊孕性確認被験者からは、この置換変異が全く見出されなかった。
〔result〕
Analysis of the base sequence of the 10th exon of the Meisetz gene for each of the infertile subject and the fertility confirmed subject revealed that the subject in which the glycine at position 1298 in the translation region of the Meisetz gene was replaced with thymine in one allele. One of 198 infertility subjects was found. This subject had azoospermia. On the other hand, this substitution mutation was not found at all in fertile confirmed subjects.
さらに、Meisetz遺伝子の翻訳領域の第2054位のシトシンが片方のアレルにおいてグアニンに置換している被験者が、不妊症被験者198人の中に1人見出された。この被験者は、高度乏精子症であった。一方、妊孕性確認被験者からは、この置換変異が全く見出されなかった。   Furthermore, one subject in 198 infertile subjects was found in which cytosine at position 2054 in the translation region of the Meisetz gene was substituted with guanine in one allele. This subject had severe oligospermia. On the other hand, this substitution mutation was not found at all in fertile confirmed subjects.
配列番号1に示すヒトMeisetz遺伝子の翻訳領域の第1298位のグリシン塩基がチミン塩基に置換すると、この部位がバリンをコードするようになる。また、2054位のシトシン塩基がグアニン塩基に置換すると、この部位がアルギニンをコードするようになる。   When the glycine base at position 1298 in the translation region of the human Meisetz gene shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with a thymine base, this site encodes valine. In addition, when the cytosine base at position 2054 is replaced with a guanine base, this site encodes arginine.
Meisetz遺伝子は哺乳類に広く保存されていること、並びに、そのタンパク質が精巣の半数体生殖細胞に特に強く発現することから、Meisetzタンパク質の変異は、男性不妊を引き起こす(或いは引き起こしやすい)と考えられる。上記の置換変異が見出された被験者は、正常なMeisetzZタンパク質の翻訳量が低減したことにより、或いは、変異型Meisetzタンパク質がドミナントネガティブに作用することにより、Meisetzタンパク質の働きが不十分になって不妊症になったものと推測された。   Because the Meisetz gene is widely conserved in mammals and the protein is particularly strongly expressed in testicular haploid germ cells, mutations in the Meisetz protein are thought to cause (or are likely to cause) male infertility. A subject who has found the above-mentioned substitution mutation has a function of the Meisetz protein that is insufficient due to a decrease in the translation amount of the normal Meisetz Z protein, or because the mutant Meisetz protein acts in a dominant negative manner. Presumed to have been infertile.
なお、本研究により、上記の置換変異以外にも一塩基多型がMeisetz遺伝子内に見出されたが、これらの一塩基多型は、そのパターンが不妊症被験者と妊孕性確認被験者との間で有意な相違を見せず、特に妊孕性に影響を与えるものとは認められなかった。   In this study, single nucleotide polymorphisms were found in the Meisetz gene in addition to the substitution mutations described above, but these single nucleotide polymorphisms were observed in patterns of infertility and fertility confirmed subjects. There was no significant difference between the two, and it was not found to affect fertility in particular.
本発明は上述した実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。   The present invention is not limited to the embodiments and examples described above, and various modifications are possible within the scope of the claims. That is, embodiments obtained by combining technical means appropriately modified within the scope of the claims are also included in the technical scope of the present invention.
本発明によれば、不妊症の現象解明や治療法の確立並びに不妊症の診断に有用なツールが提供されるので、製薬分野や医療分野において本発明を好適に利用することができる。   According to the present invention, a tool useful for elucidating the phenomenon of infertility, establishing a treatment method, and diagnosing infertility is provided. Therefore, the present invention can be suitably used in the pharmaceutical field and the medical field.
ヒトMeisetz遺伝子の構造を示す物理地図である。It is a physical map which shows the structure of a human Meisetz gene. インベーダー法の原理を説明する図である。It is a figure explaining the principle of an invader method. SMMD法の原理を説明する図である。It is a figure explaining the principle of SMMD method.
符号の説明Explanation of symbols
1 ターゲット遺伝子
1a 変異検出部位
2 インベーダープローブ
3 アレルオリゴ
3a ヌクレオチド
3b フラップ
3c フラップ遊離体
4 フラップエンドヌクレアーゼ
5 フレットプローブ
5a ヌクレオチド
5b 蛍光色素
5c クエンチャー
11 遺伝子
11a・11b 変異検出部位
12 特別プライマー
12a オリゴマー
12b タグ
13 カウンタープライマー
14 PCR産物
15 特別ターゲット
20 変異型プローブ
25 金電極
30 野生型プローブ
1 target gene 1a mutation detection site 2 invader probe 3 allele oligo 3a nucleotide 3b flap 3c flap free body 4 flap endonuclease 5 fret probe 5a nucleotide 5b fluorescent dye 5c quencher 11 gene 11a / 11b mutation detection site 12 special primer 12a oligomer 12b tag 13 Counter primer 14 PCR product 15 Special target 20 Mutant probe 25 Gold electrode 30 Wild type probe

Claims (16)

  1. 配列番号1に示される塩基配列の第1298位および第2054位に対応する塩基の少なくとも一方が野生型ヒトMeisetz遺伝子から変異していることを特徴とするポリヌクレオチド。   A polynucleotide, wherein at least one of bases corresponding to positions 1298 and 2054 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is mutated from a wild-type human Meisetz gene.
  2. 配列番号1に示される塩基配列の第1298位に対応する塩基の変異がG−T変異であることを特徴とする請求項1に記載のポリヌクレオチド。   The polynucleotide according to claim 1, wherein the base mutation corresponding to position 1298 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a GT mutation.
  3. 配列番号1に示される塩基配列の第2054位に対応する塩基の変異がC−G変異であることを特徴とする請求項1に記載のポリヌクレオチド。   The polynucleotide according to claim 1, wherein the base mutation corresponding to position 2054 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a CG mutation.
  4. 配列番号5〜7のいずれか1つに示される塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。   A polynucleotide comprising the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 5 to 7.
  5. 配列番号2に示されるアミノ酸配列の第433位および第685位に対応するアミノ酸の少なくとも一方が野生型ヒトMeisetzタンパク質から変異していることを特徴とするポリペプチド。   A polypeptide characterized in that at least one of amino acids corresponding to positions 433 and 685 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is mutated from a wild-type human Meisetz protein.
  6. 配列番号2に示されるアミノ酸配列の第433位に対応するアミノ酸の変異がG−V変異であることを特徴とする請求項5に記載のポリペプチド。   The polypeptide according to claim 5, wherein the amino acid mutation corresponding to position 433 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a GV mutation.
  7. 配列番号2に示されるアミノ酸配列の第685位に対応するアミノ酸の変異がT−R変異であることを特徴とする請求項5に記載のポリペプチド。   The polypeptide according to claim 5, wherein the amino acid mutation corresponding to position 685 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a T-R mutation.
  8. 配列番号8〜10のいずれか1つに示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。   A polypeptide comprising the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 8 to 10.
  9. 請求項5〜8の何れか1項に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。   A polynucleotide encoding the polypeptide according to any one of claims 5 to 8.
  10. 請求項1〜4の何れか1項に記載のポリヌクレオチドによってコードされることを特徴とするポリペプチド。   A polypeptide encoded by the polynucleotide according to any one of claims 1 to 4.
  11. 配列番号1に示される塩基配列の第1298位および第2054位に対応する塩基の少なくとも一方が野生型ヒトMeisetz遺伝子から変異しているポリヌクレオチドの存在の有無を検出する試薬。   A reagent for detecting the presence or absence of a polynucleotide in which at least one of bases corresponding to positions 1298 and 2054 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is mutated from a wild-type human Meisetz gene.
  12. 請求項11に記載の試薬を含んでいることを特徴とする妊孕性診断キット。   A fertility diagnostic kit comprising the reagent according to claim 11.
  13. ヒトから採取された生体サンプルにおける、配列番号1に示される塩基配列の第1298位および第2054位に対応する塩基の少なくとも一方が野生型ヒトMeisetz遺伝子から変異しているポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含んでいることを特徴とする妊孕性診断方法。   Detection of the presence of a polynucleotide in which at least one of bases corresponding to positions 1298 and 2054 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is mutated from the wild-type human Meisetz gene in a biological sample collected from humans A method for diagnosing fertility, comprising a step.
  14. 配列番号2に示されるアミノ酸配列の第433位および第685位に対応するアミノ酸の少なくとも一方が野生型ヒトMeisetzポリペプチドから変異している変異型ヒトMeisetzポリペプチドと結合し、かつ、野生型ヒトMeisetzポリペプチドと結合しないことを特徴とする抗体。   Binds to a mutated human Meisetz polypeptide in which at least one of the amino acids corresponding to positions 433 and 685 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is mutated from the wild type human Meisetz polypeptide, and An antibody characterized in that it does not bind to a Meisetz polypeptide.
  15. 請求項14に記載の抗体を含んでいることを特徴とする妊孕性診断キット。   A fertility diagnostic kit comprising the antibody according to claim 14.
  16. ヒトから採取された生体サンプルにおける、配列番号2に示されるアミノ酸配列の第433位および第685位に対応するアミノ酸の少なくとも一方が野生型ヒトMeisetzポリペプチドから変異している変異型ヒトMeisetzポリペプチドの存在を、請求項14に記載の抗体によって検出する工程を含んでいることを特徴とする妊孕性診断方法。   A mutant human Meisetz polypeptide in which at least one of the amino acids corresponding to positions 433 and 685 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in a biological sample collected from human is mutated from a wild-type human Meisetz polypeptide 15. A method for diagnosing fertility, which comprises the step of detecting the presence of the antibody by the antibody according to claim 14.
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