JP2008178309A - 新規イソロンギフォレン−９−オン誘導体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、新規なイソロンギフォレン−９−オン誘導体、好ましくはチロシナーゼ阻害活性を有する新規なイソロンギフォレン−９−オン誘導体、及び当該誘導体の製造方法、並びに当該誘導体を有効成分として含有するチロシナーゼ活性阻害剤を提供することを目的とする。
【解決手段】イソロンギフォレン−９−オンをアスペルギルス属またはグロメレーラ属に属する微生物で処理することにより微生物変換して、得られたイソロンギフォレン−９−オン誘導体を採取することによって、新規なイソロンギフォレン−９−オン誘導体を得ることができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、新規なイソロンギフォレン−９−オン誘導体およびその製造方法、並びに当該イソロンギフォレン−９−オン誘導体を有効成分として含有するチロシナーゼ活性阻害剤に関する。

イソロンギフォレン−９−オン（(+)-isolongifolene−９−one；化合物〔１〕）は、ロンギフォレン骨格を有するセスキテルペンケトンである。イソロンギフォレン−９−オンは、１９６０年に初めてイソロンギフォレンから合成された。イソロンギフォレン−９−オンは、アスペルギルス ニガー（ATCC10549）、フサリウム リニ（NRRC875、NRRL68751）などの微生物変換により誘導体化されることが知られている（非特許文献１参照）。

微生物変換とは、目的の化合物を得るために、生物触媒として生体中の酵素類を使用した生物学的な合成プロセスであり、穏和な条件下で位置特異的に化合物を産生することを特徴とする。ゆえに微生物変換は、生物活性化合物の選択的製造のための有利な方法である。

微生物変換に用いられる微生物としては、グロメレーラ シングラータやアスペルギルス ニガーが挙げられる。

例えば、グロメレーラ シングラータは、(-)-グロブロール（M. Miyazawa, T. Uemura, and H. Kameoka (1994). Phytochemistry, 37, 1027-1030）、(-)-α-ビサボロール（M. Miyazawa, H. Nankai and H. Kameoka (1995). Phytochemistry, 39, 1077-1080）、(+)-セドロール（M. Miyazawa, H. Nankai and H. Kameoka (1993). Chem. Express., 8, 573-576）、(+)-アロマデンドレンおよび(-)-アロアロマデンドレン（M. Miyazawa, H. Nankai and H. Kameoka (1995). Phytochemistry, 40, 793-796）、β-セリネン（M. Miyazawa, Y. Honjo and H. Kameoka (1997). Phytochemistry, 44, 433-436）、(+)-γ-ガジュネン（M. Miyazawa, Y. Honjo and H. Kameoka (1998). Phytochemistry, 49, 1283-1285）、(+)-ボルニルアセテートおよび(-)-ボルニルアセテート（M. Miyazawa, Y. Miyasato (2001). J. Chem. Technol. Biotechnol., 76, 220-224）、α-ブルネセン（M. Miyazawa, A. Sugawara (2005). Nat. Pro. Res., 2, 111-115）などの化合物を立体選択的に酸化して新規テルペノイド類に変換する。

また、真菌の一種であるアスペルギルス ニガーは、(+)-フェンコン（M.Miyazawa, K.Yamamoto, Y.Noma and H.Kameoka, (1990), Chemistry Express, 5, 237-430）、1,4-シネオール（M.Miyazawa, Y.Noma, K.Yamamoto and H.Kameoka, (1992), Chemistry Express, 7, 305-308）、(-)-α-ビサボロール（M.Miyazawa, Y.Funatsu and H Kameoka, (1992), Chemistry Express, 7,573-576）、(-)-cis-ローズオキサイド（M.Miyazawa, K.Yokote and H.Kameoka (1995), Phytochemistry, 39, 85-89）、(+)-trans-ローズオキサイド（M.Miyazawa, K.Yokote and H.Kameoka (1995), Phytochemistry, 39, 85-89）等の種々の天然テルペノイド類を立体選択的に酸化し、新規なテルペノイド誘導体に微生物変換することが知られている。

M. Choudhary et al. "Microbial Transformation of Isolongifolen-4-one" Helvetica Chimica Acta, Vol. 86 (2003) pp.3450-60

本発明は、新規なイソロンギフォレン−９−オン誘導体、好ましくはチロシナーゼ活性阻害作用を有するイソロンギフォレン−９−オン誘導体を提供することを目的とする。また、本発明は、当該イソロンギフォレン−９−オン誘導体の位置特異的かつ立体選択的な製造方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、当該イソロンギフォレン−９−オン誘導体を有効成分とするチロシナーゼ活性阻害剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、微生物の生物変換能力に着目し、グロメレーラ シングラータ（NBRC5257）やアスペルギルス ニガー（NBRC4414）のような異なる菌種および株種を用いたイソロンギフォレン−９−オンの微生物変換による新規生理活性テルペノイド類の産生を試み、その代謝産物を探索した。

その結果、（＋）−イソロンギフォレン−９−オンを基質としたグロメレーラ属またはアスペルギルス属に属する微生物の培養物中に、強いチロシナーゼ活性阻害作用を有する物質が産生されていることを見出した。

本発明者らは、この（＋）−イソロンギフォレン−９−オンを基質としたグロメレーラ属またはアスペルギルス属に属する微生物の培養物中に産生されるチロシナーゼ活性阻害物質を詳細に検討した結果、イソロンギフォレン−９−オン骨格を有する一連の化合物であることを確認すると共に、それらの単離、精製に成功した。

したがって、第１の態様において、本発明は、

のいずれかで表されるイソロンギフォレン−９−オン誘導体の製造方法であって、
（１）イソロンギフォレン−９−オンを基質として、当該イソロンギフォレン−９−オン誘導体を生産する能力を有するアスペルギルス属またはグロメレーラ属に属する微生物によりイソロンギフォレン−９−オンを処理する工程、そして
（２）当該誘導体を採取する工程
を含むことを特徴とする方法を提供する。

また、別の態様において、本発明は、

のいずれかで表される遊離形または塩形のイソロンギフォレン−９−オン誘導体を提供する。

さらに別の態様において、本発明は有効成分として上記イソロンギフォレン−９−オン誘導体を含有するチロシナーゼ活性阻害剤を提供する。

本発明の効果

本発明で得られるイソロンギフォレン−９−オン誘導体は、チロシナーゼに対して顕著な活性抑制作用を示す。したがって、本発明のイソロンギフォレン−９−オン誘導体は白斑や黒皮症などの色素疾患の治療薬や美白化粧品の原料、食品などの褐変抑制剤、さらには病害虫駆除薬として極めて有用である。

チロシナーゼは、動物、植物、微生物界に広く分布する酵素であり、シミやソバカスの原因物質であるメラニン色素の合成を触媒する酵素である。従って、チロシナーゼ阻害剤は、白斑や黒皮症などの色素疾患の治療薬や美白化粧品の原料、食品などの褐変抑制剤、さらには病害虫駆除薬などに極めて有用である。従来、チロシナーゼ阻害活性を有する化合物としては、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、グルタチオン、コウジ酸、アルブチン等が知られている。しかし、これらの化合物には低い経時安定性、低い黒色防止作用、強い細胞毒性、水分存在下の酸化による活性低下等の欠点があり（例えば、特開昭６０−５６９１２号公報、特開２００１−３１６２６８号公報）、このような不都合を持たないチロシナーゼ活性阻害作用を有する化合物が求められていた。

用語の定義
本明細書中において使用される用語は、指示がない限り、当業者によって通常理解される通りの意味で用いられている。

イソロンギフォレン−９−オン誘導体の製造方法
本発明の目的物質であるイソロンギフォレン−９−オン誘導体を製造するには、イソロンギフォレン−９−オンを基質として、グロメレーラ属またはアスペルギルス属に属するイソロンギフォレン−９−オン誘導体産生菌またはその生体内酵素によりイソロンギフォレン−９−オンを処理し、当該イソロンギフォレン−９−オン誘導体を採取すればよい。ここで言う「処理」とは、イソロンギフォレン−９−オンと菌体との接触、イソロンギフォレン−９−オンを菌体の培養培地に含有させて行う培養、発酵等の常套の微生物変換手段を含む意味で用いられており、「採取」とは、常套の分離、抽出及び精製手段を含む工程を意味している。

ここでイソロンギフォレン−９−オン誘導体の製造に使用されるグロメレーラ属微生物の一例としては、グロメレーラ シングラータ（Glomerella cingulata）があり、これは独立行政法人製品評価技術基盤機構にＮＢＲＣ５２５７として寄託されている。

ここでイソロンギフォレン−９−オン誘導体の製造に使用されるアスペルギルス属微生物の一例としては、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）があり、これは独立行政法人製品評価技術基盤機構にＮＢＲＣ４４１４として寄託されている。

生体内酵素とは、菌が当該反応工程に利用している酵素として同定されるあらゆる酵素を意味し、適当な条件下、例えば菌体内の条件下におくことにより、菌そのものを利用している場合と同様に反応を進行させることが可能である。

イソロンギフォレン−９−オン誘導体生産菌の培養に用いられる培地としては、使用する菌の育成あるいは所望の微生物変換に適した常套の培地を適宜選択することができ、当該菌が利用し得る栄養源を含むものであれば液体状でも固体状でもよいが、大量のイソロンギフォレン−９−オン誘導体を得るためには液体培地を用いるのが好ましい。

この培地には、当該菌を培養するために必要な物質、例えば当該菌が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源および無機物等が適宜配合される。炭素源としては、ブドウ糖、ショ糖、麦芽糖、乳糖、デンプンなどが、窒素源としては、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、マルトエキストラクト、硝酸ナトリウムなどが用いられる。また培地にはナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどの塩類が含まれ得る。

培地のｐＨ及び温度条件は使用する菌の育成に好適な範囲であればどのような条件でも使用することができ、このような条件は公知であるか、当業者であれば常套の手段により適宜設定することができる。例えば菌がグロメレーラ シングラータまたはアスペルギルス ニガーである場合、初発ｐＨは約３〜約４、好ましくは３.５であり、培養温度は約１５〜約３５℃、好ましくは２５〜３０℃、特に好ましくは約２７℃である。

グロメレーラ シングラータを用いて微生物変換を行う場合、攪拌培養が望ましい。培養期間は一定しないが、生産されるべきイソロンギフォレン−９−オン誘導体の濃度が最大となるまで培養するのが望ましい。これに要する日数は、液体培地を用いる攪拌培養の場合、通常７日間前後が適当である。

アスペルギルス ニガーは静止した物体に付着して増殖する性質があるので静置培養が望ましく、また、当該菌が付着するような物体、例えばアルミ箔を液体培地中に入れておくと増殖が促進される。培養期間は一定しないが、生産されるべきイソロンギフォレン−９−オン誘導体の濃度が最大となるまで培養するのが望ましい。これに要する日数は、液体培地を用いる静置培養の場合、通常１０日間前後が適当である。

得られた培養液は遠心分離または濾過などの手段により、菌体と培養液とに分離される。この両者は共にチロシナーゼ活性阻害作用を示すが、イソロンギフォレン−９−オン誘導体は培養液により多く含まれている。集められた培養液からイソロンギフォレン−９−オン誘導体を抽出するには、塩化ナトリウム等の飽和溶液とした後、水と混和する有機溶媒、例えばメタノール、エタノールなどの低級アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどを使用すればよい。また、水と混和しない有機溶媒、例えばクロロホルム、塩化メチレン、酢酸エチルなどを使用してもよい。

このようにして得られた抽出液から減圧下に溶媒を留去すれば、イソロンギフォレン−９−オン誘導体を含む粗抽出物を得ることができる。

この粗抽出物からイソロンギフォレン−９−オン誘導体を単離、精製するには、通常の脂溶性低分子物質の単離、精製手段を適用することができる。すなわち、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア製、登録商標）などを用いるゲル濾過型クロマトグラフィー、シリカゲルなどの吸着剤を用いる吸着クロマトグラフィー、シリカゲルなどの順相系担体を用いる高速液体クロマトグラフィーなどを単独または組み合わせて実施すればよい。

セファデックスＬＨ−２０を用いる場合は、一般に極性有機溶媒と非極性有機溶媒との組み合わせ、例えばメタノールとクロロホルムまたは塩化メチレンなどの混合溶媒により溶出される。

シリカゲルを用いる吸着クロマトグラフィーを使用する場合は、ヘキサンとクロロホルム、酢酸エチルまたは塩化メチレンなどの混合溶媒を溶出溶媒とするのが適している。

シリカゲルを担体とする高速液体クロマトグラフィーの場合には、塩化メチレンとベンゼンまたはメタノールの混合溶媒あるいは塩化メチレン単独を溶出溶媒として用いる。このような精製手段を適用することにより、前記に示されるイソロンギフォレン−９−オン誘導体の１種またはそれ以上が単離される。

代替的方法として、イソロンギフォレン−９−オンを、アスペルギルス属またはグロメレーラ属に属する微生物から単離された生体内酵素と接触させることにより、イソロンギフォレン−９−オン誘導体を得ることが可能である。

イソロンギフォレン−９−オン誘導体
本発明で得られるイソロンギフォレン−９−オン誘導体は、好ましくは、

即ち、
（−）−（２Ｓ）−１３−ヒドロキシイソロンギフォレン−９−オン〔１−１〕
（−）−（２Ｒ）−１２−ヒドロキシイソロンギフォレン−９−オン〔１−２〕
（−）−（４Ｒ）−４−ヒドロキシイソロンギフォレン−９−オン〔１−３〕
（−）−（３Ｒ,６Ｒ）−９−オキソ−２,２,７,７,−テトラメチル−３,６,７,８,９,１１−ヘキサヒドロ−１Ｈ−インデン−３−アセトアルデヒド〔１−４〕、または、
（＋）−（３Ｒ）−９−オキソ−２,２,７,７−テトラメチル−３,７,８,９,１０,１１−ヘキサヒドロ−１Ｈ−インデン−３−アセトアルデヒド〔１−５〕
のいずれかである。

本発明で得られるイソロンギフォレン−９−オン誘導体は、好ましくは、

である。

本発明で得られるイソロンギフォレン−９−オン誘導体は、遊離形または塩形であり得る。塩は、本発明のイソロンギフォレン−９−オン誘導体の、常套の無機または有機酸との酸付加塩、または常套の無機または有機塩基との塩基塩であり、好ましくは、生理的に許容し得る塩である。

本発明で得られるイソロンギフォレン−９−オン誘導体は、チロシナーゼに対して顕著な活性抑制作用を示す。当該活性は適当なｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏ試験、例えば実施例２に記載の試験により容易に確認することができる。本発明のイソロンギフォレン−９−オン誘導体は、好ましくは化合物０.５ｍＭをチロシナーゼ（シグマ製）溶液（５２８ユニット／ｍＬ）に加え、３７℃で６０分間インキュベートしたとき、チロシナーゼの活性を好ましくは５０％以上、特に好ましくは７０％以上阻害することができる。本発明の化合物は、好ましくは０.５ｍＭ以下、より好ましくは０.２５ｍＭ以下のＩＣ_５０値でチロシナーゼを阻害することができる。

したがって、本発明のイソロンギフォレン−９−オン誘導体はチロシナーゼ活性阻害剤として使用することができる。好ましくは、本発明のロンギシクレン誘導体は、常套の製剤化手段により、賦形剤、ｐＨ調整剤、香料、界面活性剤、キレート剤、増粘剤、防腐剤等の常套の助剤を適宜使用して、液体、乳液、粉末、顆粒、錠剤、ローション、軟膏、注射溶液、クリームなど、任意の剤型に調製して用いることができる。例えば化粧料として本発明のロンギシクレン誘導体を製剤するとき、ローション、乳液、クリーム等の剤型が好ましい。

また、本発明のイソロンギフォレン−９−オン誘導体を含有するチロシナーゼ活性阻害剤は、動物に投与することを意図するとき、任意の形態で、例えば経口、経腸、非経腸、局所または経皮投与することができ、食品に配合することを意図するとき、常套の混合等の手段により食品中に配合することができる。

本発明のイソロンギフォレン−９−オン誘導体は、チロシナーゼ活性阻害剤として、液体状、粉末状、顆粒状、錠剤など、任意の剤型に調製して用いることができる。さらに賦形剤、ｐＨ調整剤、香料、界面活性剤、キレート剤、増粘剤、防腐剤などの任意の助剤を適宜使用することができる。

実験手法
ＮＭＲは５００ＭＨｚ（^１Ｈ）、１２５ＭＨｚ（^１３Ｃ）を用い、ＴＭＳを内部標準としＣＤＣｌ_３で測定した。

ＧＣは水素炎イオン化型検出器、キャピラリーカラム（ＤＢ−５、島津製作所製：長さ３０ｍ×内径０.２５ｍｍ）、及び２０：１のスプリット注入ユニットを備えたＨＰ ５８９０Ａガスクロマトグラフ（ヒューレット・パッカード製）を使用した。移動相はヘリウムガスを１ｍＬ／分の流量で用いた。オーブン温度は４℃／分の昇温速度で９０℃〜２３０℃にプログラムされた。注入口温度は２７０℃、検出器温度は２８０℃に設定した。ピーク面積は HP 3396 Series2 検出器（ヒューレット・パッカード製）により計算した。

ＧＣ／ＭＳは、スプリット注入ユニット、キャピラリーカラム（ＨＰ−５ＭＳ、ヒューレット・パッカード製：長さ３０ｍ×内径０.２５ｍｍ）を備えたガスクロマトグラフ（ＨＰ ５８９０Ａ、ヒューレット・パッカード製）を質量分析計（ＨＰ ５９７２Ａ、ヒューレット・パッカード製）に直結した。昇温プログラムはＧＣと同一である。移動相はヘリウムガスを１ｍＬ／分の流量で用いた。イオン源部温度は２８０℃、電子エネルギーは７０電子ボルト（ｅＶ）であった。イオン化法は電子衝撃法（ＥＩ）を使用した。

ＩＲスペクトルはパーキン・エルマー製１７６０Ｘ型分光器により得た。
ＴＬＣは、ＣＨＣｌ_３を展開溶媒としてシリカゲル６０Ｆ２５４を塗布したＴＬＣプレート（メルク製：層厚０.２５ｍｍ）を用いた。
シリカゲルカラムクロマトの展開溶媒は、ヘキサン-酢酸エチル系を用いた。

微生物の培養および代謝産物の単離の方法
グロメレーラ シングラータの前培養
低温で保存されたグロメレーラ シングラータの胞子を、滅菌した培養培地（ショ糖１.５％、グルコース１.５％、ポリペプトン０.５％、硫酸マグネシウム（七水和物）０.０５％、塩化カリウム０.０５％、リン酸二カリウム０.１％、硫酸第一鉄（七水和物）０.００１％、及び蒸留水、ｐＨ７.２）を入れた振盪フラスコ中に植え付け、２７℃で５日間培養した。

アスペルギルス ニガーの前培養
低温で保存されたアスペルギルス ニガーの胞子を、滅菌した培養培地（ショ糖１.５％、グルコース１.５％、ポリペプトン０.５％、硫酸マグネシウム（七水和物）０.０５％、塩化カリウム０.０５％、リン酸二カリウム０.１％、硫酸第一鉄（七水和物）０.００１％、及び蒸留水、ｐＨ７.２）を入れた振盪フラスコ中に植え付け、２７℃で１日間培養した。

経時変化実験（グロメレーラ シングラータ）
前培養したグロメレーラ シングラータを２００ｍＬの培養培地を入れた３００ｍＬ容の三角フラスコに移植し、２７℃で３日間、攪拌条件下で培養した。グロメレーラ シングラータが成長した後、（＋）−イソロンギフォレン−９−オン〔１〕６０ｍｇを培地に加えて１５日間培養を続けた。その後、塩化ナトリウムで飽和し、酢酸エチルで抽出した。抽出物をＧＣにより分析した。〔１〕と代謝産物間の比率は、ＧＣとＧＣ／ＭＳのピーク面積に基づいて決定した（図１）。

経時変化実験（アスペルギルス ニガー）
前培養したアスペルギルス ニガーを培養培地（５０ｍＬのペトリ皿中２０ｍＬ）に移植し、２７℃で１日間（菌糸体が培養培地の表面積の６０〜８０％を占めるまで）、静置条件下で培養した。アスペルギルス ニガーが成長した後、（＋）−イソロンギフォレン−９−オン〔１〕６０ｍｇを培地に加えて５日間培養を続けた。その後、塩化ナトリウムで飽和し、酢酸エチルで抽出した。抽出物をＧＣにより分析した。〔１〕と代謝産物間の比率は、ＧＣとＧＣ／ＭＳのピーク面積に基づいて決定した（図１）。

（＋）−イソロンギフォレン−９−オンの３日間の微生物変換（グロメレーラ シングラータ）
前培養したグロメレーラ シングラータを培養培地８００ｍＬに移植し、２７℃で曝気条件下にて３日間攪拌培養した。グロメレーラ シングラータが成長した後、（＋）−イソロンギフォレン−９−オン２４０ｍｇを培地に添加し、３日間培養を続けた。

（＋）−イソロンギフォレン−９−オンの１０日間の微生物変換（アスペルギルス ニガー）
前培養したアスペルギルス ニガーを培養培地１８００ｍＬに移植し、２７℃で曝気条件下にて１日間攪拌培養した。アスペルギルス ニガーが成長した後、（＋）−イソロンギフォレン−９−オン６００ｍｇを培地に添加し、１０日間培養を続けた。

代謝産物の単離（グロメレーラ シングラータ）
３日間の微生物変換の後、ろ過により培地と菌糸体を分離した。培地を塩化ナトリウムで飽和し、酢酸エチルで抽出した。さらに、菌糸体を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出液を混ぜ、硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒除去し、粗抽出物を得た。抽出物をヘキサン−酢酸エチル混液と３００メッシュのシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供し、各代謝産物を単離した。

代謝産物の単離（アスペルギルス ニガー）
１０日間の微生物変換の後、ろ過により培地と菌糸体を分離した。培地を塩化ナトリウムで飽和し、酢酸エチルで抽出した。さらに、菌糸体を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出液を混ぜ、硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒除去し、粗抽出物を得た。抽出物をヘキサン−酢酸エチル混液と３００メッシュのシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供し、各代謝産物を単離した。

グロメレーラ シングラータおよびアスペルギルス ニガーによる（＋）−イソロンギフォレン−９−オンの代謝産物の単離と同定
少量の（＋）−イソロンギフォレン−９−オン〔１〕をグロメレーラ シングラータとは１５日間、アスペルギルス ニガーとは５日間共培養し、経時変化実験に供した。〔１〕はグロメレーラ シングラータにより５種、アスペルギルス ニガーにより２種の代謝産物に変換された。代謝産物は薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）及びガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ／ＭＳ）で検出された。これらの生成物は、基質を全く添加しなかった微生物培養培地のＴＬＣ、ＧＣ及びＧＣ−ＭＳ分析では検出されなかった。代謝産物の経時変化を図２に示す。

代謝産物を単離するために、〔１〕を添加した微生物の大規模培養が実施された。そして、「代謝産物の単離」の項で記載するように培地を抽出した。代謝産物は酢酸エチル抽出で単離され、スペクトルデータにより構造決定された。

化合物〔１−１〕および〔１−２〕は、過去に報告されたＭＳ法、赤外分光、およびＮＭＲデータ［Choudhary et al.、前掲］と比較して、（−）−（２Ｓ）−１３−ヒドロキシイソロンギフォレン−９−オン〔１−１〕および（−）−（２Ｒ）−１２−ヒドロキシイソロンギフォレン−９−オン〔１−２〕であると同定された。化合物〔１−３〕は、ＩＲ、^１Ｈ−および^１３Ｃ−ＮＭＲ、並びにＮＯＥ分析により、（−）−（４Ｒ）−４−ヒドロキシイソロンギフォレン−９−オンと決定された。

化合物〔１−４〕は、高分解能電子衝撃質量分析（ＨＲ−ＥＩＭＳ）により分子式Ｃ_１５Ｈ_２２Ｏ_２、ｍ／ｚ値２３４.１６１８であった。〔１−４〕のＩＲと^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルでは、カルボニル基（ＩＲ：１７２３ｃｍ^−１、δ_Ｃ２００.０ｐｐｍ（Ｃ））およびアルデヒド基（ＩＲ：１６５８ｃｍ^−１、δ_Ｃ２０１.５ｐｐｍ（Ｃ））の存在が示された。^１Ｈ−及び^１３Ｃ−ＮＭＲシグナルは基質と異なっており、環の開裂が示唆された。このことは、二次元ＮＭＲ（ＣＯＳＹ（correlation spectroscopy）、ＨＭＱＣ（heteronuclear multiple quantum correlation)、およびＨＭＢＣ（heteronuclear multiple bond correlation)）の帰属により確認された。特徴的なＨＭＢＣスペクトル相関では、メチンプロトン（δ_Ｈ２.０６−２.０８ｐｐｍ；Ｈ−１０）およびメチレン炭素（δ_Ｃ５３.３ｐｐｍ；Ｃ−８）を有する２個のメチルプロトン（δ_Ｈ０.８２，１.１７ｐｐｍ；Ｈ−１４，Ｈ−１５）、新規のメチンプロトン（δ_Ｈ２.７２ｐｐｍ；Ｈ−６）を有する２個のメチル炭素（δ_Ｃ１９.７，２９.５ｐｐｍ；Ｃ−１４，Ｃ−１５）が観測された。このことより〔１−４〕は、６位の炭素が開裂していると考えられる。そして、ＨＭＢＣでは、メチン炭素（δ_Ｃ４２.６ｐｐｍ；Ｃ−３）とメチレン炭素（δ_Ｃ２９.７ｐｐｍ；Ｃ−１１）を有する新規のメチンプロトン（δ_Ｈ２.７２ｐｐｍ；Ｈ−６）、メチンプロトン（δ_Ｈ２.１９−２.２２ｐｐｍ；Ｈ−３）を有する非プロトン炭素（δ_Ｃ４４.１ｐｐｍ；Ｃ−２）、および２個のメチレンプロトン（δ_Ｈ２.３６，２.６２ｐｐｍ；Ｈ−４，２.０６−２.０８ｐｐｍ；Ｈ−１１）が観測された。このことより〔１−４〕は、５位と６位の炭素が開裂していると考えられる。ＨＭＢＣは、メチンプロトン（δ_Ｈ２.１９−２.２２ｐｐｍ；Ｈ−３）とメチレンプロトン（δ_Ｈ２.３６，２.６２ｐｐｍ；Ｈ−４）を有する非プロトン炭素（δ_Ｃ２０１.５ｐｐｍ；Ｃ−５）が観測された。このことより〔１−４〕は、〔１〕の５位の炭素がアルデヒド化して生じた化合物であると推察された。

更に、〔１−４〕の３位および６位の炭素の絶対配置がＲ体であることをＮＯＥ分析により推測した。〔１−４〕の１３位のメチル基の共鳴をデカップリングパルスで照射して飽和させたとき、４位および６位の水素のシグナル強度の増強が観察された。しかしながら、１２位のメチル基と４位および６位の水素間のＮＯＥ分析では、３位のアセトアルデヒド基がα位であり、６位の炭素がβ位であることを示した。比旋光度は（−）−体を示した。これらのデータから、〔１−４〕の構造は、新規化合物である（−）−（３Ｒ,６Ｒ）−９−オキソ−２,２,７,７,−テトラメチル−３,６,７,８,９,１１−ヘキサヒドロ−１Ｈ−インデン−３−アセトアルデヒドと決定された。

化合物〔１−５〕は、ＨＲ−ＥＩＭＳにより分子式Ｃ_１５Ｈ_２２Ｏ_２、ｍ／ｚ値２３４.１６３２であった。〔１−５〕のＩＲ、^１Ｈ−および^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルでは、カルボニル基（ＩＲ：１７２１ｃｍ^−１、δ_Ｃ２１０.５ｐｐｍ（Ｃ））およびアルデヒド基（ＩＲ：１６５９ｃｍ^−１、δ_Ｃ２０２.４ｐｐｍ（Ｃ）、δ_Ｈ９.８４ｐｐｍ）の存在が示された。^１Ｈ−及び^１３Ｃ−ＮＭＲシグナルは〔１−４〕と同様に、６位での環の開裂が示唆された。このことは、二次元ＮＭＲ（ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、及びＨＭＢＣ）の帰属により確認された。特徴的なＨＭＢＣスペクトル相関では、メチンプロトン（δ_Ｈ２.１９−２.２２ｐｐｍ；Ｈ−３）およびメチレンプロトン（δ_Ｈ２.３６，２.６２ｐｐｍ；Ｈ−４）を有する非プロトン炭素（δ_Ｃ２０１.５ｐｐｍ；Ｃ−５）が観測された。このことより〔１−５〕は、〔１〕の５位の炭素がアルデヒド化して生じた化合物であると推察された。ＨＭＢＣは、２個のメチルプロトン（δ_Ｈ０.８２，１.１７ｐｐｍ；Ｈ−１４，Ｈ−１５）とメチンプロトン（δ_Ｈ２.１９−２.２２ｐｐｍ；Ｈ−３）を有する非プロトン炭素（δ_Ｃ１４０.２ｐｐｍ；Ｃ−６）が観測された。このことより〔１−５〕は、〔１〕の１０位の二重結合が６位に転移した化合物であると推察された。更に、〔１−５〕の３位の炭素の絶対配置がＲ体であることを〔１−４〕の結果と同様にしてＮＯＥ分析により推測した。比旋光度は（＋）−体を示した。これらのデータから、〔１−５〕の構造は、新規化合物である（＋）−（３Ｒ）−９−オキソ−２,２,７,７−テトラメチル−３,７,８,９,１０,１１−ヘキサヒドロ−１Ｈ−インデン−３−アセトアルデヒドと決定された。

グロメレーラ シングラータおよびアスペルギルス ニガーによる微生物変換の代謝経路を図１に示す。また経時変化を図２に示す。

化合物〔１−１〕
化合物〔１−１〕：無色油状、[α]_D ^19.7 -162（CHCl₃；c=0.4)、EIMS m/z：[M]⁺ 234(66), 203(55), 176(100), 147(14), 119(17), 91(66), 55(33)、IR（KBr法）ν_maxcm^-1：3429, 2965, 1653、¹H及び¹³C-NMRを表１、２に示す。

化合物〔１−２〕
化合物〔１−２〕：EIMS m/z：[M]⁺ 234(66), 203(49), 176(100), 147(49), 119(60), 91(48), 55(21)

化合物〔１−３〕
化合物〔１−３〕：無色油状、[α]_D ^19.7 -74.6（CHCl₃；c=1.0)、EIMS m/z：[M]⁺ 234(63), 216(16), 178(58), 160(51), 150(59), 135(80), 85(100), 41(90)、IR（KBr法）ν_maxcm^-1：3420, 2963, 1652、¹H及び¹³C-NMRを表１、２に示す。

化合物〔１−４〕
化合物〔１−４〕：無色結晶、[α]_D ^22.5 -20.1（CHCl₃；c=1.1)、HR-FABMS：m/z 234.1618 [M]⁺、分子式C₁₅H₂₂O₂、EIMS m/z：[M]⁺ 234(23), 219(5), 175(22), 148(10), 134(100), 107(20), 91(55), 41(57)、IR（KBr法）ν_maxcm^-1：2959, 1723, 1658、¹H及び¹³C-NMRを表１、２に示す。

化合物〔１−５〕
化合物〔１−５〕：無色結晶、[α]_D ^22.5 +5.8（CHCl₃；c=0.4)、HR-FABMS：m/z 234.1632 [M]⁺、分子式C₁₅H₂₂O₂、EIMS m/z：[M]⁺ 234(6), 220(1), 219(9), 190(70), 175(100), 148(24), 133(49), 91(39), 41(37)、IR（KBr法）ν_maxcm^-1：2958, 1721, 1659, 1463、¹H及び¹³C-NMRを表１、２に示す。

チロシナーゼ阻害活性
Ｌ−チロシンおよびＬ−ドーパを基質としたチロシナーゼ活性を分光光度法により測定した。０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）６８０μＬ、２０％ポリオキシエチレン−ノニル−フェニルエーテル８０μＬ、０.０３％Ｌ−チロシンまたはＬ−ドーパ１００ｍＬ、および化合物〔１−１〕（ＤＭＳＯ溶液）４０μＬを試験管に加え、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、チロシナーゼ（シグマ製）溶液（５２８ユニット／ｍＬ、０.１Ｍリン酸緩衝液に溶解）を加え、３７℃で６０分間インキュベートした。酵素活性はチロシナーゼにより合成されるメラニンの吸光度変化（４７５ｎｍ）を測定することにより決定した。比較対照物質にはアルブチンを使用した。他の代謝産物についても同様に試験した。チロシナーゼ活性は以下の式により得られる。
チロシナーゼ活性（％）＝［（Ａ−Ｂ）／（Ｃｐ−Ｃｎ）］×１００
この式において、Ａは試験物質（０.１Ｍリン酸緩衝液、ポリオキシエチレン−ノニル−フェニルエーテル、Ｌ−チロシンまたはＬ−ドーパ、化合物溶液、およびチロシナーゼ）の吸光度、Ｂはブランク（０.１Ｍリン酸緩衝液、ポリオキシエチレン−ノニル−フェニルエーテル、蒸留水、化合物溶液、およびチロシナーゼ）の吸光度、Ｃｐは陽性対照（０.１Ｍリン酸緩衝液、ポリオキシエチレン−ノニル−フェニルエーテル、Ｌ−チロシンまたはＬ−ドーパ、ＤＭＳＯ、およびチロシナーゼ）の吸光度、Ｃｎは陰性対照（０.１Ｍリン酸緩衝液、ポリオキシエチレン−ノニル−フェニルエーテル、蒸留水、およびチロシナーゼ）の吸光度を示す。結果を表３および図３に示す。

（＋）−イソロンギフォレン−９−オン〔１〕をアスペルギルス ニガーまたはグロメレーラ シングラータによって微生物変換したときの構造の変化を示す。 （＋）−イソロンギフォレン−９−オン〔１〕をアスペルギルス ニガーまたはグロメレーラ シングラータによって微生物変換したときの、（＋）−イソロンギフォレン−９−オン〔１〕および化合物〔１−１〕〜〔１−５〕それぞれの相対存在量についての経時変化を示す。 （＋）−イソロンギフォレン−９−オン〔１〕および化合物〔１−３〕〜〔１−５〕、並びにアルブチン（対照）のチロシナーゼ阻害活性を示す。

Claims (13)

1. 

   のいずれかで表されるイソロンギフォレン−９−オン誘導体の製造方法であって、
   （１）イソロンギフォレン−９−オンを基質として、当該イソロンギフォレン−９−オン誘導体を生産する能力を有するアスペルギルス属またはグロメレーラ属に属する微生物によりイソロンギフォレン−９−オンを処理する工程、そして
   （２）当該誘導体を採取する工程
   を含むことを特徴とする方法。
2. イソロンギフォレン−９−オン誘導体を生産する能力を有するアスペルギルス属に属する微生物がアスペルギルス ニガーである、請求項１に記載の製造方法。
3. アスペルギルス ニガーが寄託番号ＮＢＲＣ４４１４の株種である、請求項２に記載の製造方法。
4. 当該誘導体が
   

   

   である、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の製造方法。
5. 当該誘導体が
   

   

   である、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の製造方法。
6. イソロンギフォレン−９−オン誘導体を生産する能力を有するグロメレーラ属に属する微生物がグロメレーラ シングラータである、請求項１に記載の方法。
7. グロメレーラ シングラータが寄託番号ＮＢＲＣ５２５７の株種である、請求項６に記載の製造方法。
8. 当該誘導体が
   

   

   である、請求項１、請求項６または請求項７に記載の製造方法。
9. 請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の製造方法により製造される、遊離形または塩形のイソロンギフォレン−９−オン誘導体。
10. 

    のいずれかで表される遊離形または塩形のイソロンギフォレン−９−オン誘導体。
11. 

    で表される遊離形または塩形のイソロンギフォレン−９−オン誘導体。
12. チロシナーゼ活性阻害作用を有する、請求項９ないし請求項１１のいずれかに記載の誘導体。
13. 請求項９ないし請求項１２のいずれかに記載のイソロンギフォレン−９−オン誘導体を有効成分として含有するチロシナーゼ活性阻害剤。

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