JP2008154465A - 木材製品の管理方法およびプライマーセット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】木材製品からDNAを抽出し、それを鋳型として、マイクロサテライト領域を増幅するためのプライマーセットを用いてPCRにより、DNAを増幅し、得られるDNA産物の塩基長を解析することにより、その木材製品の原材料となった木の出所を同定してその履歴を管理することができる。
【選択図】なし
Description
苗から丸太、製品までの履歴をたどる場合には以下の方法が考えられる。林地において伐採する際、植栽時の記録を参照して丸太にペンキや焼印、ICチップなどの方法で個体を識別する印を付け、林地から工場までの過程で適宜、記録をつける。工場ではその記録を引き継ぎ、加工後の製品に対して印刷、シール、焼印、ICチップなどの方法で印を付ける。しかし合板や机、椅子などの複数の木材からなる製品の場合、部位ごとに印を付けることは現実的とは言い難い。また故意や過失による印の付け間違いや、丸太の樹皮の脱落などにより印が失われてしまう可能性は否定できない。
非特許文献1に記載のように、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)分析によるDNA個体識別法を使ったスギ丸太のクローン識別が試みられているが、伐採後1ヶ月以内で樹皮が付いたものに限定されており、加工後の木材製品の識別には至っていない。
2005年、木材の育種「特別号」、27−29頁、「スギ流通丸太を対象としたクローン識別の試み」
更に、本発明は、マイクロサテライト領域を増幅するためのプライマーセットであって、以下の21種類から選ばれるプライマーセットに関する:
配列番号1または2で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号3で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号4または5で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号6で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号7または8で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号9で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号10または11で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号12で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号13または14で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号15で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号16または17で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号18で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号19または20で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号21で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号22または23で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号24で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号25または26で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号27で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号28または29で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号30で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号31または32で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号33で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号34または35で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号36で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号37または38で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号39で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号40または41で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号42で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号43または44で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号45で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号46または47で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号48で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号49または50で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号51で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号52または53で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号54で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号55または56で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号57で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号58または59で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号60で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;および
配列番号61または62で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号63で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット。
また、本発明によれば、丸太はもとより、合板やLVL、ブロックボードといった加工された木材製品においても個体識別が可能である。ヒノキを例にすれば、約80年生の木の樹皮から50年前までの組織から個体識別が可能である。
また合板、LVL、ブッロクボードなどの製造時において230℃まで加熱して製造されたものであっても製造時の熱により識別不能とはなりえない。
マイクロサテライト領域は、植物のゲノム中に存在する、シトシンとアデニン、チミンとグアニンなどの数塩基からなるモチーフの繰り返し配列であり、高頻度で広く分布することが知られたDNA領域である。マイクロサテライト領域を増幅するように設計されたPCRマーカーの多くは、多型性が抜きん出て高くしかも共優性であることから、精密な遺伝子解析に適しており、近年、育種学、集団遺伝学などの分野に重用されている。従って、木材製品からDNAを抽出し、そのDNAを鋳型とし、マイクロサテライト領域を含むマイクロサテライトマーカーをPCRによって増幅し、増幅されたマイクロサテライトマーカーの塩基長によって木材製品の個体識別が可能となる。
マイクロサテライトマーカーは、植物のゲノム中に存在するマイクロサテライト領域に隣接する両端の塩基配列を、dual−suppression−PCR法(練春蘭ら、日林誌86(2),191−198,2004;Chunlan Lian et al.,Journal of Plant Research,114,381−386,2001;Chunlan Lian et al.,Molecular Ecology Notes 2,211−213,2002)により特定することができる。このようにして特定されたマイクロサテライトマーカーにより、PCRによって増幅するためのプライマーセットを設計することができる。
配列番号1または2で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号3で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号4または5で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号6で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号7または8で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号9で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号10または11で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号12で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号13または14で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号15で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号16または17で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号18で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号19または20で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号21で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;および
配列番号22または23で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号24で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット。
配列番号25または26で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号27で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号28または29で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号30で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号31または32で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号33で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号34または35で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号36で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号37または38で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号39で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号40または41で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号42で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;および
配列番号43または44で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号45で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット。
配列番号46または47で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号48で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号49または50で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号51で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号52または53で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号54で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号55または56で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号57で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号58または59で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号60で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;および
配列番号61または62で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号63で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット。
本発明では、木材製品としては、特に制限されず、いずれの木材製品も対象とすることができる。木材製品としては、例えば、丸太、合板、LVL(単板積層材)、ブロックボード、パーティクルボードなどが挙げられる。
また、木材製品の原材料としては、針葉樹または広葉樹が好ましいものとして挙げられ、具体的には、グメリナ種、ランドウ種、ラジアータパイン種、モルッカネム種に属する植物、ヒノキ、スギなどが挙げられる。
更には、本発明の方法では、以後の実施例1において明らかにされているように、木材製品が、例えば、230℃程度に高温処理して得られたものでも、その出所を同定して管理することができる。
実施例1
1、個体識別用DNAマーカー(マイクロサテライトマーカー)の作製
グメリナ(Gmelina arborea)、ランドウ(Ceiba pentandra)、ラジアータパイン(Pinus radiata)のゲノム中に存在するマイクロサテライト領域に隣接する両端の塩基配列を、dual−suppression−PCR 法(練春蘭ら、日林誌86(2),191−198,2004;Chunlan Lian et al.,Journal of Plant Research,114,381−386,2001;Chunlan Lian et al.,Molecular Ecology Notes 2,211−213,2002)に従って特定し、その塩基配列を基にプライマーセットを設計した。プライマー配列については表1に示した。これらのセットは、それぞれグメリナ種、ランドウ種、ラジアータパイン種に属する植物のゲノム中のマイクロサテライト領域をPCRにより増幅するためのプライマーセットとなるものである。
表1中、GAはグメリナ(Gmelina arborea)を、CPはランドウ(Ceiba pentandra)を、RPはラジアータパイン(Pinus radiata)を示す。
ヒノキの板、スギ合板、加熱プレスしたグメリナの単板、ランドウのブロックボード、ラジアータパインのLVL(単板積層材)をそれぞれヤスリで削り、粉末とした。粉末0.5gに対して4mlのCTAB溶液(2W/V%臭化セチルトリメチルアンモニウム、1.4M塩化ナトリウム、20mM EDTA、100mM Tris−HCl(pH8.0)、0.5V/V% 2−メルカプトエタノール)を加え、65℃で1時間加温した。ついで、等量のクロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)混液を添加し、ゆっくりと混和してから遠心(15,000rpm、5min、18℃)して上清を回収し、この上清に等量のイソプロピルアルコールを加えて混和し、−30℃で10分間静置することによりDNAおよびRNAの混合物を析出させた。析出させた混合物は再び遠心(15,000rpm、7min、4℃)してペレットとして分離し、これをTE緩衝液(1mM EDTA(pH8.0)、10mM Tris−HCl(pH8.0))0.1mlに溶解して10mg/mlのリボヌクレアーゼ(和光純薬(株)製)1μlを加え、37℃で30分間加温してRNAを分解させた後、等量のクロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)混液を添加し、ゆっくりと混和してから遠心(15,000rpm、5min、18℃)して上清を回収し、この上清に2倍量の100%エタノールと、1/10倍量の3M酢酸ナトリウムを加えて混和し、−30℃で10分間静置することによりDNAを析出させた。析出させた混合物は再び遠心(15,000rpm、7min、4℃)して得られたペレットに100μlのTE緩衝液を加えて溶解し、以後の操作に供した。
抽出したDNAを鋳型として、表1または表2に示すプライマーセットを用いて、QIAGEN Multiplex PCR Kit((株)キアゲン製)によりPCR反応を行った。即ち、1μlのDNA溶液に、2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mixを5μl、2μMの表1に示すフォワードプライマー1か2のいずれか1μlと、あるいは表2のフォワードプライマーの1μlと、2μMの蛍光標識された表1または表2に示すリバースプライマーを1μl加え、滅菌蒸留水で全液量を10μlとした。これを以下の条件で反応した。
ステップ2:94℃ 30秒→57℃ 90秒→72℃ 60秒 40サイクル
ステップ3:60℃ 30分 1サイクル
表2中、Cjgはスギ(Cryptomeria japonica)、Coはヒノキ(Chamaecyparis obtuse)を示す。それぞれMoriguchi Y.,Iwata H.,Ujino−Ihara T.,Yoshimura k.,Taira H.,Tsumura Y.(2003)Development and characterization of microsatellite markers for Cryptomeria japonica D.Don.Theor.Appl.Genet.106:751−758 およびNakao Y.,Iwata H.,Matsumoto Y.,Tsumura Y.,Tomaru N.(2001)Highly polymorphic microsatellite markers in Chamaecyparis obtusa.Can.J.For.Res.31:2248−2251を参考にした。
(1)解析結果のいくつかの例を図に示す。図1は実験に用いたヒノキの木材の断面を示す模式図である。図1に示すように、約40年生のヒノキ板をサンプルとし、中心から樹皮に向かって10年ごとに、40−1、40−2、40−3および40−4に示す幅の断面上からそれぞれサンプルを採取し、DNAを抽出して、配列番号72および73のプライマーセットを用いてPCR増幅し、ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems(株)製)を用いて解析した結果を、それぞれ図3から図6に示した。また、図2に示すように、約80年生のヒノキ板をサンプルとし、中心から樹皮に向かって10年ごとに、80−1、80−2、80−3、80−4、80−5、80−6、80−7および80−8に示す幅の断面上からそれぞれサンプルを採取し、DNAを抽出して、プライマーセットを用いてPCR増幅し、ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems(株)製)を用いて解析した結果を、それぞれ図7から図14に示した。図7から11および図13は、配列番号72および73のプライマーセットを用いた場合の結果を示し、図12は、配列番号74および75のプライマーセットを用いた場合の結果を示し、図14は、配列番号78および79のプライマーセットを用いた場合の結果を示す。
これらの図から得られるヒノキの個体識別の結果を表3にまとめて示す。表3中、○は識別可能、×は識別不能を意味する。
これらの図から得られるグメリナの個体識別の結果を表4にまとめて示す。表3中、○は識別可能、×は識別不能を意味する。
これらの図から明らかなように、いずれのサンプルについても、個体識別可能である。
Claims (10)
- 木材製品のDNA個体識別をマイクロサテライト領域に基いて行うことにより、その木材製品の原材料となった木の出所を同定してその履歴を管理する木材製品の管理方法。
- 木材製品の原材料となった木の苗を同定してその履歴を管理する請求項1に記載の管理方法。
- 木材製品の原材料となった木の苗を同定して苗の植えられた林地を同定してその履歴を管理する請求項1または2に記載の管理方法。
- 木材製品が丸太、合板、LVL、ブッロクボードまたはパーティクルボードである請求項1から3のいずれかに記載の管理方法。
- 木材製品の原材料が針葉樹または広葉樹である請求項1から4のいずれかに記載の管理方法。
- 木材製品の原材料が樹齢80年までの針葉樹または広葉樹である請求項1から5のいずれかに記載の管理方法。
- 木材製品の原材料が樹齢50年までのヒノキ、樹齢30年までのスギ、樹齢15年までのラジアータ、樹齢12年までのランドウ、樹齢10年までのメリナ、または樹齢7年までのファルカタである請求項6に記載の管理方法。
- 木材製品が高温処理して得られたものである請求項1から7のいずれかに記載の管理方法。
- 木材製品のDNA個体識別を、マイクロサテライト領域を増幅するためのプライマーセットを用いてPCR法により増幅し、増幅されたDNAの塩基長の相違により行う、請求項1から8のいずれかに記載の管理方法。
- マイクロサテライト領域を増幅するためのプライマーセットであって、以下の21種類から選ばれるプライマーセット:
配列番号1または2で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号3で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号4または5で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号6で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号7または8で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号9で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号10または11で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号12で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号13または14で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号15で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号16または17で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号18で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号19または20で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号21で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号22または23で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号24で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号25または26で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号27で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
配列番号28または29で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号30で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット;
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