JP2008222502A - Composite particle with high dispersibility inhibiting nonspecific adsorption, composite particle colloid, analysis reagent using the same, particle surface modification method and method for manufacturing composite particle - Google Patents

Composite particle with high dispersibility inhibiting nonspecific adsorption, composite particle colloid, analysis reagent using the same, particle surface modification method and method for manufacturing composite particle Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide composite particles and a composite particle colloid that prevents nonspecific adsorption except for intended adsorption upon specifically coupling biomolecules, shows high dispersibility and allows introduction of functional groups for coupling biomolecules, to provide a method for manufacturing the above particles and the colloid, and to provide an analysis reagent having excellent reproducibility of measurement results, high reliability and a high signal-noise ratio. <P>SOLUTION: The composite particles comprise silica particles and organic molecules, in which the organic molecules are adsorbed by electrostatic attractive force to the surfaces of the silica particles. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、有機分子を粒子表面に静電的引力により吸着させてなる、分散性が高い複合粒子、複合粒子コロイド、それを用いた分析試薬、粒子表面修飾方法、及び複合粒子の製造方法に関する。さらに、本発明は、生体分子を特異的に結合させる場合に、意図する以外の非特異的吸着の発生を防止した複合粒子、複合粒子コロイド、それを用いた分析試薬、粒子表面修飾方法、及び複合粒子の製造方法に関する。   The present invention relates to highly dispersible composite particles, composite particle colloids, analytical reagents using the same, particle surface modification methods, and composite particle production methods, in which organic molecules are adsorbed onto the particle surfaces by electrostatic attraction. . Furthermore, the present invention provides composite particles, composite particle colloids, analytical reagents using the same, particle surface modification methods using the same, which prevent the occurrence of nonspecific adsorption other than intended when biomolecules are specifically bound. The present invention relates to a method for producing composite particles.

近年、数nm〜1μm程度の微粒子が様々な分野に応用され、注目を集めている。例えば、吸着剤、触媒などに用いられる、多孔質シリカ粒子やゼオライト粒子、顔料に用いられるカーボンブラック、金属酸化物粒子、無機化合物粒子、導電材料に使われる金属ナノ粒子、樹脂の補強剤に使われるシリカ粒子など粒子の材質および用途は多岐にわたる。また、半導体ナノ粒子や、蛍光物質を封入したシリカ粒子は、特にバイオ分野において、新たな蛍光標識剤として、蛍光試薬への応用が期待されている。
蛍光試薬は、蛍光粒子表面にタンパク質や、DNAが結合したものであり、このタンパク質やDNAが特定の生体分子と相互作用することによって、生体分子の検出、定量、染色等に利用されるものである。半導体ナノ粒子や蛍光シリカ粒子などの蛍光粒子は高輝度かつ高い光安定性を有するため、蛍光粒子を用いた蛍光試薬の開発が注目を集めている。
蛍光粒子を蛍光試薬として用いるためには、下記の課題を満足する表面修飾が必要である。
(1)生体分子を結合するための官能基の導入
(2)緩衝液中での分散安定化
(3)非特異的吸着防止
以下、上記(1)〜(3)それぞれの課題について具体的に述べる。
(1)生体分子を結合するための官能基の導入
シリカ粒子と生体分子を一体化し安定に機能させるためには、シリカ粒子と生体分子を不可逆的に結合させることが必要である。そのためにはイオン結合や物理化学的吸着ではなく、シリカ粒子と生体分子を共有結合させることが必要である。
タンパク質は、アミノ基、カルボキシル基、チオール基等を有する。また、DNAについても、末端修飾によってアミノ基やチオール基を付与することが出来る。よってシリカ粒子にもアミノ基、カルボキシル基、チオール基等を導入すれば、架橋剤や縮合剤を用いて、シリカ粒子と生体分子を共有結合させることが可能である。
(2)緩衝液中での分散安定化
粒子の凝集・分散に働く引力と斥力をモデル化して表現したものとして、DLVO理論が知られている。これは粒子間の静電的反発力とファンデルワールス力で、粒子の凝集・分散を説明するものである(例えば、非特許文献1参照。)。
生体分子は、生理食塩水等のイオン濃度が高い水溶液中で用いられることが多い。イオン濃度が高い水溶液中では、遮蔽効果によってイオンがシリカ粒子の静電的反発力を弱めるため、粒子の凝集が起こりやすくなる。イオン濃度が高い水溶液中でも粒子が安定に分散するためには、静電的反発力以外の反発力を付与することが必要である。
静電的反発力以外に粒子間の斥力として働くものとして、立体反発力がある。これは、自由度をもった分子の鎖が互いに反発することにより、粒子間の斥力として働くものである。従って、粒子表面に自由度の高い分子鎖を導入することにより、粒子の分散性を向上させることができる。
(3)非特異的吸着防止
蛍光粒子が蛍光試薬として機能するためには、蛍光粒子に結合した生体分子がターゲットに対して特異的結合等により選択的に結合することが必要である。ターゲット以外の生体分子に非特異的に結合したり、基板に吸着が起きると、それだけ測定の感度や正確性、信頼性が低下することになる。
非特異的吸着を低減させるためには、分散性向上と同様に、立体反発力の付与が必要である。
In recent years, fine particles of about several nm to 1 μm have been applied to various fields and attracted attention. For example, porous silica particles and zeolite particles used for adsorbents and catalysts, carbon black used for pigments, metal oxide particles, inorganic compound particles, metal nanoparticles used for conductive materials, and resin reinforcing agents. There are a wide variety of materials and applications of particles such as silica particles. Further, semiconductor nanoparticles and silica particles encapsulating a fluorescent substance are expected to be applied to fluorescent reagents as new fluorescent labeling agents, particularly in the bio field.
A fluorescent reagent is a protein or DNA bound to the surface of a fluorescent particle, and is used for detection, quantification, staining, etc. of a biomolecule by interacting with the specific biomolecule. is there. Since fluorescent particles such as semiconductor nanoparticles and fluorescent silica particles have high brightness and high light stability, the development of fluorescent reagents using fluorescent particles has attracted attention.
In order to use fluorescent particles as a fluorescent reagent, surface modification that satisfies the following problems is required.
(1) Introduction of a functional group for binding a biomolecule (2) Dispersion stabilization in a buffer solution (3) Prevention of non-specific adsorption Hereinafter, each of the above problems (1) to (3) is specifically described. State.
(1) Introduction of functional group for binding biomolecules In order to integrate silica particles and biomolecules to function stably, it is necessary to bind the silica particles and biomolecules irreversibly. For this purpose, it is necessary to covalently bond silica particles and biomolecules, not ionic bonds or physicochemical adsorption.
Protein has an amino group, a carboxyl group, a thiol group, and the like. In addition, DNA can be given an amino group or a thiol group by terminal modification. Therefore, if an amino group, a carboxyl group, a thiol group or the like is introduced into the silica particles, it is possible to covalently bond the silica particles and the biomolecules using a crosslinking agent or a condensing agent.
(2) Dispersion stabilization in a buffer solution The DLVO theory is known as a modeled representation of attractive and repulsive forces that act on the aggregation and dispersion of particles. This explains the agglomeration / dispersion of particles by electrostatic repulsive force and van der Waals force between particles (for example, see Non-Patent Document 1).
Biomolecules are often used in an aqueous solution having a high ion concentration such as physiological saline. In an aqueous solution with a high ion concentration, the ions weaken the electrostatic repulsion of the silica particles due to the shielding effect, so that the particles tend to aggregate. In order to stably disperse particles even in an aqueous solution having a high ion concentration, it is necessary to apply a repulsive force other than an electrostatic repulsive force.
There is a solid repulsive force that acts as a repulsive force between particles in addition to the electrostatic repulsive force. This works as a repulsive force between particles by repelling molecular chains with degrees of freedom. Therefore, the dispersibility of the particles can be improved by introducing a molecular chain having a high degree of freedom into the particle surface.
(3) Prevention of non-specific adsorption In order for the fluorescent particles to function as a fluorescent reagent, it is necessary that biomolecules bound to the fluorescent particles be selectively bound to the target by specific binding or the like. If non-specific binding to a biomolecule other than the target or adsorption to the substrate occurs, the sensitivity, accuracy, and reliability of the measurement will decrease accordingly.
In order to reduce non-specific adsorption, it is necessary to impart steric repulsion as well as improvement in dispersibility.

以上の観点より、蛍光粒子の応用には表面修飾が必要となる。粒子の表面修飾の方法には、シランカップリング剤でシランコーティングする方法、高分子のビーズに取り込ませる方法、脂質二重膜に内包させる方法、チオール基を介して低分子を結合する方法などが知られている(例えば、特許文献1〜3参照)。しかし、シランカップリング剤でコーティングする方法は、適用できる粒子の材質が無機粒子、金属粒子、シリカ粒子などに限られ、また、シランコーティングしただけでは十分な分散性が得られないことが問題である。高分子のビーズに取り込ませる方法は、コストがかかり、また、粒径が増大してしまうことが問題である。脂質二重膜に内包させる方法は、水中での分散性は高いものの、脂質二重膜自体が不安定なため、長期的な分散性の点で問題がある。チオール基を介して低分子を結合させる方法に関しても、適用できる粒子が金属に限られる。
以上のように、様々な材質の粒子に適用でき、かつ、長期間安定な表面修飾方法は未だ知られていない。
北原文雄、古澤邦夫、尾崎正孝、大島広行、「Zeta Potentialゼータ電位:微粒子界面の物理化学」、サイエンティスト社、1995 特開2003−11505公報 特開2004−77389公報 特開2006−131771公報
From the above viewpoints, surface modification is required for application of fluorescent particles. Particle surface modification methods include silane coating with a silane coupling agent, incorporation into polymer beads, entrapment in lipid bilayers, and attachment of small molecules via thiol groups. It is known (for example, see Patent Documents 1 to 3). However, the method of coating with a silane coupling agent has a problem that applicable particles are limited to inorganic particles, metal particles, silica particles, etc., and sufficient dispersibility cannot be obtained only by silane coating. is there. The method of incorporating the polymer beads is costly and has a problem that the particle size increases. The method of encapsulating in a lipid bilayer has a problem in terms of long-term dispersibility, although the dispersibility in water is high, but the lipid bilayer itself is unstable. Also regarding the method of binding a small molecule through a thiol group, applicable particles are limited to metals.
As described above, a surface modification method that can be applied to particles of various materials and is stable for a long time is not yet known.
Fumio Kitahara, Kunio Furusawa, Masataka Ozaki, Hiroyuki Oshima, "Zeta Potential Zeta Potential: Physical Chemistry of Fine Particle Interfaces", Scientist, 1995 JP 2003-11505 A JP 2004-77389 A JP 2006-131771 A

本発明の目的は、上記の問題点に鑑みて、生体分子を特異的に結合させる場合に、意図する以外の非特異的吸着の発生を防止し、高い分散性を有し、かつ生体分子の結合のための官能基の導入が可能な複合粒子及び複合粒子コロイドを提供することにある。
また、本発明の目的は、測定結果の再現性に優れ、信頼性が高く、シグナル/ノイズ比の高い分析試薬を提供することにある。また、本発明の目的は、粒子表面上にカチオン性有機分子とアニオン性有機分子とを重畳的に吸着でき、様々な材質の粒子に適用できる粒子表面修飾方法を提供することにある。
さらに、本発明の目的は、様々な材質の粒子に適用でき、非特異的吸着の発生を防止し、高い分散性を有し、かつ生体分子の結合のための官能基の導入が可能な複合粒子の製造方法を提供することにある。
In view of the above problems, the object of the present invention is to prevent the occurrence of non-specific adsorption other than intended when biomolecules are specifically bound, have high dispersibility, and It is an object of the present invention to provide composite particles and composite particle colloids capable of introducing functional groups for bonding.
Another object of the present invention is to provide an analytical reagent having excellent reproducibility of measurement results, high reliability, and a high signal / noise ratio. Another object of the present invention is to provide a particle surface modification method capable of adsorbing cationic organic molecules and anionic organic molecules on the particle surface in a superimposed manner and applicable to particles of various materials.
Furthermore, the object of the present invention is a composite that can be applied to particles of various materials, prevents the occurrence of non-specific adsorption, has high dispersibility, and can introduce functional groups for binding biomolecules. The object is to provide a method for producing particles.

上記課題は下記の手段により達成された。
(1) シリカ粒子の表面に、有機分子が静電的引力によって吸着してなる、シリカ粒子と有機分子よりなる複合粒子。
(2) シリカ粒子の表面に、有機分子が静電的引力によって吸着し、ポリエチレングリコール誘導体が共有結合し、かつ前記有機分子の外側に位置してなる、シリカ粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体の複合粒子。
(3) シリカ粒子の表面に、有機分子が静電的引力によって吸着し、ポリエチレングリコール誘導体が、前記誘導体の一方の末端で前記有機分子に共有結合し、前記有機分子の外側に位置し、かつ前記ポリエチレングリコール誘導体の他方の末端に生体分子が共有結合してなる、シリカ粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体/生体分子の複合粒子。
(4) 前記シリカ粒子の表面に吸着した有機分子が、カチオン性有機分子およびアニオン性有機分子であって、最も内側のカチオン性有機分子が前記シリカ粒子に吸着し、更にアニオン性有機分子が前記カチオン性有機分子に吸着して、前記カチオン性有機分子の外側に位置する構造、又は前記アニオン性有機分子が前記カチオン性有機分子に吸着して、前記カチオン性有機分子の外側に位置する構造を複数回繰り返し、最も外側に前記アニオン性有機分子が位置する構造を有する、(1)〜(3)のいずれか1項に記載の複合粒子。
(5) 前記カチオン性有機分子及びアニオン性有機分子が、それぞれ、有機分子層を形成していることを特徴とする、(4)に記載の複合粒子。
(6) 前記最も外側のアニオン性有機分子に、前記ポリエチレングリコール誘導体が共有結合していることを特徴とする、(4)又は(5)に記載の複合粒子。
(7) 前記アニオン性有機分子が、ポリアクリル酸、アルギン酸、ポリスチレンスルホン酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、又はグルタミン酸もしくはアスパラギン酸の少なくとも1種を含有するポリペプチドのいずれかであって、前記カチオン性有機分子が、ポリアリルアミン塩酸塩、キトサン、ポリリシン、又はリシンのいずれかである、(6)に記載の複合粒子。
(8) 前記アニオン性有機分子同士が共有結合を介して結合しているか、前記カチオン性有機分子同士が共有結合を介して結合しているか、及び/又は前記アニオン性有機分子と前記カチオン性有機分子とが部分的に共有結合を介して結合していることを特徴とする、(6)又は(7)に記載の複合粒子。
(9) 前記ポリエチレングリコール誘導体が有する、前記有機分子と共有結合する末端の官能基が、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、マレイミド基又はスクシンイミジルエステル基のいずれかであり、前記ポリエチレングリコール誘導体が有する他方の末端の官能基が、カルボキシル基、チオール基、メトキシ基、水酸基、アミノ基、マレイミド基又はスクシンイミジルエステル基のいずれかである、(4)〜(8)のいずれか1項に記載の複合粒子。
(10) 前記生体分子が、抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド又は化学物質であることを特徴とする、(3)〜(9)のいずれか1項に記載の複合粒子。
(11) 前記シリカ粒子の平均粒径が1nm〜1μmである、(1)〜(10)のいずれか1項に記載の複合粒子。
The above problems have been achieved by the following means.
(1) Composite particles comprising silica particles and organic molecules, wherein organic molecules are adsorbed on the surface of the silica particles by electrostatic attraction.
(2) Silica particles / organic molecules / polyethylene glycol derivatives, wherein organic molecules are adsorbed on the surface of silica particles by electrostatic attraction, polyethylene glycol derivatives are covalently bonded, and located outside the organic molecules. Composite particles.
(3) An organic molecule is adsorbed to the surface of the silica particle by electrostatic attraction, and a polyethylene glycol derivative is covalently bonded to the organic molecule at one end of the derivative, located outside the organic molecule, and A composite particle of silica particles / organic molecule / polyethylene glycol derivative / biomolecule, wherein a biomolecule is covalently bonded to the other end of the polyethylene glycol derivative.
(4) The organic molecules adsorbed on the surface of the silica particles are cationic organic molecules and anionic organic molecules, the innermost cationic organic molecule is adsorbed on the silica particles, and the anionic organic molecules are A structure that is adsorbed to a cationic organic molecule and located outside the cationic organic molecule, or a structure that the anionic organic molecule is adsorbed to the cationic organic molecule and located outside the cationic organic molecule. The composite particle according to any one of (1) to (3), which is repeated a plurality of times and has a structure in which the anionic organic molecule is located on the outermost side.
(5) The composite particle according to (4), wherein the cationic organic molecule and the anionic organic molecule each form an organic molecular layer.
(6) The composite particle according to (4) or (5), wherein the polyethylene glycol derivative is covalently bonded to the outermost anionic organic molecule.
(7) The anionic organic molecule is a polypeptide containing at least one of polyacrylic acid, alginic acid, polystyrene sulfonic acid, citric acid, glutamic acid, aspartic acid, polyglutamic acid, polyaspartic acid, or glutamic acid or aspartic acid. The composite particle according to (6), wherein the cationic organic molecule is any of polyallylamine hydrochloride, chitosan, polylysine, or lysine.
(8) The anionic organic molecules are bonded via a covalent bond, the cationic organic molecules are bonded via a covalent bond, and / or the anionic organic molecule and the cationic organic The composite particle according to (6) or (7), wherein the molecule is partially bonded through a covalent bond.
(9) The polyethylene glycol derivative has a terminal functional group covalently bonded to the organic molecule, which is any one of a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, a thiol group, a maleimide group, or a succinimidyl ester group, Any of (4) to (8), wherein the functional group at the other end of the glycol derivative is any one of a carboxyl group, a thiol group, a methoxy group, a hydroxyl group, an amino group, a maleimide group, or a succinimidyl ester group. 2. Composite particles according to item 1.
(10) Any one of (3) to (9), wherein the biomolecule is an antigen, antibody, DNA, RNA, sugar, sugar chain, ligand, receptor, peptide or chemical substance. The composite particles according to 1.
(11) The composite particle according to any one of (1) to (10), wherein the silica particles have an average particle diameter of 1 nm to 1 μm.

(12) 前記有機分子の分子量が50〜100000である、(1)〜(11)のいずれか1項に記載の複合粒子。
(13) pH7の純水中におけるζ電位の絶対値が1〜60mVである、(1)〜(12)のいずれか1項に記載の複合粒子。
(14) pH7の純水中におけるζ電位の絶対値が35〜60mVである、(1)〜(13)のいずれか1項に記載の複合粒子。
(15) 前記シリカ粒子の平均粒径が1nm〜1μmで、前記有機分子の分子量が50〜100000である、(1)〜(14)のいずれか1項に記載の複合粒子。
(16) さらに、pH7の純水中におけるζ電位の絶対値が1〜60mVである、(15)に記載の複合粒子。
(17) さらに、pH7の純水中におけるζ電位の絶対値が35〜60mVである、(16)に記載の複合粒子。
(18) 前記(1)〜(17)のいずれか1項に記載の複合粒子が、分散媒中に分散した複合粒子コロイド。
(19) 前記分散媒が緩衝液である、(18)に記載の複合粒子コロイド。
(20) 前記(18)又は(19)に記載の複合粒子コロイドを用いてなる分析試薬。
(21) 粒子の表面に、カチオン性有機分子の吸着処理を行い、さらにアニオン性有機分子の吸着処理を行うという手順で、前記カチオン性有機分子と前記アニオン性有機分子とを交互に、複数回前記吸着処理を行うことにより前記粒子表面上に複数の有機分子を重畳的に吸着させることを特徴とする粒子表面修飾方法。
(22) 前記粒子がシリカ粒子である、(21)に記載の粒子表面修飾方法。
(12) The composite particle according to any one of (1) to (11), wherein the organic molecule has a molecular weight of 50 to 100,000.
(13) The composite particle according to any one of (1) to (12), wherein an absolute value of ζ potential in pure water at pH 7 is 1 to 60 mV.
(14) The composite particle according to any one of (1) to (13), wherein the absolute value of the ζ potential in pure water at pH 7 is 35 to 60 mV.
(15) The composite particle according to any one of (1) to (14), wherein the silica particle has an average particle diameter of 1 nm to 1 μm and a molecular weight of the organic molecule of 50 to 100,000.
(16) The composite particles according to (15), wherein the absolute value of the ζ potential in pure water at pH 7 is 1 to 60 mV.
(17) The composite particles according to (16), wherein the absolute value of the ζ potential in pure water at pH 7 is 35 to 60 mV.
(18) A composite particle colloid in which the composite particles according to any one of (1) to (17) are dispersed in a dispersion medium.
(19) The composite particle colloid according to (18), wherein the dispersion medium is a buffer solution.
(20) An analytical reagent using the composite particle colloid according to (18) or (19).
(21) The cationic organic molecule is adsorbed on the surface of the particle, and further, the anionic organic molecule is adsorbed, and the cationic organic molecule and the anionic organic molecule are alternately applied a plurality of times. A particle surface modification method, wherein a plurality of organic molecules are adsorbed on the particle surface in a superimposed manner by performing the adsorption treatment.
(22) The particle surface modification method according to (21), wherein the particles are silica particles.

(23) 粒子の表面に、カチオン性有機分子の吸着処理を行い、さらにアニオン性有機分子の吸着処理を行うという手順で、前記カチオン性有機分子と前記アニオン性有機分子とを交互に、複数回前記吸着処理を行うことを特徴とする、粒子と有機分子よりなる複合粒子の製造方法。
(24) 前記粒子のコロイドと、前記粒子の表面電荷に対し反対の電荷を有する有機分子の溶液とを混合することを特徴とする、(23)に記載の複合粒子の製造方法。
(25) さらに、前記粒子と前記有機分子よりなる前記複合粒子のコロイドと、前記複合粒子の表面電荷に対し反対の電荷を有する有機分子の溶液を混合することを特徴とする、(23)又は(24)に記載の複合粒子の製造方法。
(26) 前記(23)〜(25)のいずれか1項に記載の製造方法により前記粒子と前記有機分子よりなる前記複合粒子を製造した後、
前記複合粒子の最も外側に位置する有機分子に、ポリエチレングリコール誘導体を縮合剤または架橋剤により共有結合させることを特徴とする、粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体の複合粒子の製造方法。
(27) 前記粒子と有機分子よりなる前記複合粒子のコロイドと、前記ポリエチレングリコール誘導体の溶液と、前記縮合剤または架橋剤とを混合することを特徴とする、(26)に記載の複合粒子の製造方法。
(28) 前記(26)に記載の製造方法により前記粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体の前記複合粒子を製造した後、
さらに、前記ポリエチレングリコール誘導体の1つの末端に生体分子を共有結合させることを特徴とする、粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体/生体分子の複合粒子の製造方法。
(29) 前記ポリエチレングリコール誘導体の1つの末端への前記生体分子の共有結合が、前記粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体の前記複合粒子のコロイドと、前記生体分子の溶液と、前記縮合剤または架橋剤とを混合することにより行われることを特徴とする、(28)に記載の複合粒子の製造方法。
(30) 前記粒子がシリカ粒子である、(23)〜(29)のいずれか1項に記載の複合粒子の製造方法
を提供するものである。
(23) The cationic organic molecule and the anionic organic molecule are alternately applied a plurality of times by the procedure of performing adsorption treatment of the cationic organic molecule on the surface of the particle and further performing the adsorption treatment of the anionic organic molecule. A method for producing composite particles comprising particles and organic molecules, wherein the adsorption treatment is performed.
(24) The method for producing composite particles according to (23), wherein the colloid of the particles and a solution of organic molecules having a charge opposite to the surface charge of the particles are mixed.
(25) Further, the colloid of the composite particles composed of the particles and the organic molecules, and a solution of organic molecules having a charge opposite to the surface charge of the composite particles are mixed, (23) or (24) The method for producing composite particles according to (24).
(26) After producing the composite particles comprising the particles and the organic molecules by the production method according to any one of (23) to (25),
A method for producing particle / organic molecule / polyethylene glycol derivative composite particles, wherein a polyethylene glycol derivative is covalently bonded to an organic molecule located on the outermost side of the composite particles by a condensing agent or a crosslinking agent.
(27) The composite particle according to (26), wherein a colloid of the composite particle composed of the particle and an organic molecule, a solution of the polyethylene glycol derivative, and the condensing agent or a crosslinking agent are mixed. Production method.
(28) After producing the composite particles of the particles / organic molecules / polyethylene glycol derivative by the production method according to (26),
Furthermore, a method for producing a particle / organic molecule / polyethylene glycol derivative / biomolecule composite particle, wherein a biomolecule is covalently bonded to one end of the polyethylene glycol derivative.
(29) The covalent bond of the biomolecule to one end of the polyethylene glycol derivative is a colloid of the composite particle of the particle / organic molecule / polyethylene glycol derivative, a solution of the biomolecule, the condensing agent, or a cross-linking. The method for producing composite particles according to (28), which is performed by mixing with an agent.
(30) The method for producing composite particles according to any one of (23) to (29), wherein the particles are silica particles.

本発明の複合粒子は、シリカ粒子表面に電荷を有する有機分子を吸着してなるので、前記複合粒子間での静電的反発力を高め、分散性を向上させることができる。
本発明の複合粒子は、さらに、前記吸着した有機分子にポリエチレングリコール誘導体を共有結合させることによって、前記複合粒子間での立体的反発力を高め、分散性向上とともに、生体分子を特異的に結合させる場合に、意図する以外の非特異的吸着を防ぐことができる。また、生体分子の結合のための官能基の導入も可能とすることができる。
したがって、本発明の複合粒子は、低分子化合物ないしは高分子化合物による非特異的吸着、基板ないしは容器に対する非特異的吸着を防止し、また、分散性に優れ、生理食塩水等イオン強度が高い水分散コロイド中でも凝集を起こしにくい。
ここで、「非特異的吸着」とは、特定の官能基又はリガンドに特異的に結合する以外の規則に従わない吸着をいい、意図する以外の吸着現象をいう。
Since the composite particles of the present invention are formed by adsorbing organic molecules having a charge on the surface of the silica particles, the electrostatic repulsion between the composite particles can be increased and the dispersibility can be improved.
The composite particle of the present invention further increases the steric repulsion between the composite particles by covalently bonding a polyethylene glycol derivative to the adsorbed organic molecule, improves dispersibility, and specifically binds biomolecules. In this case, non-specific adsorption other than intended can be prevented. It is also possible to introduce functional groups for binding biomolecules.
Therefore, the composite particles of the present invention prevent nonspecific adsorption by a low molecular weight compound or a high molecular compound, nonspecific adsorption to a substrate or a container, and are excellent in dispersibility and have high ionic strength such as physiological saline. Aggregation hardly occurs even in dispersed colloids.
Here, “non-specific adsorption” refers to adsorption that does not follow rules other than specifically binding to a specific functional group or ligand, and refers to an adsorption phenomenon other than intended.

本発明の複合粒子コロイドは、前記複合粒子を用いてなるので、生体分子を特異的に結合させる場合に、意図する以外の非特異的吸着を防止し、分散性に優れ、生理食塩水等イオン強度が高い水分散コロイドでも凝集を起こしにくい。
本発明の分析試薬は、生体分子を特異的に結合させる場合に、意図する以外の非特異的吸着を防止し、分散性に優れる前記複合粒子コロイドを用いてなるので、測定結果の再現性に優れ、信頼性が高く、シグナル/ノイズ比の高い極微量標的試料の高感度分析が可能である。
Since the composite particle colloid of the present invention uses the composite particle, when specifically binding a biomolecule, it prevents non-specific adsorption other than intended, has excellent dispersibility, and ions such as physiological saline. Aggregation is unlikely to occur even with water-dispersed colloids with high strength.
The analytical reagent of the present invention uses the composite particle colloid that prevents non-specific adsorption other than intended and has excellent dispersibility when specifically binding biomolecules, so that the reproducibility of measurement results is improved. Highly sensitive analysis of extremely small target samples with excellent and reliable signal / noise ratio is possible.

本発明の粒子表面修飾方法は、予め粒子のζ電位を測定し、粒子が正に帯電しているか負に帯電しているかを調べ、正に帯電しているときはアニオン性有機分子を、負に帯電しているときはカチオン性有機分子を吸着処理させることにより粒子表面上に有機分子を吸着でき、粒子の材質によらず、様々な材質の粒子に適用が可能である。
本発明の粒子表面修飾方法は、カチオン性有機分子とアニオン性有機分子とを交互に吸着処理させることによって、粒子表面上にカチオン性有機分子とアニオン性有機分子とを重畳的に吸着できる。
本発明の複合粒子の製造方法も同様に、予め粒子のζ電位を測定し、粒子が正に帯電しているか負に帯電しているかを調べ、正に帯電しているときはアニオン性有機分子を、負に帯電しているときはカチオン性有機分子を吸着処理させることにより粒子表面上に有機分子を吸着でき、粒子の材質によらず、様々な材質の粒子に適用が可能である。また、カチオン性有機分子とアニオン性有機分子とを交互に吸着処理させることによって、粒子表面上に、カチオン性有機分子とアニオン性有機分子とを重畳的に吸着できる。
本発明の複合粒子の製造方法は、生理食塩水等イオン強度が高い水分散液中でも凝集を起こしにくい複合粒子を提供できる。また、粒子に対する低分子化合物及び高分子化合物の非特異的吸着と、粒子の基板や容器に対する非特異的吸着とを抑制できる複合粒子を提供できる。さらに、生体分子の結合のための官能基の導入も行うことができる。
In the particle surface modification method of the present invention, the ζ potential of a particle is measured in advance to determine whether the particle is positively charged or negatively charged. When the particle is positively charged, an anionic organic molecule is negatively charged. When charged, the organic molecules can be adsorbed on the surface of the particles by adsorbing cationic organic molecules, and can be applied to particles of various materials regardless of the material of the particles.
The particle surface modification method of the present invention can adsorb cationic organic molecules and anionic organic molecules in a superimposed manner on the particle surface by alternately adsorbing cationic organic molecules and anionic organic molecules.
Similarly, in the method for producing the composite particles of the present invention, the ζ potential of the particles is measured in advance to determine whether the particles are positively charged or negatively charged. When negatively charged, organic molecules can be adsorbed on the particle surface by adsorbing cationic organic molecules, and can be applied to particles of various materials regardless of the material of the particles. Further, by alternately adsorbing the cationic organic molecules and the anionic organic molecules, the cationic organic molecules and the anionic organic molecules can be adsorbed on the particle surface in a superimposed manner.
The method for producing composite particles of the present invention can provide composite particles that hardly cause aggregation even in an aqueous dispersion having high ionic strength such as physiological saline. Moreover, the composite particle which can suppress the nonspecific adsorption | suction of the low molecular compound and high molecular compound with respect to particle | grains, and the nonspecific adsorption | suction with respect to the board | substrate and container of particle | grains can be provided. Furthermore, a functional group for binding biomolecules can also be introduced.

まず、本発明の複合粒子の第1の実施態様について説明する。
本発明の複合粒子は、シリカ粒子の表面に、有機分子が静電的引力によって吸着してなる、シリカ粒子と有機分子よりなる構造を有する。
ここで、「静電的引力」とは、正電荷と負電荷間に働くクーロン力をいう。また、前記「吸着」とは、静電的引力、ファンデルワールス力または疎水性相互作用による一体化をいう。
本発明において、用いるシリカ粒子は特に制限はなく、任意のいかなる調製方法によって得られたシリカ粒子であってもよい。例えば、Journal of Colloid and Interface Science,159,150−157(1993)に記載のゾル−ゲル法で調製されるシリカ粒子等が挙げられる。
本発明者らは、蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の調製方法について特許出願している(例えば、特願2005−376401)。その方法に準じて得られた、機能性化合物を含有するシリカ粒子を用いることが特に好ましい。
ここで、前記機能性化合物の具体例としては、蛍光色素化合物、吸光化合物、磁性化合物、放射線標識化合物、pH感受性色素化合物等が挙げられる。
具体的には、前記機能性化合物を含有するシリカ粒子は、前記機能性化合物とシラン化合物とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合もしくは吸着させて得られた生成物に1又は2種以上のシラン化合物を重合させることにより調製することができる。
前記機能性化合物を含有するシリカ粒子の好ましい調製方法の態様としては、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する前記機能性化合物と、それら活性基と対応して反応する置換基(例えば、アミノ基、水酸基、チオール基)を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に1又は2種以上のシラン化合物を重合させることにより調製することができる。
First, a first embodiment of the composite particle of the present invention will be described.
The composite particles of the present invention have a structure composed of silica particles and organic molecules, in which organic molecules are adsorbed on the surface of the silica particles by electrostatic attraction.
Here, “electrostatic attractive force” refers to Coulomb force acting between positive charge and negative charge. The “adsorption” refers to integration by electrostatic attraction, van der Waals force or hydrophobic interaction.
In the present invention, the silica particles used are not particularly limited, and may be silica particles obtained by any arbitrary preparation method. Examples thereof include silica particles prepared by the sol-gel method described in Journal of Colloid and Interface Science, 159, 150-157 (1993).
The present inventors have applied for a patent for a method for preparing fluorescent dye compound-containing colloidal silica particles (for example, Japanese Patent Application No. 2005-376401). It is particularly preferable to use silica particles containing a functional compound obtained according to the method.
Here, specific examples of the functional compound include fluorescent dye compounds, light absorbing compounds, magnetic compounds, radiolabeled compounds, pH sensitive dye compounds, and the like.
Specifically, the silica particles containing the functional compound are reacted with a product obtained by reacting the functional compound with a silane compound and covalently bonding, ionic bonding, or other chemical bonding or adsorption. Alternatively, it can be prepared by polymerizing two or more silane compounds.
Preferred embodiments of the method for preparing silica particles containing the functional compound include N-hydroxysuccinimide (NHS) ester group, maleimide group, isocyanate group, isothiocyanate group, aldehyde group, paranitrophenyl group, diethoxy. The functional compound having an active group such as a methyl group, an epoxy group, or a cyano group, and a silane coupling agent having a substituent (for example, an amino group, a hydroxyl group, or a thiol group) that reacts with the active group. The product obtained by reacting and covalently bonding can be prepared by polymerizing one or more silane compounds.

前記活性基を有する前記機能性化合物の具体例として、下記式でそれぞれ表されるDY550−NHSエステル又はDY630−NHSエステル(いずれも商品名、Dyomics GmbH社製)等のNHSエステル基を有する蛍光色素化合物を挙げることができる。   Specific examples of the functional compound having the active group include fluorescent dyes having an NHS ester group such as DY550-NHS ester or DY630-NHS ester (both trade names, manufactured by Dynamics GmbH) represented by the following formulae, respectively. A compound can be mentioned.

前記置換基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン(APS)、3−[2−(2−アミノエチルアミノ)エチルアミノ]プロピル-トリエトキシシラン、N−2(アミノエチル)3−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、3−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。中でも、APSが好ましい。   Specific examples of the silane coupling agent having a substituent include γ-aminopropyltriethoxysilane (APS), 3- [2- (2-aminoethylamino) ethylamino] propyl-triethoxysilane, N-2 ( Examples thereof include silane coupling agents having an amino group such as (aminoethyl) 3-aminopropylmethyldimethoxysilane and 3-aminopropyltrimethoxysilane. Of these, APS is preferable.

前記重合させる前記シラン化合物としては、特に制限はされないが、テトラエトキシシラン(TEOS)、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン(APS)、3−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び3−[2−(2−アミノエチルアミノ)エチルアミノ]プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、TEOS、MPS又はAPSが好ましい。   The silane compound to be polymerized is not particularly limited, but tetraethoxysilane (TEOS), γ-mercaptopropyltrimethoxysilane (MPS), γ-mercaptopropyltriethoxysilane, γ-aminopropyltriethoxysilane (APS). ), 3-thiocyanatopropyltriethoxysilane, 3-glycidyloxypropyltriethoxysilane, 3-isocyanatopropyltriethoxysilane, and 3- [2- (2-aminoethylamino) ethylamino] propyl-triethoxy Mention may be made of silane. Among these, TEOS, MPS, or APS is preferable.

上述のように調製すると、球状、もしくは、球状に近いシリカ粒子が製造できる。球状に近いシリカ粒子とは、具体的には長軸と短軸の比が2以下の形状である。
所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、YM−10、YM−100(いずれも商品名、ミリポア社製)等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収することで可能である。
When prepared as described above, spherical or nearly spherical silica particles can be produced. The nearly spherical silica particles specifically have a shape in which the ratio of the major axis to the minor axis is 2 or less.
In order to obtain silica particles having a desired average particle size, ultrafiltration is performed using an ultrafiltration membrane such as YM-10, YM-100 (both trade names, manufactured by Millipore), and the particle size is large. It is possible to remove particles that are too small or too small, or to centrifuge at an appropriate gravitational acceleration and collect only the supernatant or precipitate.

また、本発明は、シリカ粒子ではない任意の材質の粒子にも適用することができる。具体的には、金、銀、銅などの金属粒子、フェライト、酸化チタンなどの酸化物粒子、セレン化カドミウムなどの半導体ナノ粒子であってもよいし、ポリスチレン、ポリメチルメタクリル酸などの高分子粒子であってもよい。   The present invention can also be applied to particles of any material that is not silica particles. Specifically, metal particles such as gold, silver and copper, oxide particles such as ferrite and titanium oxide, semiconductor nanoparticles such as cadmium selenide, and polymers such as polystyrene and polymethylmethacrylic acid may be used. It may be a particle.

本発明において、用いる有機分子は、静電的引力によってシリカ粒子の表面に吸着させる観点から、カチオン性有機分子またはアニオン性有機分子であることが好ましい。
特に、前記シリカ粒子の表面に直接吸着させ、形成させる有機分子は、前記シリカ粒子の表面電荷と反対の電荷を有する観点から、前記カチオン性有機分子であることが好ましい。
前記アニオン性有機分子としては、ポリアクリル酸、アルギン酸、ポリスチレンスルホン酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、又はグルタミン酸もしくはアスパラギン酸の少なくとも1種を含有するポリペプチドなどが挙げられ、ポリアクリル酸又はアルギン酸であることが好ましい。
前記カチオン性有機分子としては、ポリアリルアミン塩酸塩、キトサン、ポリリシン、又はリシンなどが挙げられ、ポリアリルアミン塩酸塩又はキトサンであることが好ましい。
これら有機分子の分子量に関しては、50〜100000であることが好ましく、2000〜20000であることがより好ましい(本発明においては、特に断りのない限り、分子量とは重量平均分子量を意味する。高分子化合物は多分散系であり、必ずしも同一の分子量または粒子量を持たない。したがって、分子量を測定して得られた値は、なんらかの形で平均された平均分子量になる。その主なものは次の3種類である。すなわち、1)数平均分子量Mn、2)重量平均分子量Mw、3)Z平均分子量Mzであり、Mn<Mw<Mzの関係が成立する。)。
In the present invention, the organic molecule to be used is preferably a cationic organic molecule or an anionic organic molecule from the viewpoint of adsorbing to the surface of the silica particles by electrostatic attraction.
In particular, the organic molecule that is directly adsorbed and formed on the surface of the silica particles is preferably the cationic organic molecule from the viewpoint of having a charge opposite to the surface charge of the silica particles.
Examples of the anionic organic molecule include polyacrylic acid, alginic acid, polystyrene sulfonic acid, citric acid, glutamic acid, aspartic acid, polyglutamic acid, polyaspartic acid, or a polypeptide containing at least one of glutamic acid or aspartic acid. And is preferably polyacrylic acid or alginic acid.
Examples of the cationic organic molecule include polyallylamine hydrochloride, chitosan, polylysine, or lysine, and polyallylamine hydrochloride or chitosan is preferable.
The molecular weight of these organic molecules is preferably 50 to 100,000, more preferably 2000 to 20,000 (in the present invention, the molecular weight means a weight average molecular weight unless otherwise specified). The compounds are polydisperse and do not necessarily have the same molecular weight or particle weight, so the value obtained by measuring the molecular weight is the average molecular weight averaged in some way, the main ones being There are three types: 1) number average molecular weight Mn, 2) weight average molecular weight Mw, 3) Z average molecular weight Mz, and a relationship of Mn <Mw <Mz is established. ).

本発明の複合粒子において、前記カチオン性有機分子と前記アニオン性有機分子とが交互に吸着した構造を形成していることが好ましく、前記カチオン性有機分子と前記アニオン性有機分子が、それぞれ、有機分子層を形成してなる多層構造を形成していることがより好ましい。
例えば、前記シリカ粒子は、後述するζ電位が負であるので、4層の有機分子を処理する場合には、内側から1層目がカチオン性有機分子、2層目がアニオン性有機分子、3層目がカチオン性有機分子、最も外側の4層目がアニオン性有機分子とすることができる。
前記シリカ粒子表面の露出を十分に小さくし、前記粒子表面に対する非特異的吸着を抑制する観点から、前記交互に吸着する数に関しては2〜10が好ましく、層を形成している場合も同様に2〜10層が好ましい。
PBS(リン酸緩衝食塩水)、Tris緩衝液、HEPES緩衝液等の緩衝液中で、本発明の複合粒子を使用する場合、前記緩衝液は吸着性の高いマイナスのイオン種を含有していることから、前記イオン種が前記複合粒子に静電的引力で吸着し、静電的反発力が弱められ、前記複合粒子が凝集することを防止する観点から、前記複合粒子の最も外側に位置する前記有機分子は、アニオン性有機分子が好ましい。
In the composite particle of the present invention, it is preferable to form a structure in which the cationic organic molecule and the anionic organic molecule are alternately adsorbed, and the cationic organic molecule and the anionic organic molecule are each organic. It is more preferable to form a multilayer structure formed by forming a molecular layer.
For example, since the silica particle has a negative ζ potential, which will be described later, when processing four layers of organic molecules, the first layer from the inside is a cationic organic molecule, the second layer is an anionic organic molecule, 3 The layer can be a cationic organic molecule, and the outermost fourth layer can be an anionic organic molecule.
From the viewpoint of sufficiently reducing the exposure of the surface of the silica particles and suppressing nonspecific adsorption to the particle surface, the number of alternately adsorbed is preferably 2 to 10, and similarly when a layer is formed. 2-10 layers are preferred.
When the composite particles of the present invention are used in a buffer solution such as PBS (phosphate buffered saline), Tris buffer solution, HEPES buffer solution, the buffer solution contains a negative ionic species with high adsorptivity. From the viewpoint of preventing the ionic species from adsorbing to the composite particles by electrostatic attraction, weakening the electrostatic repulsion, and preventing the composite particles from aggregating, The organic molecule is preferably an anionic organic molecule.

本発明の複合粒子は、前記シリカ粒子の表面に吸着したカチオン性有機分子に、前記アニオン性有機分子が吸着して、前記カチオン性有機分子の外側に位置する構造、又は前記アニオン性有機分子が前記カチオン性有機分子に吸着して、前記カチオン性有機分子の外側に位置する構造を複数回、好ましくは2〜10回繰り返し、最も外側に前記アニオン性有機分子が位置する交互構造を有することが特に好ましい。
また、前記交互構造を形成している前記有機分子は、有機分子同士が、架橋剤ないしは縮合剤を用いることによって、共有結合を介して結合していることが好ましい。前記アニオン性有機分子同士が共有結合を介して結合しているか、前記カチオン性有機分子同士が共有結合を介して結合しているか、及び/又は前記アニオン性有機分子と前記カチオン性有機分子とが部分的に共有結合を介して結合していることがより好ましい。これによって、有機分子同士の吸着が安定化され、有機分子が脱離することを防止できる。その結果、前記複合粒子の長期的な分散安定化が可能である。
ここで、「部分的に共有結合を介して結合している」とは、本発明においては、前記アニオン性有機分子と前記カチオン性有機分子とが、吸着によって結合しているが、共有結合による結合も混在していることをいう。
用いる前記架橋剤ないしは縮合剤の具体例としては、N−(6−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド(EMCS)、グルタルアルデヒド、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)等が挙げられる。反応に用いる前記架橋剤ないしは縮合剤の当量数、分散媒ないしは溶媒の種類・容量、及び反応温度等の反応条件については反応が進行する限り特に制限はない。
The composite particle of the present invention has a structure in which the anionic organic molecule is adsorbed on the cationic organic molecule adsorbed on the surface of the silica particle and is located outside the cationic organic molecule, or the anionic organic molecule is A structure that adsorbs to the cationic organic molecule and is located outside the cationic organic molecule is repeated a plurality of times, preferably 2 to 10 times, and has an alternating structure in which the anionic organic molecule is located on the outermost side. Particularly preferred.
Moreover, it is preferable that the organic molecules forming the alternating structure are bonded to each other via a covalent bond by using a crosslinking agent or a condensing agent. The anionic organic molecules are bonded via a covalent bond, the cationic organic molecules are bonded via a covalent bond, and / or the anionic organic molecule and the cationic organic molecule are More preferably, they are partially bonded via a covalent bond. This stabilizes the adsorption between the organic molecules and can prevent the organic molecules from desorbing. As a result, long-term dispersion stabilization of the composite particles is possible.
Here, “partially bonded via a covalent bond” means that, in the present invention, the anionic organic molecule and the cationic organic molecule are bonded by adsorption, but are due to the covalent bond. It means that the bonds are mixed.
Specific examples of the crosslinking agent or condensing agent used include N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide (EMCS), glutaraldehyde, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and the like. Can be mentioned. The number of equivalents of the crosslinking agent or condensing agent used in the reaction, the type and volume of the dispersion medium or solvent, and the reaction conditions such as the reaction temperature are not particularly limited as long as the reaction proceeds.

次に、本発明の複合粒子の第2の実施態様について説明する。
本発明の複合粒子は、ポリエチレングリコール誘導体(以下、単に「PEG誘導体」ということもある。)が前記有機分子に共有結合し、かつ前記有機分子の外側に位置してなる、シリカ粒子/有機分子/PEG誘導体よりなる構造を有することが好ましく、前記最も外側のアニオン性有機分子に前記PEG誘導体が共有結合していることがより好ましい。本発明の複合粒子の第2の実施態様においても、前記カチオン性有機分子と前記アニオン性有機分子とが交互に吸着した構造において、前記カチオン性有機分子と前記アニオン性有機分子が、それぞれ、有機分子層を形成していることがさらに好ましい。
本発明において、「PEG誘導体」とは、PEGを基本骨格に有し、その両末端に後述する官能基を有する化合物をいう。
本発明において、前記有機分子に共有結合させる前記PEG化合物は架橋剤もしくは縮合剤を用いて前記有機分子と共有結合を形成することができる。また、前記PEG誘導体の分子量は、50〜10000であることが好ましく、2000〜8000であることがより好ましい。
前記架橋剤ないしは縮合剤の具体例としては、1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)とN−ヒドロキシスルホスクシンイミド(Sulfo−NHS)との任意の混合比の水溶液ないしは緩衝液等が挙げられる。反応に用いる前記架橋剤ないしは縮合剤の当量数、分散媒ないしは溶媒の種類・容量、及び反応温度等の反応条件については反応が進行する限り特に制限はない。
前記PEG誘導体の末端の官能基に関して、前記有機分子と共有結合する末端については、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、マレイミド基、スクシンイミジルエステル基等が挙げられ、水酸基又はアミノ基であることが好ましい。
前記有機分子と共有結合する末端と反対側の他方の末端の官能基については、カルボキシル基、チオール基、メトキシ基、水酸基、アミノ基、マレイミド基、スクシンイミジルエステル基等が挙げられ、カルボキシル基又はチオール基であることが好ましい。
Next, a second embodiment of the composite particle of the present invention will be described.
The composite particle of the present invention is a silica particle / organic molecule in which a polyethylene glycol derivative (hereinafter sometimes simply referred to as “PEG derivative”) is covalently bonded to the organic molecule and located outside the organic molecule. / PEG derivative is preferable, and the PEG derivative is more preferably covalently bonded to the outermost anionic organic molecule. Also in the second embodiment of the composite particle of the present invention, in the structure in which the cationic organic molecule and the anionic organic molecule are alternately adsorbed, the cationic organic molecule and the anionic organic molecule are each organic. More preferably, a molecular layer is formed.
In the present invention, the “PEG derivative” refers to a compound having PEG in the basic skeleton and having functional groups described below at both ends.
In the present invention, the PEG compound covalently bonded to the organic molecule can form a covalent bond with the organic molecule using a crosslinking agent or a condensing agent. The molecular weight of the PEG derivative is preferably 50 to 10000, more preferably 2000 to 8000.
Specific examples of the crosslinking agent or condensing agent include an aqueous solution having an arbitrary mixing ratio of 1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS). Or a buffer solution etc. are mentioned. The number of equivalents of the crosslinking agent or condensing agent used in the reaction, the type and volume of the dispersion medium or solvent, and the reaction conditions such as the reaction temperature are not particularly limited as long as the reaction proceeds.
Regarding the terminal functional group of the PEG derivative, examples of the terminal covalently bonded to the organic molecule include a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, a thiol group, a maleimide group, a succinimidyl ester group, and the like. Preferably there is.
Examples of the functional group at the other end opposite to the end covalently bonded to the organic molecule include a carboxyl group, a thiol group, a methoxy group, a hydroxyl group, an amino group, a maleimide group, and a succinimidyl ester group. Or it is preferable that it is a thiol group.

次に、本発明の複合粒子の第3の実施態様について説明する。
本発明の複合粒子は、前記PEG誘導体が、その一方の末端で共有結合し、前記有機分子の外側に位置し、かつ前記PEG誘導体の他方の末端に生体分子が共有結合してなる、シリカ粒子/有機分子/PEG誘導体/生体分子よりなる構造を有することが特に好ましい。また、前記最も外側のアニオン性有機分子に前記PEG誘導体が共有結合していることが好ましい。
本発明の複合粒子の第3の実施態様においても、前記カチオン性有機分子と前記アニオン性有機分子とが交互に吸着した構造において、前記カチオン性有機分子と前記アニオン性有機分子が、それぞれ、有機分子層を形成していることがさらに好ましい。
前記生体分子は、直接または架橋剤を介して前記PEG誘導体と共有結合することが好ましい。前記架橋剤の具体例としては、N−(6−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド(EMCS)、グルタルアルデヒド等が挙げられる。反応に用いる前記架橋剤の当量数、分散媒ないしは溶媒の種類・容量、及び反応温度等の反応条件については反応が進行する限り特に制限はない。
本発明の複合粒子の第3の実施態様において、前記有機分子と結合した前記PEG誘導体の全てが前記生体分子と結合していなくてもよく、すなわち、前記生体分子が結合した前記PEG誘導体と生体分子が結合していない前記PEG誘導体が混在していてもよい。このような表面修飾を行うにあたっては、前記有機分子に結合する前記PEG誘導体について、末端官能基が異なる前記PEG誘導体を混合して行うことができる。
例えば、一方の末端がアミノ基、他方の末端がカルボキシル基のPEG誘導体と、一方の末端がアミノ基、他方の末端がメトキシ基のPEG誘導体を、任意のモル比で、好ましくは1:4のモル比で混合し、前記PEG誘導体のアミノ基と前記有機分子のカルボキシル基を縮合剤を用いて共有結合させた後、他方の末端がカルボキシル基の前記PEG誘導体に関してのみ、生体分子を結合するという方法で行うことができる。
前記PEG誘導体部分の末端に共有結合させる生体分子としては、抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド又は化学物質などが挙げられる。
ここで、リガンドとはタンパク質と特異的に結合する物質をいい、例えば、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子、あるいはホルモン、神経伝達物質などをいい、低分子量の分子やイオンばかりでなく、高分子量の物質も含む。
また化学物質とは天然有機化合物に限らず、人工的に合成された生理活性を有する化合物や環境ホルモン等を含む。
Next, a third embodiment of the composite particle of the present invention will be described.
The composite particle of the present invention is a silica particle in which the PEG derivative is covalently bonded at one end thereof, located outside the organic molecule, and a biomolecule is covalently bonded to the other end of the PEG derivative. It is particularly preferable to have a structure consisting of / organic molecule / PEG derivative / biomolecule. The PEG derivative is preferably covalently bonded to the outermost anionic organic molecule.
Also in the third embodiment of the composite particle of the present invention, in the structure in which the cationic organic molecule and the anionic organic molecule are alternately adsorbed, the cationic organic molecule and the anionic organic molecule are each organic. More preferably, a molecular layer is formed.
The biomolecule is preferably covalently bonded to the PEG derivative directly or via a crosslinking agent. Specific examples of the crosslinking agent include N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide (EMCS), glutaraldehyde and the like. There are no particular restrictions on the reaction conditions such as the number of equivalents of the crosslinking agent used in the reaction, the type / volume of the dispersion medium or solvent, and the reaction temperature, as long as the reaction proceeds.
In the third embodiment of the composite particle of the present invention, not all of the PEG derivative bound to the organic molecule may be bound to the biomolecule, that is, the PEG derivative bound to the biomolecule and the living body. The PEG derivative to which no molecule is bonded may be mixed. Such surface modification can be performed by mixing the PEG derivatives having different terminal functional groups with respect to the PEG derivative bonded to the organic molecule.
For example, a PEG derivative having an amino group at one end and a carboxyl group at the other end, and a PEG derivative having an amino group at one end and a methoxy group at the other end, preferably in a molar ratio of 1: 4. After mixing at a molar ratio and covalently bonding the amino group of the PEG derivative and the carboxyl group of the organic molecule using a condensing agent, the biomolecule is bound only with respect to the PEG derivative having a carboxyl group at the other end. Can be done by the method.
Examples of the biomolecule to be covalently bonded to the end of the PEG derivative moiety include antigens, antibodies, DNA, RNA, sugars, sugar chains, ligands, receptors, peptides or chemical substances.
Here, a ligand refers to a substance that specifically binds to a protein, such as a substrate that binds to an enzyme, a coenzyme, a regulatory factor, a hormone, or a neurotransmitter, as well as a low molecular weight molecule or ion. Also includes high molecular weight materials.
The chemical substances are not limited to natural organic compounds, but include artificially synthesized physiologically active compounds and environmental hormones.

本発明において、用いる前記シリカ粒子の平均粒径が1nm〜1μmであることが好ましく、20nm〜500nmであることがより好ましい。
本発明の複合粒子の平均粒径は、特に制限はないが1nm〜1μmであることが好ましい。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡(TEM)、走査型電子顕微鏡(SEM)等の画像から無作為に選択した50個のシリカ粒子又は複合粒子の合計の投影面積からシリカ粒子又は複合粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択したシリカ粒子又は複合粒子の個数(50個)で割った値に相当する円の直径の平均値(平均円相当直径)を求めたものである。
粒度分布の変動係数いわゆるCV値は特に制限はないが、10%以下が好ましく、8%以下がより好ましい。
本明細書及び特許請求の範囲において、単分散とはCV値15%以下の粒子群をいう。
In this invention, it is preferable that the average particle diameter of the said silica particle to be used is 1 nm-1 micrometer, and it is more preferable that it is 20 nm-500 nm.
The average particle size of the composite particles of the present invention is not particularly limited, but is preferably 1 nm to 1 μm.
In the present invention, the average particle size is calculated from the total projected area of 50 silica particles or composite particles randomly selected from an image such as a transmission electron microscope (TEM) or a scanning electron microscope (SEM). Alternatively, the area occupied by the composite particles is obtained by an image processing apparatus, and the average value of the diameters of the circles corresponding to the value obtained by dividing the total occupied area by the number of selected silica particles or composite particles (50 particles) (corresponding to the average circle) (Diameter).
The variation coefficient of the particle size distribution, the so-called CV value, is not particularly limited, but is preferably 10% or less, more preferably 8% or less.
In the present specification and claims, monodisperse means a particle group having a CV value of 15% or less.

次に、本発明の複合粒子のζ電位について説明する。
分散媒と、それに対して相対的に運動しているコロイド粒子が接触したときに界面で電荷分離が起こる。このとき粒子表面には粒子と逆の符号を持ったイオンが集まり、層を形成する。これを電気二重層と呼ぶ。粒子表面に十分近い領域では反対電荷を持ったイオンは表面に強く引き付けられ運動性が無いため固定相と呼ばれる。それより外側のイオンは運動性を有しており拡散層と呼ばれる。また固定層と拡散層の接触面を滑り面と呼ぶ。粒子から十分離れた、電荷が中性となっている領域の電位をゼロと定義したときの滑り面の電位がζ電位(以下、単に「ゼータ電位」ということもある)であり、すなわち界面動電電位である。
前記ゼータ電位は、コロイド粒子の分散性、凝集性、表面改質等を評価する上での指標となる。すなわち、コロイド粒子は帯電しており、その帯電による静電的反発力の大きさが前記ゼータ電位の絶対値の大きさに対応しているので、前記ゼータ電位の絶対値の大きさは、コロイド粒子の分散安定性の指標となる(例えば、北原文雄、古澤邦夫、尾崎正孝、大島広行、「Zeta Potentialゼータ電位:微粒子界面の物理化学」、サイエンティスト社、1995参照。)。
また、コロイド粒子がマイナスに帯電すると前記ゼータ電位は負の値となるのに対し、コロイド粒子がプラスに帯電すると前記ゼータ電位は正の値となる。
本発明の複合粒子は、pH7の純水中におけるζ電位の絶対値が1〜60mVであることが好ましく、35〜60mVであることがより好ましい。
前記絶対値が小さすぎると、容易に凝集体が生じる。また、前記絶対値が大きすぎると、静電的相互作用によって非特異的吸着が増大する。
ゼータ電位測定装置としては、ゼータサイザーナノ(商品名、マルバーン社製)、ELS−Z1(商品名、大塚電子社製)、NICOMP 380ZLS(商品名、IBC社製)等を用いることができる。
Next, the ζ potential of the composite particles of the present invention will be described.
Charge separation occurs at the interface when the dispersion medium and colloidal particles moving relative to it come into contact. At this time, ions having a sign opposite to that of the particles gather on the particle surface to form a layer. This is called an electric double layer. In a region close enough to the particle surface, ions with opposite charges are strongly attracted to the surface and have no mobility, so they are called stationary phases. The ions outside it have mobility and are called diffusion layers. The contact surface between the fixed layer and the diffusion layer is called a sliding surface. The potential of the sliding surface when the potential in a region where the charge is sufficiently far away from the particle is defined as zero is ζ potential (hereinafter sometimes simply referred to as “zeta potential”). Electric potential.
The zeta potential is an index for evaluating the dispersibility, cohesiveness, surface modification and the like of colloidal particles. That is, since the colloidal particles are charged and the magnitude of the electrostatic repulsion due to the charging corresponds to the magnitude of the absolute value of the zeta potential, the magnitude of the absolute value of the zeta potential is It is an index of the dispersion stability of particles (see, for example, Fumio Kitahara, Kunio Furusawa, Masataka Ozaki, Hiroyuki Oshima, “Zeta Potential Zeta Potential: Physical Chemistry of Fine Particle Interface”, Scientist, 1995).
Further, when the colloidal particles are negatively charged, the zeta potential becomes a negative value, while when the colloidal particles are positively charged, the zeta potential becomes a positive value.
The composite particles of the present invention preferably have an absolute value of ζ potential in pure water of pH 7 of 1 to 60 mV, and more preferably 35 to 60 mV.
If the absolute value is too small, aggregates are easily formed. If the absolute value is too large, nonspecific adsorption increases due to electrostatic interaction.
As the zeta potential measuring device, Zetasizer Nano (trade name, manufactured by Malvern), ELS-Z1 (trade name, manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.), NICOMP 380ZLS (trade name, manufactured by IBC) and the like can be used.

次に、本発明の複合粒子コロイドについて説明する。
本発明の複合粒子コロイドは、本発明の複合粒子を分散媒中に分散してなる。
前記複合粒子コロイドの分散媒については特に制限はなく、前記複合粒子を均一に分散するものであればよく、例えば、水、エタノール、PBS(リン酸緩衝食塩水)、Tris緩衝液、HEPES緩衝液等の緩衝液が挙げられる。
Next, the composite particle colloid of the present invention will be described.
The composite particle colloid of the present invention is obtained by dispersing the composite particles of the present invention in a dispersion medium.
The dispersion medium for the composite particle colloid is not particularly limited as long as it uniformly disperses the composite particles. For example, water, ethanol, PBS (phosphate buffered saline), Tris buffer, HEPES buffer And the like.

次に、本発明の分析試薬について説明する。
本発明の分析試薬は、前記複合粒子コロイドを用いてなり、前記複合粒子コロイドに含有される前記複合粒子に、蛍光、吸光、磁性、放射線、pH感受性等の標識を付与することで達成される。前記複合粒子に前記標識を付与する方法としては、前述のように、蛍光色素化合物、吸光化合物、磁性化合物、放射線標識化合物、pH感受性色素化合物等の前記機能性化合物を含有するシリカ粒子を用いて前記複合粒子を製造する方法などが挙げられる。
本発明の分析試薬の具体例としては、生体分子検出試薬、生体分子定量試薬、生体分子分離試薬、生体分子回収試薬または免疫染色用試薬が挙げられる。
本発明の複合粒子コロイドに含有される前記複合粒子が、シリカ粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体/生体分子よりなる構造を有する場合、前記生体分子を分子認識する生体分子ないしは生理活性物質を標的とすることができ、それら標的である生体分子ないしは生理活性物質を検出、定量、分離または回収する分析試薬とすることができる。また、前記生体分子と、標的である生体分子ないしは生理活性物質との分子認識が、抗原−抗体反応である場合は、前記複合粒子コロイドを用いてなる免疫染色用試薬とすることができる。
ここで、分子認識とは、(1)DNA分子間又はDNA−RNA分子間のハイブリダイゼーション、(2)抗原抗体反応、(3)酵素(受容体)−基質(リガンド)間の反応など、生体分子間の特異的相互作用をいう。
Next, the analysis reagent of the present invention will be described.
The analytical reagent of the present invention is achieved by using the composite particle colloid and imparting a label such as fluorescence, light absorption, magnetism, radiation, pH sensitivity to the composite particle contained in the composite particle colloid. . As a method for imparting the label to the composite particles, as described above, silica particles containing the functional compound such as a fluorescent dye compound, a light absorbing compound, a magnetic compound, a radiolabeled compound, and a pH sensitive dye compound are used. Examples include a method for producing the composite particles.
Specific examples of the analysis reagent of the present invention include a biomolecule detection reagent, a biomolecule quantification reagent, a biomolecule separation reagent, a biomolecule recovery reagent, or an immunostaining reagent.
When the composite particles contained in the composite particle colloid of the present invention have a structure composed of silica particles / organic molecules / polyethylene glycol derivatives / biomolecules, the biomolecules or bioactive substances that recognize the biomolecules are targeted. It can be used as an analytical reagent for detecting, quantifying, separating or recovering the target biomolecules or physiologically active substances. When the molecular recognition between the biomolecule and the target biomolecule or physiologically active substance is an antigen-antibody reaction, an immunostaining reagent using the composite particle colloid can be used.
Here, molecular recognition refers to (1) hybridization between DNA molecules or DNA-RNA molecules, (2) antigen-antibody reaction, (3) reaction between enzyme (receptor) and substrate (ligand), etc. A specific interaction between molecules.

次に、本発明の粒子表面修飾方法について説明する。
本発明の粒子表面修飾方法は、粒子の表面に、カチオン性有機分子の吸着処理を行い、さらにアニオン性有機分子の吸着処理を行うという手順で、前記カチオン性有機分子と前記アニオン性有機分子とを交互に、複数回、好ましくは2〜10回前記吸着処理を行うことにより前記粒子表面上に前記カチオン性有機分子と前記アニオン性有機分子とを重畳的に吸着させることを特徴とする。
本発明の粒子表面修飾方法において、前記粒子の材質は特に制限はなく、シリカ粒子、金、銀、銅などの金属粒子、フェライト、酸化チタンなどの酸化物粒子、セレン化カドミウムなどの半導体ナノ粒子でもよいし、ポリスチレン、ポリメチルメタクリル酸などの高分子粒子であってもよいが、前述のゾル−ゲル法等任意の調製方法によって得られたシリカ粒子であることが好ましく、前述のように、特願2005−376401に記載の方法に準じて得られた、機能性化合物を含有するシリカ粒子であることが特に好ましい。
前記有機分子による吸着処理は、前記有機分子の溶液に前記粒子のコロイドを加え混合する、または前記粒子のコロイドに前記有機分子の溶液を加え、混合することによって行うことが好ましい。前記有機分子の溶液の溶媒については特に制限はなく、前記有機分子を溶解する溶媒であればよい。また、前記有機分子の溶液と前記粒子のコロイドを混合してえられた混合分散液は均一の相をなすことが必要である。
Next, the particle surface modification method of the present invention will be described.
In the particle surface modification method of the present invention, the cationic organic molecule, the anionic organic molecule, and the anionic organic molecule are adsorbed on the surface of the particle, followed by the adsorption treatment of the anionic organic molecule. The cationic organic molecules and the anionic organic molecules are superposedly adsorbed on the particle surfaces by alternately performing the adsorption treatment a plurality of times, preferably 2 to 10 times.
In the particle surface modification method of the present invention, the material of the particles is not particularly limited, silica particles, metal particles such as gold, silver and copper, oxide particles such as ferrite and titanium oxide, and semiconductor nanoparticles such as cadmium selenide. Or may be polymer particles such as polystyrene and polymethyl methacrylic acid, but are preferably silica particles obtained by any preparation method such as the sol-gel method described above. Silica particles containing a functional compound obtained according to the method described in Japanese Patent Application No. 2005-376401 are particularly preferred.
The adsorption treatment with the organic molecules is preferably performed by adding and mixing the particle colloid to the organic molecule solution, or adding and mixing the organic molecule solution to the particle colloid. There is no restriction | limiting in particular about the solvent of the solution of the said organic molecule, What is necessary is just a solvent which melt | dissolves the said organic molecule. Further, the mixed dispersion obtained by mixing the organic molecule solution and the particle colloid needs to form a uniform phase.

前記粒子の前記有機分子による吸着処理が出来たかどうかは、処理の前後で前記粒子のゼータ電位を測定し、ゼータ電位の符号が反転したかどうか評価することによって確認できる。
前記粒子のゼータ電位が負である場合は、前記カチオン性有機分子の溶液と、前記粒子のコロイドを混合することで第一の吸着処理を行うことができる。前記吸着処理後、前記粒子と前記粒子に吸着していない有機分子との分離は、遠心分離または限外ろ過によって可能である。
洗浄後の複合粒子のゼータ電位を測定し、ゼータ電位が正に反転していることを確認することで、前記有機分子の吸着処理が出来たかどうかがわかる。また、前記有機分子を多層化する処理においても、同様に、ゼータ電位の符号が反転するかどうかで吸着処理が出来たかどうか確認できる。
Whether or not the particles can be adsorbed by the organic molecules can be confirmed by measuring the zeta potential of the particles before and after the treatment and evaluating whether the sign of the zeta potential is reversed.
When the zeta potential of the particle is negative, the first adsorption treatment can be performed by mixing the solution of the cationic organic molecule and the colloid of the particle. After the adsorption treatment, separation of the particles and organic molecules not adsorbed on the particles can be performed by centrifugation or ultrafiltration.
By measuring the zeta potential of the composite particles after washing and confirming that the zeta potential is positively reversed, it can be determined whether or not the organic molecules have been adsorbed. Similarly, in the process of multilayering the organic molecules, it can be confirmed whether or not the adsorption process can be performed based on whether the sign of the zeta potential is reversed.

次に、本発明の複合粒子の製造方法について説明する。
本発明の複合粒子の製造方法は、前記粒子の表面に、前記カチオン性有機分子の吸着処理を行い、さらに前記アニオン性有機分子の吸着処理を行うという手順で、前記カチオン性有機分子と前記アニオン性有機分子とを交互に、複数回、好ましくは2〜10回前記吸着処理を行うことを特徴とする。
本発明の複合粒子の製造方法において、前記粒子の材質は特に制限はなく、シリカ粒子、金、銀、銅などの金属粒子、フェライト、酸化チタンなどの酸化物粒子、セレン化カドミウムなどの半導体ナノ粒子でもよいし、ポリスチレン、ポリメチルメタクリル酸などの高分子粒子であってもよいが、前述のゾル−ゲル法等任意の調製方法によって得られたシリカ粒子であることが好ましく、前述のように、特願2005−376401に記載の方法に準じて得られた、機能性化合物を含有するシリカ粒子であることが特に好ましい。
本発明の製造方法において、前記粒子のコロイドと、前記粒子の表面電荷に対して反対の電荷を有する有機分子の溶液とを混合することが好ましい。例えば、シリカ粒子を用いた場合、その表面電荷はマイナスであるので、前記混合する溶液は、前記カチオン性有機分子の溶液とすることができる。
さらに、前述のようにして得られる前記粒子と前記有機分子よりなる複合粒子のコロイドと、前記複合粒子の表面電荷に対し反対の電荷を有する有機分子の溶液を混合することを1ないしは複数回繰り返すことにより目的の複合粒子を製造することができる。
Next, the manufacturing method of the composite particle of this invention is demonstrated.
The method for producing composite particles according to the present invention includes the step of subjecting the surface of the particles to adsorption treatment of the cationic organic molecules, and further subjecting the anionic organic molecules to adsorption treatment. It is characterized in that the adsorption treatment is alternately carried out a plurality of times, preferably 2 to 10 times, with organic organic molecules.
In the method for producing composite particles of the present invention, the material of the particles is not particularly limited, and silica nanoparticles, metal particles such as gold, silver, and copper, oxide particles such as ferrite and titanium oxide, and semiconductor nanoparticles such as cadmium selenide. Particles may be used, and polymer particles such as polystyrene and polymethyl methacrylic acid may be used, but silica particles obtained by any preparation method such as the sol-gel method described above are preferable, as described above. Silica particles containing a functional compound obtained according to the method described in Japanese Patent Application No. 2005-376401 are particularly preferable.
In the production method of the present invention, it is preferable to mix the colloid of the particles and a solution of organic molecules having a charge opposite to the surface charge of the particles. For example, when silica particles are used, since the surface charge is negative, the solution to be mixed can be a solution of the cationic organic molecule.
Further, the mixing of the colloid of the composite particles composed of the particles and the organic molecules obtained as described above and the organic molecule solution having a charge opposite to the surface charge of the composite particles is repeated one or more times. Thus, the desired composite particles can be produced.

本発明の複合粒子の製造方法において、粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体の複合粒子を製造するためには、前述のようにして、前記粒子と前記有機分子よりなる前記複合粒子を製造した後、
前記有機分子に、ポリエチレングリコール誘導体を縮合剤または架橋剤により共有結合させることにより達成できる。前記縮合剤または架橋剤については前述した通りである。
前述のように、粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体の前記複合粒子を製造する方法において、前記粒子と前記有機分子よりなる前記複合粒子のコロイドと、前記ポリエチレングリコール誘導体の溶液と、前記縮合剤または架橋剤とを混合することによって行うことが好ましい。前記ポリエチレングリコール誘導体の溶液の溶媒については特に制限はなく、前記ポリエチレングリコール誘導体を溶解する溶媒であればよい。
In the method for producing composite particles of the present invention, in order to produce composite particles of particles / organic molecules / polyethylene glycol derivatives, as described above, after producing the composite particles composed of the particles and the organic molecules,
This can be achieved by covalently bonding a polyethylene glycol derivative to the organic molecule with a condensing agent or a crosslinking agent. The condensing agent or crosslinking agent is as described above.
As described above, in the method for producing the composite particle of particle / organic molecule / polyethylene glycol derivative, a colloid of the composite particle composed of the particle and the organic molecule, a solution of the polyethylene glycol derivative, the condensing agent or It is preferable to carry out by mixing with a crosslinking agent. There is no restriction | limiting in particular about the solvent of the solution of the said polyethyleneglycol derivative, What is necessary is just a solvent which melt | dissolves the said polyethyleneglycol derivative.

本発明の前記複合粒子の製造方法において、粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体/生体分子の複合粒子を製造するためには、前述のようにして、粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体の前記複合粒子を製造した後、
さらに、前記ポリエチレングリコール誘導体の1つの末端の官能基に前記生体分子を共有結合させることにより達成できる。
前述のように、粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体/生体分子の前記複合粒子を製造する方法において、前記粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体の前記複合粒子のコロイドと、前記生体分子の溶液と、前記縮合剤または架橋剤とを混合することにより行われることが好ましい。前記生体分子の溶液の溶媒については特に制限はなく、前記生体分子を溶解する溶媒であればよい。縮合剤または架橋剤については前述した通りである。
In the method for producing composite particles of the present invention, in order to produce composite particles of particles / organic molecules / polyethylene glycol derivatives / biomolecules, the composite particles of particles / organic molecules / polyethylene glycol derivatives are used as described above. After manufacturing
Furthermore, this can be achieved by covalently bonding the biomolecule to a functional group at one end of the polyethylene glycol derivative.
As described above, in the method for producing the composite particle of particles / organic molecule / polyethylene glycol derivative / biomolecule, the colloid of the composite particle of particle / organic molecule / polyethylene glycol derivative, the solution of the biomolecule, It is preferably carried out by mixing the condensing agent or the crosslinking agent. The solvent for the biomolecule solution is not particularly limited as long as it is a solvent that dissolves the biomolecule. The condensing agent or crosslinking agent is as described above.

以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、以下の実施例において「部」とは「質量部」を表し、「%」は「質量%」を表し、「分子量」は「重量平均分子量」を表す。
参考例
(本発明の複合粒子の製造に用いるシリカ粒子の調製)
DY550−NHSエステル(商品名、Dyomics GmbH社製)5.6mgを1mlのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した。ここに1.3μlのAPSを加え、室温(23℃)で1時間反応を行った。
得られた反応液100μlにエタノール32ml、TEOS100μl、蒸留水7.2ml、28質量%アンモニア水100μlを加え室温で24時間反応を行った。
反応液を22000×gの重力加速度で30分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子に蒸留水を1ml加え分散させ、再度22000×gの重力加速度で30分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに2回繰り返し、蛍光シリカ粒子分散液に含まれる未反応のTEOSやアンモニア等を除去し、平均粒径64nmのシリカ粒子24.5mgを得た。収率約91%。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples. The present invention is not limited to these examples. Unless otherwise specified, in the following examples, “part” represents “part by mass”, “%” represents “mass%”, and “molecular weight” represents “weight average molecular weight”.
Reference Example (Preparation of silica particles used for production of composite particles of the present invention)
5.6 mg of DY550-NHS ester (trade name, manufactured by Dynamics GmbH) was dissolved in 1 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO). 1.3 μl of APS was added thereto and reacted at room temperature (23 ° C.) for 1 hour.
To 100 μl of the obtained reaction solution, 32 ml of ethanol, 100 μl of TEOS, 7.2 ml of distilled water, and 100 μl of 28% by mass ammonia water were added and reacted at room temperature for 24 hours.
The reaction solution was centrifuged at a gravity acceleration of 22000 × g for 30 minutes, and the supernatant was removed. 1 ml of distilled water was added to and dispersed in the precipitated silica particles, and centrifuged again at a gravitational acceleration of 22000 × g for 30 minutes. This washing operation was further repeated twice to remove unreacted TEOS, ammonia and the like contained in the fluorescent silica particle dispersion, thereby obtaining 24.5 mg of silica particles having an average particle diameter of 64 nm. Yield about 91%.

実施例1
(PAH/PAAで修飾された複合シリカ粒子の調製法)
PAH(ポリアリルアミン塩酸塩、Fluorochem社製)水溶液(1mg/ml)9mlを30mlのビーカーに入れた。撹拌子をいれ、良く混合した。ここに、前記参考例で調製したシリカ粒子の水分散コロイド(粒径64nm、10mg/ml)1mlを、3分間かけて撹拌を続けながらゆっくりと加えた。
室温(23℃)で、得られた混合分散液を15分撹拌後、遠心分離(20,000g)を30分行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去した。得られた沈殿物を5mlの蒸留水に再分散させ、再度遠心分離(20,000g)を30分行い、粒子を沈降させた。同様の操作を3回繰り返し、余分なPAHを除去した。
最後に、粒子を1mlの蒸留水に分散させて、PAHで修飾された複合シリカ粒子を水分散コロイドとして得た(収量10mg/ml×1ml)。
前記水分散コロイド50μlに蒸留水1000μlを加え、ゼータ電位測定装置(ゼータサイザーナノ、マルバーン社製)によって、前記PAHで修飾された複合シリカ粒子のゼータ電位を測定した。
図1は、表面修飾によるゼータ電位の変化を示したグラフである。
図1中、aは、PAH処理前のPAHを有していない表面未処理シリカ粒子のゼータ電位、bは、PAH処理後のPAHで修飾された複合シリカ粒子のゼータ電位、cは、後述のPAAでさらに処理した、PAH及びPAAで修飾された複合シリカ粒子のゼータ電位を示す。
図1から明らかなように、PAH処理前のPAHを有していない表面未処理シリカ粒子のゼータ電位aが負であるのに対し、PAH処理後の複合シリカ粒子のゼータ電位bは正になっているので、前記シリカ粒子が表層にPAHを有していることを確認した。
Example 1
(Method for preparing composite silica particles modified with PAH / PAA)
9 ml of a PAH (polyallylamine hydrochloride, Fluorochem) aqueous solution (1 mg / ml) was placed in a 30 ml beaker. A stir bar was added and mixed well. To this, 1 ml of an aqueous dispersion colloid of silica particles (particle size: 64 nm, 10 mg / ml) prepared in the above Reference Example was slowly added while stirring over 3 minutes.
The obtained dispersion mixture was stirred at room temperature (23 ° C.) for 15 minutes, then centrifuged (20,000 g) for 30 minutes to settle the particles, and the supernatant was immediately removed. The obtained precipitate was re-dispersed in 5 ml of distilled water, and centrifuged (20,000 g) again for 30 minutes to settle the particles. The same operation was repeated three times to remove excess PAH.
Finally, the particles were dispersed in 1 ml of distilled water to obtain composite silica particles modified with PAH as a water-dispersed colloid (yield 10 mg / ml × 1 ml).
1000 μl of distilled water was added to 50 μl of the water-dispersed colloid, and the zeta potential of the composite silica particles modified with the PAH was measured with a zeta potential measuring device (Zeta Sizer Nano, manufactured by Malvern).
FIG. 1 is a graph showing changes in zeta potential due to surface modification.
In FIG. 1, a is a zeta potential of surface untreated silica particles not having PAH before PAH treatment, b is a zeta potential of composite silica particles modified with PAH after PAH treatment, and c is described below. Figure 2 shows the zeta potential of PAH and PAA modified composite silica particles further treated with PAA.
As is clear from FIG. 1, the zeta potential a of the surface untreated silica particles not having PAH before PAH treatment is negative, whereas the zeta potential b of the composite silica particles after PAH treatment is positive. Therefore, it was confirmed that the silica particles had PAH on the surface layer.

次に、PAA(ポリアクリル酸、平均分子量約5,000、和光純薬社製)水溶液(1mg/ml)を9mlのビーカーに入れた。撹拌子をいれ、水溶液を良く混合した。ここに、前記得られたPAHで修飾された複合シリカ粒子の水分散コロイド1mlを、3分間かけて撹拌を続けながらゆっくりと加えた。
室温で、混合分散液を15分撹拌後、PAHの処理のときと同様に、遠心分離(20,000g)処理で過剰のPAAを除去した。
最後に、粒子を500μlの蒸留水に分散させて、PAH及びPAAで修飾された複合シリカ粒子を水分散コロイドとして得た(収量19mg/ml×500μl)。
水分散液コロイド25μlに蒸留水1000μlを加え、前記ゼータ電位測定装置によって、前記複合シリカ粒子のゼータ電位を測定した。
図1から明らかなように、PAAでさらに処理した複合シリカ粒子のゼータ電位cは負になっているので、前記複合シリカ粒子が最も外側にPAAを有してなる、PAH及びPAAで修飾された複合シリカ粒子であることを確認した。
Next, a PAA (polyacrylic acid, average molecular weight of about 5,000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) aqueous solution (1 mg / ml) was placed in a 9 ml beaker. A stir bar was added and the aqueous solution was mixed well. Here, 1 ml of the aqueous dispersion colloid of composite silica particles modified with PAH obtained above was slowly added while stirring over 3 minutes.
After stirring the mixed dispersion for 15 minutes at room temperature, excess PAA was removed by centrifugation (20,000 g) in the same manner as in the PAH treatment.
Finally, the particles were dispersed in 500 μl of distilled water to obtain composite silica particles modified with PAH and PAA as a water-dispersed colloid (yield 19 mg / ml × 500 μl).
1000 μl of distilled water was added to 25 μl of the aqueous dispersion colloid, and the zeta potential of the composite silica particles was measured with the zeta potential measuring device.
As is clear from FIG. 1, since the zeta potential c of the composite silica particles further treated with PAA is negative, the composite silica particles are modified with PAH and PAA, which have PAA on the outermost side. It was confirmed to be composite silica particles.

実施例2
(PEG誘導体及びアビジンの結合)
PAH及びPAAの処理を行ったPAH及びPAAで修飾された複合シリカ粒子のコロイド(19mg/ml)200μlをマイクロチューブに入れた。ここに蒸留水を600μl加えた。
10mMのEDC(1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩)と25mMのSulfo−NHS(N−ヒドロキシスルホスクシンイミド)を含む水溶液200μlを前記複合シリカ粒子のコロイドに加え、15分間、室温で混合した。15分混合後、一方の末端がアミノ基であり、他方の末端がメトキシ基であるPEG誘導体(分子量2,000、SUNBRIGHT MEPA−20H、日本油脂社製)が4mMの濃度で、一方の末端がアミノ基であり、他方の末端にカルボキシル基であるPEG誘導体(分子量2,000、SUNBRIGHT PA−020HC、日本油脂社製)が1mMの濃度で溶解した、前記2種類のPEG誘導体を含む水溶液を200μl加え、3時間、室温で混合を行った。
3時間混合後、遠心分離(20,000g)を30分行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去した。得られた沈殿物を1mlの蒸留水に再分散させ、再度遠心分離(20,000g)を30分行い、粒子を沈降させた。同様の操作を3回繰り返し、余分な、PEG誘導体、EDC及びSulfo−NHSを除去した。最後に沈殿物を800μlの蒸留水に分散させた。
得られた分散液に、10mMのEDCと25mMのSulfo−NHSを含む水溶液200μlを前記複合シリカ粒子コロイドに加え、15分、室温で混合した。15分混合後、2mg/mlのアビジン(商品名、和光純薬社製)溶液を50μl加え、3時間撹拌した。
3時間混合後、遠心分離(20,000g)を30分行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去した。得られた沈殿物を1mlの蒸留水に再分散させ、再度遠心分離(20,000g)を30分行い、粒子を沈降させた。同様の操作を4回繰り返し、余分なアビジンを除去した。最後に蒸留水1mlに粒子を分散させ、PAH/PAA/PEG誘導体/アビジンで修飾された複合シリカ粒子を得た(収量3.5mg/ml×1ml)。
Example 2
(Binding of PEG derivative and avidin)
200 μl of colloid (19 mg / ml) of composite silica particles modified with PAH and PAA treated with PAH and PAA was placed in a microtube. 600 μl of distilled water was added thereto.
200 μl of an aqueous solution containing 10 mM EDC (1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) and 25 mM Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) is added to the colloid of the composite silica particles for 15 minutes. And mixed at room temperature. After mixing for 15 minutes, a PEG derivative (molecular weight 2,000, SUNBRIGHT MEPA-20H, manufactured by NOF Corporation) having one amino group at one end and a methoxy group at the other end is at a concentration of 4 mM. 200 μl of an aqueous solution containing the above-mentioned two kinds of PEG derivatives in which a PEG derivative (molecular weight 2,000, SUNBRIGHT PA-020HC, manufactured by NOF Corporation), which is an amino group and a carboxyl group at the other end, is dissolved at a concentration of 1 mM In addition, mixing was performed at room temperature for 3 hours.
After mixing for 3 hours, centrifugation (20,000 g) was performed for 30 minutes to settle the particles, and the supernatant was immediately removed. The obtained precipitate was redispersed in 1 ml of distilled water, and centrifuged (20,000 g) again for 30 minutes to settle the particles. The same operation was repeated three times to remove excess PEG derivative, EDC and Sulfo-NHS. Finally, the precipitate was dispersed in 800 μl of distilled water.
To the obtained dispersion, 200 μl of an aqueous solution containing 10 mM EDC and 25 mM Sulfo-NHS was added to the composite silica particle colloid, and mixed for 15 minutes at room temperature. After mixing for 15 minutes, 50 μl of 2 mg / ml avidin (trade name, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) solution was added and stirred for 3 hours.
After mixing for 3 hours, centrifugation (20,000 g) was performed for 30 minutes to settle the particles, and the supernatant was immediately removed. The obtained precipitate was redispersed in 1 ml of distilled water, and centrifuged (20,000 g) again for 30 minutes to settle the particles. The same operation was repeated 4 times to remove excess avidin. Finally, the particles were dispersed in 1 ml of distilled water to obtain composite silica particles modified with PAH / PAA / PEG derivative / avidin (yield 3.5 mg / ml × 1 ml).

実施例3
(分散性評価)
PAHとPAAで処理を行って得たPAH及びPAAで修飾された複合シリカ粒子水分散コロイド(10mg/ml)と何ら処理を行っていない表面未処理シリカ粒子水分散コロイド(10mg/ml)それぞれ950μlに対し、1mg/mlアビジン水溶液を50μl加え30分混合した。得られた2種類のコロイド100μlをそれぞれ別のPBS(リン酸緩衝食塩水)900μlに加え、粒径の時間変化を動的光散乱法により、ゼータサイザーナノ(商品名、マルバーン社製)を用いて測定した。測定の結果を図2に示す。
図2に示すように、PAHとPAAの処理を行っていない表面未処理シリカ粒子(図中e)は、PBSに添加して直ぐに液が白濁し、粒径が800nm程度に増大し、凝集が起こっていることが確認された。一方、PAHとPAAで処理したPAH及びPAAで修飾された複合シリカ粒子(図中d)については、3時間後でも粒径はほとんど増大せず、高い分散性が保たれていた。
Example 3
(Dispersibility evaluation)
950 μl each of the aqueous dispersion colloid (10 mg / ml) modified with PAH and PAA modified with PAH and PAA, and the untreated surface untreated silica particle (10 mg / ml) with no treatment. On the other hand, 50 μl of 1 mg / ml avidin aqueous solution was added and mixed for 30 minutes. 100 μl of the obtained two types of colloids are added to 900 μl each of different PBS (phosphate buffered saline), and the time change of the particle size is measured by dynamic light scattering method using Zetasizer Nano (trade name, manufactured by Malvern). Measured. The measurement results are shown in FIG.
As shown in FIG. 2, the surface untreated silica particles (e in the figure) that were not treated with PAH and PAA became cloudy immediately after addition to PBS, the particle size increased to about 800 nm, and aggregation occurred. It was confirmed that this was happening. On the other hand, PAH and PAA-modified composite silica particles treated with PAH and PAA (d in the figure) did not increase in particle size even after 3 hours and maintained high dispersibility.

実施例4
(非特異的吸着の抑制)
PAHとPAAで処理を行ったPAH及びPAAで修飾された複合シリカ粒子と、PAHとPAAで処理を行った後、PEG誘導体を結合した複合シリカ粒子をそれぞれ蒸留水に分散させた(粒子濃度0.6mg/ml)。これら複合シリカ粒子のコロイド1mlに、それぞれビオチン−4−フルオレセイン(商品名、Ana Spec Inc社製)を4μg/mlになるように加え、6時間室温で混合した。
6時間混合後、遠心分離(20,000g)を30分行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去した。得られた沈殿物を1mlの蒸留水に再分散させ、再度遠心分離(20,000g)を30分行い、粒子を沈降させた。同様の操作を4回繰り返し、余分なビオチン−4−フルオレセインを除去した。
得られた粒子の蛍光を測定した。測定は蛍光分光光度計FP−6500(日本分光社製)を用いた。シリカ粒子由来の蛍光強度、すなわち、557nmの励起光における578nmの発光強度とビオチン−4−フルオレセイン由来の発光強度、すなわち490nmの励起光における520nmの発光強度を測定した。
単位粒子あたりに結合したビオチン−4−フルオレセインの量を見積もるため、ビオチン−4−フルオレセイン由来の発光強度をシリカ粒子由来の蛍光強度で割り、得られた値を標識パラメータと定義した。得られた結果を図3に示す。
図3に示すように、PEG誘導体を結合した複合シリカ粒子の標識パラメータはPEG誘導体を結合していない複合シリカ粒子の標識パラメータの1/5であり、PEG誘導体の結合によって非特異的吸着が抑制されたことを確認した。
Example 4
(Suppression of non-specific adsorption)
PAH and PAA-modified composite silica particles treated with PAH and PAA and PAH and PAA-treated composite silica particles were each dispersed in distilled water (particle concentration 0). .6 mg / ml). Biotin-4-fluorescein (trade name, manufactured by Ana Spec Inc.) was added to 1 ml of these colloidal silica particle colloids at 4 μg / ml and mixed at room temperature for 6 hours.
After mixing for 6 hours, centrifugation (20,000 g) was performed for 30 minutes to settle the particles, and the supernatant was immediately removed. The obtained precipitate was redispersed in 1 ml of distilled water, and centrifuged (20,000 g) again for 30 minutes to settle the particles. The same operation was repeated 4 times to remove excess biotin-4-fluorescein.
The fluorescence of the obtained particles was measured. The measurement was performed using a fluorescence spectrophotometer FP-6500 (manufactured by JASCO Corporation). The fluorescence intensity derived from silica particles, that is, the emission intensity at 578 nm in the excitation light at 557 nm and the emission intensity from biotin-4-fluorescein, that is, the emission intensity at 520 nm in the excitation light at 490 nm were measured.
In order to estimate the amount of biotin-4-fluorescein bound per unit particle, the emission intensity derived from biotin-4-fluorescein was divided by the fluorescence intensity derived from silica particles, and the obtained value was defined as a labeling parameter. The obtained results are shown in FIG.
As shown in FIG. 3, the labeling parameter of the composite silica particles bound with the PEG derivative is 1/5 of the labeling parameter of the composite silica particles not bound with the PEG derivative, and nonspecific adsorption is suppressed by the binding of the PEG derivative. Confirmed that it was.

図1は、表面修飾によるゼータ電位の変化を示したグラフである。FIG. 1 is a graph showing changes in zeta potential due to surface modification. 図2は、PBS中での粒子の粒径の時間変化を示したグラフである。FIG. 2 is a graph showing the change over time of the particle size of the particles in PBS. 図3は、標識パラメータを示したグラフである。FIG. 3 is a graph showing the label parameter.

Claims (30)

  1. シリカ粒子の表面に、有機分子が静電的引力によって吸着してなる、シリカ粒子と有機分子よりなる複合粒子。   A composite particle composed of silica particles and organic molecules, in which organic molecules are adsorbed to the surface of the silica particles by electrostatic attraction.
  2. シリカ粒子の表面に、有機分子が静電的引力によって吸着し、ポリエチレングリコール誘導体が前記有機分子に共有結合し、かつ前記有機分子の外側に位置してなる、シリカ粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体の複合粒子。   Silica particles / organic molecules / polyethylene glycol derivatives in which organic molecules are adsorbed on the surface of silica particles by electrostatic attraction, and polyethylene glycol derivatives are covalently bonded to the organic molecules and located outside the organic molecules. Composite particles.
  3. シリカ粒子の表面に、有機分子が静電的引力によって吸着し、ポリエチレングリコール誘導体が、前記誘導体の一方の末端で前記有機分子に共有結合し、前記有機分子の外側に位置し、かつ前記ポリエチレングリコール誘導体の他方の末端に生体分子が共有結合してなる、シリカ粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体/生体分子の複合粒子。   An organic molecule is adsorbed to the surface of the silica particle by electrostatic attraction, and a polyethylene glycol derivative is covalently bonded to the organic molecule at one end of the derivative, located outside the organic molecule, and the polyethylene glycol. A composite particle of silica particle / organic molecule / polyethylene glycol derivative / biomolecule, wherein a biomolecule is covalently bonded to the other end of the derivative.
  4. 前記シリカ粒子の表面に吸着した有機分子が、カチオン性有機分子およびアニオン性有機分子であって、最も内側のカチオン性有機分子が前記シリカ粒子に吸着し、更にアニオン性有機分子が前記カチオン性有機分子に吸着して、前記カチオン性有機分子の外側に位置する構造、又は前記アニオン性有機分子が前記カチオン性有機分子に吸着して、前記カチオン性有機分子の外側に位置する構造を複数回繰り返し、最も外側に前記アニオン性有機分子が位置する構造を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の複合粒子。   The organic molecules adsorbed on the surface of the silica particles are a cationic organic molecule and an anionic organic molecule, the innermost cationic organic molecule is adsorbed on the silica particle, and the anionic organic molecule further is the cationic organic molecule. A structure that is adsorbed to a molecule and located outside the cationic organic molecule, or a structure that the anionic organic molecule is adsorbed to the cationic organic molecule and located outside the cationic organic molecule is repeated a plurality of times. The composite particle according to any one of claims 1 to 3, which has a structure in which the anionic organic molecule is located on the outermost side.
  5. 前記カチオン性有機分子及びアニオン性有機分子が、それぞれ、有機分子層を形成していることを特徴とする、請求項4に記載の複合粒子。   The composite particle according to claim 4, wherein the cationic organic molecule and the anionic organic molecule each form an organic molecular layer.
  6. 前記最も外側のアニオン性有機分子に、前記ポリエチレングリコール誘導体が共有結合していることを特徴とする、請求項4又は5に記載の複合粒子。   The composite particle according to claim 4 or 5, wherein the polyethylene glycol derivative is covalently bonded to the outermost anionic organic molecule.
  7. 前記アニオン性有機分子が、ポリアクリル酸、アルギン酸、ポリスチレンスルホン酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、又はグルタミン酸もしくはアスパラギン酸の少なくとも1種を含有するポリペプチドのいずれかであって、前記カチオン性有機分子が、ポリアリルアミン塩酸塩、キトサン、ポリリシン、又はリシンのいずれかである、請求項6に記載の複合粒子。   The anionic organic molecule is any one of polyacrylic acid, alginic acid, polystyrene sulfonic acid, citric acid, glutamic acid, aspartic acid, polyglutamic acid, polyaspartic acid, or a polypeptide containing at least one of glutamic acid or aspartic acid. The composite particle according to claim 6, wherein the cationic organic molecule is any one of polyallylamine hydrochloride, chitosan, polylysine, and lysine.
  8. 前記アニオン性有機分子同士が共有結合を介して結合しているか、前記カチオン性有機分子同士が共有結合を介して結合しているか、及び/又は前記アニオン性有機分子と前記カチオン性有機分子とが部分的に共有結合を介して結合していることを特徴とする、請求項6又は7に記載の複合粒子。   The anionic organic molecules are bonded via a covalent bond, the cationic organic molecules are bonded via a covalent bond, and / or the anionic organic molecule and the cationic organic molecule are The composite particle according to claim 6 or 7, which is partially bonded through a covalent bond.
  9. 前記ポリエチレングリコール誘導体が有する、前記有機分子と共有結合する末端の官能基が、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、マレイミド基又はスクシンイミジルエステル基のいずれかであり、前記ポリエチレングリコール誘導体が有する他方の末端の官能基が、カルボキシル基、チオール基、メトキシ基、水酸基、アミノ基、マレイミド基又はスクシンイミジルエステル基のいずれかである、請求項4〜8いずれか1項に記載の複合粒子。   The polyethylene glycol derivative has a terminal functional group covalently bonded to the organic molecule, which is a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, a thiol group, a maleimide group, or a succinimidyl ester group, and the polyethylene glycol derivative is The composite according to any one of claims 4 to 8, wherein the functional group at the other end has any of a carboxyl group, a thiol group, a methoxy group, a hydroxyl group, an amino group, a maleimide group, or a succinimidyl ester group. particle.
  10. 前記生体分子が、抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド又は化学物質であることを特徴とする、請求項3〜9のいずれか1項に記載の複合粒子。   The composite particle according to any one of claims 3 to 9, wherein the biomolecule is an antigen, antibody, DNA, RNA, sugar, sugar chain, ligand, receptor, peptide, or chemical substance. .
  11. 前記シリカ粒子の平均粒径が1nm〜1μmである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の複合粒子。   The composite particle according to any one of claims 1 to 10, wherein an average particle diameter of the silica particles is 1 nm to 1 µm.
  12. 前記有機分子の分子量が50〜100000である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の複合粒子。   The composite particle according to any one of claims 1 to 11, wherein the molecular weight of the organic molecule is 50 to 100,000.
  13. pH7の純水中におけるζ電位の絶対値が1〜60mVである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の複合粒子。   The composite particle according to any one of claims 1 to 12, wherein an absolute value of ζ potential in pure water at pH 7 is 1 to 60 mV.
  14. pH7の純水中におけるζ電位の絶対値が35〜60mVである、請求項1〜13のいずれか1項に記載の複合粒子。   The composite particle according to any one of claims 1 to 13, wherein an absolute value of ζ potential in pure water having a pH of 7 is 35 to 60 mV.
  15. 前記シリカ粒子の平均粒径が1nm〜1μmで、前記有機分子の分子量が50〜100000である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の複合粒子。   The composite particle according to any one of claims 1 to 14, wherein an average particle diameter of the silica particles is 1 nm to 1 µm, and a molecular weight of the organic molecule is 50 to 100,000.
  16. さらに、pH7の純水中におけるζ電位の絶対値が1〜60mVである、請求項15に記載の複合粒子。   Furthermore, the composite particle of Claim 15 whose absolute value of ζ potential in the pure water of pH 7 is 1-60 mV.
  17. さらに、pH7の純水中におけるζ電位の絶対値が35〜60mVである、請求項16に記載の複合粒子。   Furthermore, the composite particle of Claim 16 whose absolute value of zeta potential in the pure water of pH7 is 35-60mV.
  18. 請求項1〜17のいずれか1項に記載の複合粒子が、分散媒中に分散した複合粒子コロイド。   A composite particle colloid in which the composite particles according to any one of claims 1 to 17 are dispersed in a dispersion medium.
  19. 前記分散媒が緩衝液である、請求項18に記載の複合粒子コロイド。   The composite particle colloid according to claim 18, wherein the dispersion medium is a buffer solution.
  20. 請求項18又は19に記載の複合粒子コロイドを用いてなる分析試薬。   An analytical reagent comprising the composite particle colloid according to claim 18 or 19.
  21. 粒子の表面に、カチオン性有機分子の吸着処理を行い、さらにアニオン性有機分子の吸着処理を行うという手順で、前記カチオン性有機分子と前記アニオン性有機分子とを交互に、複数回前記吸着処理を行うことにより前記粒子表面上に複数の有機分子を重畳的に吸着させることを特徴とする粒子表面修飾方法。   The adsorption treatment of the cationic organic molecules on the surface of the particles, followed by the adsorption treatment of the anionic organic molecules, and the adsorption treatment of the cationic organic molecules and the anionic organic molecules alternately, a plurality of times. A particle surface modification method characterized in that a plurality of organic molecules are superposedly adsorbed on the particle surface by performing the step.
  22. 前記粒子がシリカ粒子である、請求項21に記載の粒子表面修飾方法。   The particle surface modification method according to claim 21, wherein the particles are silica particles.
  23. 粒子の表面に、カチオン性有機分子の吸着処理を行い、さらにアニオン性有機分子の吸着処理を行うという手順で、前記カチオン性有機分子と前記アニオン性有機分子とを交互に、複数回前記吸着処理を行うことを特徴とする、粒子と有機分子よりなる複合粒子の製造方法。   The adsorption treatment of the cationic organic molecules on the surface of the particles, followed by the adsorption treatment of the anionic organic molecules, and the adsorption treatment of the cationic organic molecules and the anionic organic molecules alternately, a plurality of times. A method for producing composite particles composed of particles and organic molecules.
  24. 前記粒子のコロイドと、前記粒子の表面電荷に対し反対の電荷を有する有機分子の溶液とを混合することを特徴とする、請求項23に記載の複合粒子の製造方法。   The method for producing composite particles according to claim 23, wherein a colloid of the particles and a solution of organic molecules having a charge opposite to the surface charge of the particles are mixed.
  25. さらに、前記粒子と前記有機分子よりなる前記複合粒子のコロイドと、前記複合粒子の表面電荷に対し反対の電荷を有する有機分子の溶液を混合することを特徴とする、請求項23又は24に記載の複合粒子の製造方法。   25. The colloid of the composite particles comprising the particles and the organic molecules, and a solution of organic molecules having a charge opposite to the surface charge of the composite particles are mixed. A method for producing composite particles.
  26. 請求項23〜25のいずれか1項に記載の製造方法により前記粒子と前記有機分子よりなる前記複合粒子を製造した後、
    前記複合粒子の最も外側に位置する有機分子に、ポリエチレングリコール誘導体を縮合剤または架橋剤により共有結合させることを特徴とする、粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体の複合粒子の製造方法。
    After producing the composite particles composed of the particles and the organic molecules by the production method according to any one of claims 23 to 25,
    A method for producing particle / organic molecule / polyethylene glycol derivative composite particles, wherein a polyethylene glycol derivative is covalently bonded to an organic molecule located on the outermost side of the composite particles by a condensing agent or a crosslinking agent.
  27. 前記粒子と前記有機分子よりなる前記複合粒子のコロイドと、前記ポリエチレングリコール誘導体の溶液と、前記縮合剤または架橋剤とを混合することを特徴とする、請求項26に記載の複合粒子の製造方法。   27. The method for producing composite particles according to claim 26, wherein a colloid of the composite particles composed of the particles and the organic molecules, a solution of the polyethylene glycol derivative, and the condensing agent or a crosslinking agent are mixed. .
  28. 請求項26に記載の製造方法により前記粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体の前記複合粒子を製造した後、
    さらに、前記ポリエチレングリコール誘導体の1つの末端に生体分子を共有結合させることを特徴とする、粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体/生体分子の複合粒子の製造方法。
    After producing the composite particles of the particles / organic molecules / polyethylene glycol derivative by the production method according to claim 26,
    Furthermore, a method for producing a particle / organic molecule / polyethylene glycol derivative / biomolecule composite particle, wherein a biomolecule is covalently bonded to one end of the polyethylene glycol derivative.
  29. 前記ポリエチレングリコール誘導体の1つの末端への前記生体分子の共有結合が、前記粒子/有機分子/ポリエチレングリコール誘導体の前記複合粒子のコロイドと、前記生体分子の溶液と、前記縮合剤または架橋剤とを混合することにより行われることを特徴とする、請求項28に記載の複合粒子の製造方法。   The covalent bond of the biomolecule to one end of the polyethylene glycol derivative comprises a colloid of the composite particle of the particle / organic molecule / polyethylene glycol derivative, a solution of the biomolecule, and the condensing agent or cross-linking agent. It is performed by mixing, The manufacturing method of the composite particle of Claim 28 characterized by the above-mentioned.
  30. 前記粒子がシリカ粒子である、請求項23〜29のいずれか1項に記載の複合粒子の製造方法。   The method for producing composite particles according to any one of claims 23 to 29, wherein the particles are silica particles.
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