JP2008201744A

JP2008201744A - New flavanol compound and method for producing the same

Info

Publication number: JP2008201744A
Application number: JP2007041249A
Authority: JP
Inventors: Taira Cho; 平趙; Toshihiko Shoji; 俊彦庄司; Tomomasa Kanda; 智正神田
Original assignee: Asahi Breweries Ltd
Current assignee: Asahi Breweries Ltd
Priority date: 2007-02-21
Filing date: 2007-02-21
Publication date: 2008-09-04

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new compound which can be used as a medicine, a cosmetic, a health food, a food additive or the like. <P>SOLUTION: The flavanol compound represented by formula (1) or its diastereomer is provided. By the present invention, the new flavanol compound having an antioxidizing action can be provided. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、抗酸化活性を有し、医薬品、化粧品、健康食品、食品添加物などとして利用することができる新規フラバノール化合物に関するものである。 The present invention relates to a novel flavanol compound which has antioxidant activity and can be used as a pharmaceutical, cosmetic, health food, food additive and the like.

抗酸化化合物としては、例えばビタミン−Ｃ（アスコルビン酸）などの水溶性抗酸化化合物、ビタミン−Ｅ（α−トコフェロール）などの脂溶性抗酸化化合物が知られているが、ポリフェノールの中でも幅広い植物に含まれるプロアントシアニジン（ＰＡ）の機能性が健康食品分野において近年関心を集めている。ＰＡは、フラバンユニットから構成され、酸性条件下分解してフラバンユニットの４位にカルボカチオンが生成するという化学的性質を持っており、トルエン−α−チオール、フロログルシノールなどの求核剤を共存させると、それらがカチオンをトラップしてフラバンユニットとの結合物質が生成することが知られている。 As antioxidant compounds, for example, water-soluble antioxidant compounds such as vitamin-C (ascorbic acid) and fat-soluble antioxidant compounds such as vitamin-E (α-tocopherol) are known. The functionality of contained proanthocyanidins (PA) has recently attracted interest in the health food field. PA is composed of flavan units and has the chemical property that carbocation is generated at the 4-position of the flavan units when decomposed under acidic conditions. Nucleophiles such as toluene-α-thiol and phloroglucinol It is known that when they coexist, they trap cations and produce a substance bound to the flavan unit.

国際公開第2003/024951号パンフレットInternational Publication No. 2003/024951 Pamphlet 国際公開第2004/103988号パンフレットInternational Publication No. 2004/103988 Pamphlet Torres, J.L., et al., 2005. Conjugation of Catechins with Cysteine Generates Antioxidant Compounds with Enhanced Neuroprotective Activity. Phytochemistry 66, 2032-2037.Torres, J.L., et al., 2005. Conjugation of Catechins with Cysteine Generates Antioxidant Compounds with Enhanced Neuroprotective Activity. Phytochemistry 66, 2032-2037. Selga, A. & Torres, J.L., 2005. Efficient Preparation of Catechin Thio Conjugates by One Step Extraction/Depolymerization of Pine (Pinus pinaster) Bark Procyanidins. J. Agric. Food Chem. 53, 7760-7765.Selga, A. & Torres, J.L., 2005. Efficient Preparation of Catechin Thio Conjugates by One Step Extraction / Depolymerization of Pine (Pinus pinaster) Bark Procyanidins. J. Agric. Food Chem. 53, 7760-7765. Lozano, C., et al., 2005. Effect of New Antioxidant Cysteinyl-Flavanol Conjugates on Skin Cancer Cells. FEBS Letters 579, 4219-4225.Lozano, C., et al., 2005. Effect of New Antioxidant Cysteinyl-Flavanol Conjugates on Skin Cancer Cells.FEBS Letters 579, 4219-4225. Selga, A., et al., 2004. Efficient One Pot Extraction and Depolymerization of Grape (Vitis vinifera) Pomace Procaynidins for the Preparation of Antioxidant Thio-Conjugates. J. Agric. Food Chem. 52, 467-473.Selga, A., et al., 2004. Efficient One Pot Extraction and Depolymerization of Grape (Vitis vinifera) Pomace Procaynidins for the Preparation of Antioxidant Thio-Conjugates. J. Agric. Food Chem. 52, 467-473. Mitjans, M., et al., 2004. Immunomodulatory Activity of a New Family of Antioxidants Obtained from Grape Polyphenols. J. Agric. Food Chem. 52, 7297-7299.Mitjans, M., et al., 2004. Immunomodulatory Activity of a New Family of Antioxidants Obtained from Grape Polyphenols. J. Agric. Food Chem. 52, 7297-7299. Torres, J.L., et al., 2002. Cysteinyl-flavan-3-ol Conjugates from Grape Procyanidins. Antioxidant and Antiproliferative Properties. Bioorganic & Medicinal Chemistry 10, 2497-2509.Torres, J.L., et al., 2002. Cysteinyl-flavan-3-ol Conjugates from Grape Procyanidins. Antioxidant and Antiproliferative Properties. Bioorganic & Medicinal Chemistry 10, 2497-2509. Torres, J.L. and Bobet, R., 2001. New Flavanol Derivatives from Grape (Vitis vinifera) Byproducts. Antioxidant Aminoethylthio-Flavan-3-ol Conjugates from a Polymeric Waste Fraction Used as a Source of Flavanols. J. Agric. Food Chem. 49, 4627-4634.Torres, JL and Bobet, R., 2001. New Flavanol Derivatives from Grape (Vitis vinifera) Byproducts. Antioxidant Aminoethylthio-Flavan-3-ol Conjugates from a Polymeric Waste Fraction Used as a Source of Flavanols. J. Agric. Food Chem. 49, 4627-4634. Tanaka, T., et al., 1994. Chemical Evidence for the De-astringency (Insolubilization of Tannins) of Persimmon Fruit. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 20, 3013-3022.Tanaka, T., et al., 1994. Chemical Evidence for the De-astringency (Insolubilization of Tannins) of Persimmon Fruit. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 20, 3013-3022.

本発明は、医薬品、化粧品、健康食品、食品添加物などとして利用することができる、新規化合物を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the novel compound which can be utilized as a pharmaceutical, cosmetics, health food, a food additive, etc.

本発明者らは、リンゴ未熟果実由来のプロシアニジン２量体画分とＳＨ基を有するジチオスレイトール（ＤＴＴ）を求核剤として反応させ、新規フラバノール類化合物として４β−Ｌ−（−）−ジチオスレイトイル−（−）−エピカテキン（Ｌ−ＤＴＴ−ＥＰＣ）及び４β−Ｄ−（＋）−ジチオスレイトイル−（−）−エピカテキン（Ｄ−ＤＴＴ−ＥＰＣ）を単離し、これらの化合物がビタミンＣを上回る強い抗酸化活性を有することを見いだし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、下記式（１）又は（２）で表されるフラバノール化合物を提供する。

また、本発明は、リンゴ果実由来のプロシアニジン２量体画分と求核剤とを反応させることを含む、前記フラバノール化合物の製造方法を提供する。 The present inventors reacted procyanidin dimer fraction derived from an immature apple fruit with dithiothreitol (DTT) having an SH group as a nucleophile, and 4β-L-(−)-dithio as a novel flavanol compound. Sleytoyl-(−)-epicatechin (L-DTT-EPC) and 4β-D-(+)-dithiothreitoyl-(−)-epicatechin (D-DTT-EPC) were isolated and these compounds were It has been found that it has a strong antioxidant activity exceeding that of vitamin C, and the present invention has been completed.
That is, this invention provides the flavanol compound represented by following formula (1) or (2).

Moreover, this invention provides the manufacturing method of the said flavanol compound including reacting the procyanidin dimer fraction derived from an apple fruit, and a nucleophile.

本発明により、抗酸化作用を有する新規フラバノール化合物を提供することができる。この新規フラバノール化合物は、抗酸化作用を有するので、生体内に生成した活性酸素や過酸化脂質によって引き起こされる障害を抑制する能力を有し、健康上の障害、美容上の障害の予防、治療に有効であり、医薬品、飲食品、化粧品などに応用、加工ができる。 According to the present invention, a novel flavanol compound having an antioxidant action can be provided. Since this novel flavanol compound has an antioxidant action, it has the ability to suppress damage caused by active oxygen and lipid peroxide generated in the living body, and it can be used for the prevention and treatment of health and cosmetic disorders. It is effective and can be applied and processed for pharmaceuticals, foods and drinks, cosmetics, etc.

上記式（１）又は（２）で表されるフラバノール化合物は、例えばプロシアニジン２量体と、ジチオスレイトール及びその塩からなる群より選ばれる求核剤とを反応させることによって製造することができる。ここで用いるプロシアジンは、２量体以外にも３〜１５量体のいずれか、あるいは混合体であってもよい。
プロシアニジン２量体は、例えばリンゴ果実由来のプロシアニジン２量体画分であってもよく、好ましくはリンゴ未熟果実由来のプロシアニジン２量体画分である。ここで、「リンゴ未熟果実」とは、リンゴの果実が成熟する前に人為的に摘果したもの、あるいは落下などにより自然にリンゴ果樹より脱落したものをいう。
プロシアニジン２量体と、ジチオスレイトール及びその塩からなる群より選ばれる求核剤との反応は、好ましくは酸性条件下で行う。用いる酸としては、有機酸又は無機酸のいずれであってもよい。有機酸としては、酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、蓚酸、リンゴ酸、ギ酸、乳酸、コハク酸、酒石酸、エリソルビン酸などが挙げられる。好ましくは、アスコルビン酸である。無機酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。好ましくは、塩酸である。これらの酸は、単独で、又は２種以上混合して用いてもよい。
プロシアニジン２量体と、ジチオスレイトール及びその塩からなる群より選ばれる求核剤との反応は、好ましくは20〜95℃、より好ましくは50〜90℃、最も好ましくは70℃である。
プロシアニジン２量体と、ジチオスレイトール及びその塩からなる群より選ばれる求核剤との反応に用いられる溶媒としては、好ましくは水、メタノール、エタノールなどが用いられる。医薬品、化粧品、健康食品、食品添加物などに使用することを考えると、溶媒は、好ましくは水、エタノールである。これらの溶媒は、単独で、又は２種以上混合して用いてもよい。 The flavanol compound represented by the above formula (1) or (2) can be produced, for example, by reacting a procyanidin dimer with a nucleophile selected from the group consisting of dithiothreitol and a salt thereof. . The procyanine used here may be any of 3 to 15 mer or a mixture other than the dimer.
The procyanidin dimer may be, for example, a procyanidin dimer fraction derived from an apple fruit, and is preferably a procyanidin dimer fraction derived from an immature apple fruit. As used herein, the term “apple immature fruit” refers to a fruit that has been artificially harvested before the fruit of the apple has matured, or that has fallen naturally from the apple fruit tree due to dropping or the like.
The reaction of procyanidin dimer with a nucleophile selected from the group consisting of dithiothreitol and its salts is preferably carried out under acidic conditions. The acid used may be either an organic acid or an inorganic acid. Examples of the organic acid include acetic acid, citric acid, ascorbic acid, succinic acid, malic acid, formic acid, lactic acid, succinic acid, tartaric acid, and erythorbic acid. Ascorbic acid is preferable. Examples of inorganic acids include hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid and the like. Preferably, it is hydrochloric acid. These acids may be used alone or in combination of two or more.
The reaction of procyanidin dimer with a nucleophile selected from the group consisting of dithiothreitol and salts thereof is preferably 20 to 95 ° C, more preferably 50 to 90 ° C, and most preferably 70 ° C.
As a solvent used for the reaction of procyanidin dimer with a nucleophile selected from the group consisting of dithiothreitol and a salt thereof, water, methanol, ethanol or the like is preferably used. Considering use in pharmaceuticals, cosmetics, health foods, food additives, etc., the solvent is preferably water or ethanol. These solvents may be used alone or in combination of two or more.

前記反応後、残渣を濾別して、濾液を濃縮したあと常法により精製する。濃縮液の精製は、濃縮液を膜処理（限外濾過や逆浸透など）又は吸着剤処理などにより行うことができる。吸着剤としては、メタクリル酸吸着剤、ポリアクリルアミドゲル、スチレン−ジビニルベンゼン吸着剤、修飾デキストランゲル、親水性ビニルポリマー、逆相シリカゲル、イオン交換樹脂などが挙げられる。これらの吸着剤を用いる場合、本発明の新規フラバノール化合物は、吸着剤に吸着する画分に含まれる。この画分をメタノールなどのアルコール又は含水アルコール、アセトンなどで溶出させることにより、本発明の新規フラバノール化合物を得ることができる。
以下、Ｌ−ＤＴＴ−ＥＰＣ及びＤ−ＤＴＴ−ＥＰＣの製造方法の例を記載する。これらの実施例は本発明を詳細に説明する目的で特に好ましい様態を示したものであるが、本発明はこれらに制限されるものではない。 After the reaction, the residue is filtered off and the filtrate is concentrated and purified by a conventional method. The concentrate can be purified by membrane treatment (ultrafiltration or reverse osmosis) or adsorbent treatment. Examples of the adsorbent include methacrylic acid adsorbent, polyacrylamide gel, styrene-divinylbenzene adsorbent, modified dextran gel, hydrophilic vinyl polymer, reverse phase silica gel, ion exchange resin and the like. When these adsorbents are used, the novel flavanol compound of the present invention is contained in the fraction adsorbed on the adsorbent. The novel flavanol compound of the present invention can be obtained by eluting this fraction with an alcohol such as methanol or a hydrous alcohol, acetone or the like.
Hereinafter, the example of the manufacturing method of L-DTT-EPC and D-DTT-EPC is described. These examples show particularly preferable modes for the purpose of explaining the present invention in detail, but the present invention is not limited to these examples.

（実施例１）
リンゴ未熟果実由来のポリフェノールより得られたプロシアニジン２量体画分３ｇ、ジチオスレイトール（還元型）（和光純薬工業（株）製）18ｇ、アスコルビン酸（和光純薬工業（株）製）0.5ｇ、１％塩酸300mlを混合し、70℃で１時間反応させた。この反応液を冷水で冷却した後Sephadex ＬＨ−２０（ファルマシア（株）製）を充填したカラム（容量約200ml）に負荷し、非吸着物質を水200mlで洗浄した後、40-50％メタノール400mlずつで溶出する画分をそれぞれ回収し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し、凍結乾燥して褐色粉末の画分１（収量1.98ｇ）を得た。更に、画分１を下記の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、類白色粉末として下記式のＬ−ＤＴＴ−ＥＰＣ（収量0.34ｇ）及びＤ−ＤＴＴ−ＥＰＣ（収量0.59ｇ）を分取精製した。 (Example 1)
Procyanidin dimer fraction 3g obtained from polyphenol derived from immature apple fruit, dithiothreitol (reduced) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 18g, ascorbic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.5 g 300 ml of 1% hydrochloric acid was mixed and reacted at 70 ° C. for 1 hour. The reaction solution was cooled with cold water, loaded onto a column (capacity: about 200 ml) packed with Sephadex LH-20 (Pharmacia Co., Ltd.), and the non-adsorbed substance was washed with 200 ml of water, and then 40-50% methanol 400 ml. Fractions eluted at a time were collected, concentrated under reduced pressure using a rotary evaporator, and lyophilized to obtain a brown powder fraction 1 (yield 1.98 g). Further, fraction 1 was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) under the following conditions to obtain L-DTT-EPC (yield 0.34 g) and D-DTT-EPC (yield 0.59 g) of the following formula as white powder. It was collected and purified.

ＨＰＬＣ条件：
装置：Hitachi ＨＰＬＣシステム（Hitachi Ltd., Tokyo, Japan）
カラム：Inertsil ＯＤＳ−３（φ20×250mm、GL Sciences Inc., Tokyo, Japan）
カラム温度：40℃；流速：12ml/min；注入量：50〜100mg/mlメタノール；ＵＶ検出：280nm
移動相：15％アセトニトリル HPLC conditions:
Apparatus: Hitachi HPLC system (Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)
Column: Inertsil ODS-3 (φ20 × 250mm, GL Sciences Inc., Tokyo, Japan)
Column temperature: 40 ° C .; flow rate: 12 ml / min; injection volume: 50-100 mg / ml methanol; UV detection: 280 nm
Mobile phase: 15% acetonitrile

（実施例２ＤＰＰＨラジカル消去活性）
新規フラバノール化合物であるＬ−ＤＴＴ−ＥＰＣ及びＤ−ＤＴＴ−ＥＰＣのＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）ラジカル消去活性を測定した。すなわち、96穴ウェルプレート中でサンプルの希釈系列を調製し（１ウェル100μL）、750μMのＤＰＰＨのエタノール溶液100μLを加え、暗黒条件下、室温で30分間インキュベーションした後にプレートリーダーを用いて517nmでの吸光度を測定した。吸光度を半減させる供試物質の最終濃度（ＩＣ₅₀）を求め、これを抗酸化活性の指標とした。対照化合物として、ビタミンＣ（Ｖｃ）を用いた。結果を図１に示す。
図１の結果から、本発明の新規フラバノール化合物の活性（ＩＣ₅₀（mM））は、Ｖｃに比べて非常に強いものであった。 (Example 2 DPPH radical scavenging activity)
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical scavenging activity of L-DTT-EPC and D-DTT-EPC, which are novel flavanol compounds, was measured. That is, prepare a dilution series of samples in a 96-well plate (100 μL per well), add 100 μL of 750 μM DPPH in ethanol, incubate at room temperature for 30 minutes in the dark, and then use a plate reader at 517 nm. Absorbance was measured. The final concentration (IC ₅₀ ) of the test substance that reduces the absorbance by half was determined and used as an index of antioxidant activity. Vitamin C (Vc) was used as a control compound. The results are shown in FIG.
From the results shown in FIG. 1, the activity (IC ₅₀ (mM)) of the novel flavanol compound of the present invention was very strong compared to Vc.

本発明の新規フラバノール化合物のＤＰＰＨラジカル消去活性を示すグラフである。It is a graph which shows DPPH radical scavenging activity of the novel flavanol compound of this invention.

Claims

The flavanol compound represented by following formula (1) or (2).

The manufacturing method of the flavanol compound of Claim 1 including making the procyanidin dimer fraction derived from an apple fruit react with the nucleophile chosen from the group which consists of dithiothreitol and its salt.

The manufacturing method of Claim 2 which performs reaction of the procyanidin dimer fraction derived from an apple fruit and a nucleophile at 70 degreeC.