JP2008216092A - ポリペプチドのｎｍｒスペクトル測定・解析法、その方法に用いる試料、装置およびプログラム - Google Patents

ポリペプチドのｎｍｒスペクトル測定・解析法、その方法に用いる試料、装置およびプログラム Download PDF

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Abstract

【課題】従来ＮＭＲスペクトルの測定およびＮＭＲ法による解析が困難であったポリペプチドに対しても使用可能な、ＮＭＲ法によるポリペプチドの構造解析に関する技術を提供する。
【解決手段】目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルの測定方法であって、目的ポリペプチドと目的ポリペプチドより分子量の大きなタグポリペプチドと両ポリペプチドの間に介在して両ポリペプチドを結合させるリンカーとを含む融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを測定するステップを含む、測定方法。および、スペクトル解析による目的ポリペプチドの構造決定の方法。
【選択図】 図７

Description

本発明は、ポリペプチドのＮＭＲスペクトル測定・解析法、その方法に用いる試料、装置およびプログラムに関する。
近年、疾病に関係するタンパク質の立体構造を解析することは、疾病の原因や機構の解明においてますます重要性を増しつつあり、プロテオーム解析など蛋白質の構造や機能を迅速かつ網羅的に解析する試みが多く行われている。また、最近の薬剤開発においても、疾病に関係するタンパク質を見つけ、そのタンパク質の立体構造を解明することによって、標的タンパク質に結合する薬剤の構造を設計するという手法が取られつつある。このような手法を取ることにより、候補化合物を絞り込み、効果試験をする時間と経費を節約することが可能となる。
生体分子の立体構造決定法には、Ｘ線結晶解析法とＮＭＲ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：核磁気共鳴）法とが存在する。何れもÅ単位の原子座標を決定することができる。しかし、Ｘ線結晶解析法においては、基本的には結晶水を含む結晶中の構造としてタンパク質の立体構造が求められるため、動きのある部分は適切な回折像が得られにくく、構造を決定するのが困難である。一方、ＮＭＲ法においては、溶液中で平均的な構造として解析することができるという利点が知られている。
Ｘ線結晶解析法においては、試料となるタンパク質の溶解性および結晶性が要求される。一方、ＮＭＲ法による解析にはそのタンパク質の溶解性及び安定性が高いことが要求される。このような性質を達成するための方法としては、例えば、結晶構造解析においては、膜タンパク質の疎水面同士の会合を回避するために抗体を結合させたり脂質を混入する方法が知られている。一方、ＮＭＲ法においては、界面活性剤や塩を含んだ溶媒を用いてタンパク質の凝集を防ぐ方法が知られている。また、特許文献１には、タンパク質の溶解度を向上させるための技術として、親水性の１−２０残基程度の短いタグペプチドを付加する技術が公開されている。
特開２００６−１８８５０７号公報
ＮＭＲ測定用試料中のタンパク質の溶解度を向上させる技術としては、界面活性剤などを含む溶媒によるものが知られていた。しかし、疎水性等の目的タンパク質の性質によっては、溶媒のみでは溶解度を向上させることが困難なこともあり、また、溶媒の条件によっては、生理条件とは大きく異なることも多く、本来の高次構造を変性させてしまうため、さらなる改善の余地があった。また、個々のタンパク質によって溶解条件は大きく異なるため、大量の試行錯誤により条件検討する必要があり、簡便で適用範囲の広い手法の開発が望まれていた。
また、短い親水性タグポリペプチドを付加することでタンパク質全体としての親水性を向上させるという技術も知られていた。しかし、この手法では、短いポリペプチドでは親水性の向上の効果が小さく、また、目的ポリペプチドの電荷や塩基性・酸性に左右される場合も多く、目的ポリペプチドに応じたアミノ酸の選択が必要であるため、さらなる改善の余地があった。
一方、Ｘ線結晶構造解析法では稀に、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のような大きな親水性タグポリペプチドを含む融合ポリペプチドとして解析している例は存在していた。しかし、ＮＭＲ法においては、このように大きなタグポリペプチドは、目的タンパク質のシグナルを覆い隠してしまい、正常なＮＭＲスペクトルの測定ができないであろうと考えられていた（〔特許文献１〕参照のこと）。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、従来ＮＭＲスペクトルの測定およびＮＭＲ法による解析が困難であったポリペプチドに対しても使用可能な、ＮＭＲ法に関する技術を提供することを目的とするものである。
本発明によれば、目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルの測定方法であって、目的ポリペプチドと目的ポリペプチドより分子量の大きなタグポリペプチドと両ポリペプチドの間に介在して両ポリペプチドを結合させるリンカーとを含む融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを測定するステップを含む、測定方法が提供される。
この測定方法は、直接ＮＭＲスペクトルを測定することが困難な目的ポリペプチドに対しても、タグポリペプチドとの融合ポリペプチドを用いることでその溶解性・安定性を向上させ、ＮＭＲスペクトルの測定を可能にする。また、タグポリペプチドが目的ポリペプチドより大きく、かつリンカーを介して付加していることにより、タグポリペプチド由来のＮＭＲスペクトルはより低くブロードになるため、タグポリペプチド由来のブロードなピークと、目的ポリペプチド由来のよりシャープなピークとの区別が容易となり、間接的に目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを測定することを可能にする。
また、本発明によれば、ＮＭＲスペクトル測定のための試料であって、目的ポリペプチドと目的ポリペプチドより分子量の大きなタグポリペプチドと両ポリペプチドの間に介在して両ポリペプチドを結合させるリンカーとを含む融合ポリペプチドと、ＮＭＲスペクトル測定に許容可能な溶媒と、を含む、試料が提供される。
この試料を用いると、直接ＮＭＲスペクトルを測定することが困難な目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルの測定においても、タグポリペプチドとの融合ポリペプチドを用いることでその溶解性・安定性を向上させ、ＮＭＲスペクトルの測定を可能にする。また、タグポリペプチドが目的ポリペプチドより大きく、かつリンカーを介して付加していることにより、タグポリペプチド由来のＮＭＲスペクトルはより低くブロードになるため、この試料を用いると、タグポリペプチド由来のブロードなピークと、目的ポリペプチド由来のよりシャープなピークとの区別が容易となり、間接的に目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得・帰属することが可能になる。
また、本発明によれば、目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルの解析方法であって、目的ポリペプチドと目的ポリペプチドより分子量の大きなタグポリペプチドと両ポリペプチドの間に介在して両ポリペプチドを結合させるリンカーとを含む融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得するステップと、融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルから、目的ポリペプチド由来のピークを抽出するステップと、を含む、解析方法が提供される。
この解析方法は、ＮＭＲ法による直接の立体構造解析が困難な目的ポリペプチドに対しても、タグポリペプチドとの融合ポリペプチドを用いることでその溶解性・安定性を向上させ、立体構造の解析を可能にする。また、タグポリペプチドが目的ポリペプチドより大きく、かつリンカーを介して付加していることにより、タグポリペプチド由来のＮＭＲスペクトルはより低くブロードになるため、タグポリペプチド由来のブロードなピークと、目的ポリペプチド由来のよりシャープなピークとの区別が容易となり、間接的に目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを測定し、それを用いて目的ポリペプチドの構造を解析することが可能となる。
また、本発明によれば、目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルの解析装置であって、目的ポリペプチドと前記目的ポリペプチドより分子量の大きなタグポリペプチドと前記両ポリペプチドの間に介在して前記両ポリペプチドを結合させるリンカーとを含む融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得するタグ付スペクトル取得部と、融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルから、目的ポリペプチド由来のピークを抽出するシグナル抽出部と、を有する、解析装置が提供される。
この解析装置は、ＮＭＲ法による直接の立体構造解析が困難な目的ポリペプチドに対しても、タグポリペプチドとの融合ポリペプチドを用いることでその溶解性・安定性を向上させ、立体構造の解析を可能にする。また、タグポリペプチドが目的ポリペプチドより大きく、かつリンカーを介して付加していることにより、タグポリペプチド由来のＮＭＲスペクトルはより低くブロードになるため、タグポリペプチド由来のブロードなピークと、目的ポリペプチド由来のよりシャープなピークとの区別が容易となり、間接的に目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを測定し、それを用いて目的ポリペプチドの構造を解析することが可能となる。
また、本発明によれば、コンピューターに目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを生成させるためのプログラムであって、コンピューターに、目的ポリペプチドと目的ポリペプチドより分子量の大きなタグポリペプチドと両ポリペプチドの間に介在して両ポリペプチドを結合させるリンカーとを含む融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得するステップと、融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルから、目的ポリペプチド由来のピークを抽出するステップと、を実行させる、プログラムが提供される。
このプログラムは、ＮＭＲ法による直接の立体構造解析が困難な目的ポリペプチドに対しても、タグポリペプチドとの融合ポリペプチドを用いることでその溶解性・安定性を向上させ、立体構造の解析を可能にする。また、タグポリペプチドが目的ポリペプチドより大きく、かつリンカーを介して付加していることにより、タグポリペプチド由来のＮＭＲスペクトルはより低くブロードになるため、タグポリペプチド由来のブロードなピークと、目的ポリペプチド由来のよりシャープなピークとの区別が容易となり、間接的に目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを測定し、それを用いて目的ポリペプチドの構造を解析することが可能となる。
本発明は、直接的にＮＭＲスペクトルの測定および／またはＮＭＲによる立体構造解析の困難なポリペプチドの、ＮＭＲスペクトルの測定および立体構造解析を可能にする。
〔用語の説明〕
本明細書における「ＮＭＲ」（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：核磁気共鳴）とは、外部磁場に置かれた原子核が固有の周波数の電磁波と相互作用する現象およびその現象を用いた物質の解析法をいい、特にここでは、通常、ポリペプチドの立体構造解析に用いられる溶液ＮＭＲ法のことをいう。ＮＭＲ法に用いることのできる測定機器は、日本電子（ＪＥＯＬ）、ブルカー、バリアンなどのメーカーから入手可能である。本実施形態にかかるＮＭＲにおいては、本技術分野でポリペプチドの立体構造解析に通常用いられる各種ＮＭＲスペクトルを用いることが可能であり、限定されるものではないが、例えば、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、１５Ｎ−ＮＭＲ、２Ｈ−ＮＭＲなどの各核種のＮＭＲを用いることができる。
また、ＮＭＲスペクトルを生成する際にはＦＴ−ＮＭＲ（フーリエ変換ＮＭＲ）が用いられ、その際には、特定のパルスシークエンスを組み合わせて用いることができる。例えば、一または複数の核種間の、ＡＰＴ、ＩＮＥＰＴ、ＤＥＰＴ、ＣＯＳＹ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ（ＨＯＨＡＨＡ）、ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、ＩＮＡＤＥＱＵＡＴＥ、ＴＲＯＳＹ、ＨＮＣＯ、ＨＮＣＡ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＣＢＣＡＮＨ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＢＨＡ（ＣＢＣＡＣＯ）ＮＨ、Ｃ（ＣＯ）ＮＨ、Ｈ（ＣＣＯ）ＮＨなど、この技術分野の通常の知識を有する者によく知られた各種ＮＭＲ法（スペクトル）を、単独または組合わせた一元ＮＭＲ、二次元ＮＭＲあるいは三次元ＮＭＲを用いることができる。また、これらのＮＭＲを組合わせることで、１Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎなどの相関関係およびその相関関係から得られる位置情報を取得することができる。
上記のＮＭＲスペクトルのうち、ポリペプチドの立体構造解析においては、特に、ＨＮＣＯ、ＨＮＣＡ、ＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＣＢＣＡＮＨ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣ−ＮＯＥＳＹ、１５Ｎ−１Ｈ−ＨＳＱＣ、１３Ｃ−１Ｈ−ＨＳＱＣなどがよく用いられるが、これらに限られない。これらのスペクトル解析を行うことにより、各水素、炭素および窒素の相対的な位置関係を知ることができる。これら単独、あるいは、好ましくはポリペプチドの一次配列を用いた連鎖帰属や水素結合などの構造情報と組み合わせることにより、具体的な立体構造を解析することができる。
本明細書における「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がアミド結合を介して連なったポリマーのことをいい、好ましくはタンパク質であるが、これに限られず、低分子のペプチドや、非天然のアミノ酸等を含む人工的なペプチドを測定・解析対象としてもよい。これらのタンパク質は、球状タンパク質、多ドメインタンパク質から分離された機能・構造ドメインタンパク質および膜タンパク質を含む。また、これらのタンパク質はタンパク質の複合体も含む。また、これらのポリペプチドは、直鎖であっても、分岐していてもよく、化学修飾されていてもよい。また、これらのポリペプチドは、測定するＮＭＲスペクトルの種類に応じて、１３Ｃや１５Ｎや２Ｈなどの安定同位体を含む同位体で標識されていてもよい。
本明細書における「目的ポリペプチド」とは、測定または解析対象となるポリペプチドのことをいう。その分子量は、好ましくは２００００以下、より好ましくは１５０００以下、最も好ましくは１００００以下のものが選ばれる。分子量２００００以下ではＮＭＲスペクトルがシャープになり、分子量１５０００以下ではブロードなシグナルが減少し、分子量１００００以下ではタグポリペプチド由来のシグナルとの区別がより明確になる。
本明細書における「タグポリペプチド」とは、精製の際にアフィニティー精製のタグとして使用可能であるか、あるいは目的ポリペプチドに付加することでポリペプチド全体の親水性を向上させるタグとして使用可能な任意のポリペプチドをいう。ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＳＥＴ、チオレドキシンなど、この技術分野の通常の知識を有する者に知られたタグポリペプチドを用いることができるが、抗体を作成することで任意のポリペプチドをタグとして使用することも可能である。また、大腸菌などの宿主で発現させる場合には、発現上昇をもたらすものであってもよい。また、好ましくは、親水性であるか、親水性のアミノ酸を多く含み、より好ましくは、密なポリペプチドあるいは球状ポリペプチドである。
タグポリペプチドの分子量（複合体を形成する時はその複合体の見かけの分子量）は、好ましくは５０００以上、より好ましくは１００００以上、更に好ましくは２００００以上であるが、目的ポリペプチドより分子量が大きいことが望ましい。分子量５０００以上では目的ポリペプチドと区別をつけることが容易に可能になり、分子量１００００以上ではタグによる融合ポリペプチドの性質変化がより顕著になり、分子量２００００以上ではシグナルがブロードなピークを有する傾向が高くなり、後述する抽出処理において非常に有利となる。
本明細書における「リンカー」とは、目的ポリペチドとタグポリペプチドの間に介在し、両者を共有結合的に結合させるものをいう。リンカーは、目的ポリペプチドおよびタグポリペプチドの立体構造を乱さなければ、目的ポリペプチドおよびタグポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端あるいは側鎖の何れか一箇所または複数箇所に付与してもよい。リンカーとしては、通常ポリペプチドが用いられるが、各種置換アルキル、アルキレンまたはアリルなどの非ペプチド性のものでもよい。
ポリペプチド性のリンカーは、目的ポリペプチドとタグポリペプチドが相互に区別して扱えるくらいの長さで、かつ、それ自体が目的ポリペプチドあるいはタグポリペプチドと相互作用しないものから選ばれ、その長さは、５残基以上が望ましく、更に好ましくは５−３０残基、より好ましくは５−２５残基、より好ましくは５−２０残基、より好ましくは５−１５残基、最も好ましくは５−１０残基である。５残基以上であれば目的ポリペプチドとタグポリペプチドを相互に区別して扱え、５−３０残基では、タグポリペプチドによる親水性向上の効果が向上し、５−２５残基ではより効果的に融合ポリペプチドの凝集を防ぐことができ、５−２０残基では目的ポリペプチドの変性を防ぐ効果が増大し、５−１５残基ではリンカー部分が相互作用する可能性が減少し、５−１０残基ではより容易に融合ポリペチドを調整することができるようになる。非ペプチド性のリンカーに関しても、好ましくは上記ポリペプチドに相当する長さとなるものから選ばれる。また、ポリペプチド性のリンカーは、好ましくは、グリシンおよび／またはプロリンからなるか、それらを含む。
本明細書における「融合ポリペプチド」とは、目的ポリペプチドとタグポリペプチドと目的ポリペプチドとタグポリペプチドの間に介在して両ポリペプチドを結合させるリンカーとを含むポリペプチドをいう。リンカーを介して共有結合的に付加されるタグポリペプチドは、目的ポリペプチドの立体構造を乱さなければ、目的ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端あるいは側鎖の何れか一箇所または複数箇所に付与してもよい。
上記のタグポリペプチドまたは融合ポリペプチドを得る方法としては、特に制限されるものではないが、例えば、タグポリペプチドまたは融合ポリペプチドを産生する遺伝子を用いた遺伝子組み換えにより、インビトロ合成、あるいは大腸菌、酵母、細胞などの宿主を形質転換し、得られた宿主を培養することによりこれを得る方法、化学合成機などを用いた化学的合成によりこれを得る方法などを挙げることができる。化学合成機を用いる場合、タグポリペプチドと目的ポリペプチドを、上記の方法等により個別に得た後、更にアミノ酸残基に対する化学修飾や、更なる化学合成によりそれらをリンカーで結合させることも可能である。以上の方法は、本技術分野でよく知られた手順（発現、精製等）に従って行うことができる。
また、これらのポリペプチドの任意の原子または元素は同位体により標識されていてもよい。同位体による標識の方法は、本技術分野でよく知られた方法を用いて行われるが、例えば、標識アミノ酸を培地に加えて宿主で発現させる、または標識アミノ酸を用いて化学合成する方法や、培地に１３Ｃ−グルコースや１５Ｎ−塩化アンモニウムを加えて宿主で発現させる方法などを挙げることができる。
本明細書における「ＮＭＲ測定に許容な溶媒」とは、目的のＮＭＲスペクトルを測定することを阻害しない溶媒のことをいう。生理的条件下で測定する場合は、特に水が好ましく、通常は、アミド結合のプロトンも測定することが多いため、軽水が用いられる（通常はＮＭＲ測定の際のロック用に１０％前後（２−２０％、より好ましくは５−１５％）の重水を含むが、これに限られず、他のロック用溶媒を用いてもよい。）。ただし、これに限られず、アミドのプロトンを測定する必要の無い場合、軽水のシグナルに重なったシグナルを測定したい場合など、測定対象のスペクトルによっては、重水や他の溶媒であってもよい。
試料の溶媒のｐＨは、測定対象のポリペプチドが測定したい構造（生理的条件での構造など）を保ち得る範囲内で選ばれる。タンパク質や多くのポリペプチドの場合、ｐＨは、通常、２−１０、より好ましくは３−９、さらに好ましくは４−８、最も好ましくは５−７の範囲から選ばれるが、これに限られない。また、測定するＮＭＲスペクトルによっては、アミドプロトンなどの交換可能プロトンの交換速度を遅くするために、ｐＨを下げることが望ましいこともある。緩衝剤としては、測定対象の元素を含まないものが好ましいがこれに限られず、測定目的、測定対象元素、および測定対象ＮＭＲスペクトルの種類に応じて、本技術分野でよく知られたものの中から選ばれる。通常、プロトンのＮＭＲを測定する場合は、プロトンを含まない緩衝剤が最も頻繁に使われており、例えば、各種リン酸緩衝液（剤）や、重水素化酢酸緩衝液（剤）などを挙げることができる。
以下、本発明の実施形態について、図面を用いて説明する。また、この装置を含むプログラムについても説明する。なお、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
〔実施形態の概略〕
図１は、実施形態に係る測定装置の全体構成を示した概略図である。なお、図１においては、ＮＭＲスペクトル測定装置１０００の概略のみを示した。ＮＭＲスペクトル測定装置１０００は、ＮＭＲスペクトルの測定を担うＮＭＲスペクトル測定部４００と、ＮＭＲスペクトル測定装置１０００の制御を行うワークステーション３００を備え、ＮＭＲスペクトル測定部４００は更に、分光計コンソール２００と、ＮＭＲ超伝導磁石１００と、電磁波パルスの照射とシグナルの検出を行うプローブ１０２と、電磁波パルスの発生や照射のタイミングなどを制御する分光計２０２と、デジタル信号への変換を担うＡ／Ｄ変換器２０４とを備える。
ワークステーション３００では、分光計２０２およびＡ／Ｄ変換器２０４により生成されたデジタル信号を取得して所定のフォーマットでハードディスクなどの記録媒体に格納する。なお、ＮＭＲ装置は高価なので、測定したら直に次ぎの研究者が待っているため、交代しながら使用することが一般的である。例えば、ＮＭＲ装置で測定するとき、１回１試料の測定に１週間かかる場合がある。この場合には、３次元の測定の場合、百ＭＢ(メガバイト)単位のＦＩＤデータとなる。従って、データ処理（フーリエ変換を含む）は、ネットでつながった別のワークステーション（不図示）で行うことになる。多くの場合、各研究室に専用のソフトを搭載したワークステーションを持っている。
タンパク質の立体構造を解析するためには、３次元ＮＭＲ測定を数種類おこなって、シグナルの帰属をすることが、第一関門である。一般的には、１測定に約１週間、各パルスシークエンスの測定を終えるには、ＮＭＲスペクトル測定装置１０００を占有しても１カ月以上かかることが多い。他の試料も測定することになるので、一種類のタンパク質の立体構造の解析に必要なデータを取得するために何ヶ月もかかることになる。また、ＮＭＲ測定は多数のパラメーターを試料に合わせて設定する必要がある。そのため、ＧＳＴタグ付きタンパク質の場合にも同じように注意深く条件を決めて測定を開始することになる。よって、一度測定を開始すると数日間は触ることが出来ない場合が多い。その結果、測定している間、既に測定済みのデータをワークステーション３００とは別のワークステーションに移して解析を進めることが効率的である。
また、測定の結果得られたＮＭＲスペクトルのピークの重なりが全く無い場合は、蛋白質の立体構造の全自動解析が可能かもしれないが、数種類の３次元ＮＭＲ測定データを矛盾無く説明するには、相当な時間が必要である。そのため、将来は、使い易くなると想定されるが、その場合でもやはりＮＭＲスペクトル測定装置１０００付属のワークステーション３００で解析するよりも他のワークステーションで解析することが有利である。ＮＭＲスペクトル測定装置１０００は高価な装置であり、液体ヘリウムを使うため維持費も高い。そのため、ＮＭＲスペクトル測定装置１０００は、常時測定している場合が多い。従って、研究機関のコストパフォーマンスを考慮すると、ＮＭＲスペクトルの測定以外の部分の機能を実行するのは、高性能で安い別のワークステーションを使うのが得策である。
このように、ＮＭＲスペクトル測定装置１０００に付属のワークステーション３００には、測定ソフトのみを搭載し、ＮＭＲスペクトル測定装置１０００とは独立した別のワークステーションにスペクトルの解析ソフトとタンパク質の構造計算ソフトを別途搭載する形式が一般的である。このような形式が、将来も続くと思われるが、ＮＭＲスペクトル測定装置１０００に付属のワークステーション３００にスペクトルの解析ソフトとタンパク質の構造計算ソフトを併せて搭載することを除外する趣旨ではない。
図２は、実施形態に係るＮＭＲ測定用の試料の概略図である。試料１１０は、測定用チューブ（ＮＭＲ試料管）１１８に収められ、キャップ１０６をした後、ＮＭＲ測定装置に設置される。試料１１０中においては、目的ポリペプチド１１４ａはリンカー１１６ａを介してタグポリペプチド１１２ａと共有結合している。本明細書においては、この１１２ａ−１１６ａ−１１４ａを融合ポリペプチドと称する。ある実施形態では、タグポリペプチドは、例えばＧＳＴであり、ＧＳＴは図２に示すように溶液中では二量体を形成しているため、見かけの分子量は約５０ｋＤａとなる。
タグにリンカーを付与するのは、タグ自体に柔軟性を持たせること、および目的ポリペプチドとタグである親水性アミノ酸残基との間に距離を置くことにより、それらの間における相互作用を防止することを目的とするためである。さらに、リンカー部分を自由に動きやすい構造にすることで、目的ポリペプチドとタグポリペプチドを相互に独立して扱うことが可能となる。したがって、本発明における融合ポリペプチドは、目的ポリペプチド本来の機能発現や立体構造に影響が及ばず、目的とするポリペプチドの機能や構造を損なうことなく溶解度の向上が可能であるという優れた効果を発揮する。
図３は、実施形態に係る融合ポリペプチドの取得法の概略図である。ここでは、ＧＳＴをタグポリペプチドとして使用し、融合ポリペプチドとして宿主に発現させる場合の実施形態を示す。大腸菌などの宿主に、「ＧＳＴ−目的ポリペプチド」という融合ポリペプチドの発現ベクターを組み込み、発現条件下で融合ポリペプチドを発現させる（図中（ａ））。次に、超音波破砕や界面活性剤などの本技術分野でよく知られた方法により、宿主を溶解する（図中（ｂ））。この時、そのままの条件では所望の高次構造をとっていないと考えられる場合は、透析やシャペロンカラムなどを用いて、所望の構造へと遷移させる（図中（ｃ））。次に、ＧＳＴタグ部分を介して、融合ポリペプチドをグルタチオン樹脂と結合させ（図中（ｄ））、目的外のものを洗い流す（図中（ｆ））。最後に、グルタチオンやｐＨ変化などの本技術分野でよく知られた方法を用いて、グルタチオン樹脂と結合した融合ポリペプチドを溶出させ（図中（ｆ））、所望の融合ポリペプチドを得る（図中（ｇ））。
図４は、実施形態に係るＮＭＲスペクトル測定方法の概略図である。ここでは、ＧＳＴをタグポリペプチドとして使用した場合の実施形態を示す。図３に示した方法等により得られた融合ポリペプチド（図中（ａ））は、本発明以前はＧＳＴタグの部分が測定の障害になると考えられていたため、トロンビンなどのプロテアーゼによりリンカー部分で切断されＧＳＴタグ部分を除去されていた（図中（ｂ））。しかし、ポリペプチドによっては、ＧＳＴタグを取り除くことで、凝集（あるいは会合または分解）し、その後の測定の障害となってしまうという問題点を有していた。本発明においては、融合ポリペプチドをそのまま測定用の試料として用いることで、凝集や不安定性の問題を解決し、ＮＭＲスペクトルを測定することを可能にした（図中（ｄ））。その後、融合タンパク質のＮＭＲスペクトルのＧＳＴタグ相当部分を除去することにより、目的タンパク質のＮＭＲスペクトルを得ることができる。その際、参考のために、ＧＳＴのＮＭＲスペクトルを別途測定することもできる（図中（ｅ））
図５は、実施形態に係るＮＭＲスペクトルの抽出ステップの概略図である。ＧＳＴのように大きな分子量のタグポリペプチドを用いることで、タグポリペプチド由来のシグナルはブロードなピークを有する傾向を示す（図中（ａ））。そのため、タグポリペプチド由来のシグナルを簡便に除去するために、タグポリペプチド由来のピークの最大シグナル強度に基づく閾値（例えば、最大シグナル強度を超える閾値や、最大シグナル強度の５０％の閾値）を用いて、その閾値以上のシグナル強度を有する目的ポリペプチド由来のピークを抽出する処理（図中（ｂ））を行うことができる。ここで、タグポリペプチド由来のピークの最大シグナル強度は、別途測定したタグ部分のＮＭＲスペクトルとそのポリペプチド濃度に基づき、算出することができる。
あるいは、実施形態に係るＮＭＲスペクトルの抽出ステップでは、タグポリペプチド由来のシグナルを簡便に除去するために、融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルとタグポリペプチドのＮＭＲスペクトルとの差を求めてもよい。ＦＴ−ＮＭＲでは２通りの差の取り方がある。（１）フーリエ変換する前のＦＩＤ（Ｆｒｅｅ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｅｃａｙ）のデータの差を取リ、差のＦＩＤをフーリエ変換する。（２）フーリエ変換してＮＭＲスペクトルにしたあと差をとる。
図６は、ＧＳＴとＧＳＴ−Ｈｅｘ−Ｃ（ＨｅｘのＣ末端）の１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルの比較図である。ＧＳＴ単独のＮＭＲスペクトルが左図（ａ）、ＧＳＴ−Ｈｅｘ−Ｃ（融合ポリペプチド）のＮＭＲスペクトルが右図（ｂ）となる。（ａ）のＮＭＲスペクトルは低くブロードなピークを示し、（ｂ）のＮＭＲスペクトルは、そのようなピークを除くように抽出されているため、左に見られるＧＳＴ由来のシグナルが見られない。
ただし、図６において、ＧＳＴ単独のスペクトル（ａ）はＮＭＲスペクトルの最大シグナル強度の１％に相当する閾値（１）により、その閾値（１）を超えるピークを抽出したものである。また、ＧＳＴ−Ｈｅｘ−Ｃのスペクトル（ｂ）は、閾値（１）よりも大きい値からなる閾値（２）（閾値（１）の１５０％に相当する）により、その閾値（１）を超えるピークを抽出したものである。すなわち、ＧＳＴ−Ｈｅｘ−Ｃのスペクトル（ｂ）は上記のＮＭＲスペクトル抽出処理後のものである。
図７は、上記のようにして得られたＣＢＣＡＮＨおよびＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨスペクトルを基にしたＨｅｘ−Ｃのα炭素およびβ炭素のＮＭＲスペクトルの帰属図である。縦軸が１３Ｃ、横軸が１Ｈ、Ｚ軸が１５Ｎのシグナルを表しており、各アミノ酸残基のα位とβ位の炭素を帰属している。
図８は、上記のようにして得られた様々なスペクトルを基にＨｅｘ−Ｃの立体構造解析を行った結果を画像で示した図である。複数のスペクトルを基に、各原子の相対的な位置関係などを特定し、画像に変換すると、図８に示すような立体構造図が得られる。
以上のように、本発明によると、直接ＮＭＲスペクトルを測定することが困難な目的ポリペプチドに対しても、タグポリペプチドとの融合ポリペプチドを測定対象とすることでその溶解性・安定性を向上させ、測定された融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルから、低くブロードであるタグポリペプチド由来のＮＭＲスペクトルを除去する（すなわち、高くシャープである目的ポリペプチド由来のＮＭＲスペクトルを抽出する）ことで、間接的にＮＭＲスペクトルの測定およびそれを用いた立体構造解析を行うことが可能となる。
〔実施形態〕
図９は、実施形態に係る解析装置の全体構成を示した機能ブロック図である。なお、図９においては、解析装置２０００の概略のみを示し、詳細な内部構成については、後述する他の図面を用いて説明する。
解析装置２０００は、この解析装置は、直接ＮＭＲスペクトルを測定することが困難な目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルの測定においても、タグポリペプチドとの融合ポリペプチドを対象として、測定された融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルから、より低くブロードであるタグポリペプチド由来のＮＭＲスペクトルを除いた目的ポリペプチド由来のピークを抽出することで、間接的に目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを測定することを可能にする。
また、解析装置２０００は、ＮＭＲスペクトル測定装置１０００により測定されたＮＭＲスペクトルまたは記憶媒体に格納されているＮＭＲスペクトルを取得するＮＭＲスペクトル取得部１４００およびスペクトルの処理を行うＮＭＲスペクトル処理部１３００を備える。ＮＭＲスペクトル取得部１４００は更に、融合タンパク質のＮＭＲスペクトルを取得するタグ付スペクトル取得部４０２およびタグポリペプチドのＮＭＲシグナルを取得する対照スペクトル取得部４０４を有する。ＮＭＲスペクトル処理部１３００は更に、目的ポリペプチド由来のピークを抽出する処理を行うシグナル抽出部３０２、得られた目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルの確認を行う目的スペクトル確認部３０４、およびその目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを外部に出力する出力部３０６を有する。
本装置により取得された目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルは、出力部を通じて外部に出力することができ、プリンタ６０２で印刷することも、サーバ６０４に格納することも、モニター６１２に表示することも、ネットワーク６０６を介して更に外部に送信することも、あるいは、別のワークステーションからなる立体構造解析装置５００に出力してＮＭＲスペクトルを解析し、立体構造を得ることも可能である。
図１０は、実施形態に係る解析装置の、シグナル抽出部３０２の内部構成をさらに詳細に示した機能ブロック図である。
シグナル抽出部３０２は、入力されたＮＭＲスペクトルおよびその測定条件を基に閾値を判定するシグナル強度判定部３０７と、その閾値に基づき実際に目的ポリペプチド由来のピークを抽出するフィルタリング部３０９とを備える。また、シグナル抽出部３０２は、閾値記憶部３１４および閾値参照部３１２も備えており、既に記憶済みの、それぞれのタグポリペプチドに対する閾値を参照し、その閾値を直接用いるか、もしくはシグナル強度判定部３０７を介して測定条件による修正を行った値を用いて抽出することも可能である。その場合は、タグポリペプチド単体を調製する必要も、測定する必要も無く、更に利便性が高まる。
図１１は、実施形態に係る測定装置の、目的スペクトル確認部３０４の内部構成をさらに詳細に示した機能ブロック図である。
目的スペクトル確認部３０４は、シグナル抽出部３０２から入力されるＮＭＲスペクトルを、対応する他のＮＭＲスペクトル中にそれぞれのピークに対応するピークがあるかを確認する対応スペクトル確認部３１６、および一次配列と他の対応するＮＭＲスペクトルを用いて、それぞれのピークが連鎖帰属可能かどうかを確認する連鎖帰属確認部３２０を備える。対応スペクトル確認部３１６は、同じように測定され、入力された他のＮＭＲスペクトルを用いてもよいが、それらのＮＭＲスペクトルを対応スペクトル記憶部３１８に格納しておくことも可能である。また、一次配列は、一次配列記憶部３２２に格納しておくことも可能である。
確認後の目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルは、そのまま出力部３０６を通じて外部に出力することも可能であるが、内部に保存、あるいは画像データの形で内部に保存あるいは出力することも可能である。目的スペクトル確認部３０４は、そのための、目的スペクトル記憶部３２４および画像データ生成部３２６を更に備えてもよい。
〔実施形態の変形例〕
図１２は、実施形態に係る解析装置２０００の変形例の内部構成を詳細に示した機能ブロック図である。
解析装置２０００は、図１０で示したタグ付スペクトル取得部４０２と、タグポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得するための対照スペクトル取得部４０４とを有し、それらを介して各ＮＭＲスペクトルを取得する。タグ付スペクトル取得部４０２では、ＮＭＲスペクトル測定装置１０００からＣＤ−ＲＯＭ、ＭＤなどの記録媒体を介して融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得してもよく、あるいはＮＭＲスペクトル測定装置１０００からＬＡＮなどのネットワークを介して融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得してもよく、またはあらかじめ解析装置２０００内部の記憶装置に格納されている融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを読み出して取得してもよい。
対照スペクトル取得部４０４においては、ＮＭＲスペクトル測定装置１０００で直接タグポリペプチドのＮＭＲスペクトルを測定して、そのＮＭＲスペクトルを取得するかわりに、外部のネットワーク６１０あるいはサーバ６０８、もしくは内部の対照スペクトル記憶部３１０から、既に記憶されたデータの形でＮＭＲスペクトルを取得してもよい。
この変形例では、シグナル抽出部３０２において、融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルとタグポリペプチドのＮＭＲスペクトルとの差を取ることにより、目的ポリペプチド由来のピークを抽出する。この抽出処理を経て得られた目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルは、目的スペクトル確認部３０４において、前述のように確認処理を経た後、立体構造解析部３０８で目的ポリペプチドの立体構造の解析に用いられる。この構成により、目的ポリペプチドの立体構造を直接解析することが困難な場合でも、融合ポリペプチドとタグポリペプチドのＮＭＲスペクトルを基に、目的ポリペプチドの立体構造解析が可能となる。
解析結果は、出力部３０６を通じて外部に出力することができ、プリンタ６０２で印刷することも、サーバ６０４に格納することも、モニター６１２に表示することも、ネットワーク６０６を介して更に外部に送信することも可能である。
図１３は、この変形例における各スペクトル取得部をさらに詳細に示した機能ブロック図である。
融合ポリペプチドのＮＭＲシグナルを取得するタグ付スペクトル取得部４０２は、ＮＭＲスペクトル測定装置１０００のワークステーション３００と研究所内ＬＡＮからなるネットワーク１０１と接続しており、このネットワーク１０１を介して融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得する。タグポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得する対照スペクトル取得部は、対照スペクトル読出部４０６を有し、外部の対照スペクトル記憶部３１０からタグポリペプチドのＮＭＲスペクトルデータである対照スペクトルデータ４０８を取得することができる。この場合、タグポリペプチド単体の調製およびＮＭＲスペクトルの測定が必要なくなり、より簡便な測定が可能となる。このようにして得られた融合ポリペプチドおよびタグポリペプチドのＮＭＲスペクトルは、上述のシグナル抽出部３０２、目的スペクトル確認部３０４等を介して処理される。
図１４は、この変形例における立体構造解析装置の目的スペクトル確認部３０４および立体構造解析部３０８をさらに詳細に示した機能ブロック図である。
目的スペクトル確認部３０４は、シグナル抽出部３０２から入力されるＮＭＲスペクトルを、対応する他のＮＭＲスペクトル中にそれぞれのピークに対応するピークがあるかを確認する対応スペクトル確認部３１６、および一次配列と他の対応するＮＭＲスペクトルを用いて、それぞれのピークが連鎖帰属可能かどうかを確認する連鎖帰属確認部３２０を備える。対応スペクトル確認部３１６は、同じように測定され、入力された他のＮＭＲスペクトルを用いてもよいが、それらのＮＭＲスペクトルを対応スペクトル記憶部３１８に格納しておくことも可能である。また、一次配列は、一次配列記憶部３２２に格納しておくことも可能である。また、得られた目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルはそのまま立体構造解析部３０８に入力されてもよいが、目的スペクトル記憶部３２４に格納し、後に解析処理を行うことも可能である。
立体構造解析部３０８は、例えば、連鎖帰属判定部３４０、ＮＯＥＳＹ計算部３２８、ＴＯＣＳＹ計算部３３０、ＨＳＱＣ計算部３３２、総合計算部３３４を備え、得られた複数のＮＭＲスペクトルを個別に計算し、各ピーク（シグナル）の帰属を行い、またそれらを総合的に構造計算することで立体構造を解析する。具体的には、立体構造解析部３０８では、構造計算をするために、これらの各種計算部・判例部によって、数種類の３次元スペクトルを用いて、スペクトルの解釈（帰属：assignment）をしながら、構造情報を確定するという手順を実行することになる。ここで用い得られた立体構造は立体構造画像データ生成部３３８で画像に変換してもよく、また、画像データ、座標データ共に、立体構造記憶部３３６に記憶し、後に参照することも可能である。また得られた画像データあるいは解析データは、出力部３０６を通じて外部に出力することも可能である。
〔実施形態の動作の説明〕
図１５は、実施形態に係る測定・解析装置（変形例を除く）の動作を説明するためのフローチャートである。
ＮＭＲスペクトル測定装置１０００での測定では、まず融合ポリペプチドの調製が行われ（Ｓ１０２）、次いで、その融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルが測定され（Ｓ１０４）、融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルが得られる。
それと並行して、解析装置２０００では、タグポリペプチドのＮＭＲスペクトルの取得も行われるが、最初に、タグポリペプチドの測定しようとするＮＭＲスペクトルに関する閾値データが既知であるかどうかの判定が行われ（Ｓ２００）、既知であった場合、閾値記憶部３１４から閾値参照部３１２により読み出され（Ｓ２１４）、抽出処理に用いられる。Ｓ２００の判定において閾値データが既知でなかった場合、タグポリペプチドの測定しようとするＮＭＲスペクトル自身が既知であるかどうかの判定が行われ（Ｓ２０２）、既知であった場合、対照スペクトル読出部４０６によりタグポリペプチドのＮＭＲスペクトルが読み出され（Ｓ２１０）、抽出処理に用いられる。
また、Ｓ２０２の判定において、タグポリペプチドのＮＭＲスペクトルが既知でなかった場合は、融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトル取得と同様に、まずタグポリペプチドが調製され（Ｓ２０４）、ＮＭＲスペクトル測定装置１０００においてタグポリペプチドのＮＭＲスペクトルが測定され（Ｓ２０６）、抽出処理に用いられる。
そして、解析装置２０００では、シグナル強度判定部３０７において、融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルの測定条件に応じた閾値は、タグポリペプチドのＮＭＲスペクトルおよび両ポリペプチドの測定条件の違いを考慮して算出される。または、この閾値は、閾値参照部３１２を通じて取得されてもよい。その後、フィルタリング部３０９において、融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルからその閾値以上のシグナル強度を持つピークが抽出される（Ｓ１０６）。
目的スペクトル確認部３０４において、Ｓ１０６の結果得られたＮＭＲスペクトルが、他のＮＭＲスペクトルおよび／または連鎖帰属可能性から確認され（Ｓ１０８）、目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルが得られる。そして、この目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルが出力がされる（Ｓ１１２）。
あるいは、引き続いて、立体構造解析部３０８において、得られたＮＭＲスペクトルによる立体構造解析がなされ（Ｓ１１０）、解析結果が出力される（Ｓ１１２）。
次に、実施形態に係る測定・解析方法と、その方法および上記の装置に用いる試料の作用効果について説明する。
〔実施形態の作用効果の説明〕
上記の実施形態の目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルの解析方法は、タグ付スペクトル取得部４０２がその目的ポリペプチドとその目的ポリペプチドより分子量の大きなタグポリペプチドとその両ポリペプチドの間に介在してその両ポリペプチドを結合させるリンカーとを含む融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得するステップと、シグナル抽出部３０２がその融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルから、そのタグポリペプチド由来のピークの最大シグナル強度に基づく閾値を用いて、その閾値以上のシグナル強度を有する目的ポリペプチド由来のピークを抽出するステップとを含む解析方法である。（以下、装置の説明に関しては、特に示さない限り図９を参照のこと）
そのため、この方法では、（タグ切断後などに）凝集や分解してしまうなど、直接ＮＭＲスペクトルを測定することが困難な目的ポリペプチドに対しても、タグポリペプチドとの融合ポリペプチドを用いることでその溶解性・安定性を向上させ、ＮＭＲスペクトルの測定を可能にする。また、タグポリペプチドが目的ポリペプチドより大きく、かつリンカーを介して付加していることにより、タグポリペプチド由来のＮＭＲスペクトルはより低くブロードになるため、それらの最大シグナル強度に基づく閾値以上のピークを抽出することで、間接的に目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを測定することを可能にする。またその手順も他の方法に比べ簡便である。
また、上記の実施形態の解析方法は、対照スペクトル取得部４０４がそのタグポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得するステップを更に含み、その目的ポリペプチド由来のピークを抽出するステップが、そのタグポリペプチドのＮＭＲスペクトルの最大シグナル強度をその融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルでのシグナル強度に換算することにより、その閾値を算出するステップを含む解析方法である。そのため、タグポリペプチドのＮＭＲスペクトルを実際に取得し、閾値算出に用いることで、より精確にタグポリペプチド由来のシグナルを除くことができる。
また、上記の実施形態の解析方法では、プローブ１０２、分光計２０２、Ａ／Ｄ変換器２０４などを有するＮＭＲスペクトル測定装置１０００によって測定されたタグポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得して解析に用いるため、融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルの測定条件と近い条件下で測定された精確なタグポリペプチドのＮＭＲスペクトルを用いることができる。その結果、両者のＮＭＲスペクトルを対比して、より精確に目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを測定することが可能となる。
また、上記の実施形態の解析方法では、立体構造を解析するステップが、核種または測定条件の異なる複数種の目的ポリペプチド由来のＮＭＲスペクトルを用いて、目的ポリペプチドの立体構造を解析するステップを含んでいる。このように、複数の核種または複数種のＮＭＲスペクトルを総合的に解析することで、精確な立体構造の解析が可能となる。
また、上記の実施形態の解析方法では、タグポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得するステップが、対照スペクトル取得部４０４によって、外部のサーバ６０８、ネットワーク６１０、対照スペクトル記憶部３１０などに格納されている、あらかじめ測定されたタグポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得するステップを含んでいる。そのため、あらかじめ測定されているデータを用いることができるので、タグポリペプチドの調製や測定の手間を省き、より迅速で簡便な解析を行うことが可能となる。
また、上記の実施形態の解析方法では、タグポリペプチドのＮＭＲスペクトルおよび融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルがいずれも所定のＮＭＲ測定条件でＮＭＲ測定されている。さらに、閾値を算出するステップが、シグナル強度判定部３０７によって、そのＮＭＲ測定条件におけるポリペプチド濃度および最大シグナル強度の対応関係に基づいて、そのＮＭＲ測定におけるそのタグポリペプチドおよびその融合ポリペプチドの双方の濃度を比較することにより、そのタグポリペプチドのＮＭＲスペクトルの最大シグナル強度を、その融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルでのシグナル強度に換算するステップを含んでいる。そのため、ポリペプチド濃度とシグナル強度が相関または比例することを利用して、簡便かつ精確に、異なる測定条件のポリペプチド濃度からも、最大シグナル強度を算出し、閾値を設定することが可能となる。
また、上記の実施形態の解析方法では、目的ポリペプチド由来のピークを抽出するステップが、閾値参照部３１２によって閾値記憶部３１４からあらかじめ算出されている閾値を取得するステップを含んでいる。このように、あらかじめ算出されている閾値を用いることで、より迅速な測定が可能となる。
また、上記の実施形態の解析方法では、対応スペクトル確認部３１６によって、抽出された目的ポリペプチド由来のピークが融合ポリペプチドのＣＢＣＡＮＨスペクトルおよびＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨスペクトルなどの他種類のＮＭＲスペクトルの中に対応するピークを有することを確認するステップをさらに含んでいる。この確認作業により、抽出後のＮＭＲスペクトル内に、タグポリペプチド由来の物がないことが確認され、より精確で確実な測定結果を得ることができる。
〔実施形態の変形例の作用効果の説明〕
上記の目的ポリペプチドの立体構造のＮＭＲによる解析方法は、目的ポリペプチドとその目的ポリペプチドより分子量の大きなタグポリペプチドとその両ポリペプチドの間に介在してその両ポリペプチドを結合させるリンカーとを含む融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルをタグ付きスペクトル取得部４０２により取得するステップと、シグナル抽出部３０２を用いて、その融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルとそのタグポリペプチドのＮＭＲスペクトルとの差を取ることによって、目的ポリペプチド由来のピークを抽出することにより、その目的ポリペプチド由来のＮＭＲスペクトルを生成するステップと、その目的ポリペプチド由来のＮＭＲスペクトルに基づいて、前記目的ポリペプチドの立体構造を立体構造解析部３０８により解析するステップとを含む解析方法である（以下、解析装置の説明に関しては、特に示さない限り図１２を参照のこと）。
そのため、この方法では、（タグ切断後などに）凝集や分解してしまうなど、ＮＭＲによる直接の立体構造解析が困難な目的ポリペプチドに対しても、タグポリペプチドとの融合ポリペプチドを用いることでその溶解性・安定性を向上させ、立体構造の解析を可能にする。また、タグポリペプチドが目的ポリペプチドより大きく、かつリンカーを介して付加していることにより、タグポリペプチドの由来のＮＭＲスペクトルは独立したスペクトルを示しやすくなると同時に、タグポリペプチド由来のＮＭＲスペクトルはより低くブロードになるため、両者のＮＭＲスペクトルの差を求めることによって目的ポリペプチド由来のピークを抽出することで、間接的に目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを解析し、それを用いて目的ポリペプチドの構造を解析することが可能となる。
〔実施形態に用いる試料の作用効果の説明〕
上記の実施形態の測定方法は、ＮＭＲスペクトル測定のための試料であって、目的ポリペプチドとその目的ポリペプチドより分子量の大きなタグポリペプチドとその両ポリペプチドの間に介在してその両ポリペプチドを結合させるリンカーとを含む融合ポリペプチドと、ＮＭＲスペクトル測定に許容可能な溶媒とを含む試料を用いる。そのため、直接ＮＭＲスペクトルを測定することが困難な目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルの測定においても、タグポリペプチドとの融合ポリペプチドを用いることでその溶解性・安定性を向上させ、ＮＭＲスペクトルの測定を可能にする。また、タグポリペプチドが目的ポリペプチドより大きく、かつリンカーを介して付加していることにより、タグポリペプチド由来のＮＭＲスペクトルはピークがよりブロードになるため、この試料を用いると、タグポリペプチド由来のブロードなピークのＮＭＲスペクトルと、目的ポリペプチド由来のよりシャープなピークのＮＭＲスペクトルとの区別が容易となり、間接的に目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得・帰属することが可能になる。
また、この試料は、タグポリペプチドが親水性のポリペプチドである試料である。そのため、この試料を用いると、タグポリペプチドが親水性であることにより、融合ポリペプチド同士の凝集を防がれ、ＮＭＲスペクトルの測定がさらに容易となる。また、親水性のタグポリペプチドとの融合ポリペプチドとすることにより、その調製の過程においても、（遺伝子工学的な手法を用いた場合）発現の上昇や、安定性などの点でも効果を奏することができる。親水性のポリペプチドとしては、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＳＥＴなどを用いることができるが、タグとして使用可能なポリペプチドであれば、これらに限られず、任意の親水性ポリペプチドを用いることが可能である。
また、この試料は、タグポリペプチドがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である試料である。ＧＳＴは、親水性でＮＭＲスペクトルもよく知られ、また二量体を形成するために見かけの分子量が約５００００と大きく、密になっていることで、そのＮＭＲスペクトルはブロードで低いピークを示すため、明確に目的ポリペプチド由来のピークとの区別がつき、また、抽出処理も確実に行え、より精確な目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトル測定が可能となる。また、精製の過程においても、精製法のよく知られたＧＳＴを用いることで迅速、簡便かつ安価な精製を行うことができる。
また、この試料は、タグポリペプチドが分子量２００００以上である試料である。タグポリペプチドの分子量が大きいことで、タグポリペプチドのＮＭＲスペクトルピークがよりブロードとなるため、より簡便かつ確実に抽出作業を行うことが可能となる。
また、この試料は、目的ポリペプチドがＨｅｘ−Ｃなどの分子量１００００以下である試料である。目的ポリペプチドの分子量が小さいことにより、目的ポリペプチド由来のＮＭＲシグナルのピークがよりシャープとなり、タグポリペプチド由来のシグナルとの区別もつきやすく、また、抽出の際も目的ポリペプチド由来のＮＭＲシグナルのピークが失われる危険性を回避できる。
また、この試料は、リンカーが５残基以上のアミノ酸残基からなるポリペプチドである試料である。リンカーが長いことにより、目的ポリペプチドとタグポリペプチドが独立した別々のポリペプチドとして扱えるようになり、そのＮＭＲスペクトルもより独立したものになり、目的ポリペプチド由来のＮＭＲシグナルのピークがブロードになるのを防ぐことができる。また、タグポリペプチドにより本来の目的ポリペプチドの立体構造が乱されることも防ぎ、他方、目的ポリペプチドによりタグポリペプチドのＮＭＲスペクトルが影響を受け、除去（抽出処理）が困難になるのを防ぐこともできる。
また、この試料は、グリシン残基またはプロリン残基を含むポリペプチドである試料である。リンカーが他と相互作用しにくいグリシンおよび／またはプロリンを含むことにより、リンカー自身の構造もより柔軟になると共に、リンカーが目的ポリペプチドおよびタグポリペプチドと相互作用しにくくなり、より精確なＮＭＲスペクトルを得ることができる。
以上全ての実施形態のうち、融合ポリペプチドとして宿主に発現させた場合に関しては、通常、宿主を用いて遺伝子工学的に合成された融合ポリペプチドから目的ポリペプチドを分離精製するステップは煩雑であるが、本発明においてはタグポリペプチドの切断・除去の必要が無くなり、手順の煩雑さを減少させ、迅速な測定を可能にすると共に、収率向上等の面でも寄与するという更なる効果も奏する。
なお、上記の実施形態により説明される測定・解析装置は、本願発明を限定するものではなく、例示することを意図して開示されているものである。本願発明の技術的範囲は、特許請求の範囲の記載により定められるものであり、当業者は、特許請求の範囲に記載された発明の技術的範囲において種々の設計的変更が可能である。
例えば、対照スペクトルを取得する場合は、閾値参照部３１２および閾値記憶部３１４を設ける必要は無く、逆に閾値参照部３１２を用いる場合は、対照スペクトル取得部４０４を設ける必要は無い。また、スペクトルの確認ステップを省略する場合は、目的スペクトル確認部３０４を有さなくてもよい。また、各記憶部の代わりに、ネットワーク等につながり、外部から情報を得るように設計を変更することも可能である。更に、測定されたデータを、各記憶部に格納可能なように設計することも可能である。更に、立体構造解析部３０８においては、立体構造解析の一例を示したに過ぎず、本技術分野で確立された任意のＮＭＲスペクトルを用いて立体構造解析を行うような設計変更も可能である。また、必要に応じて、フーリエ変換部などを更に付加する設計変更も当然のことながら可能であり、これらのような態様の測定・解析装置が本願発明の技術的範囲に含まれることはいうまでもない。
また、上記の実施形態において、あらかじめ測定されたタグポリペプチドのＮＭＲスペクトルの測定データは、融合ポリペプチドと同じ測定条件下での測定データであることが望ましいが、これに限られず、類似あるいは異なる測定条件下での測定データを換算することにより、本実施形態に用いることも可能である。簡易的には、両ポリペプチド濃度を比較して、ポリペプチド濃度とシグナル強度が比例すると仮定することにより、異なる測定条件下での最大シグナル強度を求めることができるが、これに限られず、本技術分野の通常の知識を有する者であれば、過度の検討の必要なく、タグポリペプチド由来のピークを除去できるように、閾値を設定することが可能である。
また、測定データや閾値は、ローカルの記憶媒体（対照スペクトル記憶部３１０など）に直接記録されていても、オンライン上の記録媒体に記録されていてデータベースなどで使用可能な状態（サーバ６０８、ネットワーク６１０など）になっていてもよく、特に後者の場合、より迅速な測定を可能にすると共に、データの蓄積や多数によるフィードバックを経ることから、より精確な測定も可能となる。
また、上記の実施形態において、抽出されたＮＭＲスペクトルの確認ステップにおいて、ＣＢＣＡＮＨスペクトルおよびＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨスペクトル以外のＮＭＲスペクトルなどからなる別の他種類のＮＭＲスペクトルを用いて、抽出後の目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトル中のピークに対応するピークが存在することを確認してもよい。
また、上記の実施形態における試料中のポリペプチドの濃度は、ポリペプチドの分子量や性質によるところが大きいが、凝集せず、測定したい構造（生理的条件での構造など）を保ち得る範囲内で選ばれる。タンパク質や多くのポリペプチドの場合、ポリペプチドの濃度は、通常、０．０５〜２０ｍＭ、好ましくは０．１〜１０ｍＭ、より好ましくは０．４〜５ｍＭ、最も好ましくは０．４〜２ｍＭの範囲から選ばれるが、これに限られない。
また、上記の実施形態における試料の温度は、高い方が粘度が下がり、良好なスペクトルが得られるが、測定対象のポリペプチドが測定したい構造（生理的条件での構造など）を保ち得る範囲内で選ばれる。タンパク質や多くのポリペプチドの場合、温度は、通常、１０℃−５０℃、より好ましくは１５℃−４５℃、さらに好ましくは２０℃−４０℃、最も好ましくは２５℃−３０℃の範囲から選ばれるが、これに限られない。
また、上記の実施形態における試料内に溶存酸素が残っていた場合、感度の低下や、ＮＯＥの測定の障害となることもあるため、更に、脱気処理を行ってもよい。脱気は、減圧による脱気法などの、本技術分野でよく知られた方法で行うことができる。
また、上記の実施形態における試料は更に、ｐＨの緩衝剤（緩衝液）、界面活性剤、ポリオール、各種金属塩、酸化防止剤などの安定化剤を含んでもよい。更に、プロテアーゼ阻害剤やアジドなどの防腐剤を含んでもよく、また、目的タンパク質に対するリガンドや基質などを含んでもよい。これらは、例えば、測定しようとする核種を含まないものが好ましいが、測定するＮＭＲの条件や測定の目的などに基づいて、本技術分野の通常の知識の範囲内で、適切に選択される。
なお、上記の実施形態により説明される測定・解析方法、測定・解析装置、測定・解析プログラム、または試料の何れかを用い、各種疾病の治療薬をスクリーニングする方法や病態を解析する方法なども、本発明の範囲内に含まれる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これは一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用し、実験手法に関しても、特に示さない限り、通常用いられる手法を用いて行った。
〔ポリペプチドの調製〕
タグポリペプチドとしてＧＳＴ、目的ポリペプチドとして転写因子ＨｅｘのＣ末端（Ｈｅｘ−Ｃ）を用いて実験を行った。ＧＳＴをコードするpGEX2T (GE Healthcare Bioscience)ベクターを用い、制限酵素ＢａｍＨＩを用いてＨｅｘ−ＣのｃＤＮＡを導入したプラスミド（６残基のリンカーを有する）を作成し、大腸菌に形質転換して培養した。温度２５℃で振蕩培養し、波長６００ｎｍの吸光度が０．５に達した時点で、０．２ｍＭの濃度となるようにisopropyl β-D-thiogalactopyranoside（ＩＰＴＧ）を培養液に加え、ＧＳＴ−Ｈｅｘ−Ｃの合成を誘導した。 誘導から１６時間培養後、大腸菌を超音波破砕し、可溶性画分をグルタチオンを用いたアフィニティクロマトグラフ法により粗精製した。次に、AKTAprime装置(GE Healthcare Bioscience)を用いHiLoad 16/60 Superdex 75pgカラム(GE Healthcare Bioscience)でゲルろ過クロマトグラフ法により精製した。精製の度合いは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。得られた精製Ｈｅｘ−Ｃ溶液は、アミコンYM10 (Millipore)を用いて濃縮した。
〔ＮＭＲスペクトルの測定〕
ＮＭＲスペクトル測定は Unity Inova 500 ＮＭＲ 装置(Varian Technologies )で行った。測定に用いたパルスシーケンスなどの諸条件はすでに確立された方法によって行った。すなわち、１５Ｎ−ＨＳＱＣ、及び１３Ｃ−ＨＳＱＣを基本スペクトルとして、１５Ｎ、および１３Ｃを含む３核３次元測定を以下のように組み合わせて、シグナルの帰属を行った。ただし、各シグナルの帰属前に、ＧＳＴのＮＭＲスペクトルの最大強度シグナル以上の値を有するＧＳＴ−Ｈｅｘ−ＣのＮＭＲスペクトルを抽出する処理を行った。その際のスペクトルの代表的な例として、図６に、ＧＳＴ（ａ）およびＧＳＴ−Ｈｅｘ−Ｃ（ｂ）の１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを示した。
〔ＮＭＲスペクトルの解析〕
ＮＭＲシグナルの帰属に関しては、ＣＢＣＡＮＨとＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨを組み合わせて、α炭素とβ炭素を連鎖帰属した。図７に、その際のスペクトルの帰属図を示した。さらに、ＨＮＣＯとＨＮＣＡＣＯを組み合わせて連鎖を確認し、カルボニル炭素を連鎖帰属した。同時に、アミドのＮと、ＮＨを帰属した。次に、ＴＯＣＳＹ−１５Ｎ−ＨＳＱＣおよびＨＣ（ＣＯ）ＮＨにより、αプロトンと対応する側鎖のプロトンを帰属した。さらに、 ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹおよびＤＱＦ−ＣＯＳＹで残りの側鎖のプロトンを全て帰属した。また、側鎖の炭素は、ＣＣＨ-ＴＯＣＳＹを用いて帰属した。以上のとおり、可能な限りの原子の帰属を決定した。次に、構造を計算する距離情報は、プロトンの帰属をもとに、ＮＯＥＳＹ−１５Ｎ−ＨＳＱＣ、ＮＯＥＳＹ−１３Ｃ−ＨＳＱＣ、Ｈ−Ｈ ＮＯＥＳＹを用いて求めた。ＮＭＲから求められる距離情報、二面角情報、及び水素結合等の構造情報から、構造計算ソフト（Cyana1.2；L.A.Systems Inc.)を用いて計算し、Ｈｅｘ−Ｃの立体構造を得た。上記の結果得られたＨｅｘ−Ｃの立体構造を画像表示した図を、図８に示した。
本実施例では、タグの付加しない単独の状態では会合・凝集してしまい、ＮＭＲスペクトルの測定および構造解析が困難であったＨｅｘ−Ｃ（転写因子ＨｅｘのＣ末端）に関して、適切なタグポリペプチド（ＧＳＴ）およびリンカー（６アミノ酸残基）を含む融合ポリペプチドを用いることで、正常の高次構造を保ったＨｅｘ−Ｃの調製に成功した。また、この融合ポリペプチドＧＳＴ−Ｈｅｘ−ＣのＮＭＲスペクトルを測定し、それからＧＳＴ単独のＮＭＲスペクトルを減算することで、本発明以前は困難であったＨｅｘ−ＣのＮＭＲスペクトルの（間接的な）測定、および構造解析を可能にした。会合・凝集・不安定性などの問題からＮＭＲ測定の困難なポリペプチドに対する本発明の有用性が明らかとなった。
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
以上のように、本発明に係る測定方法、試料、測定装置、解析方法、解析装置およびプログラムは、ＮＭＲスペクトル測定の困難なポリペプチドの、ＮＭＲスペクトルの測定または立体構造解析を行う上で有用である。
図１は、実施形態に係る測定装置の全体構成の概略を示す。 図２は、ＮＭＲ測定用の試料の概略を示す。 図３は、実施形態に係る融合ポリペプチドの取得法の概略を示す。 図４は、実施形態に係るＮＭＲスペクトル測定方法の概略を示す。 図５は、実施形態に係るＮＭＲスペクトルの抽出ステップの概略を示す。 図６は、ＧＳＴとＧＳＴ−Ｈｅｘ−Ｃ（ＨｅｘのＣ末端）との１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルの比較を示す。 図７は、ＣＢＣＡＮＨおよびＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨスペクトルを基にしたＨｅｘ−Ｃのα炭素およびβ炭素のＮＭＲスペクトルの帰属を示す。 図８は、Ｈｅｘ−Ｃの立体構造解析結果の画像を示す。 図９は、実施形態に係る解析装置の全体構成を示した機能ブロック図を示す。 図１０は、実施形態に係る解析装置の内部構成をさらに詳細に示した機能ブロック図を示す。 図１１は、実施形態に係る解析装置の目的スペクトル確認部の内部構成をさらに詳細に示した機能ブロック図を示す。 図１２は、実施形態に係る解析装置の内部構成をさらに詳細に示した機能ブロック図を示す。 図１３は、各スペクトル取得部をさらに詳細に示した機能ブロック図を示す。 図１４は、実施形態に係る立体構造解析装置の目的スペクトル確認部および立体構造解析部をさらに詳細に示した機能ブロック図を示す。 図１５は、実施形態に係る測定・解析装置の動作を説明するためのフローチャートを示す。
符号の説明
１００ ＮＭＲ超伝導磁石
１０１ ネットワーク
１０２ プローブ
１０６ キャップ
１１０ 試料
１１２ａ、１１２ｂ ＧＳＴタグポリペプチド
１１４ａ、１１４ｂ 目的ポリペプチド
１１６ａ、１１６ｂ リンカー
１１８ 測定用チューブ（ＮＭＲ試料管）
２００ 分光計コンソール
２０２ 分光計
２０４ Ａ／Ｄ変換器
３００ ワークステーション
３０２ シグナル抽出部
３０４ 目的スペクトル確認部
３０６ 出力部
３０７ シグナル強度判定部
３０８ 立体構造解析部
３０９ フィルタリング部
３１０ 対照スペクトル記憶部
３１２ 閾値参照部
３１４ 閾値記憶部
３１６ 対応スペクトル確認部
３１８ 対応スペクトル記憶部
３２０ 連鎖帰属確認部
３２２ 一次配列記憶部
３２４ 目的スペクトル記憶部
３２６ 画像データ生成部
３２８ ＮＯＥＳＹ計算部
３３０ ＴＯＣＳＹ計算部
３３２ ＨＳＱＣ計算部
３３４ 総合計算部
３３６ 立体構造記憶部
３３８ 立体構造画像データ生成部
３４０ 連鎖帰属判定部
４００ ＮＭＲスペクトル測定部
４０２ タグ付スペクトル取得部
４０４ 対照スペクトル取得部
４０６ 対照スペクトル読出部
４０８ 対照スペクトルデータ
５００ 立体構造解析装置
６０２ プリンタ
６０４ サーバ
６０６ ネットワーク
６０８ サーバ
６１０ ネットワーク
６１２ モニター
１０００ ＮＭＲスペクトル測定装置
１３００ ＮＭＲスペクトル処理部
１４００ ＮＭＲスペクトル取得部
２０００ 解析装置

Claims (15)

  1. 目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルの測定方法であって、
    前記目的ポリペプチドと前記目的ポリペプチドより分子量の大きなタグポリペプチドと前記両ポリペプチドの間に介在して前記両ポリペプチドを結合させるリンカーとを含む融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを測定するステップ
    を含む、測定方法。
  2. ＮＭＲスペクトル測定のための試料であって、
    目的ポリペプチドと前記目的ポリペプチドより分子量の大きなタグポリペプチドと前記両ポリペプチドの間に介在して前記両ポリペプチドを結合させるリンカーとを含む融合ポリペプチドと、
    ＮＭＲスペクトル測定に許容可能な溶媒と、緩衝剤と、安定化剤と、
    を含む、試料。
  3. 請求項２記載の試料において、
    前記タグポリペプチドは、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼである、試料。
  4. 請求項２または３記載の試料において、
    前記リンカーは、５残基以上のアミノ酸残基からなるポリペプチドである、試料。
  5. 目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルの解析方法であって、
    前記目的ポリペプチドと前記目的ポリペプチドより分子量の大きなタグポリペプチドと前記両ポリペプチドの間に介在して前記両ポリペプチドを結合させるリンカーとを含む融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得するステップと、
    前記融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルから、前記目的ポリペプチド由来のピークを抽出するステップと、
    を含む、解析方法。
  6. 請求項５記載の解析方法において、
    前記目的ポリペプチド由来のピークを抽出するステップは、
    前記タグポリペプチドのＮＭＲスペクトルのピークの最大シグナル強度に基づいた閾値を取得するステップと、
    前記融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルから、前記タグポリペプチドのＮＭＲスペクトルの最大シグナル強度に基づいた閾値を用いて、前記閾値以上のシグナル強度を有する目的ポリペプチド由来のピークを抽出するステップと、
    を含む、解析方法。
  7. 請求項６記載の解析方法において、
    前記閾値を取得するステップは、前記タグポリペプチドのＮＭＲスペクトルの最大シグナル強度を、前記融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルでのシグナル強度に換算することにより、前記閾値を算出するステップを含む、解析方法。
  8. 請求項７記載の解析方法において、
    前記タグポリペプチドのＮＭＲスペクトルおよび前記融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルは、いずれも所定のＮＭＲ測定条件でＮＭＲ測定されており、
    前記閾値を算出するステップは、前記ＮＭＲ測定条件におけるポリペプチド濃度および最大シグナル強度の対応関係に基づいて、前記ＮＭＲ測定における前記タグポリペプチドおよび前記融合ポリペプチドの双方の濃度を比較することにより、前記タグポリペプチドのＮＭＲスペクトルの最大シグナル強度を、前記融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルでのシグナル強度に換算するステップを含む、解析方法。
  9. 請求項５記載の解析方法において、
    前記目的ポリペプチド由来のピークを抽出するステップは、
    前記タグポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得するステップと、
    前記融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルおよび前記タグポリペプチドのＮＭＲスペクトルの差を取ることにより、前記目的ポリペプチド由来のピークを抽出するステップと、
    を含む、解析方法。
  10. 請求項５乃至９いずれかに記載の解析方法において、
    前記抽出された目的ポリペプチド由来のピークが、前記融合ポリペプチドの前記抽出処理を経ていない他種類のＮＭＲスペクトルの中に対応するピークを有することを確認するステップをさらに含む、解析方法。
  11. 請求項５乃至１０いずれかに記載の解析方法において、
    前記抽出された目的ポリペプチド由来のピークは、連鎖帰属可能であることを確認するステップをさらに含む、解析方法。
  12. 請求項５乃至１１いずれかに記載の解析方法において、
    前記目的ポリペプチド由来のＮＭＲスペクトルに基づいて、前記目的ポリペプチドの立体構造を解析するステップをさらに含む、解析方法。
  13. 請求項１２記載の解析方法において、
    前記立体構造を解析するステップは、核種または測定条件の異なる複数種の前記目的ポリペプチド由来のＮＭＲスペクトルを用いて、前記目的ポリペプチドの立体構造を解析するステップを含む、解析方法。
  14. 目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルの解析装置であって、
    前記目的ポリペプチドと前記目的ポリペプチドより分子量の大きなタグポリペプチドと前記両ポリペプチドの間に介在して前記両ポリペプチドを結合させるリンカーとを含む融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得するタグ付スペクトル取得部と、
    前記融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルから、前記目的ポリペプチド由来のピークを抽出するシグナル抽出部と、
    を有する、解析装置。
  15. コンピューターに目的ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを生成させるためのプログラムであって、
    前記コンピューターに、
    前記目的ポリペプチドと前記目的ポリペプチドより分子量の大きなタグポリペプチドと前記両ポリペプチドの間に介在して前記両ポリペプチドを結合させるリンカーとを含む融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを取得するステップと、
    前記融合ポリペプチドのＮＭＲスペクトルから、前記目的ポリペプチド由来のピークを抽出するステップと、
    を実行させる、プログラム。
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