JP2009221059A - Method for producing silica nanoparticle having laminated structure, silica nanoparticle having laminated structure, and labeled reagent using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ナノメートルサイズの積層構造のシリカナノ粒子の製造方法に関する。より詳しくは、タンパク質等の特定物質の検出用ないしは定量用の標識試薬として用いる、ナノメートルサイズの積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、該方法により得られた積層構造のシリカナノ粒子、及びそれを用いた標識試薬に関する。 The present invention relates to a method for producing silica nanoparticles having a nanometer-size laminated structure. More specifically, a method for producing a nanometer-sized layered silica nanoparticle used as a labeling reagent for detection or quantification of a specific substance such as a protein, a layered structure silica nanoparticle obtained by the method, and use thereof The present invention relates to a labeled reagent.
テトラエトキシシラン（以下ＴＥＯＳということもある。）に代表されるテトラアルコキシシランに、触媒であるアンモニア存在下、水を加えて加水分解すると縮重合によるシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）形成後、ナノ〜ミクロンサイズのシリカ粒子が形成される（例えば、非特許文献１参照）。
シリカ自身には光吸収特性や磁性がないためその粒子を検出することができず、標識試薬として用いることはできない。しかし、シリカには高い化学的安定性や表面修飾についての高い自由度、生体に対する無害性といった標識試薬にとって好ましい特性をいくつも兼ね備えている。そのため、例えばシリカ粒子の内部もしくは表面に蛍光もしくは発色特性を有する有機色素分子を結合させれば、光学的にその存在を検出することができる標識試薬を得ることができる。
When tetraalkoxysilane represented by tetraethoxysilane (hereinafter sometimes referred to as TEOS) is hydrolyzed by adding water in the presence of ammonia as a catalyst to form a siloxane bond (Si-O bond) by condensation polymerization, nano- Silica particles of ˜micron size are formed (for example, see Non-Patent Document 1).
Silica itself does not have light absorption properties or magnetism, so its particles cannot be detected and cannot be used as a labeling reagent. However, silica has a number of desirable properties for labeling reagents such as high chemical stability, high degree of freedom for surface modification, and harmlessness to living organisms. Therefore, for example, if an organic dye molecule having fluorescence or color development characteristics is bound to the inside or the surface of silica particles, a labeling reagent capable of optically detecting the presence of the reagent can be obtained.
シリカ粒子の内部に有機色素分子を取り込む手法としては、アミノ基と反応しやすいＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを有する色素分子をシランカップリング剤の一種である３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）分子のアミノ基と結合させ、このようにして得られる色素分子とＡＰＳ分子からなる化合物（以下、単に「色素結合ＡＰＳ」という。）のエトキシ基を加水分解させてシリカと重合させることで、結果的にシリカと前記色素分子をペプチド結合によって結合させる方法がある（例えば、特許文献１参照）。しかし前記手法でシリカ粒子を調製する場合、ＴＥＯＳの方が前記色素結合ＡＰＳよりも反応速度が速く、結果として前記色素結合ＡＰＳはシリカ粒子の表面近傍ないしは表面に高濃度に偏在することになる。
色素の種類によっては前記色素結合ＡＰＳのシリカ粒子への取り込み効率が非常に低いものもある。そのような場合十分な量の色素をシリカ粒子に取り込ませるためには過剰量の前記色素結合ＡＰＳを前記アンモニア水含有溶媒に含有させなければならず、前記色素結合ＡＰＳが高価であるため、コストがかさんでしまう。
また、表面修飾の際などに前記の手法で得られたシリカ粒子をアンモニア水や水酸化ナトリウムなどの塩基性溶液に曝すと、前記シリカ粒子表面のシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）が加水分解され、粒子表面に偏在していた色素結合オルガノシロキサン成分が脱離してしまう問題があった。色素分子をシリカ粒子に取り込んで標識試薬とする場合、シリカ粒子から脱離した色素分子はターゲット物質以外のものと非特異的結合を起こしてシグナル／ノイズ比低下の原因となってしまう。さらに、シリカ粒子表面に存在する色素分子がシリカ粒子の表面修飾処理の際に悪影響を及ぼすという問題もあった。
Depending on the type of the dye, there is a thing in which the incorporation efficiency of the dye-bound APS into the silica particles is very low. In such a case, in order to incorporate a sufficient amount of the dye into the silica particles, an excessive amount of the dye-bound APS must be contained in the ammonia water-containing solvent. It ’s a mess.
In addition, when the silica particles obtained by the above method are exposed to a basic solution such as aqueous ammonia or sodium hydroxide during surface modification, siloxane bonds (Si-O bonds) on the silica particle surfaces are hydrolyzed. There was a problem that the dye-bonded organosiloxane component that was unevenly distributed on the particle surface was detached. When the dye molecules are incorporated into the silica particles and used as the labeling reagent, the dye molecules detached from the silica particles cause non-specific binding with substances other than the target substance, causing a reduction in the signal / noise ratio. Further, there is a problem that the dye molecules existing on the surface of the silica particles have an adverse effect on the surface modification treatment of the silica particles.
本発明の目的は、上記の問題点に鑑みて、蛍光色素分子、吸光色素分子等の機能性分子のシリカ粒子への取り込み効率を向上させる積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、アルカリ溶液下で前記シリカナノ粒子から前記機能性分子が脱離することを抑制するシリカのシェル層を有する積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、及びそれにより製造される積層構造のシリカナノ粒子を提供することにある。また、本発明の目的は、測定結果の再現性に優れる、極微量標的物質の高感度定量分析が可能な標識試薬を提供することにある。 In view of the above problems, an object of the present invention is to provide a method for producing a silica nanoparticle having a laminated structure that improves the efficiency of incorporation of functional molecules such as fluorescent dye molecules and light-absorbing dye molecules into silica particles, under an alkaline solution. It is an object of the present invention to provide a method for producing a silica nanoparticle having a laminated structure having a silica shell layer that suppresses the functional molecules from detaching from the silica nanoparticle, and a silica nanoparticle having a laminated structure produced thereby. Another object of the present invention is to provide a labeling reagent that is excellent in reproducibility of measurement results and capable of highly sensitive quantitative analysis of an extremely small amount of target substance.
上記課題は下記の手段により達成された。
（１） 次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなることを特徴とする積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、
（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させ、機能性分子含有シリカ粒子を調製する工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）により前記機能性分子含有シリカ粒子を調製した後に、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が残存する前記アンモニア水含有溶媒にテトラアルコキシシランをさらに含有させ、加水分解と縮重合とにより前記機能性分子を含有するシリカの層を前記シリカ粒子の表面上に形成し、調製されるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量を増大する工程、
The above problems have been achieved by the following means.
(1) A method for producing silica nanoparticles having a laminated structure, comprising the following steps (a) and (b):
(A) a step of hydrolyzing a functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound together with a tetraalkoxysilane in an aqueous ammonia-containing solvent, followed by condensation polymerization of the hydrolyzate to prepare functional molecule-containing silica particles, and (b) After preparing the functional molecule-containing silica particles by the step (a), the ammonia water-containing solvent in which the functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound remains further contains tetraalkoxysilane, hydrolysis and condensation polymerization, Forming a layer of silica containing the functional molecules on the surface of the silica particles to increase the content of the functional molecules per silica particle to be prepared,
（２） 前記工程（ｂ）の代わりに下記工程（ｃ）を、又は前記工程（ｂ）の後、さらに下記工程（ｃ）を含んでなることを特徴とする（１）に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、
（ｃ）前記工程（ａ）又は（ｂ）の反応液を、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有しない新たなアンモニア水含有溶媒を用いて溶媒置換した後、テトラアルコキシシランをさらに含有させ加水分解と縮重合とにより、前記工程（ａ）又は（ｂ）により調製された前記機能性分子含有シリカ粒子に含有される前記機能性分子１００質量部に対して、２０質量部以下の前記機能性分子を含有するあるいは前記機能性分子を含有しないシリカのシェル層を前記シリカ粒子の表面上に形成する工程、
（３） 前記工程（ｂ）を２回以上繰り返すことを特徴とする（１）又は（２）に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、
（４） 前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）のアミノ基と機能性分子のカルボキシル基とをペプチド結合により連結させた化合物であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか１項に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
（５） 前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の製造方法によって得られた積層構造のシリカナノ粒子、
(2) The laminated structure according to (1), further comprising the following step (c) instead of the step (b), or further comprising the following step (c) after the step (b) A method for producing silica nanoparticles of
(C) The reaction liquid in the step (a) or (b) is solvent-substituted using a new ammonia water-containing solvent not containing the functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound, and further contains tetraalkoxysilane. The function of 20 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of the functional molecule contained in the functional molecule-containing silica particles prepared by the step (a) or (b) by hydrolysis and condensation polymerization. Forming a silica shell layer on the surface of the silica particles containing a functional molecule or not containing the functional molecule,
(3) The method for producing silica nanoparticles having a laminated structure according to (1) or (2), wherein the step (b) is repeated twice or more,
(4) The functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound is a compound in which an amino group of 3-aminopropyltriethoxysilane (APS) and a carboxyl group of a functional molecule are linked by a peptide bond. (1) The manufacturing method of the silica nanoparticle of the laminated structure of any one of (3).
(5) Silica nanoparticles having a laminated structure obtained by the production method according to any one of (1) to (4),
（６） 最も外側の前記シリカの層が、前記機能性分子を含有しないシリカのシェル層であることを特徴とする（５）に記載の積層構造のシリカナノ粒子、
（７） 平均粒径が２０〜１００ｎｍであり、かつ変動係数が１５％以下であることを特徴とする（５）又は（６）に記載の積層構造のシリカナノ粒子、
（８） 平均粒径が１００〜５００ｎｍであり、かつ変動係数が１０％以下であることを特徴とする（５）又は（６）に記載の積層構造のシリカナノ粒子、及び
（９） 前記（５）〜（８）のいずれか１項に記載の積層構造のシリカナノ粒子を用いて調製される標識試薬
を提供するものである。
本明細書及び特許請求の範囲において、「シリカナノ粒子」とは、平均粒径が、１，０００ｎｍ以下のコロイドシリカ粒子をいう。前記シリカナノ粒子を標識試薬として用いる場合、検出物質や検出法によって使用するのに好適な粒子径は様々であるが、２０〜５００ｎｍの範囲内である場合が多く、この範囲にあるシリカナノ粒子であることが好ましい。
(6) The outermost silica layer is a silica shell layer that does not contain the functional molecule, and the silica nanoparticles having a laminated structure according to (5),
(7) The silica nanoparticles having a laminated structure according to (5) or (6), wherein the average particle diameter is 20 to 100 nm and the coefficient of variation is 15% or less,
(8) The average particle diameter is 100 to 500 nm, and the coefficient of variation is 10% or less, and the silica nanoparticles having a laminated structure according to (5) or (6), and (9) The labeling reagent prepared using the silica nanoparticle of laminated structure of any one of (1)-(8) is provided.
In the present specification and claims, “silica nanoparticles” refers to colloidal silica particles having an average particle diameter of 1,000 nm or less. When the silica nanoparticles are used as a labeling reagent, the particle diameters suitable for use depending on the detection substance and the detection method are various, but are often in the range of 20 to 500 nm, and the silica nanoparticles are in this range. It is preferable.
本発明の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法は、機能性分子の前記シリカ粒子への取り込み効率を向上させることができる。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法は、前記シリカ粒子の最も外側に、アルカリ溶液下で前記シリカナノ粒子から機能性分子が脱離することを抑制するシリカのシェル層を形成できる。
The method for producing a silica nanoparticle having a laminated structure of the present invention can improve the efficiency of incorporating functional molecules into the silica particles.
In the method for producing a silica nanoparticle having a laminated structure according to the present invention, a silica shell layer can be formed on the outermost side of the silica particle, which suppresses the release of functional molecules from the silica nanoparticle under an alkaline solution.
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、蛍光色素分子、吸光色素分子等の機能性分子を高濃度に含有させられ、高感度の標識試薬として用いることが可能である。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前記シリカ粒子の最も外側に、アルカリ溶液下で機能性分子が脱離することを抑制するシリカのシェル層を有するので、高いアルカリ溶液耐性を持つ。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は平均粒径がナノメートルサイズであり、かつ粒度分布の幅が狭く粒径が揃っている。
本発明の標識試薬は、平均粒径が揃った前記シリカナノ粒子を用いてなるので、測定結果の再現性に優れ、信頼性が高い極微量標的物質の高感度定量分析が可能である。
The silica nanoparticles having a laminated structure of the present invention contain functional molecules such as fluorescent dye molecules and light-absorbing dye molecules at high concentrations, and can be used as highly sensitive labeling reagents.
The silica nanoparticles having a laminated structure of the present invention have a high alkali solution resistance because they have a silica shell layer on the outermost side of the silica particles that suppresses the release of functional molecules under an alkaline solution.
The silica nanoparticles of the laminated structure of the present invention have an average particle size of nanometer size, and a narrow particle size distribution width and uniform particle size.
Since the labeling reagent of the present invention uses the above-mentioned silica nanoparticles having a uniform average particle diameter, it is possible to perform highly sensitive quantitative analysis of an extremely small amount of target substance with excellent reproducibility of measurement results and high reliability.
まず、本発明の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法（以下、単に「本発明の製造方法」という。）について説明する。
本発明の製造方法は、次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなる。
（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物に由来する機能性分子結合オルガノシロキサン成分を含有するコアとなるシリカ粒子（以下、「機能性分子含有シリカ粒子」という。）を調製する工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）により前記コアとなる前記機能性分子含有シリカ粒子を調製した後に、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が残存する前記アンモニア水含有溶媒に前記テトラアルコキシシランをさらに含有させ、加水分解と縮重合とによるシロキサン結合形成により、前記機能性分子を含有するシリカの層を前記シリカ粒子の表面上に形成し、調製されるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量を増大する工程。
First, a method for producing a silica nanoparticle having a laminated structure of the present invention (hereinafter simply referred to as “the production method of the present invention”) will be described.
The production method of the present invention comprises the following steps (a) and (b).
(A) The functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound is hydrolyzed in a solvent containing ammonia water together with tetraalkoxysilane and then hydrolyzed to form a siloxane bond by hydrolyzing the hydrolyzate. A step of preparing silica particles (hereinafter referred to as “functional molecule-containing silica particles”) containing a functional molecule-bonded organosiloxane component derived from a compound, and (b) the core by the step (a). After the functional molecule-containing silica particles are prepared, the tetraalkoxysilane is further added to the ammonia water-containing solvent in which the functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound remains, and siloxane bonds are formed by hydrolysis and condensation polymerization. Formation of silica containing the functional molecule Step the formed on the surface of the silica particles, to increase the content of the functional molecule per silica particles prepared with.
本発明の製造方法において、前記工程（ｂ）の代わりに下記工程（ｃ）を、又は前記工程（ｂ）の後、さらに下記工程（ｃ）を含むことが好ましい。
（ｃ）前記工程（ａ）又は（ｂ）の反応液を、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有しない新たなアンモニア水含有溶媒を用いて溶媒置換処理し上記調製されたシリカ粒子を再分散させた後、テトラアルコキシシランをさらに含有させ加水分解と縮重合とにより、シリカのシェル層を前記シリカ粒子の表面上に形成する工程。
In the manufacturing method of this invention, it is preferable that the following process (c) is included instead of the said process (b), or the following process (c) is further included after the said process (b).
(C) The reaction solution of the step (a) or (b) is subjected to solvent substitution treatment using a new ammonia water-containing solvent not containing the functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound, and the silica particles prepared above are re-reacted. A step of forming a silica shell layer on the surface of the silica particles by further containing a tetraalkoxysilane after the dispersion and by hydrolysis and condensation polymerization.
本発明において、溶媒置換とは、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有する前記工程（ａ）又は（ｂ）の反応液を、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有しない新たなアンモニア水含有溶媒で置換することをいい、詳しくはエタノール洗浄、水洗浄等の洗浄操作、減圧蒸留等を行わないこととする。
具体的な溶媒置換処理操作としては、前記工程（ａ）又は工程（ｂ）の終了後、得られた反応液を２００×ｇ〜２，０００×ｇを５〜２０分の弱い遠心分離により粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去し、得られた沈殿物を前記新たなアンモニア水含有溶媒に再分散させる方法や、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行った後、前記新たなアンモニア水含有溶媒に再分散させる方法等が挙げられる。
In the present invention, solvent substitution means that the reaction liquid of the step (a) or (b) containing the functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound is replaced with new ammonia that does not contain the functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound. Substitution with a water-containing solvent, specifically, washing operations such as ethanol washing and water washing, and vacuum distillation are not performed.
As a specific solvent replacement treatment operation, after the completion of the step (a) or the step (b), the reaction solution obtained was subjected to 200 × g to 2,000 × g by weak centrifugation for 5 to 20 minutes. After the sedimentation, the supernatant was immediately removed, and the resulting precipitate was redispersed in the new ammonia water-containing solvent, YM-10, YM-100 (both trade names, manufactured by Millipore) And the like, and then re-dispersing in the new ammonia water-containing solvent.
前記工程（ｃ）において、形成されるシリカのシェル層は、前記機能性分子を含有しないことが好ましい。
前記工程（ｃ）において、上記溶媒置換によっても粒子表面等に残存する前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を前記新たなアンモニア水含有溶媒に含有させてもよく、前記工程（ａ）又は（ｂ）により調製された前記機能性分子含有シリカ粒子に含有される前記機能性分子１００質量部に対して、２０質量部以下の前記機能性分子を含有するシリカのシェル層が形成されてもよく、１５質量部以下の前記機能性分子を含有するシリカのシェル層が形成されることが好ましい。
前記工程（ｃ）により、本発明の製造方法により調製されるシリカナノ粒子にアルカリ溶液に対する高い耐性を付与することができる。
In the step (c), the formed silica shell layer preferably does not contain the functional molecule.
In the step (c), the functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound remaining on the particle surface or the like even after the solvent replacement may be contained in the new ammonia water-containing solvent, and the step (a) or (b A silica shell layer containing 20 parts by mass or less of the functional molecule may be formed with respect to 100 parts by mass of the functional molecule contained in the functional molecule-containing silica particles prepared by It is preferable that a silica shell layer containing 15 parts by mass or less of the functional molecule is formed.
By the said process (c), the high tolerance with respect to an alkaline solution can be provided to the silica nanoparticle prepared by the manufacturing method of this invention.
本発明の製造方法において前記工程（ｂ）を、２回以上繰り返すことにより、得られるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量をさらに増大させることが好ましい。ただし前記工程（ｂ）を何度も繰り返すのは煩雑であり、またそれによって合成されるシリカ粒子の粒度分布が広くなるという弊害もあることから、前記工程（ｂ）の繰り返し回数をいくらでも多くすればよいというわけではない。実際には、前記コアとなる前記シリカ粒子の表面上に１〜６層の前記機能性分子を含有するシリカの層を形成するために、前記工程（ｂ）を１〜６回行うことが好ましい。
本発明に用いる前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物は、互いに反応して結合を形成する活性部位を持つ機能性分子とオルガノアルコキシシランとを反応させることで得ることができる。例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）のアミノ基と機能性分子が持つカルボキシル基を脱水縮合させてペプチド結合を形成させる手法がある。カルボキシル基とスクシンイミドを縮合させたＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基を持つ機能性分子であれば、ＡＰＳと混合させるだけでアミノ基と反応してペプチド結合でつながれた機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を得ることができ、好ましい。
In the production method of the present invention, it is preferable that the content of the functional molecule per silica particle to be obtained is further increased by repeating the step (b) twice or more. However, it is troublesome to repeat the step (b) many times, and there is an adverse effect that the particle size distribution of the silica particles synthesized thereby becomes wide, so the number of repetitions of the step (b) can be increased as much as possible. That's not to say. Actually, in order to form a layer of silica containing 1 to 6 layers of the functional molecule on the surface of the silica particles as the core, the step (b) is preferably performed 1 to 6 times. .
The functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound used in the present invention can be obtained by reacting an organoalkoxysilane with a functional molecule having an active site that reacts with each other to form a bond. For example, there is a technique in which a peptide bond is formed by dehydration condensation of an amino group of 3-aminopropyltriethoxysilane (APS) and a carboxyl group of a functional molecule. If it is a functional molecule having an N-hydroxysuccinimide (NHS) ester group obtained by condensing a carboxyl group and succinimide, the functional molecule-bonded organoalkoxysilane linked with a peptide bond by reacting with an amino group simply by mixing with APS Compounds can be obtained and are preferred.
ここで、前記機能性分子の具体例としては、蛍光色素分子（例えば、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、フルオレセイン）、吸光色素分子、磁性分子、放射線標識分子、ｐＨ感受性色素分子等が挙げられる。
前記活性基を有する前記機能性分子の好ましい具体例として、下記式でそれぞれ表される５−カルボキシＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステル、５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＮＨＳエステル、５−カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳエステル（いずれも商品名；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物を挙げることができる。
Here, specific examples of the functional molecule include fluorescent dye molecules (for example, TAMRA, rhodamine 6G, fluorescein), light-absorbing dye molecules, magnetic molecules, radiolabeled molecules, pH-sensitive dye molecules, and the like.
Preferable specific examples of the functional molecule having the active group include 5-carboxyTAMRA-NHS ester, 5-carboxyrhodamine 6G-NHS ester, and 5-carboxyfluorescein-NHS ester represented by the following formulas (all products) Name: a fluorescent dye compound having an NHS ester group such as Invitrogen).
前記活性基を有する前記オルガノアルコキシシランは、商業的に市販のものを入手することも可能である。
前記反応性基を有するオルガノアルコキシシランの具体例として、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するオルガノアルコキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン等のメルカプト基を有するオルガノアルコキシシラン等を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。メルカプト基を有するオルガノアルコキシシランを用いる場合は、マレイミド基を持つ機能性分子と結合させることができる。
The said organoalkoxysilane which has the said active group can also obtain a commercially available thing.
Specific examples of the organoalkoxysilane having the reactive group include organoalkoxysilane having an amino group such as 3-aminopropyltriethoxysilane (APS) and 3-aminopropyltrimethoxysilane, 3-mercaptopropyltrimethoxysilane, and the like. And organoalkoxysilane having a mercapto group. Of these, APS is preferable. When an organoalkoxysilane having a mercapto group is used, it can be combined with a functional molecule having a maleimide group.
前記ＮＨＳエステル基を有する機能性分子と前記アミノ基を有するオルガノアルコキシシランとの反応は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）やＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）等の溶媒に溶解した後、室温（例えば、２５℃）条件下で攪拌しながら反応することによって行うことができる。
その場合反応に用いる前記ＮＨＳエステル基を有する機能性分子と前記アミノ基を有するオルガノアルコキシシランとの割合は、モル換算で等量であることが好ましい。ＮＨＳエステル基を有する機能性分子は一般に高価なためできるだけ無駄を少なくしたいが、アミノ基を有するオルガノアルコキシシランの割合が高いと未反応のアミノ基を持つオルガノアルコキシシランがシリカ粒子に取り込まれることになり、シリカ粒子が純水中で凝集傾向を持ってしまうことがある。
The reaction between the functional molecule having the NHS ester group and the organoalkoxysilane having the amino group is dissolved in a solvent such as DMSO (dimethyl sulfoxide) or DMF (N, N-dimethylformamide) and then at room temperature (for example, The reaction can be carried out with stirring under the conditions of (25 ° C.).
In that case, the ratio of the functional molecule having the NHS ester group used in the reaction and the organoalkoxysilane having the amino group is preferably equivalent in terms of mole. Since functional molecules having NHS ester groups are generally expensive, we want to reduce waste as much as possible. However, if the proportion of organoalkoxysilanes having amino groups is high, organoalkoxysilanes having unreacted amino groups are incorporated into silica particles. Thus, the silica particles may have a tendency to aggregate in pure water.
本発明の製造方法に用いられる前記テトラアルコキシシランとしては、例えば、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、テトラメトキシシラン等が挙げられ、ＴＥＯＳが好ましい。 Examples of the tetraalkoxysilane used in the production method of the present invention include tetraethoxysilane (TEOS) and tetramethoxysilane, and TEOS is preferable.
前記テトラアルコキシシランのアルコキシ基は前記アンモニア水含有溶媒の中で加水分解されてヒドロキシル基となり、さらにそれらが脱水縮合してシロキサン結合を形成する。
一般にシリカとは、シロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）に基づくケイ素原子及び酸素原子からなる３次元構造体を指すが、ここでは前述のようなオルガノシロキサン成分を含有するケイ素原子及び酸素原子からなる３次元構造体を含むものとする。
The alkoxy group of the tetraalkoxysilane is hydrolyzed in the aqueous ammonia-containing solvent to become a hydroxyl group, and they are dehydrated and condensed to form a siloxane bond.
In general, silica refers to a three-dimensional structure composed of a silicon atom and an oxygen atom based on a siloxane bond (Si—O bond). Here, the silica is composed of a silicon atom and an oxygen atom containing an organosiloxane component as described above. It shall include a dimensional structure.
本発明における前記工程（ａ）について、テトラアルコキシシランとしてＴＥＯＳを用いた場合を下記スキームに例示する。 About the said process (a) in this invention, the case where TEOS is used as tetraalkoxysilane is illustrated in the following scheme.
本発明の製造方法の前記工程（ａ）において、前記テトラアルコキシシランの前記アンモニア水含有溶媒に含有させる量は、高すぎると粒子同士の融合が発生しやすくなり、逆に低すぎても粒度分布が広がる傾向にある。具体的には０．１〜２．０体積％であることが好ましく、０．２〜１．０体積％であることがより好ましい。
本発明の製造方法の前記工程（ａ）において、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物の前記アンモニア水含有溶媒中に含有させる量は、前記テトラアルコキシシランとの混合モル比率として、１：１００〜１：５の範囲で反応させることが好ましく、１：５０〜１：１０の範囲で反応させることがより好ましい。
この溶解ないしは含有させておく前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物の量により、得られる積層構造のシリカナノ粒子中の前記機能性分子の含有量を制御できる。
In the step (a) of the production method of the present invention, if the amount of the tetraalkoxysilane contained in the ammonia water-containing solvent is too high, the particles tend to coalesce with each other. Tend to spread. Specifically, it is preferably 0.1 to 2.0% by volume, and more preferably 0.2 to 1.0% by volume.
In the step (a) of the production method of the present invention, the amount of the functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound to be contained in the ammonia water-containing solvent is from 1: 100 to a mixed molar ratio with the tetraalkoxysilane. It is preferable to make it react in the range of 1: 5, and it is more preferable to make it react in the range of 1: 50-1: 10.
The content of the functional molecule in the silica nanoparticles having a laminated structure can be controlled by the amount of the functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound to be dissolved or contained.
前記アンモニア水含有溶媒において、水と混合させる前記親水性溶媒としては、エタノール、メタノール等が挙げられるが、エタノールが好ましい。前記水と前記親水性溶媒との体積比が１：２０〜１：３の混合溶媒であることが好ましく、１：６〜１：４の混合溶媒であることがより好ましい。
本発明の製造方法で用いられるアンモニア水含有溶媒に含有させるアンモニア水の濃度は、目的の積層構造のシリカナノ粒子の平均粒径を制御する観点から、１〜２８質量％であることが好ましく、２〜１４質量％であることがより好ましい。
In the ammonia water-containing solvent, the hydrophilic solvent to be mixed with water includes ethanol, methanol and the like, and ethanol is preferable. The volume ratio of the water and the hydrophilic solvent is preferably a mixed solvent of 1:20 to 1: 3, more preferably a mixed solvent of 1: 6 to 1: 4.
The concentration of the ammonia water contained in the ammonia water-containing solvent used in the production method of the present invention is preferably 1 to 28% by mass from the viewpoint of controlling the average particle diameter of the silica nanoparticles having the target laminated structure. More preferably, it is -14 mass%.
前記アンモニアの含有量（アンモニア濃度）が高いほどシリカ粒子の核形成頻度、シリカ粒子の成長速度共に高くなるが、そのアンモニア濃度依存性はシリカ粒子の成長速度の方が高い。したがって、このアンモニア濃度依存性の違い（差）によりアンモニアの濃度を調節することで目的の積層構造の前記シリカナノ粒子及び前記コアとなる前記シリカ粒子の平均粒径を調整することができる。
前記工程（ａ）における前記コアとなる前記シリカ粒子の形成の温度条件としては特に制限はないが、高温で合成を行うとシリカへの機能性分子の取り込み効率を高めることができる。したがって、機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は３５〜６０℃の温度条件下で行うことが好ましい。反応時間としては特に制限はないが、反応時間を長くするとシリカへの機能性分子の取り込み効率を高めることができる。したがって、機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は４〜４８時間反応させることが好ましい。
The higher the ammonia content (ammonia concentration), the higher the nucleation frequency of the silica particles and the growth rate of the silica particles, but the dependence on the ammonia concentration is higher for the growth rate of the silica particles. Therefore, by adjusting the ammonia concentration based on the difference (difference) in dependency on the ammonia concentration, the average particle diameter of the silica nanoparticles having the target laminated structure and the silica particles serving as the core can be adjusted.
Although there is no restriction | limiting in particular as temperature conditions of formation of the said silica particle used as the said core in the said process (a), If it synthesize | combines at high temperature, the uptake | capture efficiency of a functional molecule to a silica can be improved. Therefore, when it is desired to increase the uptake efficiency of the functional molecule, it is preferably carried out under a temperature condition of 35 to 60 ° C. Although there is no restriction | limiting in particular as reaction time, If the reaction time is lengthened, the uptake | capture efficiency of a functional molecule to a silica can be improved. Therefore, when it is desired to increase the uptake efficiency of the functional molecule, the reaction is preferably performed for 4 to 48 hours.
前記機能性分子として蛍光色素分子を用いる場合、前記工程（ｂ）において、後述するＦＲＥＴによる自己消光を防止するためには１０ｎｍ以上の厚みの色素分子を多く含まないシェル層を形成させることが望ましい。前記テトラアルコキシシランと比べて反応速度の遅い色素結合ＡＰＳをシリカ粒子に取り込む場合、前記コアとなるシリカ粒子の表面近傍に色素分子が偏在することになり、ここで前記工程（ｂ）を施すとさらに含有された前記テトラアルコキシシランが色素を多く含まない前記シリカの層を形成することになる。さらに時間をかけると新たに形成された層の表面近傍にも色素が多く取り込まれることになるが、前記コアの表面に偏在する色素からは１０ｎｍ以上隔たれていることになり、ＦＲＥＴによる自己消光を効果的に防止することができる。 When a fluorescent dye molecule is used as the functional molecule, in the step (b), in order to prevent self-quenching due to FRET, which will be described later, it is desirable to form a shell layer that does not contain many dye molecules having a thickness of 10 nm or more. . When the dye-bound APS having a slower reaction rate than the tetraalkoxysilane is incorporated into the silica particles, the dye molecules are unevenly distributed in the vicinity of the surface of the core silica particles, and the step (b) is performed here. Further, the contained tetraalkoxysilane forms a layer of the silica containing no pigment. If more time is taken, a large amount of dye is also taken in the vicinity of the surface of the newly formed layer, but it is separated from the dye unevenly distributed on the surface of the core by 10 nm or more, and self-quenching by FRET is prevented. It can be effectively prevented.
１０ｎｍ以上の層を形成させるために前記アンモニア水含有溶媒にさらに含有させる前記テトラアルコキシシランの量は、その時点で形成されているシリカ粒子の粒径によって異なる。例えば平均粒径３０ｎｍのシリカ粒子に１０ｎｍの層を形成させるためには、前記工程（ａ）において使用した前記テトラアルコキシシラン１００質量部に対して１００〜１２０質量部が好ましく、平均粒径１００ｎｍのシリカ粒子に１０ｎｍの層を形成させるためには、前記工程（ａ）において使用した前記テトラアルコキシシラン１００質量部に対して３０〜３６質量部が好ましい。
前記工程（ｂ）における前記シリカ層の形成温度条件としては特に制限はないが、前記工程（ａ）の場合と同様機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は３５〜６０℃の温度条件下で行うことが好ましい。反応時間としては特に制限はないが、前記工程（ａ）の場合と同様機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は４〜４８時間反応させることが好ましい。
The amount of the tetraalkoxysilane further contained in the ammonia water-containing solvent in order to form a layer of 10 nm or more varies depending on the particle size of the silica particles formed at that time. For example, in order to form a 10 nm layer on silica particles having an average particle diameter of 30 nm, 100 to 120 parts by mass is preferable with respect to 100 parts by mass of the tetraalkoxysilane used in the step (a), and an average particle diameter of 100 nm is used. In order to form a 10 nm layer on the silica particles, the amount is preferably 30 to 36 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the tetraalkoxysilane used in the step (a).
Although there is no restriction | limiting in particular as the formation temperature conditions of the said silica layer in the said process (b), When it wants to make high functional molecule uptake | capture efficiency like the said process (a), it is 35-60 degreeC temperature conditions. Preferably it is done. Although there is no restriction | limiting in particular as reaction time, It is preferable to make it react for 4 to 48 hours, when raising the uptake | capture efficiency of a functional molecule like the case of the said process (a).
実施例の項において図３を参照して後述するように、前記工程（ｃ）の前に、前記工程（ａ）又は（ｂ）で調製された反応液についてシリカ粒子の洗浄又は精製を行うとアンモニア水含有溶媒中で粒子同士の凝集傾向が生じてしまい、前記工程（ｃ）のシェル形成反応により前記シリカ粒子同士の不可逆的な融合が生じてしまう。
前記工程（ｃ）における前記シリカシェルの形成反応の温度条件としては特に制限はないが、除去しきれずに残留する機能性分子の取り込みを極力抑えたい場合には前記工程（ａ）や（ｂ）の場合とは逆に低い温度、すなわち０〜２０℃の温度条件下で行うことが好ましい。反応時間としては特に制限はないが、上記のような事情の場合には短時間、すなわち１〜３時間にとどめることが好ましい。
本発明の製造方法によれば、球状、もしくは、球状に近いシリカナノ粒子が製造できる。球状に近いシリカナノ粒子とは、具体的には長径と短径の比が１．２以下の形状である。
所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収する手法がある。
As described later with reference to FIG. 3 in the Example section, before the step (c), the silica particles are washed or purified with respect to the reaction solution prepared in the step (a) or (b). Aggregation tendency of particles occurs in the ammonia water-containing solvent, and irreversible fusion of the silica particles occurs due to the shell formation reaction in the step (c).
The temperature condition of the silica shell formation reaction in the step (c) is not particularly limited. However, when it is desired to suppress the incorporation of the remaining functional molecules without being removed, the steps (a) and (b) On the contrary, it is preferable to carry out the reaction at a low temperature, that is, at a temperature of 0 to 20 ° C. Although there is no restriction | limiting in particular as reaction time, In the above situations, it is preferable to keep it for a short time, ie, 1-3 hours.
According to the production method of the present invention, spherical or nearly spherical silica nanoparticles can be produced. The nearly spherical silica nanoparticles specifically have a shape in which the ratio of the major axis to the minor axis is 1.2 or less.
In order to obtain silica particles having a desired average particle diameter, there is a technique of performing centrifugation at an appropriate gravity acceleration and collecting only the supernatant or the precipitate.
次に、本発明の積層構造のシリカナノ粒子について説明する。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述した本発明の製造方法により製造することができる。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前記工程（ａ）により得られた前記機能性分子含有シリカ粒子をコアとし、前記シリカ粒子の表面上を１層又は２層以上のシリカの層がシロキサン結合により包囲してなる積層構造のシリカナノ粒子であることを特徴とする。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子において、前記シリカの層数としては、１〜６層であることが好ましい。
前述のように、前記工程（ａ）により得られたコアとなる前記シリカ粒子を調製する場合、テトラアルコキシシランの方が前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物よりも反応速度が速い。そのため、合成初期にはテトラアルコキシシランが反応して形成されるシリカに含有される前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分の比率が低く、逆に合成後期には前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分の比率が高くなる。結果として、前記コアとなる前記シリカ粒子の内部においては、前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分が表面近傍ないしは表面に高濃度に偏在することになる。前記工程（ｂ）により前記シリカの層を形成する場合においても同様に、前記シリカの層の外側に前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分が高濃度に偏在することになる。
Next, the silica nanoparticles having a laminated structure of the present invention will be described.
The silica nanoparticles having the laminated structure of the present invention can be produced by the production method of the present invention described above.
The silica nanoparticles having a laminated structure of the present invention have the functional molecule-containing silica particles obtained by the step (a) as a core, and one or more silica layers are bonded to the surface of the silica particles by a siloxane bond. It is characterized in that it is a silica nanoparticle having a laminated structure surrounded by.
In the silica nanoparticles having a laminated structure of the present invention, the number of silica layers is preferably 1 to 6 layers.
As described above, when preparing the silica particles to be the core obtained in the step (a), the reaction rate of tetraalkoxysilane is faster than that of the functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound. Therefore, the ratio of the functional molecule-bonded organosiloxane component contained in the silica formed by the reaction of tetraalkoxysilane is low at the beginning of synthesis, and conversely, the ratio of the functional molecule-bonded organosiloxane component is late in the synthesis. Becomes higher. As a result, the functional molecule-bonded organosiloxane component is unevenly distributed in the vicinity of the surface or on the surface in a high concentration inside the silica particles serving as the core. Similarly, when the silica layer is formed by the step (b), the functional molecule-bonded organosiloxane component is unevenly distributed at a high concentration outside the silica layer.
前記機能性分子として蛍光色素分子を用いる場合であって、前記工程（ｂ）でシリカの層を２層以上形成する場合、あるシリカ層における前記蛍光色素分子成分が高濃度に偏在する部分と、それに隣接するシリカ層における前記蛍光色素分子成分が高濃度に偏在する部分との距離が近すぎるとＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｔ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ；蛍光共鳴エネルギー遷移）が生じ、前記蛍光色素分子成分間で自己消光を起こして蛍光強度が低下してしまう（例えば、Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂ ７３，２４５３０２（２００６）参照。）。
そこで、本発明の積層構造のシリカナノ粒子において、前記シリカの層の厚みは、前記ＦＲＥＴによる自己消光を防止する観点から、７ｎｍ以上が好ましく、１０ｎｍ以上がより好ましく、１０〜２０ｎｍがさらに好ましい。
ただし、前記シリカの層が厚くなるとシリカ粒子の重量が増大し、それによりコロイド重量あたりの蛍光強度が減少することになる。そのため、コロイド重量あたりの蛍光強度を高くするには前記ＦＲＥＴによる自己消光が抑制される範囲で前記シリカの層を極力薄くすることが好ましい。
In the case where fluorescent dye molecules are used as the functional molecules, and when two or more layers of silica are formed in the step (b), the fluorescent dye molecule component in a certain silica layer is unevenly distributed at a high concentration; If the distance from the portion where the fluorescent dye molecular component is unevenly distributed in the silica layer adjacent thereto is too close, FRET (Fluorescence resonance energy transfer) occurs, and self-quenching occurs between the fluorescent dye molecular components. As a result, the fluorescence intensity decreases (see, for example, Physical Review B 73, 245302 (2006)).
Therefore, in the silica nanoparticles having a laminated structure of the present invention, the thickness of the silica layer is preferably 7 nm or more, more preferably 10 nm or more, and further preferably 10 to 20 nm, from the viewpoint of preventing self-quenching by the FRET.
However, as the silica layer becomes thicker, the weight of the silica particles increases, and thereby the fluorescence intensity per colloidal weight decreases. Therefore, in order to increase the fluorescence intensity per colloidal weight, it is preferable to make the silica layer as thin as possible within a range in which self-quenching by the FRET is suppressed.
本発明の積層構造のシリカナノ粒子に、前述のようにアルカリ溶液耐性を付与する観点から、最も外側のシリカの層が、前記工程（ｃ）により形成された前記機能性分子を含有しないシリカのシェル層であることが好ましい。
ただし、前記機能性分子を含有しない純粋なシリカのシェル層でもゆっくりではあるがアルカリ溶液によって溶かされていく。そのため、前記シェル層が厚いほど長時間、もしくは強いアルカリ溶液に耐えることができる。最も外側の前記機能性分子を含有しないシェル層の厚みは、前述のアルカリ溶液耐性を付与する観点から、７ｎｍ以上が好ましく、１０ｎｍ以上がより好ましく、１０〜２０ｎｍがさらに好ましい。
ただし、前記シェル層が厚くなるとシリカ粒子の重量が増大し、それによりコロイド重量あたりの蛍光強度が減少することになる。そのため、コロイド重量あたりの蛍光強度を高くするには必要なアルカリ溶液耐性が得られる範囲で前記シェル層を極力薄くすることが好ましい。
From the viewpoint of imparting alkali solution resistance to the silica nanoparticles having the laminated structure of the present invention, the outermost silica layer does not contain the functional molecule formed by the step (c). A layer is preferred.
However, the pure silica shell layer not containing the functional molecules is slowly dissolved by the alkaline solution. Therefore, the thicker the shell layer, the longer it can withstand a strong alkaline solution. The thickness of the outermost shell layer that does not contain the functional molecule is preferably 7 nm or more, more preferably 10 nm or more, and even more preferably 10 to 20 nm, from the viewpoint of imparting the aforementioned alkali solution resistance.
However, as the shell layer becomes thicker, the weight of the silica particles increases, thereby reducing the fluorescence intensity per colloidal weight. For this reason, it is preferable to make the shell layer as thin as possible within a range where the alkali solution resistance necessary for increasing the fluorescence intensity per colloidal weight is obtained.
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法における前記アンモニア水含有溶媒中のアンモニアの含有量を制御すること、並びに前記工程（ｂ）を１回又は２回以上繰り返すことで制御することにより粒径が揃ったｎｍサイズの所望の平均粒径とすることができる。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から直接各粒子（少なくとも１００個）の長径と短径を測定し、その平均値を計算して求めたものである。
本発明により得られたシリカナノ粒子の粒度分布の変動係数（以下ＣＶということもある。）は、１５％以下が好ましく、１０％以下がより好ましい。ここで、前記変動係数は、粒度の分布の標準偏差を平均粒径で割った値をいう。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法における前記アンモニア水含有溶媒中のアンモニアの含有量を制御すること、並びに前記工程（ｂ）を１回又は２回以上繰り返すことで制御することにより２０〜１００ｎｍの範囲にある平均粒径とした場合、変動係数は１５％以下とすることができる。
As described above, the silica nanoparticle having a laminated structure of the present invention controls the content of ammonia in the aqueous ammonia-containing solvent in the production method of the present invention, and the step (b) is performed once or twice or more. By controlling by repeating, it is possible to obtain a desired average particle size of nm size with uniform particle size.
In the present invention, the average particle diameter is determined by measuring the major axis and minor axis of each particle (at least 100 particles) directly from an image such as a transmission electron microscope (TEM), a scanning electron microscope (SEM), and the like. It is obtained by calculation.
The variation coefficient (hereinafter sometimes referred to as CV) of the particle size distribution of the silica nanoparticles obtained by the present invention is preferably 15% or less, and more preferably 10% or less. Here, the coefficient of variation refers to a value obtained by dividing the standard deviation of the particle size distribution by the average particle size.
As described above, the silica nanoparticle having a laminated structure of the present invention controls the content of ammonia in the aqueous ammonia-containing solvent in the production method of the present invention, and the step (b) is performed once or twice or more. When the average particle diameter is in the range of 20 to 100 nm by controlling by repetition, the variation coefficient can be 15% or less.
また、本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、１００〜５００ｎｍの範囲にある平均粒径とした場合、変動係数は１０％以下とすることができる。
本明細書及び特許請求の範囲において、単分散とはＣＶ１５％以下の粒子群をいう。
前述の通り、例えばＡＰＳなどのオルガノアルコキシシランと結合させてテトラアルコキシシランと共に反応させることで、前記機能性分子をシリカ粒子に取り込むことができる。ただしその取り込み効率は結合させる機能性分子の種類によって異なり、例えば蛍光色素であるカルボキシフルオレセイン色素をＡＰＳと結合させたオルガノアルコキシシラン化合物は取り込み効率が低い。取り込み効率の低い機能性物質をシリカ粒子に十分取り込ませるためには合成の際に多くのオルガノアルコキシシラン化合物を投入する必要があり、その場合投入した大部分のオルガノアルコキシシラン化合物が取り込まれずに廃棄されることになるため、コスト増大の要因となる。
Further, when the silica nanoparticles having a laminated structure of the present invention have an average particle diameter in the range of 100 to 500 nm, the coefficient of variation can be 10% or less.
In the present specification and claims, monodisperse means a particle group having a CV of 15% or less.
As described above, the functional molecule can be incorporated into the silica particles by reacting with an organoalkoxysilane such as APS and reacting with tetraalkoxysilane. However, the uptake efficiency varies depending on the type of functional molecule to be bonded. For example, an organoalkoxysilane compound in which a carboxyfluorescein dye, which is a fluorescent dye, is combined with APS has low uptake efficiency. In order to fully incorporate the functional substance with low uptake efficiency into the silica particles, it is necessary to put in a lot of organoalkoxysilane compounds during the synthesis, in which case most of the added organoalkoxysilane compounds are discarded without being taken up. As a result, the cost increases.
これに対して、本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法において、前記工程（ｂ）を１回又は２回以上繰り返すことにより、前記機能性分子を高い効率で取り込むことができる。前記機能性分子のシリカ粒子への取り込み効率の低さは、その反応速度の遅さに起因している。反応速度の遅いオルガノアルコキシシラン化合物はテトラアルコキシシランによってシリカ粒子が合成された後で粒子表面に徐々に結合していくが、その密度が高くなると取り込まれにくくなり、ついにはオルガノアルコキシシラン化合物の取り込まれる量と脱離する量が同じになって平衡状態に達し、オルガノアルコキシシラン化合物はそれ以上取り込まれなくなる。この状態で前記工程（ｂ）を施せばシリカ粒子の表面に新たなシリカの層が形成され、その表面にも同様にオルガノアルコキシシラン化合物が高密度に結合することで、一粒子あたりのオルガノアルコキシシラン化合物の結合量を増大させることができる。
一般的には前記機能性分子の取り込み量は多いほど好ましいが、蛍光色素に関しては濃度消光による蛍光強度の低下があるため最適な取り込み量が存在する。その量は１ｍｌあたり３×１０１７分子程度であり、これは粒径１００ｎｍのシリカ粒子に換算すると約１３，０００分子に相当する。本発明の積層構造のシリカナノ粒子では、シリカ粒子への取り込み効率の低いカルボキシフルオレセイン色素分子でも少ない投入量でこのシリカ粒子内密度を達成することができる。
On the other hand, as described above, the silica nanoparticle having a laminated structure according to the present invention has a high efficiency by repeating the step (b) once or twice or more in the production method of the present invention. Can be imported. The low efficiency of incorporation of the functional molecules into the silica particles is due to the slow reaction rate. The organoalkoxysilane compound, which has a slow reaction rate, is gradually bonded to the particle surface after the silica particles are synthesized by tetraalkoxysilane. The amount to be released and the amount to be released become the same, reaching an equilibrium state, and the organoalkoxysilane compound is not taken in any more. When the step (b) is performed in this state, a new silica layer is formed on the surface of the silica particles, and the organoalkoxysilane compound is similarly bonded to the surface at a high density, so that the organoalkoxy per particle is bonded. The bonding amount of the silane compound can be increased.
In general, the larger the amount of the functional molecule incorporated, the better. However, there is an optimum amount of fluorescent dye due to a decrease in fluorescence intensity due to concentration quenching. The amount is about 3 × 10 17 molecules per ml, which corresponds to about 13,000 molecules when converted to silica particles having a particle size of 100 nm. In the silica nanoparticles having a laminated structure of the present invention, the density in silica particles can be achieved with a small amount of input even with carboxyfluorescein dye molecules having low incorporation efficiency into silica particles.
次に「シリカナノ粒子表面修飾」について説明する。
シリカは、一般に、化学的に不活性であると共に、その修飾が容易であることが知られている。本発明の積層構造のシリカナノ粒子もまた、容易に所望の物質を表面に結合させることが可能である。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、所望の標的生体分子を分子認識する物質を表面に結合もしくは吸着させることが好ましい。
前記積層構造のシリカナノ粒子が、前記機能性分子として蛍光色素分子もしくは吸光色素分子を含有する場合、検体（例えば、任意の細胞抽出液、溶菌液、培地・培養液、溶液、バッファー）中の標的生体分子（生理活性物質を含む。）を蛍光ないしは吸光色素標識付けすることができる。
前記積層構造のシリカナノ粒子を表面修飾する前記標的生体分子を分子認識する物質としては、抗体、抗原、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖鎖、リガンド、受容体、化学物質等が挙げられる。
ここで、分子認識とは、（１）ＤＮＡ分子間又はＤＮＡ−ＲＮＡ分子間のハイブリダイゼーション、（２）抗原抗体反応、（３）酵素（受容体）−基質（リガンド）間の反応など、生体分子間の特異的相互作用をいう。
Next, “silica nanoparticle surface modification” will be described.
Silica is generally known to be chemically inert and easy to modify. The silica nanoparticles having the laminated structure of the present invention can also easily bind a desired substance to the surface.
The silica nanoparticles having a laminated structure of the present invention preferably bind or adsorb a substance that recognizes a desired target biomolecule to the surface.
When the layered silica nanoparticles contain a fluorescent dye molecule or a light absorbing dye molecule as the functional molecule, a target in a specimen (eg, any cell extract, lysate, medium / culture solution, solution, buffer) Biomolecules (including physiologically active substances) can be labeled with fluorescent or light absorbing dyes.
Examples of the substance that recognizes the target biomolecule that modifies the surface of the layered silica nanoparticles include antibodies, antigens, peptides, DNA, RNA, sugar chains, ligands, receptors, chemical substances, and the like.
Here, molecular recognition refers to (1) hybridization between DNA molecules or DNA-RNA molecules, (2) antigen-antibody reaction, (3) reaction between enzyme (receptor) and substrate (ligand), etc. A specific interaction between molecules.
ここで、リガンドとはタンパク質と特異的に結合する物質をいい、例えば、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子、あるいはホルモン、神経伝達物質などをいい、低分子量の分子やイオンばかりでなく、高分子量の物質も含む。
また化学物質とは天然有機化合物に限らず、人工的に合成された生理活性を有する化合物や環境ホルモン等を含む。
すなわち、前記シリカナノ粒子を表面修飾した標的生体分子を分子認識する物質は、それ自体が受容体部位となって、例えば抗原−抗体反応、ビオチン−アビジン反応、塩基配列の相補性を利用したハイブリダイゼーションなどの特異的な分子認識を利用して、標的生体分子に特異的に結合することができる。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子の表面への、前記生体分子による吸着等の表面修飾が、縮合剤ないしは架橋剤の存在下又は非存在下にて、前記積層構造のシリカナノ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより行われることが好ましい。
例えば、縮合剤等の非存在下、前記積層構造のシリカナノ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより、前記生体分子は、前記シリカナノ粒子の表面と吸着することができる。
Here, a ligand refers to a substance that specifically binds to a protein, such as a substrate that binds to an enzyme, a coenzyme, a regulatory factor, a hormone, or a neurotransmitter, as well as a low molecular weight molecule or ion. Also includes high molecular weight materials.
The chemical substances are not limited to natural organic compounds, but include artificially synthesized physiologically active compounds and environmental hormones.
That is, a substance that recognizes a target biomolecule whose surface has been modified with silica nanoparticles itself becomes a receptor site, and for example, hybridization using antigen-antibody reaction, biotin-avidin reaction, and complementarity of base sequences. Specific binding to a target biomolecule can be performed using specific molecular recognition such as.
The surface modification of the silica nanoparticles having the laminated structure of the present invention, such as adsorption by the biomolecule, is carried out in the presence or absence of a condensing agent or a cross-linking agent, and the colloid of the silica nanoparticles having the laminated structure and the living body. It is preferably carried out by mixing with a solution of molecules.
For example, in the absence of a condensing agent or the like, the biomolecule can be adsorbed on the surface of the silica nanoparticle by mixing the colloid of the silica nanoparticle having the laminated structure and the biomolecule solution.
前記縮合剤ないしは架橋剤を用いる場合の具体例としては、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等が挙げられる。
表面修飾に用いる前記縮合剤ないしは架橋剤の当量数、前記コロイドの分散媒、前記生体分子の溶液の溶媒の種類・容量、及び反応温度等の反応条件については表面修飾が進行する限り特に制限はない。
前記表面修飾した後、前記積層構造のシリカナノ粒子と前記シリカナノ粒子に結合ないし吸着していない前記生体分子との分離は、遠心分離または限外ろ過によって可能である。
前記生体分子により前記シリカナノ粒子を表面修飾した後は、前述の非特異的吸着をさらに防止する観点から、ＰＥＧ、ＢＳＡなどの任意のブロッキング剤でブロッキング処理を施してもよい。
前記生体分子の表面修飾が出来たかどうかの確認は、混合液から遠心分離または限外ろ過で粒子を除去した溶液に含まれる前記生体分子を一般的なタンパク質定量法（例えば、ＵＶ法、Ｌｏｗｒｙ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）で定量し、減少した前記生体分子の量を定量することで行うことができる。
Specific examples in the case of using the condensing agent or the crosslinking agent include N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide (EMCS), glutaraldehyde, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Etc.
Regarding the reaction conditions such as the number of equivalents of the condensing agent or crosslinking agent used for surface modification, the colloidal dispersion medium, the type and volume of the solvent of the biomolecule solution, and the reaction temperature, there are no particular restrictions as long as the surface modification proceeds. Absent.
After the surface modification, the silica nanoparticles having the laminated structure can be separated from the biomolecules that are not bound to or adsorbed to the silica nanoparticles by centrifugation or ultrafiltration.
After the surface modification of the silica nanoparticles with the biomolecule, blocking treatment may be performed with an arbitrary blocking agent such as PEG or BSA from the viewpoint of further preventing the above-mentioned non-specific adsorption.
Confirmation of whether the surface modification of the biomolecule has been made can be performed by performing a general protein quantification method (for example, UV method, Lowry method) on the biomolecule contained in the solution obtained by removing particles from the mixed solution by centrifugation or ultrafiltration. , Bradford method), and the amount of the reduced biomolecule can be quantified.
次に、本発明の標識試薬について説明する。
本発明の標識試薬は、本発明の積層構造のシリカナノ粒子を用いてなる。前記積層構造のシリカナノ粒子を用いて、蛍光ないし吸光色素標識を付与することが好ましい。さらに前述のシリカナノ粒子の表面修飾により抗体やホルモンなどの標的生体分子を分子認識する物質でシリカ粒子表面を修飾し、光学特性を検出する装置又は目視によって前記標的生体分子が評価されるべき試料中に存在するか否か等の評価を可能にする標識試薬として利用することができる。
本発明の標識試薬の具体例としては、生体分子検出試薬、生体分子定量試薬、生体分子分離試薬、生体分子回収試薬または免疫染色用試薬が挙げられる。
前記標的生体分子を検出、定量、分離または回収する分析試薬とすることができる。また、前記標的生体分子との分子認識が、抗原−抗体反応である場合は、前記シリカナノ粒子を用いてなる免疫染色用試薬とすることができる。
Next, the labeling reagent of the present invention will be described.
The labeling reagent of the present invention uses the silica nanoparticles having the laminated structure of the present invention. It is preferable to give a fluorescent or light-absorbing dye label by using the silica nanoparticles having the laminated structure. Further, the surface of the silica nanoparticles is modified with a substance that recognizes the target biomolecule such as an antibody or a hormone by the surface modification of the silica nanoparticle, and the target biomolecule is to be evaluated by a device for detecting optical characteristics or by visual observation. It can be used as a labeling reagent that makes it possible to evaluate whether or not it exists.
Specific examples of the labeling reagent of the present invention include a biomolecule detection reagent, a biomolecule quantification reagent, a biomolecule separation reagent, a biomolecule recovery reagent, or an immunostaining reagent.
The target biomolecule can be used as an analytical reagent for detecting, quantifying, separating or recovering. Moreover, when the molecular recognition with the said target biomolecule is an antigen-antibody reaction, it can be set as the reagent for immuno-staining which uses the said silica nanoparticle.
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１（本発明の積層構造のシリカナノ粒子の調製）
１．工程（ａ）
１４質量％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍に希釈しアンモニア水含有溶媒１００ｍｌとし、その中に０．５体積％となる体積５００μｌのＴＥＯＳを、前記ＴＥＯＳと同体積のカルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳのＤＭＦ溶液を、それぞれ、添加して室温（２５℃）にて撹拌した。
ここで、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物としての前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳは下記式で表され、前記カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳエステルとＡＰＳとを反応させたものを用いた。前記ＤＭＦ溶液は４０ｍＭの濃度に調整したものを用いた。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples. The present invention is not limited to these examples.
Example 1 (Preparation of silica nanoparticles having a laminated structure of the present invention)
1. Step (a)
14% by mass of ammonia water was further diluted 5-fold with ethanol to make 100 ml of ammonia water-containing solvent, and 500 μl of TEOS in a volume of 0.5% by volume was added to DMF of carboxyfluorescein-APS having the same volume as TEOS. Each solution was added and stirred at room temperature (25 ° C.).
Here, the carboxyfluorescein-APS as the functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound is represented by the following formula, and a product obtained by reacting the carboxyfluorescein-NHS ester with APS was used. The DMF solution used was adjusted to a concentration of 40 mM.
撹拌１時間ほどでシリカコロイドの生成はほぼ完了したが、蛍光強度を測定すると極めて弱く、前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳが粒子に取り込まれるにはなお２〜３時間を要した。
蛍光強度の測定の結果から、反応開始から４〜５時間経過すると前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳの取り込み速度が減少してきた。ここまでの操作を工程（ａ）とする。
前記工程（ａ）により得られたシェル層無しのシリカナノ粒子の蛍光強度を後述する図１において対照とした。
なお、前記シリカ粒子の蛍光強度の測定は、蛍光分光光度計ＦＰ−６５００（商品名、日本分光社製）を用いて、４９０ｎｍの励起光における５２０ｎｍの蛍光強度を測定した。
The formation of the silica colloid was almost completed in about 1 hour with stirring, but it was very weak when the fluorescence intensity was measured, and it still took 2-3 hours for the carboxyfluorescein-APS to be incorporated into the particles.
From the result of the measurement of the fluorescence intensity, the uptake rate of the carboxyfluorescein-APS decreased after 4 to 5 hours from the start of the reaction. The operation so far is referred to as step (a).
The fluorescence intensity of the silica nanoparticles without the shell layer obtained by the step (a) was used as a control in FIG.
In addition, the fluorescence intensity of the said silica particle measured the fluorescence intensity of 520 nm in 490 nm excitation light using the fluorescence spectrophotometer FP-6500 (brand name, JASCO Corporation make).
２．工程（ｂ）
工程（ａ）で得られたシリカ粒子に、前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳを取り込む余地の豊富なシリカを提供するため、ＴＥＯＳを追加投入し室温５時間反応させ、１層のシリカ層を有するシリカナノ粒子を得た。
ＴＥＯＳの追加投入量は、工程（ａ）における投入量の５０％分とした。
さらに、この工程（ｂ）のシェル形成操作を繰り返して積層構造とした粒子も調製した。すなわち、この工程（ｂ）をさらに１回繰り返して２層のシェル層を有するシリカナノ粒子、この工程（ｂ）をさらに２回繰り返して３層のシェル層を有するシリカナノ粒子を、それぞれ、調製した。２回目以降のＴＥＯＳの追加投入量も工程（ａ）における投入量の５０％分とした。
上記得られた各シリカナノ粒子を、それぞれ、洗浄し、平均粒径及び蛍光強度を測定した。
具体的な洗浄操作としては、反応終了後、遠心分離（５０００×ｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去した。得られた沈殿物をエタノールに再分散させ、再度遠心分離（５０００×ｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた。同様のエタノール洗浄操作をさらに１回繰り返し、未反応のＴＥＯＳ等を除去した。さらにエタノールの代わりに蒸留水を用いた以外は同様な洗浄操作を４回行い、遊離色素等を除去した。
2. Step (b)
In order to provide the silica particles obtained in step (a) with abundant room for incorporating the carboxyfluorescein-APS, TEOS was additionally added and reacted for 5 hours at room temperature to obtain silica nanoparticles having one silica layer. Obtained.
The additional input amount of TEOS was 50% of the input amount in step (a).
Furthermore, the shell formation operation of this process (b) was repeated and the particle | grains made into the laminated structure were also prepared. That is, this step (b) was repeated once more to prepare silica nanoparticles having two shell layers, and this step (b) was further repeated twice to prepare silica nanoparticles having three shell layers. The additional amount of TEOS added after the second time was also set to 50% of the amount charged in step (a).
Each silica nanoparticle obtained above was washed, and the average particle size and fluorescence intensity were measured.
As a specific washing operation, after completion of the reaction, centrifugation (5000 × g) was performed for 30 minutes to settle the particles, and then the supernatant was immediately removed. The resulting precipitate was redispersed in ethanol and centrifuged again (5000 × g) for 30 minutes to precipitate the particles. The same ethanol washing operation was further repeated once to remove unreacted TEOS and the like. Further, the same washing operation was performed 4 times except that distilled water was used in place of ethanol to remove free dye and the like.
３．平均粒径測定
上記得られた各シリカナノ粒子の平均粒径は、ＳＥＭ画像に写っている各粒子（１００個以上）の直径を測定し、その平均値として算出した。
前記工程（ａ）により得られた対照としてのシェル層無しのシリカナノ粒子の平均粒径は、変動係数９．０％の粒度分布で平均粒径１９０ｎｍであった。
前記工程（ｂ）により得られたシェル層を１層、２層、３層を有するシリカナノ粒子の平均粒径は、それぞれ、シェル層分だけ平均粒径が増加し、１９８ｎｍ（変動係数８．６％）、２０４ｎｍ（変動係数７．８％）、２０９ｎｍ（変動係数６．１％）であった。
４．蛍光強度測定
前記工程（ａ）により得られた対照としてのシェル層無しのシリカナノ粒子、前記工程（ｂ）により得られたシェル層を１層、２層、３層有するシリカナノ粒子、それぞれの蛍光強度を前述と同様な装置、測定条件で測定した。図１に得られた結果を示す。
3. Average Particle Size Measurement The average particle size of each silica nanoparticle obtained above was calculated as the average value of the diameter of each particle (100 or more) shown in the SEM image.
The average particle size of silica nanoparticles without a shell layer as a control obtained by the step (a) was 190 nm with a particle size distribution with a coefficient of variation of 9.0%.
The average particle diameter of the silica nanoparticles having one, two, and three shell layers obtained by the step (b) is increased by the shell layer, and the average particle diameter is 198 nm (coefficient of variation 8.6). %), 204 nm (variation coefficient 7.8%), and 209 nm (variation coefficient 6.1%).
4). Fluorescence intensity measurement Silica nanoparticles without a shell layer as a control obtained by the step (a), silica nanoparticles having one layer, two layers, and three layers of the shell layer obtained by the step (b), each fluorescence intensity Was measured using the same apparatus and measurement conditions as described above. FIG. 1 shows the results obtained.
図１は、０層（対照）、１層、２層、３層のシリカ層をそれぞれ形成してなるシリカナノ粒子の蛍光強度を示す図である。
図１において、一定量である工程（ａ）において添加したカルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳの添加量で規格化（ノーマライズ）したシリカナノ粒子の蛍光強度（前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳ添加量当りの蛍光強度）、及び測定対象となったシリカコロイドの質量濃度で規格化した蛍光強度（シリカナノ粒子の質量当りの蛍光強度）の２通りで示した。いずれも単位はａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ（ａｕ：任意単位）として表した。以下同様である。
FIG. 1 is a graph showing the fluorescence intensity of silica nanoparticles formed by forming 0 layer (control), 1 layer, 2 layers, and 3 layers of silica layers, respectively.
In FIG. 1, the fluorescence intensity of the silica nanoparticles normalized (normalized) with the added amount of carboxyfluorescein-APS added in step (a), which is a constant amount (fluorescence intensity per added amount of carboxyfluorescein-APS), and measurement The fluorescence intensity normalized with the mass concentration of the target silica colloid (fluorescence intensity per mass of silica nanoparticles) is shown in two ways. In any case, the unit was expressed as an arbitrary unit (au: arbitrary unit). The same applies hereinafter.
図１から明らかなように、シリカナノ粒子の層数を１層、２層、３層と増加するごとに前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳ投入量当りのシリカナノ粒子の蛍光強度は直線的に増加している。これにより、前記工程（ｂ）を行うごとに、アンモニア水含有溶媒に残存するカルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳが取り込まれていることがわかる。
一方、シリカナノ粒子の質量当りの蛍光強度については、シェルを１層形成することでシェル無しの対照の場合より１３％増大し、シェルを２層形成するとシェル無しの対照の場合より４３％増大した。しかしシェルを３層形成すると、その増大量は２９％に低下した。これは、シェルを形成することによってシリカナノ粒子の質量が増大し、その結果蛍光強度の増大率がシリカコロイドの質量濃度の増大率を下回ったからである。このことから、２層のシェルを形成することが最も機能性分子の取り込み効率が高い結果となった。
しかし、シェル形成のために追加するＴＥＯＳの量を適宜減じることにより、シリカナノ粒子の質量の増加率を抑えられるため、上記結果よりもさらにシリカコロイドの質量濃度当りの蛍光強度、すなわち機能性分子の取り込み効率を高めることができる。
As is apparent from FIG. 1, the fluorescence intensity of the silica nanoparticles per unit amount of carboxyfluorescein-APS increases linearly as the number of layers of silica nanoparticles increases to one layer, two layers, and three layers. Thereby, it turns out that the carboxyfluorescein-APS which remains in the ammonia water containing solvent is taken in whenever the said process (b) is performed.
On the other hand, the fluorescence intensity per mass of the silica nanoparticles was increased by 13% by forming one shell, compared with the control without shell, and increased by 43% when forming two shells, compared with the control without shell. . However, when three layers of shells were formed, the increase was reduced to 29%. This is because the formation of the shell increases the mass of the silica nanoparticles, and as a result, the increase rate of the fluorescence intensity is lower than the increase rate of the silica colloid mass concentration. For this reason, the formation of a two-layer shell resulted in the highest functional molecule uptake efficiency.
However, since the rate of increase in the mass of silica nanoparticles can be suppressed by appropriately reducing the amount of TEOS added for shell formation, the fluorescence intensity per mass concentration of silica colloid, that is, the functional molecule Uptake efficiency can be increased.
実施例２（本発明の積層構造の吸光型シリカナノ粒子の調製）
１．工程（ａ）
色素を高濃度に含有する吸光型シリカコロイドを合成すべく、２質量％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍に希釈してアンモニア水含有溶媒１００ｍｌとし、その中に０．５体積％となる体積５００μｌのＴＥＯＳを前記ＴＥＯＳと同体積のカルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳのＤＭＦ溶液を、それぞれ、添加して室温にて撹拌した。
ここで、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物としての前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳは下記式で表され、前記５−カルボキシＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステルとＡＰＳとを反応させたものを用いた。前記ＤＭＦ溶液は４０ｍＭの濃度に調整したものを用いた。
Example 2 (Preparation of light-absorbing silica nanoparticles having a laminated structure of the present invention)
1. Step (a)
In order to synthesize a light-absorbing silica colloid containing a high concentration of dye, 2% by mass of ammonia water was further diluted 5-fold with ethanol to make 100 ml of ammonia water-containing solvent, and the volume that would be 0.5% by volume therein. A DMF solution of carboxyTAMRA-APS having the same volume as TEOS was added to 500 μl of TEOS, followed by stirring at room temperature.
Here, the carboxy TAMRA-APS as the functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound is represented by the following formula, and a product obtained by reacting the 5-carboxy TAMRA-NHS ester with APS was used. The DMF solution used was adjusted to a concentration of 40 mM.
室温下、撹拌３時間ほどでシリカ粒子のコロイドが生成したが、この場合前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳの投入量が多いため、シリカ粒子内部に取り込まれずに溶液中に残留する前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳの比率が高かった。
溶液中の遊離色素による蛍光強度の測定の結果から、反応開始から７〜８時間経過すると前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳの取り込み速度が減少し、反応終了とした。得られた粒子は、カルボキシＴＡＭＲＡ色素がシリカ粒子の表面近傍ないしは表面に偏在していた。
A colloid of silica particles was formed in about 3 hours of stirring at room temperature. In this case, since the amount of the carboxyTAMRA-APS was large, the ratio of the carboxyTAMRA-APS remaining in the solution without being taken into the silica particles. Was expensive.
From the result of the measurement of the fluorescence intensity by the free dye in the solution, the carboxyTAMRA-APS uptake rate decreased after 7-8 hours from the start of the reaction, and the reaction was terminated. In the obtained particles, the carboxy TAMRA dye was unevenly distributed near or on the surface of the silica particles.
２．工程（ｂ）
実施例１の工程（ｂ）と同様な操作によりＴＥＯＳを追加投入し反応させ、反応終了後、実施例１と同様な洗浄操作を行った。その結果、１層のシリカ層を有するシリカナノ粒子を得た（平均粒径８７ｎｍ）。得られたシリカ粒子を実施例２のシリカナノ粒子とする。
溶液中に前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳが残存する状態で反応させ、シェルを形成しているので、シェル層の表面近傍ないしは表面にも多くの色素が結合していた。
2. Step (b)
TEOS was additionally added and reacted by the same operation as in step (b) of Example 1, and after the reaction, the same washing operation as in Example 1 was performed. As a result, silica nanoparticles having one silica layer were obtained (average particle size 87 nm). The obtained silica particles are referred to as silica nanoparticles of Example 2.
Since the reaction was carried out with the carboxy TAMRA-APS remaining in the solution to form a shell, many dyes were bound near or on the surface of the shell layer.
実施例３（本発明の機能性分子脱離防止用シェル層を有するシリカナノ粒子の調製）
１．工程（ｃ）
実施例２の工程（ａ）と同様な操作により得たシリカ粒子を、工程（ｂ）を行うことなく、アルカリ水溶液耐性を付与するための前記ＴＡＭＲＡを含有しないシェル層を形成するため、以下の工程（ｃ）に供した。
工程（ａ）終了後、得られたシリカ粒子を前記洗浄操作に供することなく、前記ＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳを含有しない新たなアンモニア水含有溶媒で溶媒置換処理を行った。具体的には、１，０００×ｇ、１０分の条件で遠心分離により粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去後、得られた沈殿物を２質量％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍に希釈して得た新たなアンモニア水含有溶媒１００ｍｌに再分散させ溶媒置換した。
Example 3 (Preparation of silica nanoparticles having a shell layer for preventing functional molecule elimination of the present invention)
1. Step (c)
In order to form a shell layer not containing TAMRA for imparting alkali aqueous solution resistance to silica particles obtained by the same operation as in step (a) of Example 2, without performing step (b), the following It used for the process (c).
After completion of the step (a), the obtained silica particles were subjected to a solvent substitution treatment with a new ammonia water-containing solvent not containing TAMRA-APS without being subjected to the washing operation. Specifically, after sedimentation of particles by centrifugation at 1,000 × g for 10 minutes, the supernatant was immediately removed, and the resulting precipitate was further added with 2% by mass of ammonia water with ethanol. The solvent was replaced by redispersion in 100 ml of a new ammonia water-containing solvent obtained by 5-fold dilution.
次に、工程（ａ）における投入量と等量のＴＥＯＳを投入し室温２時間反応させ、反応終了後、実施例１と同様な洗浄操作を行った。その結果、前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素をほとんど含有しない１層のシリカのシェル層を有するシリカナノ粒子を得た（収量１７０ｍｇ分；コロイド乾燥重量、収率６３％）。得られたシリカ粒子を実施例３のシリカナノ粒子とする。
図３に得られたシリカナノ粒子のＳＥＭ画像を示す。なお、図１中のスケールバーは６００ｎｍを示す（倍率５万倍）。図中、白く見える球状物質が、得られた積層構造のシリカナノ粒子である。粒子同士が融合するような不具合が生じていないことがわかる。
ＳＥＭ画像に写っている各粒子（２００個以上）の直径を測定し、その粒度分布を算出したところ、変動係数１４．７％で平均粒径８８ｎｍであった。
Next, TEOS having the same amount as that in the step (a) was added and reacted at room temperature for 2 hours. After the reaction was completed, the same washing operation as in Example 1 was performed. As a result, silica nanoparticles having a single silica shell layer containing almost no carboxy TAMRA dye were obtained (yield: 170 mg; colloid dry weight, yield: 63%). The obtained silica particles are referred to as silica nanoparticles of Example 3.
FIG. 3 shows an SEM image of the silica nanoparticles obtained. In addition, the scale bar in FIG. 1 shows 600 nm (magnification 50,000 times). In the figure, spherical substances that appear white are the silica nanoparticles of the resulting laminated structure. It turns out that the malfunction which particle | grains fuse | melt does not arise.
When the diameter of each particle (200 or more) shown in the SEM image was measured and the particle size distribution was calculated, the coefficient of variation was 14.7% and the average particle size was 88 nm.
２．比較試験
実施例２の工程（ａ）と同様な操作により得たシリカ粒子を、アルカリ水溶液耐性を付与するシェル層を形成するための前記工程（ｃ）に供する前に、実施例１と同様な洗浄操作を行った後、工程（ｃ）を行うことを試みた。
工程（ａ）終了後、実施例１と同様な洗浄操作を行ったシリカ粒子を再度シリカ粒子合成液に分散させて新たにＴＥＯＳを投入したところ、反応に供したシリカ粒子同士が融合してしまった。
図４に得られたシリカ粒子のＳＥＭ画像を示す。なお、図４中のスケールバーは１．０μｍを示す（倍率３万倍）。図中、白く見える物質が、得られたシリカ粒子である。図４から明らかなように、粒子の多くがいびつな形状をしており、反応に供したシリカ粒子同士の融合が頻繁に発生したことがわかる。
2. Comparative test The silica particles obtained by the same operation as in step (a) of Example 2 were the same as in Example 1 before being subjected to the above-mentioned step (c) for forming a shell layer imparting alkali aqueous solution resistance. After performing the washing operation, an attempt was made to perform the step (c).
After the completion of the step (a), silica particles subjected to the same washing operation as in Example 1 were dispersed again in the silica particle synthesis solution and TEOS was newly added. As a result, the silica particles subjected to the reaction were fused together. It was.
FIG. 4 shows an SEM image of the silica particles obtained. In addition, the scale bar in FIG. 4 shows 1.0 micrometer (magnification 30,000 times). In the figure, the substances that appear white are the silica particles obtained. As can be seen from FIG. 4, many of the particles have an irregular shape, and it is found that the silica particles subjected to the reaction frequently fused.
３．アンモニア水溶液によるエッチング試験
前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素を含有する１層のシリカ層を有する実施例２のシリカナノ粒子、前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素を含有しない１層のシリカのシェル層を有する実施例３のシリカナノ粒子を、それぞれ、２．８質量％のアンモニア水溶液中に分散させ、アンモニア水溶液によるエッチング試験を行い、アルカリ水溶液に対する耐性を評価した。
色素の脱離量は、遠心分離によって前記アンモニア水溶液からシリカ粒子を除去した残りの溶媒を回収し、その中に遊離している色素がシリカ粒子から脱離した色素とみなし、その蛍光強度を測定することで、その評価を行った。
3. Etching test with aqueous ammonia solution The silica nanoparticles of Example 2 having one silica layer containing the carboxy TAMRA dye, the silica nanoparticles of Example 3 having a silica shell layer not containing the carboxy TAMRA dye, Each was dispersed in a 2.8% by mass aqueous ammonia solution, and an etching test with an aqueous ammonia solution was conducted to evaluate the resistance to an aqueous alkaline solution.
The amount of dye desorbed is measured by collecting the remaining solvent from which the silica particles have been removed from the aqueous ammonia solution by centrifugation, and assuming that the dye that has been liberated therein is desorbed from the silica particles, and measuring the fluorescence intensity. The evaluation was done.
図４は、エッチング処理１時間後、２時間後それぞれの脱離カルボキシＴＡＭＲＡ色素による蛍光強度のグラフを示す図である。
図４から明らかなように、前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素を含有する１層のシリカ層を有する実施例２のシリカナノ粒子については、１時間後には、蛍光強度にして４０００ａｕ以上の大量の前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素がシリカ粒子から脱離してしまったことがわかる。２時間後にも同様に約１８０００ａｕの蛍光強度が検出され、大量の脱離が起こっていることがわかる。
FIG. 4 is a graph showing fluorescence intensities of the desorbed carboxy TAMRA dyes after 1 hour and 2 hours after the etching treatment.
As is apparent from FIG. 4, the silica nanoparticles of Example 2 having one silica layer containing the carboxy TAMRA dye had a large amount of the carboxy TAMRA dye having a fluorescence intensity of 4000 au or more after 1 hour. It can be seen that it has been detached from the silica particles. Similarly, after 2 hours, a fluorescence intensity of about 18000 au is detected, indicating that a large amount of desorption occurs.
一方、前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素を含有しない１層のシリカのシェル層を有する実施例３のシリカナノ粒子については、１時間後の前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素の脱離量は、蛍光強度にして５００ａｕ未満の僅かな量にとどまったことがわかる。
実施例２のシリカナノ粒子の結果との比較から、実施例３のシリカナノ粒子についてはアルカリ溶液に対して耐性があるといえる。
２時間後についてはアンモニア水溶液中に約１４０００ａｕの蛍光強度が検出されたが、前記シェル層を越えてエッチングが進行したため、工程（ａ）で得られた粒子のコア部分から脱離したといえる。
On the other hand, with respect to the silica nanoparticles of Example 3 having a single silica shell layer that does not contain the carboxy TAMRA dye, the amount of the carboxy TAMRA dye desorbed after 1 hour is slightly less than 500 au in terms of fluorescence intensity. You can see that the amount remained.
From the comparison with the results of the silica nanoparticles of Example 2, it can be said that the silica nanoparticles of Example 3 are resistant to the alkaline solution.
After 2 hours, a fluorescence intensity of about 14000 au was detected in the aqueous ammonia solution. However, since etching progressed beyond the shell layer, it can be said that it was detached from the core portion of the particles obtained in step (a).
実施例４
（積層構造のシリカナノ粒子のコロイドへの抗体の吸着）
遠心管に５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）を１ｍＬと、実施例２の積層構造のシリカナノ粒子のコロイド（１０ｍｇ／ｍＬ）９ｍＬを加えて軽く撹拌した。遠心管に抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅｓ／５００８， Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）１ｍＬ（６０μｇ／ｍＬ）を撹拌しながら加え、室温で１時間静置した。これに１質量％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量２００００、和光純薬工業社製）を０．５５ｍＬ加え軽く撹拌し、更に１０％ＢＳＡを１．１ｍＬ加え軽く撹拌した。
混合液を１２，０００×Ｇで１５分間遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた。この分散液に保存用バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．２）， ０．０５％ ＰＥＧ２０，０００， １％ＢＳＡ， ０．１％ＮａＮ３）を２０ｍＬ加え、再度遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた（コロイドＡ）。
Example 4
(Adsorption of antibody to colloid of silica nanoparticles with laminated structure)
To the centrifuge tube, 1 mL of 50 mM KH 2 PO 4 (pH 6.5) and 9 mL of a colloid of silica nanoparticles having a laminated structure of Example 2 (10 mg / mL) were added and stirred gently. 1 mL (60 μg / mL) of an anti-hCG antibody (Anti-hCG clone codes / 5008, manufactured by Medix Biochemical) was added to the centrifuge tube with stirring, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. 0.55 mL of 1% by mass of PEG (polyethylene glycol, molecular weight 20000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added thereto and stirred gently, and 1.1 mL of 10% BSA was further added and stirred gently.
The mixed solution was centrifuged at 12,000 × G for 15 minutes, and about 1 mL of the supernatant was removed, and the precipitate was dispersed in the remaining supernatant. To this dispersion, 20 mL of a storage buffer (20 mM Tris-HCl (pH 8.2), 0.05% PEG 20,000, 1% BSA, 0.1% NaN 3 ) was added, centrifuged again, and the supernatant was recovered. About 1 mL was left and removed, and the precipitate was dispersed in the remaining supernatant (colloid A).
（分子認識試験）
続いて、前記抗ｈＣＧ抗体を表面修飾した積層構造のシリカナノ粒子のコロイド（コロイドＡ）１００μｌを９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた。次に、抗ＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が１ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）を用意した。図５は、分子認識試験に用いたストリップ１の平面図である。一方の末端２から約１５ｍｍの位置３にライン状に、前記溶液を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量（約１ｍｍ幅）で塗布したメンブレン４（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を５ｍｍ幅にカットし、ストリップ１（丈２５ｍｍ）とした。
前記ストリップ１の末端を前記９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた抗ｈＣＧ抗体を表面修飾した積層構造のシリカナノ粒子のコロイドに浸し、１時間放置した。
図５から明らかなように、抗ＩｇＧ抗体がライン状に塗布された部分３が赤く発色し、前記抗ｈＣＧ抗体を表面修飾した積層構造のシリカナノ粒子が形成されていることが確認された。また、本発明の積層構造のシリカナノ粒子が分析試薬として好適であることが分かる。
(Molecular recognition test)
Subsequently, 100 μl of a colloid of colloidal silica nanoparticles (colloid A) having a surface-modified anti-hCG antibody was placed in one of wells of a 96-well microplate. Next, a solution (50 mM KH 2 PO 4 , pH 7.0) containing 1 mg / mL of an anti-IgG antibody (Anti Mouse IgG, manufactured by Dako) was prepared. FIG. 5 is a plan view of the strip 1 used in the molecular recognition test. Membrane 4 (Hi-Flow Plus 120 membrane, manufactured by MILLIPORE) coated with the above solution at a coating amount (about 1 mm width) of 0.75 μL / cm in a line shape at a position 3 about 15 mm from one end 2 is 5 mm wide. To be a strip 1 (length 25 mm).
The end of the strip 1 was immersed in a colloid of laminated silica nanoparticles having a surface modified with an anti-hCG antibody placed in one of the wells of the 96-well microplate and left for 1 hour.
As is clear from FIG. 5, it was confirmed that the portion 3 where the anti-IgG antibody was applied in a line shape was colored red, and the silica nanoparticles having a laminated structure in which the anti-hCG antibody was surface-modified were formed. Moreover, it turns out that the silica nanoparticle of the laminated structure of this invention is suitable as an analytical reagent.
Claims (9)
（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させ、機能性分子含有シリカ粒子を調製する工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）により前記機能性分子含有シリカ粒子を調製した後に、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が残存する前記アンモニア水含有溶媒にテトラアルコキシシランをさらに含有させ、加水分解と縮重合とにより前記機能性分子を含有するシリカの層を前記シリカ粒子の表面上に形成し、調製されるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量を増大する工程。 A process for producing silica nanoparticles having a laminated structure, comprising the following steps (a) and (b):
(A) a step of hydrolyzing a functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound together with a tetraalkoxysilane in an aqueous ammonia-containing solvent, followed by condensation polymerization of the hydrolyzate to prepare functional molecule-containing silica particles, and (b) After preparing the functional molecule-containing silica particles by the step (a), the ammonia water-containing solvent in which the functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound remains further contains tetraalkoxysilane, hydrolysis and condensation polymerization, A step of forming a layer of silica containing the functional molecules on the surface of the silica particles to increase the content of the functional molecules per silica particle to be prepared.
（ｃ）前記工程（ａ）又は（ｂ）の反応液を、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有しない新たなアンモニア水含有溶媒を用いて溶媒置換した後、テトラアルコキシシランをさらに含有させ加水分解と縮重合とにより、前記工程（ａ）又は（ｂ）により調製された前記機能性分子含有シリカ粒子に含有される前記機能性分子１００質量部に対して、２０質量部以下の前記機能性分子を含有するあるいは前記機能性分子を含有しないシリカのシェル層を前記機能性分子含有シリカ粒子の表面上に形成する工程。 2. The laminated structure silica nanoparticles according to claim 1, further comprising the following step (c) instead of the step (b), or further comprising the following step (c) after the step (b). Manufacturing method.
(C) The reaction liquid in the step (a) or (b) is solvent-substituted using a new ammonia water-containing solvent not containing the functional molecule-bonded organoalkoxysilane compound, and further contains tetraalkoxysilane. The function of 20 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of the functional molecule contained in the functional molecule-containing silica particles prepared by the step (a) or (b) by hydrolysis and condensation polymerization. Forming a silica shell layer containing functional molecules or not containing functional molecules on the surface of the functional molecule-containing silica particles.
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